FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA . DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
Dissertação de Mestrado
EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS ENZIMAS
XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE
DE Candida guilliermondii
Luanne Helena Augusto Lima
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LORENA - SP - BRASIL
2002
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS ENZIMAS
XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE
DE Candida guilliermondii
Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial
Banca examinadora:
Ora. Maria das Graças de Almeida Felipe (presidente) Dr. Michele Vitelo
Ora. Adriane Maria Ferreira Milagres
Estudante:
Luanne Helena Augusto Lima
Lorena - SP - Brasil
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS ENZIMAS
XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE
DE Candida guilliermondii
Este exemplar corresponde à versão
final da Dissertação de Mestrado aprovada pela banca examinadora.
Dra. Maria dar:l:!!!:e Almeida Felipe
Presidente da Banca Examinadora
Lorena - SP - Brasil
Agradeço primeiramente a Profa. Ora. Maria das Graças de Almeida Felipe pela amizade e pela confiança, além da paciência e dedicação com que
me orientou durante todo o mestrado.
À mamãe pelo incomensurável apoio em todo e qualquer momento e a toda a minha família pelo incentivo sempre necessário.
Ao Christian Niel Berlinck pelos novos horizontes, pelos momentos de
escape e pelo apoio logístico na finalização deste trabalho.
Aos amigos do laboratório, principalmente Gilvane, Talita. Ely, Dani, Zéa e aos "companeros" por compartilhar conhecimento, equipamentos, micropipetas e por tornar a rotina mais agradável.
Ao Eduardo Gomes Gonçalves pelo incentivo, principalmente nos
momentos decisivos.
Às parceiras de república: Priscila, pela mão estendida na hora certa e
pela catálise de diversas amizades e Karlia, pelas várias gargalhadas e por ter me mostrado que a FAENQUIL fica muito mais perto do que eu imaginava.
Aos técnicos do DEBIQ, principalmente a Rita, Paulinho, Nica e Zé
Cobrinha pelo auxílio e pela amizade.
Aos meus amigos de Brasília, que mesmo longe fisicamente sempre estiveram presentes.
Às leveduras que se ofereceram em sacrifício para que este trabalho pudesse ser realizado.
Efeito do Ácido Acético nas Enzimas Xilose Redutase e Xilitol Desidrogenase
de Candida guilliermondii. Luanne Helena Augusto Lima. Dissertação de
Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial.
Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Q~::r.:ca de Lorena.
Orientadora: Maria das Graças de Almeida Felipe (Departamento de
Biotecnologia, FAENQUIL, C.P.116, 12600-970, Lorena, SP, Brasil). Banca
Examinadora: Dr. Michele Vitolo e Ora. Adriane Maria Ferreira Milagres. Abril
de 2002.
O xilitol é um produto de grande interesse econormco pelas suas
características como poder adoçante, anticariogenicidade e metabolismo
independente de insulina. Estas características são exploradas na formulação de produtos alimentícios, odontológicos e farmacêuticos, sendo a utilização de
xilitol também permitida para pessoas diabéticas, obesas ou com anemia
hemolítica. A etapa inicial do metabolismo de xilose é a formação de xilitol a partir da redução de xilose, catalisada pela enzima xilose redutase
(EC 1.1.1.21) na presença de cofatores reduzidos NADPH e/ou NADH. A
seguir o xilitol é oxidado a xilulose pela enzima xilitol desidrogenase
(EC 1.1.1.9), com participação de NADP+ e/ou NAD+. Assim como na via
química, os materiais lignocelulósicos constituem a matéria-prima para a
obtenção de xilitol pela via biotecnológica. O bagaço de cana de açúcar
consiste em um resíduo promissor para este bioprocesso, apesar de ser
utilizado para geração de energia nas próprias usinas. Embora, o hidrolisado
de bagaço apresente elevado teor de xilose, ele também possui compostos tóxicos resultantes da hidrólise ácida da estrutura lignocelulósica. Dentre estes
compostos, o ácido acético destaca-se pelo seu efeito inibitório na fermentação
e na produtividade em xilitol. Desta forma. o objetivo deste projeto foi avaliar o
efeito deste ácido nas atividades das enzimas intracelulares xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) e consequentemente na formação de xilitol. Para a realização deste estudo, empregou-se Candida guil/iermondii cultivada em meio elaborado à base de hidrolisado ácido de bagaço de cana
