UNIVERSIDADE ESTADUAL DO AMAZONAS - UEA
PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A HEMATOLOGIA
PREVALÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA INFECÇÃO
PELO VÍRUS HTLV-1/2 EM PACIENTES COM DOENÇAS
HEMATOLÓGICAS ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO HOSPITALAR DE
HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS (HEMOAM)
HYGOR HALYSON FIGUEIREDO RIBEIRO
MANAUS - AMAZONAS
2017
AMAZONAS - HEMOAM
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO AMAZONAS - UEA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A HEMATOLOGIA
HYGOR HALYSON FIGUEIREDO RIBEIRO
PREVALÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA INFECÇÃO
PELO VÍRUS HTLV-1/2 EM PACIENTES COM DOENÇAS
HEMATOLÓGICAS ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO HOSPITALAR DE
HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS (HEMOAM)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia, em convênio com a Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas para obtenção do grau de Mestre em Hematologia.
Orientador: Dr. Gemilson Soares Pontes
MANAUS - AMAZONAS
2017
PREVALÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA INFECÇÃO
PELO VÍRUS HTLV-1/2 EM PACIENTES COM DOENÇAS
HEMATOLÓGICAS ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO HOSPITALAR DE
HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS (HEMOAM)
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr.Gemilson Soares PontesFUNDAÇÃO DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA AMAZONAS
____________________________________________________ Prof. Dr. Luis André Morais Mariuba
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
____________________________________________________ Prof. Dr. Maurício M. Ogusku
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISA DA AMAZÔNIA - INPA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia, em convênio com a Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas para obtenção do grau de Mestre em Hematologia.
Ao Dr. Gemilson Soares Pontes, que foi persistente e conselheiro a ponto de não
me permitir desistir nem mesmo nos momentos de maior diversidade nessa
empreitada que começamos a dois anos atrás, soube ser duro quando foi preciso
e soube ser paciente também, que mais pessoas tenham a chance de ter
orientadores como ele, obrigado.
A Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, bem
como a Fundação de Amparo à Pesquisa no Amazonas, por me darem a
oportunidade de iniciar e concluir esse estudo único, e me ajudar a concretizar o
sonho de seguir na carreira científica desenvolvendo uma pesquisa relevante não
só para o estado mas como para futuras gerações.
Ao Dr Nelson Abrahim Frajii por me proporcionar como gestor do HEMOAM,
toda a estrutura da instituição para coleta de material, bem como disponibilizar
tudo que estivesse ao seu alcance para a conclusão do trabalho
A secretaria Wilmara da fundação HEMOAM por auxiliar na medida do
possível em todos os aspectos técnicos e burocráticos, nas etapas diversas do
mestrado, bem como todos meus colegas/amigos que iniciaram comigo esta
empreitada, Ellen, Raquel, Emmerson, Aline, Pollyana, Purim, Luís, Marcelo e
Aleteia, meu muito obrigado pelos momentos de estudo e diversão.
Aos colaboradores do INPA , laboratório de Virologia, principalmente na pessoa
da aluna Diana Mota, que como bolsista de iniciação científica me ajudou
enormemente no início do projeto, com todo o entendimento sobre o que se
tratava, todo o trabalho árduo do início , na consciência que certamente sem a
presença dela essa caminhada não seria de forma alguma passível de conclusão.
Também agradeço ao aluno de mestrado Jean Silva, que me auxiliou na reta
brilhante pois tem um potencial grande dentro de si, obrigado. Aproveitando
para agradecer aos demais alunos do laboratório, Daniel, Rejane , Eduardo e
outros pelos momentos de alegria e parceria quando necessário.
Agradecer a minha mãe por todo o esforço dedicado e inserido na minha pessoa
à 27 anos, nunca me deixando faltar nada, mesmo em momentos de dificuldade
extrema, sendo assim o meu exemplo de vida maior, tendo superado tudo que
ela superou e continuando uma constante luta para vencer na vida e ser sempre a
melhor, mulher que me inspira e sempre me inspirou a ser tudo que sou hoje,
profissional exemplar, mãe dedicada e pessoa única. Obrigado mãe por lutar
pela minha felicidade sempre, que eu possa lhe pagar um dia tudo que a senhora
investiu em mim, nem que seja através do orgulho, te amo.
A minha noiva Juliana , por ser companheira, fiel, e talvez minha maior fã, me
aguentou em momentos de estresse, em momentos de depressão , provando cada
vez que a escolha que fiz para minha vida foi a mais acertada, sempre me deu
força e apoio quando por muitas vezes eu pensei em desistir, na certeza que eu
tinha um potencial que eu julgava não ter, por olhar no meu olho e dizer que eu
conseguiria, te amo.
Por fim a todos meus amigos que me deram força pra seguir em frente, que
nunca duvidaram da minha capacidade , e que direta ou indiretamente me
auxiliaram na conclusão desse trabalho, seja me ajudando em termos técnicos,
Deborah, Bárbara, ou tantos outros que deram suporte pra seguir em frente em
busca de meus sonhos, a todos vocês e a quem possivelmente possa ter
esquecido muito obrigado.
“Nunca se esqueça de quem você é, porque é certo que o mundo não se
lembrará. Faça disso sua força. Assim, não poderá ser nunca a sua fraqueza.
Arme-se com esta lembrança, e ela nunca poderá ser usada para magoá-lo’’
A infecção por HTLV-1/2 apresenta ampla disseminação mundial com prevalências que variam de acordo com o grupo populacional. Altas prevalências observadas entre pacientes com doenças hematológicas em diferentes partes do mundo têm causado preocupação devido a possível piora no prognóstico desses pacientes em decorrência desta infecção. Apesar da grande quantidade de indivíduos portadores de doenças hematológicas no estado do Amazonas, até o presente momento, não há estudos epidemiológicos que visem caracterizar a infecção por HTLV-1/2 nesses pacientes, o que seria de grande importância na promoção à saúde destes indivíduos. O presente estudo teve como objetivo principal estimar e caracterizar a prevalência da infeção pelo HLTV-1/2 em pacientes com doenças hematológicas atendidos no HEMOAM de Manaus. Um total de 306 indivíduos foram submetidos ao diagnóstico sorológico da infecção pelo HTLV-1/2 e tiveram seus dados demográficos coletados por meio de um inquérito epidemiológico. A sororreatividade para HTLV-1/2 foi confirmada por meio da reação da PCR em tempo real (qPCR). A amplificação, sequenciamento e análise filogenética da região LTR foi utilizada para a caracterização molecular do HTLV-1/2. Os dados epidemiológicos demonstraram que do total dos 306 indivíduos analisados, 42,81% são acometidos por algum tipo de leucemia, 51% são do sexo feminino, 62,4% se autodeclaram como pardo e 61,8% indica que já recebeu pelo menos uma transfusão sanguínea no último ano. As análises sorológicas identificaram um indivíduo soropositivo para o HTLV-1/2 e dois indeterminados, contudo, o diagnóstico molecular por qPCR confirmou a positividade para apenas um indivíduo de 29 anos, sexo masculino, portador de anemia falciforme e politransfundido. As análises filogenéticas da região LTR do DNA proviral extraído, demonstrou tratar-se do HTLV-2c devido o mesmo apresentar 99% de similaridade genética com as cepas de HTLV-2c Kayapó79 e KAA8879 anteriormente descrita no Pará. Os dados gerados por este estudo irão contribuir com a epidemiologia da infecção por HTLV-1/2 na região e no Brasil, visto que descreve de forma pioneira a ocorrência do HTLV-2c em regiões urbanas da Amazônia Ocidental, sugerindo uma possível transmissão via transfusão sanguínea uma vez que o paciente infectado é portador de anemia falciforme e foi submetido a inúmeras transfusões de hemoderivados no decorrer da vida.
HTLV-1/2 infection is distributed worldwide showing prevalence rates varying according to the population group. High prevalences are observed among patients with hematological diseases in different parts of the world have caused concern due to the possibility of worsening prognosis in patients resulted by HTLV-1/2 infection. Despite of the large number of patients suffering from hematological disease in the Amazon region, until now there are no epidemiological studies regarding the characterizing HTLV-1/2 infection among these patients, which would be a great approach to health promotion. The main goal of this study was to estimate and characterize the prevalence of HTLV-1/2 infection in patients suffering from haematological diseases treated at HEMOAM, Manaus. A total of 306 patients were submitted to serological diagnosis of HTLV-1/2 infection and had their demographic data collected through an epidemiological survey. HTLV-1/2 seroreactivity was confirmed by real-time PCR reaction (qPCR). An amplification, sequencing and phylogenectics analysis of the LTR region was performed for molecular characterization of HTLV-1/2. Epidemiological data demonstrated that of a total of 306 analyzed individuals, 42,81% are affected by some type of leukemia, 51% are female, 62,4% self-reported as brown, and 61,8% indicate that already have received at least one blood transfusion during the previous year. Serological tests identified a seropositive individual for HTLV-1/2 and two undetermined reactions. However, the molecular diagnosis by qPCR confirmed positivity for only a 29 year old male patient carrier of sickle cell anemia who has had multiple blood transfusions. The phylogenetic analysis of the DNA proviral LTR region demonstrate that HTLV-2c was the subtype isolated, because it shows 99% of genetic similarity with the strains of HTLV-2c, Kayapó79 and KAA8879, previously described in Pará. The data generated by this study will contribute with the epidemiology of HTLV-1/2 in our region and in Brazil, once this study describe for the first time the occurrence of the HTLV-2c in the urban area of Western Amazon Region, which suggests the possibility of a transmission through blood transfusion since the patient has sickle cell anemia since young ages and was submitted to numerous blood transfusion through his whole life.
Figura 1. Representação esquemática da partícula viral do HTLV-1/2 ... ...16 Figura 2. Organização genômica do HTLV-1e HTLV-2. ... ...18 Figura 3. Representação esquemática do ciclo de replicação viral e suas respectivas fases. ..21
Figura 4. Demonstração Esquemática dos subtipos de HTLV- ...23
Figura 5. Estimativa de regiões endêmias de soroprevalência do vírus HTLV-1/2 ... ..27 Figura 6. Representação esquemática da HBZ no HTLV-1 para a APH-2 no HTLV-2 ... 30 Figura 7. Relação entre frequência das patologias observadas e o número de pacientes que
receberam transfusão...50
Figura 8. Percentual das Patologias mais frequentes nas subpopulações de maior
importâncias para o estudo...51
Figura 9. Fragmento da amplificação da região 5’LTR do HTLV-2 ... ....53 Figura 10. Corrida realizada para identificação da clonagem realizada do inserto região
LTR/HTLV-2. ... ...54
Figura 11. Árvore filogenética evidenciando as relações filogenéticas entre cepa do
HTLV-2...56
Tabela 1. Iniciadores e sonda da reação de qPCR. ... 41 Tabela 2. Mistura da reação de qPCR. ... 41 Tabela 3. Iniciadores utilizados nas reações de Nested PCR da região 5’LTR do HTLV-1. .. 42 Tabela 4. Iniciadores utilizados nas reações de Nested PCR da região 5’LTR do HTLV-2 ... 43 Tabela 5. Variáveis sócio-demográficas da população estudada... 46 Tabela 6. Variáveis de risco para HTLV-1-1/2 e doenças sexualmente transmissíveis em
geral... 48
Tabela 7. Frequência das doenças hematológicas observadas na população
estudada...49
Tabela 8. . Prevalência da infecção pelo HTLV-1/2 em pacientes com doenças hematológicas
atendidos na Fundação HEMOAM...52
Tabela 9. Comparação da similaridade genética entre as cepas de HTLV-2 com sequências
HTLV Vírus Linfotrópico de Células T Humano ATLL Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto BHE Barreira Hemato Encefálica
CA Capsídeo
cDNA Ácido Desoxirribonucléico complementar DNA Ácido Desoxirribonucléico
dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfatados Env Glicoproteína do envelope viral Glut-1 Transportador de glicose-1
GM-CSF Fator de Estimulação de Crescimento de Colônias de Granulócitos HAM Mielopatia associada ao HTLV
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
IFN Interferon
IL Interleucina
IN Integrase
MA Matriz Viral
mRNA Ácido ribonucléico Mensageiro
NC Nucleocapsídeo
ORF Região de leitura aberta
PCR Reação em cadeia da polimerase
RNA Ácido Ribonucléico
RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro
RT Transcriptase Reversa/Transcrição Reversa SLTV Vírus Linfotrópico de células t de Símios Tax Proteína transativadora do HTLV-1
tax Gene regulador de transativação
TNF Fator de Necrose Tumoral TSP Paraestesia Espática Tropical
1. INTRODUÇÃO ... 13 2. REFERENCIAL TEÓRICO ... 14 2.1 Histórico ... 14 2.2 Biologia do vírus ... 15 2.2.1 Genoma do HTLV ... 16 2.3 Ciclo replicativo ... 20 2.4 Heterogeneidade do HTLV-1/2 ... 21 2.5 Epidemiologia ... 24 2.5.1 Distribuição mundial do HTLV-1/2 ... 24 2.5.2 Distribuição do HTLV1/2 no Brasil ... 25 2.6 Mecanismo de patogenicidade. ... 29 2.7 Transmissão e Diagnóstico ... 31
2.8 Principais patologias associadas à infecção pelo HTLV-1/2 ... 32
2.8.1 Doenças neurológicas ... 32
2.8.2 Doenças Hematológicas versus infecção pelo HTLV-1/2... 33
3. OBJETIVOS ... 37
4. METODOLOGIA ... 38
4.1 Aspectos éticos ... 38
4.2 Caracterização da População Investigada ... 38
4.3 Sorologia ... 39
4.4 Extração de DNA ... 39
4.5 Reação de PCR em Tempo Real ( qPCR) ... 40
4.7 Amplificação da região 5’LTR do HTLV-1... 41
4.8 Amplificação da região 5’LTR do HTLV-2... 42
4.9 Eletroforese ... 43
4.10 Clonagem da região LTR-HTLV-1/2 em vetor pGEM®-T ... 43
4.10.1 Ligação no vetor de Clonagem pGEM e transformação em TOP 10: ... 43
4.10.2 Extração Plasmidial e digestão para confirmação da presença do inserto da região LTR do HTLV-2 ... 44
5.1 Perfil sócio-demográfico da população estudada ... 46
5.2 Frequência das principais doenças hematológicas na população estudada ... 49
5.3 Prevalência da infecção pelo HTLV-1/2 ... 51
5.4 Perfil epidemiológico do paciente soropositivo para HTLV-1/2. ... 52
5.5 Determinação do subtipo do HTLV-1/2 ... 53
5.6 Clonagem da Região LTR ... 53
5.7 Análise nucleotídica do sequenciamento da Região LTR do HTLV-2 ... 54
5.8 Análise filogenética ... 55
6. DISCUSSÃO ... 57
7. CONCLUSÕES ... 65
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 66
1. INTRODUÇÃO
O Vírus Linfotrópico de Células T Humanas (HTLV) foi inicialmente isolado no início dos anos 80 de um paciente portador de linfoma de células T (Poiesz et al., 1980). O HTLV apresenta distribuição mundial e infecta persistentemente os linfócitos T CD4+. Estima-se que aproximadamente de 5 a 10 milhões de indivíduos encontram-se infectados com este vírus em todo o mundo (Gessain & Cassar et al., 2012). Apesar da infecção ser assintomática na maioria dos casos, ainda assim, ela gera um estigma para o portador com possível diminuição de sua qualidade de vida (Barbeau, Peloponese, & Mesnard et al., 2013).
A infecção por HTLV está principalmente associada ao desenvolvimento de leucemia/linfoma de células T do adulto (LLcTA) e paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV (PET/HAM), ambas relacionadas ao subtipo viral HTLV-1(Alvarez et al., 2015). Em relação ao subtipo HTLV-2, até o presente momento não confirmação de patologia correlata a infecção por este vírus, porém há relatos de possíveis associações da infecção por HTLV-2 e algumas desordens e complicações do sistema nervoso central (E. L. Dos Santos et al., 2009).
Estudos epidemiológicos tem demonstrado que o Brasil é o país com maior número absoluto de indivíduos soropositivos para o HTLV-1/2 no mundo (Carneiro-Proietti, Catalan-Soares, & Murphy et al., 2005 ;Lopes & Proietti et al., 2008). Contudo, devido sua extensão territorial, mais estudos são necessários para traçar uma média de prevalência real do vírus (Gessain & Cassar et al., 2012). Estudos realizados em doadores de sangue demonstraram uma prevalência média de aproximadamente 0,45% de indivíduos infectados, entretanto estes índices podem variar entre 0 a 1,8% dependendo da região estudada (Araújo et al., 2009). A região nordeste é conhecida como a região de maior prevalência no Brasil, sendo a maior prevalência observada no estado da Bahia (1,76%), principalmente entre indivíduos com comportamento de risco (Mello et al., 2014).