concentrado e tratado, acrescido de ácido acético em concentrações
superiores à inibitória (3,0 g/L). Experimentos também foram realizados em meio sintético contendo os mesmos teores de açúcares do hidrolisado. Para o estudo do efeito na atividade das enzimas, acetato de sódio foi utilizado no ensaio enzimático em diferentes concentrações. Observou-se que os valores de atividade específica para XR e XDH obtidas de células cultivadas no hidrolisado foram menores que em meio sintético, evidenciando que o efeito tóxico do ácido acético na expressão das enzimas foi potencializado pelos outros compostos presentes no hidrolisado. Foi observado aumento na atividade específica das enzimas (58% e 60%, para XR e XDH respectivamente), com o aumento da concentração de acetato de sódio no
ensaio, sugerindo que o ácido acético presente no meio de cultura pode
aumentar a atividade destas enzimas. Não houve aumento de produtividade do xilitol durante as fermentações do meio com ácido acético, porque embora a formação de xilitol tenha sido favorecida pelo aumento da atividade de XR, seu
consumo também foi aumentado por causa da atividade de XDH.
Effect of the acetic acid on the enzymes xylose reductase and xylitol dehydrogenase of Candida guilliermondii
Xylitol is a produr+ of great economic interest due !:- its characteristics,
such as sweetening power, anticariogenicity and insulin-independent
metabolism. These qualities have been exploited in the production of foodstuffs,
odontological products and pharmaceuticals. Besides, xylitol can be ingested by
people with diabetes, obesity and hemolytic anemia. This sweetener is
commercialy produced by chemical process, but it can also be obtained
biotecnologically. ln the biotecnological process, the initial stage of the xylose
metabolism is the formation of xylitol from the reduction of xylose catalyzed by
the xylose reductase enzyme (EC 1.1.1.21) when the reduced cofactors NADH
are present. Next, xylitol is oxidized to xylulose by the xylitol dehydrogenase
enzyme (EC 1.1.1.9), with the participation of NADP+ and/or NAD+. Like the
chemical path, the biotechnological process also utilizes lignocellulosics, not
only because they have high contents of xylan, which can be hydrolysed to xylose, but also because they are low-cost renewable resources. A good
example of lignocellulosic materiais is sugar cane bagasse. ln general bagasse
is utilized to produce electrical power for the mill itself. Another good use however, would be the generation of a product of high aggregate value, like xylitol. Although bagasse hydrolysate has a high xylose content, it also has toxic
compounds coming from acid hydrolysis of the lignocellulosic structure. One of
such compounds is acetic acid, which inhibitis fermentation, reducing the xylitol
productivity as a consequence. The aim of this project was to evaluate the
effects of this acid on the activities of xylose reductase (XR) and xylitol dehidrogenase (XDH) enzymes and therefore on xylitol formation. ln this study Candida guilliermondii yeast was used for fermentation of concentrated and treated hydrolysate medium with acetic acid concentration considered as
inhibitory (higher than 3.0 g/1). Experiments were also performed with syntetic
medium containing the sarne amounts of sugar as the hydrolysate. To study the
effect of the acid on the enzyme activity, sodium acetate was used at different concentrations. The XR and XDH specific activities in the hydrolysate were
lower than in the synthetic medium, which provided the evidence that the toxic
effect of the acetic acid on these enzyme was potentiated by the other compounds found in the hydrolysate. lncreases in the XR and XDH specific activities (58% and 60% respectively) were observed together with an increase
in sodium acetate in the reaction medium, suggesting that the acetic acid
present in the culture medium enhanced the activities of these enzymes. No
xylitol productivity increase was observed during the fermentation of medium
containing acetic acid, because although the xylitol formation was favored by the enhancement of XR activity, the xylitol consumption also íncreased as a result of the XDH activity.