Apesar de estudos sobre o HTLV-1/2 terem avançado nas últimas décadas, ainda há muito a ser esclarecido sobre a prevalência e padrões endêmicos junto à subpopulações específicas ainda não estudadas, como pacientes com distúrbios hematológicos, por exemplo. Mediante uma parceria realizada junto a Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, instituição responsável pelo atendimento referência de pacientes com as mais diversas desordens hematológicas na região, este estudo visa
investigar a epidemiologia sorológica e molecular do HTLV-1/2 em pacientes com doenças hematológicas.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Histórico
Em 1980, Poiez e colaboradores, isolaram e caracterizaram um retrovírus do tipo C, a partir da linhagem de linfócitos proveniente de um paciente com linfoma cutâneo de células T. Dois anos depois, um retrovírus semelhante associado à leucemia de células T foi isolado no Japão (Yoshida et al.,1982). Estudos comparativos demonstraram que o vírus isolado no Japão se tratava do mesmo vírus isolado anteriormente nos Estados Unidos, passando a ser denominado de Vírus Linfotrópico de Células T Humano (HTLV) (Gallo et al., 2005).
Em 1982, a partir de uma linhagem contínua de células T obtidas de um paciente com tricoleucemia (ou leucemia benigna de células pilosas), foi isolado um novo vírus que apresentava 65% de similaridade genética com o HTLV-1, recebendo a denominação de HTLV-2 (Kalyanaraman et al., 1982; Sodroski et al., 1992). Embora similar geneticamente, o HTLV-2 não está associado com leucemia. Contudo, é possível que a infecção por este vírus possa estar diretamente associada ao desenvolvimento de uma linfocitose benigna e de algumas síndromes neurológicas (Biswas et al., 2009).
Em 2005, dois novos retrovírus humanos denominados de HTLV-3 e HTLV-4 foram isolados em indivíduos residentes da zona rural de Camarões, que praticavam atividades de caça a macacos e a outros primatas (Wolfe et al., 2005). Na ocasião foi observado que o HTLV-3 isolado apresentava similaridade genética ao Vírus Linfotrópico de Células T de Símios (STLV-3), sendo que, este último, já foi relacionado por estudos anteriores aos dois principais tipos de HTLV, compartilhando algumas similaridades genéticas (Mahieux & Gessain et al., 2009).
O HTLV-4, também descoberto pelo mesmo grupo de pesquisa de Duprez e colaboradores, foi descrito a partir do primeiro e único paciente infectado também na zona rural de Camarões. A análise filogenética deste vírus demonstrou que o mesmo pertencia a uma linhagem bem distinta de seus predecessores (Calattini et al., 2005). As informações a cerca da biologia do HTLV-3 e HTLV-4 e as possíveis patologias associadas à infecção
por esses vírus ainda permanecem desconhecidas (Santos et al., 2013; Larocque et al., 2014).
2.2 Biologia do vírus
O HTLV pertence à família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e gênero
Deltaretrovirus (Proietti et al., 2010). A partícula viral apresenta morfologia esférica e
pleomórfica, cujo tamanho varia de 80 a 100 nanômetros de diâmetro. O vírus é constituído basicamente de um envelope, um nucleocapsídeo icosaédrico, das enzimas transcriptase reversa, integrase e protease, além de seu genoma composto por duas fitas de RNA de polaridade positiva (figura 1).
O envelope é composto por uma dupla camada lipídica, proteínas de superfície extracelular e a proteína transmembrana gp21, além da glicoproteína viral externa gp46 (figura 1). A gp46 projeta-se na superfície viral sob a forma de 72 espículas, que se ancoram nas demais estruturas virais por meio da glicoproteína gp 21 (Schüpbach et al., 1989). Junto à membrana do envelope, encontra-se a matriz viral (MA), formada basicamente pela proteina p19. O capsídeo é composto pelas proteínas codificadas pelo gene gag (Franchini et al., 1995;Wycuff et al., 2001;Hoshino et al., 2012).
O genoma do HTLV é composto por cerca de 10 quilobases de comprimento, (Andrada-Serpa et al., 1994). Ao contrário do que acontece com o HIV, não são detectadas com facilidade partículas virais livres do HTLV no sangue ou em outros fluídos biológicos de indivíduos infectados, acreditando-se assim, que as partículas virais estejam associadas apenas aos linfócitos infectados.
Figura 1. Representação esquemática da partícula viral do HTLV-1/2 (imagem adaptada do site
www.htlv.com.br.)
2.2.1 Genoma do HTLV
O genoma do HTLV apresenta cerca de 8930 a 9030 nucleotídeos, flanqueados por duas sequências de repetição terminal longa (LTR) as quais se apresentam como duas regiões idênticas localizadas nas extremidades 5’ e 3’. As LTRs são fundamentais para a integração do recém formado DNA proviral no DNA cromossômico da célula hospedeira. As regiões LTRs também participam da regulação transcricional do vírus, sendo responsáveis pela sinalização de início e término da transcrição, (Johnson:Harrod et al., 2001;Hoshino et al.,2012).
O HTLV-1 codifica pelo menos 7 produtos gênicos regulatórios, que controlam a transcrição proviral, o transporte e splicing do mRNA, além de controlar também a expressão de certos genes da célula hospedeira (Bangham, Cook, & Melamed et al., 2014).Assim como outros retrovírus similares de sua família, o HTLV possui os genes estruturais gag, pol e env, além de uma região denominada de região px localizada próximo à extremidade 3’, a qual contém uma variedade de genes acessórios como; tax, rex ,p12, p21, p13, p30 ( Bai & Nicot et al.,2012) . O genoma apresenta ainda genes codificadores das enzimas Transcriptase Reversa (RT), RNaseH (RH), integrase(IN) e protease ( Johnson:Harrod, et al., 2001). A partir da fita “antisense”, a proteína “basic leucine zíper” (HBZ) também é codificada, como mostrado na figura 2. Apesar da grande similaridade genética com o HTLV-1,o HTLV-2 apresenta outros genes codificantes como
em seu genoma, o qual desempenha papel similar a proteína HBZ (Johnson : Harrod,et al., 2001;Gaudray et al., 2002 E. L. Dos Santos et al., 2009).
As proteínas acessórias de ambos os subtipos virais são dispensáveis quando se trata de infecção in vitro e transformação de células T, mas são importantes no auxílio da infecção viral, disseminação e persistência quando se trata de infecção in vivo (Albrecht and Lairmore et al., 2002; Feuer e Green et al., 2005;Barbeau et al., 2013)
O gene env é responsável por codificar a glicoproteína gp62 que posteriormente é clivada em duas subunidades, a proteína de superfície gp46 e a proteína transmembrana gp21, ambas importantes para a entrada do vírus na célula hospedeira. A gp46 confere a capacidade de adsorção do vírus à membrana da célula hospedeira, enquanto a gp 21 medeia a fusão das membranas viral e celular, além de serem as principais indutoras de anticorpos neutralizantes (Hall et al., 1994; Johnson et al., 2001; Hoshino et al., 2012).
O gene gag é responsável por codificar a proteína p52, que dará origem a proteína da matriz (p19), a proteína do capsídeo (p24) e a proteína do nucleocapsídeo (p15) (Le Blanc et al., 2012). Essas proteínas irão formar os componentes que constituem as principais estruturas da partícula viral madura. A proteína do capsídeo (p24) apresenta alta similaridade em sua sequência de aminoácidos quando se compara com p24 do HTLV-2, o que fatalmente acarreta em reatividade cruzada nos testes sorológicos (Bangham et al., 2014).
O gene pol, localizado na posição 3’ próximo do gene gag, codifica a transcriptase reversa, fundamental para a transcrição do RNA viral em DNA e sua incorporação no genoma da célula hospedeira. O gene pol também codifica a enzimas RNAse, endonuclease e a protease (Feuer& Green et al., 2005). A protease é codificada por nucleotídeos localizados na porção 3’ da região gag e na parte 5’ da região pol. Assim, a síntese da protease é feita com partes do precursor poliprotéico gag . A protease é responsável pelo processamento dos produtos gag e pela sua própria clivagem, para gerar a molécula de protease madura(de Queiroz et al., 2007).
gag pro pol env P30/p13 p12 tax rex 5’LTR 3’LTR HBZ DNA proviral do HTLV-1 gag pro pol env tax rex p28 p10 p11 APH-2 5’LTR 3’LTR DNA proviral do HTLV-2 Região px Região px
Figura 2. Organização genômica do HTLV-1e HTLV-2. Observa-se no esquema o DNA proviral
flanqueado pelas regiões LTRs , e os transcritos (mRNA) não processados e processados pelo mecanismo de splicing alternativo.
A p12 codificada pela ORF I (Open Region Frame) do HTLV-1 é uma proteína capaz de interagir com os receptores de cadeia da IL-2(IL-2R), principalmente os receptores beta e gama, alterando assim a via de sinalização da Il-2 ( Farcet et al., 1991). Assim, a contínua ativação da via de sinalização por IL-2R pela proteína p12 está diretamente correlacionada com a independência de IL-2 das células T (Franchinni et al., 1995; Johnson et al., 2001;B.Barbeau et al., 2013).
A TAX e a REX são proteínas com funções regulatórias do genoma viral, sendo que ambas são codificadas pela região pX do HTLV-1. A proteína REX, do HTLV-1, pode exercer as funções da proteína REV do HIV-1, até mesmo substituindo-a. Contudo, o inverso não ocorre (Greene et al., 1990; Johnson et al., 2001).
Ao interagir com proteínas regulatórias celulares, a TAX pode induzir também a expressão de genes celulares (Franchinni et al., 1995; Ferreira et al., 1997). O gene tax também codifica a proteína p40, responsável pela transativação da região U3 do segmento LTR do genoma viral e também de genes da célula eucariótica infectada, tais como: cadeia
alfa do receptor da IL-2 (CD25) , a própria IL-2, a IL-1, a IL-3, a IL-6, o TGF-beta, fator de crescimento de granulócitos (GM-CSF), a c-fos, a c-sis, a c-myc, a proteína relacionada ao paratormônio(mecanismo ligado ao aumento de complicação em casos de ATL), entre outros (Johnson & Harrod et al., 2001;Nyborg, Egan, & Sharma et al, 2010;Hoshino et al, 2012).A expressão do gene tax está diretamente correlacionado a proliferação da células T infectadas e, consequentemente com o aumento da carga proviral (Nyborg et al., 2010).
Outro importante componente do genoma viral é o fator nuclear transcricional HBZ, o qual é capaz de interagir com as proteínas ATF/CREB, responsáveis respectivamente por: (i) influenciar processos fisiológicos celulares por meio da regulação da expressão de genes alvo (principalmente atf1);e (ii) influenciar no crescimento, sobrevivência e outras atividades celulares. Já a proteína de ligação ao fator cAMP (CREB), regula o processo de expressão de importantes genes ''downstream'', ou seja no sentido 3'.A interação da HBZ com essas respectivas proteínas se dá por meio do domínio bZIP, levando a inibição da sua capacidade de ligação com o DNA da célula hospedeira, o que resulta na inatividade parcial da TAX ao impedir seu posicionamento no promotor viral, impossibilitando a ativação da transcrição do HTLV-1 ( Matsuoka & Greene et al., 2009).A HBZ age como um repressor da transcrição viral através da formação de heterodímeros com CREB, CREB-2, CREM e ATF-1 que passam a ser incapazes de se ligar a TxRE (Arnald et al., 2006;Ciminale, Rende, Bertazzoni, & Romanelli et al., 2014)
Assim como no HTLV-1, a proteína APH-2 do vírus HTLV-2, desempenha uma função semelhante à HBZ, e também mostrou-se capaz de suprimir a transcrição viral mediada por sua própria TAX, por meio de interação com CREB (B.Barbeau et al., 2013).Vale salientar que a expressão do gene HBZ foi detectada em células primárias de leucemia isoladas de todos os pacientes com LLTA, enquanto a TAX foi praticamente indetectável ou ausente em muitos casos ( Matsuoka & Greene et al., 2009).A HBZ comprovadamente apresenta promoção do fator de crescimento celular tanto in vivo como
in vitro, o que sugere indispensabilidade sua essencialidade no desenvolvimento da
principal patologia correlacionada ao HTLV-1 (Arnold et al., 2006; Matsuoka & Jeang., 2011;Barbeau 2013).
2.3 Ciclo replicativo
O HTL-1/2 infecta principalmente os linfócitos T CD4+ e CD8+ podendo também infectar monócitos e células dendríticas. Primeiramente ocorre a adsorção na membrana da célula hospedeira, que acontece por meio da interação da proteína de superfície gp46 com o receptor celular GLUT-1 presente na membrana plasmática da célula hospedeira, com auxílio de outras proteínas virais recém sintetizadas presentes no envelope viral (Overbaugh et al., 2004; Takenouchi et al., 2007; Romanos et al., 2008).
Após a fusão de membranas, o cerne viral é introduzido no citoplasma (figura 3), onde ocorre o desnudamento do capsídeo, e liberação do conteúdo interno do vírus (genoma) . Em seguida, o RNA viral é transcrito em DNA de fita dupla pela transcriptase reversa (RT) ( Santos & Lima et al., 2005). Logo após a síntese da fita dupla de DNA, o DNA viral é transportado para o núcleo e inserido no genoma da célula hospedeira por ação de outra importante enzima viral, a integrase. O provírus integrado corresponde a 9,03 KB para o HTLV-1 e 8,93kb para o HTLV-2 e codifica proteínas estruturais, enzimas e demais proteínas regulatórias, descritas anteriormente (Hoshino et al., 2012).
A partir deste momento, inicia-se a síntese do RNA viral pelos mecanismos de replicação celular, tendo como molde o provírus integrado (F. L. N. Santos & Lima et al, 2005). Os RNAs transcritos são processados em mRNAs e em genomas que irão compor novas partículas virais (figura 3). Este processo marca o início da fase tardia onde são sintetizadas as proteínas virais. Ao terminar este processo de síntese, ocorre o início da montagem e brotamento das partículas virais.
Reconhecimento Celular -RNA Genômico Transcrição Reversa DNA proviral Fase Inicial Integração Montagem Viral Fase Tardia Transcrição Splicing RNAm Brotamento
Figura 3. Representação esquemática do ciclo de replicação viral e suas respectivas fases.
2.4 Heterogeneidade do HTLV-1/2
O HTLV-1 e o HTLV-2 compartilham cerca de 65% de homologia em suas sequências de nucleotídeos dependendo da região analisada, o que resulta em codificação e síntese de diversos produtos gênicos semelhantes (Calattini et al., 2005). A variabilidade genética observada entre esses vírus tem levado à descrição de subtipos e a construção de árvores filogenéticas que representam relações evolutivas entre os mesmos (Cann e Chen et al., 1996). Este fato justifica a alta taxa de reações cruzadas observadas entre soros de pacientes infectados por diferentes tipos de HTLV-1/2, (Vallinoto et al., 2017).
Por meio de análises filogenéticas da região LTR, o HTLV-1 pode ser classificado em sete subtipos o subtipo HTLV-1a ou Cosmopolita; HTLV-1b ou Centro Africano; HTLV-1c ou oriundo da Melanésia; HTLV-1d, isolado de pigmeus em Camarões e na
Adsorção
região do Gabão; HTLV-1e isolado de pigmeus na República Democrática do Congo; HTLV-1f de um indivíduo singular do Gabão e por fim HTLV-1g recentemente descrito como um novo subtipo em Camarões na África Central( Gessain & Cassar et al.,2012). O subtipo HTLV-1a ou Cosmopolita,é o mais disseminado em diversas populações e áreas geográficas, compreendendo cinco cepas específicas: o Japonês, o Transcontinental, o da Africano da região Norte, da região Central e o Peruano Negro (Treviño et al, 2014). É possível que pelo menos três subtipos (O próprio subtipo Cosmopolita 1a; O subtipo Africano Central b; e o subtipo da Melanesia) tenham sido originados a partir de transmissão entre espécies, principalmente de primatas portadores de algum tipo de vírus causador de Leucemia de células T de Símios (SLTV), que após ser introduzido no hospedeiro humano, passou longos períodos de variabilidade evolutiva (Treviño et al, 2014). A variabilidade genômica do HTLV-1 está mais relacionada à área geográfica onde está mais presente, ou até mesmo onde foi inicialmente descrita, não tendo por enquanto relatos de patologias exclusivamente relacionadas a um subtipo específico (Casseb et al., 2006).
A caracterização molecular do genoma viral do HTLV-2, demonstrou a existência de quatro subtipos virais, denominados de HTLV-2a, HTLV-2b, HTLV-2c e HTLV-2d ( Roucoux & Murphy et al, 2004; Ishak et al., 2007) (Figura 4). O HTLV-2a, HTLV-2b e HTLV-2c são amplamente distribuídos em regiões indígenas nativas das Américas, sendo o HTLV-2c mais prevalente no Brasil, onde originou-se( Maloney et al., 1993). Na América do Norte, os subtipos 2a e 2b estão presente entre os povos indígenas de Navajo e Pueblo do estado do Novo México assim como entre os índios Seminole da Flórida ( Kazanji et al., 2001; Ishak et al., 2003). Já o HTLV-2b é endêmico entre os índios Guaymi no Panamá, tendo sido também encontrados entre os descendentes dos Mayas do México ( Biggar et al., 1996) .
Na América do Sul o HTLV-2b é amplamente distribuído entre os as populações indígenas Guahibo e Wayu localizados na Colômbia, e entre os Toba e Mataco da Argentina, além de já ter sido identificados em pequenos grupos do Chile (Casseb& Paiva et al, 2015). Por fim o subtipo HTLV-2c é o único subtipo molecular ocorrendo entre várias tribos indígenas da região Amazônica brasileira, bem como nas áreas urbanas do país (Roucoux & Murphy, 2004;Ishak, et al 2006;Ishak et al., 2007; ;E. L. Dos Santos et al., 2009). Essa variante foi primeiro descrita por Ishak e colaboradores em 1995 ocorrendo principalmente em tribos indígenas no estado do Pará caracterizadas como Kayapó.
Contudo estudos subsequentes mostraram a distribuição do subtipo em diversas tribos isoladas da tribo onde primeiro foi descrito o vírus, como as tribos Arara do Laranjal, Zo’é e Tiriyó( Ishak et al., 2003 Ishak et al., 2005).
A presença do vírus também já foi verificada em áreas urbanas principalmente na cidade de Belém capital do Pará acreditando-se tratar de uma transmissão por contato sexual com descendentes das tribos indígenas interioranas, ou com os próprios habitantes das tribos (Vallinoto et al., 2002). Vallinoto e colaboradores em 2017 chegaram a uma possível explicação para a origem do HTLV-2c na Amazônia, considerando a possibilidade de uma origem autóctone, a partir de um proto-HTLV-2ª infectante, oriundo de um ancestral ameríndio, que possivelmente entrou no Brasil por meio da Amazônia, fazendo assim com que essa variante fosse disseminada entre os povos indígenas do Brasil , mesmo que isolados, como em uma espécie de processo de expansão populacional.
Figura 4: Demostração esquemática dos Subtipos e as relações moleculares entre os mesmos, segundo o
2.5 Epidemiologia
2.5.1 Distribuição mundial do HTLV-1/2
A infecção pelo HTLV- 1/2 apresenta como característica peculiar seu agrupamento em áreas geográficas bem delimitadas, não atuando assim de forma homogênea como no caso de muitas doenças (Catalan-Soares et al., 2005). Existe ainda uma variação das taxas de soroprevalência nas áreas endêmicas, possivelmente decorrentes de fatores genéticos e hereditários ligados a doença, além de um aumento da soroprevalência de acordo com a idade (efeito da idade, efeito de coorte, soroconversão tardia), com o sexo (mais presente no sexo feminino) ou outros fatores de risco estudados ao longo da última década, como usuários de drogas, contato sexual com portadores, múltiplos parceiros, dentre outros (Hino et al., 2011;Casseb et al., 2014).
Em termos de média mundial de soroprevalência, um estudo recente de Gessain e Cassar em 2012, mostrou por meio de meta-análise uma regra geral para a soroprevalência mundial, variando geralmente de 1 a 2%, podendo chegar a valores mais elevados como 20 a 40% se considerarmos apenas pessoas acima de 50 anos, ou moradores de regiões endêmicas.
As principais regiões de maior endemicidade no mundo são: o Sudoeste do Japão, algumas partes da região Caribenha, alguns focos presentes na América do Sul (especificamente em partes da Colômbia e da Guiana Francesa), algumas áreas da África intertropical, como o Gabão do Sul por exemplo, e no Oriente Médio (Região de Mashad no Irã) ( Adedayo et al., 2004;Keshvari et al 2014). Há também focos isolados na região da Austrália-Melanésia (Chihara et al., 2012). Na Europa apenas a Romênia aparenta ter uma prevalência mais representativa do HTLV-1, sendo de aproximadamente 5,3/10.000 habitantes, ao passo que a Europa como um todo apresenta uma média de 0,4/10.000 habitantes (Gessain e Cassar et al., 2012).
Ainda no continente Europeu, Gessain e Cassar (2012), também verificaram que 80% dos casos de pacientes infectados pelo o HTLV-1 são imigrantes ou filhos de imigrantes de regiões endêmicas para o vírus, principalmente Índia Ocidental, Jamaica e de países próximos como Barbados e Trindad e Tobago (Adedayo et al 2004). Raramente está parcela de imigrantes vêm de países africanos, obedecendo a ordem de antigas
colônias ou metrópoles do século XIX, em relação aos respectivos países Europeus ( Gessain & Cassar et al., 2012).
Outro estudo realizado na Espanha demonstrou um padrão de prevalência da infecção semelhante ao acima relatado (Traveño et al., 2014). Apesar do fato do país ser caracterizado como uma região não endêmica, devido à incidência do aumento do fluxo migratório, novos casos foram relatados da doença, de modo que o sistema de saúde local, por se tratar de uma doença em tese controlada, não acompanhou o crescimento da mesma.
O HTLV-1 também é endêmico na América do Sul, presente assim nos 13 países, apresentando prevalência assim como em outras partes do globo em populações étnicas, como imigrantes japoneses e africanos, principalmente no Brasil, e em descendentes de Ameríndios que habitavam o continente a milhares de anos (Paiva & Casseb et al., 2015).
Já o HTLV-2 mostrou-se endêmico em diversas regiões principalmente de população Ameríndia, incluindo províncias como em Navajo e Pueblo, no Estado do Novo México nos Estados Unidos e na região de Seminole ( Flórida), também na América do Norte ( Ishak et al., 2003).
Na América do Sul, o HTLV-2 foi descrito em populações da Colombia (Wayu, Guahibo e Tunebo), na Argentina nas tribos Toba e Mataco e por fim no Brasil nas tribos Kayapó e Kraho como já descrito(Kazanji et al., 2010). O HTLV-2 foi descrito inicialmente em pacientes usuários de drogas intravenosos na América do Norte e Europa, principalmente na Itália e Espanha, tendo sido descrito os subtipos HTLV-2a e 2b em ambas populações ( Ameríndios e Usuários de drogas intravenosas), ao passo que o HTLV-2c , que corresponde a uma variante do 2a foi primeiro identificado em indígenas da região Amazônica Ocidental conhecida como tribo Kayapó (Ishak et al., 2003).
2.5.2 Distribuição do HTLV1/2 no Brasil
No Brasil, a infecção pelo HTLV-1 é considerada endêmica em muitas regiões, porém não apresenta prevalência elevada na população em geral, com exceção das regiões endêmicas (E. L. Dos Santos et al., 2009).A infecção pelo HTLV-1/2 têm sido mais prevalente nos estados da Bahia, Pernambuco e Pará(E. L. Dos Santos et al., 2009; Paiva & Casseb et al., 2014).
Devido sua extensão continental e sua grande densidade populacional assim como lugares de difícil acesso, além do fato de grande parte da população ainda está presente em áreas rurais, torna-se difícil estabelecer uma estimativa precisa do número de casos
absolutos de indivíduos infectados no Brasil. Talvez o estudo que mais se aproximou da realidade absoluta em termos de soroprevalência no país, foi o de Catalan-Soares e colaboradores (2005), que demonstrou a prevalência e a distribuição geográfica do vírus ao longo do país a partir da triagem sorológica de doadores de sangue de grandes áreas urbanas do Brasil nos 26 estados e no Distrito Federal. Embora os achados não sejam representativos do número absoluto de indivíduos infectados nas regiões estudadas, devido o estudo ter sido baseado em um comportamento pro-social específico (doar sangue), os resultados foram bastante elucidativos em relação à endemicidade do HTLV-1/2 no Brasil.
Contudo, devido a escassez de estudos soroepidemiológicos relacionados à prevalência do HTLV-1/2 no Brasil, torna-se difícil estimar a incidência/prevalência da infecção por esse vírus no país. Estudos semelhantes aos realizados em doadores de sangue por Carneiro-Proietti em 2005 demonstram que a cidade de Salvador caracteriza-se como a região de maior endemicidade para o HTLV-1 no Brasil, com uma soroprevalência registrada em torno de 1,35%, seguido por Recife e Rio de Janeiro com 0,33%, Belo Horizonte com 0,32%, São Paulo com 0,15% e Manaus e Florianópolis com 0,08%, obtendo-se uma soropositividade geral de 0,46% , valor este bastante superior aos 0,025% observados nos Estados Unidos por exemplo(Lopes, Maria Sueli S. N., & Proietti et al., 2008). .
A partir de estudos mais atualizados e novas descobertas, percebe-se que talvez o padrão epidemiológico possa ter mudado ao longo dos anos, ou tenha havido uma necessidade de abranger-se novos grupos amostrais, mais próximos de comportamento de risco associado ao vírus (Figura 5).
Figura 5. Estimativa de regiões endêmias de soroprevalência do vírus HTLV-1/2. Número absoluto de
habitantes em estudos recentes, nos 26 estados e no distrito federal(Magno Falcão et al 2013; Mello et al 2014; Monteiro et al 2014;Nascimento et al 2014; Bandeira,Uehara et al 2015;Glória et al 2015).
Como demonstrado na figura 5, mesmo após quase uma década desde a realização desse estudo em escala nacional (Carneiro-Proietti et al, 2005), não houve variação nas taxas de prevalência em algumas cidades no decorrer dos anos, como no caso de Salvador, onde a prevalência em doadores sanguíneos passou a ser de 1,36% (aumento de 0,01%) (Mello et al., 2014). Outro estudo também realizado em Salvador envolvendo a população em geral, detectou a prevalência de 1,76%, podendo ser de 8,4% se considerarmos apenas mulheres com idade acima de 51 anos (grupo de risco) (Dourado et al., 2003;Ribeiro et al., 2010). Assim como demais regiões do Brasil, apesar da alta prevalência em mulheres, a contaminação do vírus está muito associada à baixa escolaridade e baixo poder aquisitivos, bem como em áreas com piores indicadores socioeconômicos (Mello et al., 2014).
Na Região Sudeste do Brasil especificamente no Rio de Janeiro Monteiro e colaboradores em 2014, estudaram a soroprevalência do vírus em gestantes localizadas na área metropolitana do Rio de Janeiro. Um total de 1204 grávidas foram testadas para infecção por HTLV-1/2, observando-se uma prevalência de 0,66%. O estudo também
demonstrou, assim como em estudos anteriores, um perfil de pacientes positivos onde a maioria é caucasiana (87,5%), não possui parceiro fixo (62,5%), com menos de 10 anos de educação formal (62,5%) e uma renda mensal familiar próximo de 600 dólares (87,5%).
Um estudo realizado por Uehara e colaboradores (2015) em Campo Grande no estado do Mato Grosso do Sul, verificou uma prevalência de 6,8% para infecção pelo HTLV-1 em população de imigrantes japoneses, valor acima da média registrada na região. No estudo, verificou-se uma frequência maior de soropositivos entre indivíduos maiores de 45 anos, mostrando assim a importância do diagnóstico precoce e aconselhamento.
Na Região Norte, o estado do Pará tem uma das maiores taxas de prevalência de HTLV no Brasil. Estudos atualizados, realizados na parte oriental da Amazônia brasileira, incluindo regiões indígenas, fazem parte dessa faixa de elevada prevalência. Ainda assim, essas regiões como as demais do país estão sujeitas a fatores externos, como taxa de migração, e comportamento de risco, como demonstrado em Magno Falcão e colaboradores em 2013, que verificaram uma prevalência de 4,7%, bem maior que a média nacional, em municípios fronteiriços a região da usina de Tucuruí.
Outro importante estudo do estado do Pará foi realizado por Glória e colaboradores em 2015, que traçou um perfil clínico-epidemiológico de pacientes já infectados pelo HTLV-1 na capital do estado (Belém). O perfil apresentado foi de maioria do sexo feminino (64,8%), havendo predomínio de indivíduos casados (47,8%) e a maioria procedente do município de Belém-PA. Em relação aos pacientes sintomáticos houve ocorrência de 51% de sintomas neurológicos, precedidos de 18% de queixas dermatológicas, 18% de queixas reumatológicas e 10% queixas autonômicas.
No estado do Amazonas um estudo testou especificamente a hipótese de uma maior prevalência de infecção pelo HTLV-1/2 em pacientes com alguma desordem dermatológica. Um parâmetro comparativo foi traçado com exames de triagem nestes pacientes (1091 pacientes) bem como em paralelo com 6865 doadores de sangue primários. A prevalência de HTLV-1/2 foi de 0,14% entre os doadores de sangue, ao passo que não houve ocorrência entre pacientes com desordens dermatológicas da capital, mostrando assim um padrão diferente do esperado para nossa região, além de salientar a necessidade de mais estudos que incluam outras faixas de grupos possivelmente mais endêmicos (Nascimento et al., 2014).
O HTLV-2 é endêmico a nível mundial principalmente entre usuários de drogas injetáveis em países como Estados Unidos, Europa e Sudeste Asiático, além de
particularmente apresentar cepas distintas desses usuários de drogas, infectando ameríndios do Norte ao Sul do continente bem como tribos de pigmeus na região Central da África. Os índices de infecção geralmente são baixos, ou até inconsistentes de certa forma , podendo abrangir de 1% a 40% em si tratando de regiões endêmicas ou comportamentos de risco ( Ishak et al., 2003).
No Brasil principalmente o HTLV-2 mostra uma distribuição geográfica desigual pelo continente se concentrando fortemente em regiões de populações indígenas em comunidades muitas vezes fechadas, dificultando muitas vezes a coleta de dados epidemiológicos (Vallinoto et al., 2002), apenas estudos como o de Shindo e colaboradores em 2002, ou de Alcântara e colaboradores em 2003, foram capazes de identificar a presença de pessoas infectadas com HTLV-2 a nível urbano ou em usuários de drogas no Brasil, sem contudo quantificar a incidência ou prevalência do mesmo.
2.6 Mecanismo de patogenicidade.
A maioria dos pacientes infectados pelo HTLV-1/2 apresentam curso assintomático ou oligossintomático por longos períodos, no entanto estudos apontam estes agentes retrovirais como etiologicamente responsáveis por algumas síndromes clínicas de natureza neoplásica maligna, inflamatória ou mesmo degenerativa além de complicações infecciosas (Verdonck et al., 2007).
Dentre os pacientes que não se tornam assintomáticos, uma pequena parcela de infectados desenvolvem algum tipo de doença correlata. Dependendo, por exemplo, de seu gênero ou etnia, aproximadamente 2-3% dos indivíduos podem desenvolver a LTA, enquanto que cerca de 0,25-5% podem desenvolver HAM/TSP (Hisada et al., 2004). Outras patologias associadas incluem uveite associada e dermatite infecciosa persistente (Cook et al., 2012).
Alguns parâmetros tornam-se preditivos em termos patológicos, como alta carga proviral, elevada linfoproliferação espontânea, altos títulos de anticorpos e linfócitos T CD8+ específicos para antígenos do HTLV-1 tanto no soro quanto no fluído cerebrospinal ( Hall et al., 2004).Estes parâmetros estão mais associados à presença de TSP/HAM, uveíte e com LLTA, se compararmos aos exibidos por portadores assintomáticos da infecção (Montanheiro et al., 2005). Contudo, uma vez que nenhum subtipo viral do HTLV-1 específico foi diretamente associado com alguma doença correlata e o hospedeiro apresenta
uma elevada resposta imune, a hipótese mais recorrente é que o sistema imune pode ser o fator determinante para o desenvolvimento das manifestações clínicas (Kannagi et al, 2011).
A infecção dos linfócitos T tanto pelo HTLV-1 quanto pelo HTLV-2 resulta inicialmente em um aumento da carga proviral, sendo maior observada no caso do HTLV-1 como visto na Figura 6 (Barbeau et al., 2013).Uma vez detectado pelo sistema imune, uma resposta de anticorpos é gerada contra os produtos do genes gag, env e tax é linfócitos TCD8 são ativados, induzindo assim a morte das células infectadas (Arnold et al., 2006). Contudo o HTLV-1 apresenta um modo de evadir da resposta imune, por meio da redução da expressão da TAX e ao estimular uma maior expressão da HBZ (Matsuoka & Greene et al., 2009). A proteína HBZ provoca o estabelecimento da cronicidade da infecção por meio da inibição do transcrito viral do gene tax , estimulando sua própria expressão e induzindo a proliferação das células T, como já descrito anteriormente (Ciminale et al., 2014). A APH-2 presente no HTLV-2 também age diminuindo a regulação do transcrito do gene tax , porém ela se mostra incapaz de induzir a proliferação celular como a HBZ, causando assim ao final apenas uma linfocitose proeminente (Cook et al., 2012;Barbeau et al., 2013).
Figura 6. Representação esquemática da HBZ no HTLV-1 para a APH-2 no HTLV-2. O HTLV-1 é
capaz de evadir a Resposta Imune do Hospedeiro através da diminuição da expressão da Tax e aumento da síntese da HBZ, enquanto o HTLV-2 atua por mecanismo similar contudo sendo incapaz de induzir a proliferação celular.Adaptado de Barbeau et al., 2013.
Uma vez que o DNA proviral é inserido de forma aleatória no genoma da célula hospedeira, o vírus permanece de forma latente por um período longo (de duas a três décadas).Contudo, ainda assim pode haver proliferação celular induzida por mecanismos virais direto ou indireto, via estímulo de citocinas como IFN-γ e TNF-α (Haddad et al., 2011). Neste processo, haverá então uma estimulação das próprias células infectadas (ou clone maligno) com consequente produção de novas células, replicação e multiplicação viral (Franchini et al., 2005).
2.7 Transmissão e Diagnóstico
A transmissão inicial do HTLV-1/2, ocorre principalmente por meio do contato célula - célula, seja por via vertical, sexual ou via exposição a soluções de continuidade. . Embora a transmissão sexual e vertical sejam constantemente relatadas como as mais frequentes, hemocomponentes contaminados é também considerado um importante veículo de transmissão do HTLV-1/2, principalmente entre usuários de drogas intravenosas (S.VanDooren et al., 2004; G.P. Taylor 2006; Nyborg et al., 2009;Gessain e Cassar et al., 2012).
Após o contato célula-célula, estudos como o de Nyborg e colaboradores em 2009, apontam para a replicação mitótica como a rota a ser tomada pelo vírus em sua fase de expansão no indivíduo infectado, sendo a transmissão proviral auxiliada por 4 fatores/mecanismos, que auxiliarão no estabelecimento da doença ( Nyborg et al., 2009):
1-A ausência (quase total) de partículas virais no meio extracelular; 2-Uma alta proporção de célula TCD4+ carregando o provírus integrado;
3-Baixa variação da sequência genética do provírus (papel que será mais proeminente desempenhado pela DNA polimerase do hospedeiro);
4- A ineficácia dos inibidores da transcriptase reversa em reduzir as cargas provirais.
Em termos de diagnóstico, a sorologia para o vírus se tornou obrigatória nos Hemocentros do Brasil a partir de 1993. Em bancos de sangue, amostras de soro devem ser submetidas à triagem para detecção de anticorpos específicos pelo teste imunoenzimático (ELISA), que apresenta em sua composição antígenos específicos do HTLV-1/2. Os antígenos mais comumente utilizados nos testes disponíveis no mercado são aqueles provenientes de lisados virais do HTLV-1/2. Como os vírus possuem grande homologia entre si, é necessário enriquecer os testes com antígenos recombinantes específicos de cada vírus (Viana, da Silva, Souza, Lopes, & Nascimento et al., 2015).
Para confirmação de diagnóstico, faz-se necessário a realização de testes moleculares como o da PCR (reação em cadeia da polimerase). O principal benefício deste método em relação aos testes sorológicos é não depender da soroconversão que leva algumas semanas para ocorrer, uma vez que detecta diretamente o material genético do mesmo (DNA proviral) poucos dias após a infecção (Morimoto et al., 2007).
2.8 Principais patologias associadas à infecção pelo HTLV-1/2
2.8.1 Doenças neurológicas
A principal doença neurológica associada ao vírus HTLV-1/2 é a chamada Paraparesia Espástica Tropical/Mielopatia associada ao HTLV (PET/MAH), a qual é classicamente descrita como uma mielopatia crônica com um início mais severo e uma progressão lenta ao passar dos anos (Lima et al., 2007).O primeiro estudo Nacional sobre o HAM/TSP foi de Araújo e colaboradores em 1996, que conclui que a patologia é mais prevalente em pacientes do sexo feminino e caucasianas, tendo importantes fatores de risco como a promiscuidade sexual e pacientes politransfundidos.
Os pacientes portadores da PET/MAH tendem a se queixar de sintomas como, fraqueza nos membros inferiores, incontinência urinária ou emergência, perda do tato e de sinais sensoriais como sensação de vibração ( Alvarez et al., 2015). Alguns pacientes podem ainda se queixar de dores lombares com irradiação para os membros inferiores, semelhantes a doenças reumáticas, essas dores podem ser de certa forma estigmatizantes para o paciente, de forma a incapacitar o modo de vida do mesmo (Castro-Costa et al., 2006)
Existem diversas teorias relacionando o vírus HTLV-1/2 com o desenvolvimento da PET/MAH, dentre elas, a mais notável é a de que o vírus age por meio de um processo inflamatório citotóxico e desmielinizante, de natureza crônica (Araújo, Leite, Lima, & Silva et al., 2009).Os linfócitos são ativados durante a PET/MAH ao atravessar a barreira Hemato-Encefálica, logo o processo se inicia no Sistema Nervoso Central resultando em lesões permanentes, principalmente nas bainha de Mielina e nas Células da Glia (Cooper et al., 2009).Outra importante teoria está relacionada ao mecanismo citotóxico direto, onde os linfócitos T CD8+ citotóxicos infectados pelo vírus atravessa a barreira Hemato-Encefálica e destrói diretamente as células da glia infectadas via citotoxicidade ou produção de citocinas (Matsura et al., 2010). Por último outra teoria sugere a presença de mecanismos autoimunes na progressão e no aparecimento de microlesões crônicas no Sistema Nervoso Central por meio de processos inflamatórios (Quaresma et al., 2016).
O HTLV-2 foi associado com o desenvolvimento de algumas manifestações clínica e neuropatias sensoriais bastante similares ao HAM/TSP em alguns estudos ( Hall et al., 2004; Biswas et al., 2009), sendo todos os casos documentados até meados de 2014 desses distúrbios neurológicos generalizados, todos associados com o HTLV-2a ( Jacobson et al., 1993 ; Araújo & Hall et al., 2004). Sendo o estudo de Rosadas e colaboradores em 2014, reportando um paciente diagnosticado com infecção pelo HTLV-2b tendo desenvolvido e sendo relatado como o primeiro caso de doença semelhante a HAM/TSP associada a está cepa do vírus específica.
2.8.2 Doenças Hematológicas versus infecção pelo HTLV-1/2
Como já mencionado anteriormente, a probabilidade do paciente portador de HTLV-1 desenvolver a LTA é de aproximadamente de 3 a 5%. Não se pode atribuir o risco de desenvolvimento da doença a variáveis independentes, contudo algumas variáveis como a carga proviral, já mostraram um bom prospecto no caso de premeditar o aparecimento da doença. A carga proviral é significantemente maior em pacientes com LTA do tipo aguda ou crônica, do que em pacientes com HAM-TSP ou LTA do tipo linfoma (Iwanaga et al., 2010).
Indivíduos infectados com o HTLV-1 após a adolescência, ou seja, excluindo-se a transmissão vertical, são considerados como tendo baixo risco de desenvolver a LTA, sendo assim a transmissão de mãe para filho é talvez o mais importante fator de risco
diretamente associado a uma pré-disposição em apresentar um caso de LTA subsequente (Moriuchi et al., 2013).
Os achados clínicos mais frequentes em pacientes com LTA são: linfoadenopatia generalizada, lesões na pele, hepatoesplenomegalia, leucocitose apresentando núcleos em formato de flor (sinal patognomônico da doença), atipia de neutrófilos, hipercalcemia (importante no prognóstico) e frequente acometimento e complicações com infecções oportunistas como Candida albicans, Citomegalovírus e Strongiloidíase (Ishitsuka et al., 2014).
Duas proteínas do genoma viral são importantes, quando se tratam de vias oncogênicas do vírus, as proteínas TAX e a HBZ. A TAX desenvolve um importante papel nas fases iniciais da oncogênese, tendo em vista sua capacidade de imortalizar células in
vitro (Matsuoka & Greene et al., 2009). Contudo apesar de já está claro a necessidade da
TAX na patogenia da doença, um estudo mostrou que a proteína não pôde ser detectada em células recentes de LTA de pacientes infectados, sugerindo uma possível acumulação de mutações ''non-sense'', inserções e deleções ocorrendo no gene tax, além de metilação do DNA do provírus causando silenciamento ou até deleção da LTR 5', mostrando assim que a TAX não é imprescindível na manutenção da doença em fases mais avançadas da oncogênese (Matsuoka et al., 2007).
Em contrapartida a proteína HBZ como já descrito, pode está diretamente ligada à manutenção da LTA, sendo expressa na totalidade em pacientes em estágio avançado. Um estudo in vitro mostrou que a supressão da transcrição do gene HBZ acaba por inibir a proliferação de células de LTA, enquanto a expressão do mesmo gene promove a proliferação das células cancerígenas. A HBZ inibe seletivamente a via clássica do NF-kB sem inibir a via alternativa do mesmo fator, além de induzir a expressão do FOXP3, proteína presente nas células T naive induzido a um fenótipo Treg, sendo um dos principais fenótipos ligado à células de LTA (Satou et al., 2006;Zhao et al., 2011;Yamagishi et al., 2012).
Além da patologia hematológica clássica LLTA, existem relatos sobre a ocorrência de outras doenças hematológicas possivelmente associadas à infecção por HTLV-1/2. Matsuhita e colaboradores, estudaram a presença do HTLV-1 em pacientes portadores de Púrpura Trombocitopênica Idiopática (PTI). No estudo realizado em 2005, a prevalência de pacientes com PTI infectados pelo HTLV-1 foi de 22,1%, ou seja, uma frequência maior do que a prevalência média entre a população geral japonesa, a qual varia entre 5 a 10%, uma das maiores do mundo. Agregando a esta descoberta, o mesmo estudo mostrou ainda a
associação da infecção pelo HTLV-1 nesses pacientes com a dificuldade de resposta completa (RC) ao tratamento padrão com prednisona, causando assim uma resposta parcial (RP) e consequentemente ausência de controle da doença.
Já em 2007 um estudo de caso, realizado por Okada e colaboradores, apresentou um paciente idoso do sexo feminino de idade de 62 anos, acometido por púrpura acentuada com lesões proeminentes nas pernas. Após uma biópsia realizada nos tecidos referentes a lesão púrpura revelou-se infiltrações de linfócitos atípicos na derme papilar e extravasamento de eritrócitos na epiderme, apresentando ainda anticorpos séricos contra vírus HTLV-1. Testes adicionais diagnosticaram a patologia como leucemia de células T do adulto, com lesões púrpuras subsequentes específicas para LLTA.
Também em 2007, Inoue e colaboradores, conduziu um estudo em pacientes com Síndrome Mielodisplásica (MDS), Anemia Refratória com Excesso de Blastos (RAEB) e Leucemia Mielóide Aguda/Leucemia Promielóide Aguda. Os resultados apontaram para uma alta prevalência (28,3%) de HTLV-1 entre os pacientes com MDS e RAEB, e uma correlação mais específica entre o vírus e o desenvolvimento de Leucemia Promielóide Aguda (APL). Como citado nos estudos anteriores a associação da baixa contagem plaquetária e a presença do vírus, também nesse estudo foram responsáveis pela diminuição da sobrevida dos pacientes nos três grupos de patologias estudadas (Inoue et al., 2007).
Outro estudo realizado no Irã por Keshvari e colaboradores em 2014, mostrou a importância de realizar testes de triagem sorológicas nas instituições de Banco de Sangue, principalmente em países onde o HTLV mostrou-se emergente. Neste estudo conduzido a partir da pesquisa do vírus em pacientes Talassêmicos, os quais naturalmente recebem uma maior quantidade de bolsas de sangue ao longo do ano, apresentou uma soroprevalência (11,3%) desproporcional ao resto do país (1,6%).
Mesmo com o advento da triagem do vírus de forma fixa em bancos de Sangue no Brasil, e mais especificamente em Manaus, muitos pacientes hematológicos atendidos na instituição HEMOAM, necessitam ter o controle e o conhecimento maior em relação a uma possível contaminação por transfusão, principalmente pacientes politransfundidos portadores de alguma doença hematológica. Também, são necessários estudos que até mesmo avalie uma possível associação entre a doença hematológica e a presença do vírus HTLV-1/2.
Estudos como estes já citados, onde foram realizadas triagens em Bancos de Sangue (Inoue et al., 2007; Keshvari et al., 2014) , mostram a importância de realizar estudos
epidemiológicos de cunho sócio-científico para avaliar a prevalência da infecção por HTLV-1/2 em pacientes com doenças hematológicas e a possível relação dessas infecções via disseminação por transfusão sanguínea, no sentido de promover a saúde desses pacientes e contribuir com a vigilância epidemiológica desses vírus em nossa região, visto que trata-se de uma infecção emergente no mundo inteiro, tendo o Brasil como possivelmente o país com o maior número de casos absolutos ( Proietti et al., 2005; Gessain & Cassar et al., 2012).
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Estimar a prevalência e caracterizar molecularmente a infeção pelo HLTV-1/2 em pacientes com doenças hematológicas atendidos no HEMOAM.
3.2 Específicos
- Estimar a soroprevalência do HTLV-1/2 em pacientes com doenças hematológicas. - Identificar os subtipos do HTLV-1/2 circulantes na população estudada;
- Propor possíveis rotas de disseminação do HTLV-1/2 na região Amazônica ocidental, por meio de análises filogenéticas dos subtipos virais encontrados na população investigada;
- Identificar as possíveis características sócio-demográficas dos indivíduos estudados, que possam estar relacionadas a susceptibilidade à infecção pelo HLTV-1/2
4. METODOLOGIA
4.1 Aspectos éticos
O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa em Seres Humanos do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA, CAA: 40866215.4.0000.0006) de acordo com o que determina a resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde, a qual preconiza as diretrizes e Normas Regulamentares da Pesquisa Envolvendo Seres Humanos.
4.2 Caracterização da População Investigada
As amostras utilizadas no presente estudo, foram obtidas a partir de pacientes atendidos na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM), entre um período de abril de 2015 a Dezembro de 2016. Pacientes que estivessem realizando um retorno médico ao hematologista da instituição, com suspeita ou já diagnosticado com algum tipo de desordem do tipo hematológica, foi submetido a um inquérito epidemiológico para coleta de dados sobre a doença hematológica, dados demográficos e sobre comportamento de risco relacionados à susceptibilidade à infecções sexualmente transmissíveis (IST). Os pacientes que concordaram em participar da pesquisa foram convidados a assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), podendo o mesmo tendo sido assinado pelo próprio ( maior de 18 anos) ou pelo responsável legal. Quando o paciente era menor de idade, o mesmo foi convidado a assinar o termo de assentimento, conforme preconiza as diretrizes estabelecidas pela regulação 466/2012. Foram selecionados indivíduos de ambos os sexos, crianças e adultos, de diferentes idades e etnia.
O tamanho amostral foi calculado utilizando a ferramenta online OpenEpi (www.openepi.com) considerando um intervalo de confiança de 95%.Foram coletadas 310 amostras sanguíneas de pacientes com diferentes desordens hematológicas. Todos os pacientes tiveram acesso à informação sobre o objetivo da pesquisa bem como esclarecimento e demais explicações sobre o teor das diversas perguntas do inquérito epidemiológico. Foi dada a opção também do entrevistado de participar, ou recusar