RESUMO ... asTRAcr LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS iv V viii X 1. INTRODUÇÃO 1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3 2.1 Xilitol 2.1.1 Propriedades e Aplicações 2.1.2 Tolerância e Toxicidade 3 3 5 2.2 Obtenção de Xilitol 6
2.3 Bioconversão de Xilose em Xilitol 2.3.1 Aspectos Bioquímicos
2.3.2 Fatores que influenciam o metabolismo
8 8 10 2.4 Matéria-Prima
2.4.1 Bagaço de Cana de Açúcar 15 16
2.5 Efeito Tóxico dos Hidrolisados Hemicelulósicos
2.5.1 Efeito do Ácido Acético 17 19
3. OBJETIVOS 22
3.1 Geral 22
3.2 Específicos 22
4. MATERIAL E MÉTODOS 23
4.1 Microrganismo e Preparo do lnóculo 23
4.2 Preparo do Hidrolisado de Bagaço de Cana de Açúcar 23
4.3 Concentração e Tratamento 24
4.4 Meios e Condições de Fermentação 24
4.5 Métodos Analíticos
4.5.1 Viabilidade e Pureza da Cultura
4.5.2 Determinação da Concentração Celular 4.5.3 Determinação de pH
4.5.4 Determinação da Concentração de Açúcares e Ácido Acético 4.5.5 Determinação da Concentração de Furfural e Hidroximetilfuriural 4.5.6 Determinação da Concentração de Fenóis
25 25 26 26 26 26 27 vi
4.7 Determinação de Proteína Solúvel 28
4.8 Medida das Atividades Enzimáticas 28
4.9 Efeito do Acetato de Sódio nas Atividades Enzimáticas 29 4.10 Determinação dos Parâmetros Fermentativos 29
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 31
5.1 Efeito do Ácido Acético na Fermentação em Meio Sintético 31 5.1.1 Efeito do Ácido Acético no Consumo de Açúcares 31 5.1.2 Consumo de Ácido Acético Durante a Fermentação 34 5.1.3 Formação de Células na Presença de Ácido Acético 37 5.1.4 Efeito do Ácido Acético na Formação de Xilitol 38 5.1.5 Efeito do Ácido Acético nas Enzimas Xilose Redutase e Xilitol Desidrogenase 40 5.2 Efeito do Ácido Acético na Fermentação em Hidrolisado 42
5.2.1 Caracterização do Hidrolisado 42
5.2.2 Efeito do Ácido Acético no Consumo de Açúcares 44 5.2.3 Consumo de Ácido Acético Durante a Fermentação 46 5.2.4 Formação de Células na Presença de Ácido Acético 48
5.2.5 Efeito do Ácido Acético na Formação de Xilitol 49
5.2.6 Efeito do Ácido Acético nas Enzimas Xilose Redutase e Xilitol Desidrogenase 50 5.3 Efeito do Acetato de Sódio na Atividade das Enzimas Xilose Redutase e Xilitol
Desidrogenase 52
6. CONCLUSÕES 54
7. RECOMENDAÇÕES 55
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56
TABELA 1 - Leveduras identificadas como produtoras de xilitol a partir de
xilose 7
TABELA li - Características dos meios de cultura após a adição de ácido
acético 30
TABELA li 1 - Concentrações de arabinose durante cultivo de C. guilliermondii
em meio sintético contendo ácido acético em diferentes
concentrações 32
TABELA IV - Ácido acético consumido durante cultivo de C. guilliermondii em
meio sintético contendo diferentes concentrações de ácido acético 33
TABELA V - Valores de pH durante cultivo de C. guilliermondii em meio
sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações 35
TABELA VI - Concentrações celulares de C. guil/iermondii durante as
fermentações em meio sintético contendo ácido acético em diferentes
concentrações 36
TABELA VII - Proporções de células inviáveis durante cultivo de
C. guilliermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes
concentrações 37
TABELA VIII - Produtividade (Op), rendimento (Yp1s) e eficiência de conversão
(ri) de xilitol após 58 horas de cultivo de C. guilliermondii em meio
sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações 39
TABELA IX - Atividades específicas de xilose redutase durante cultivo de
C. guilliermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes
concentrações 39
TABELA X - Atividades específicas de xilitol desidrogenase durante cultivo de
C. guilliermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes
concentrações 40
TABELA XI - Características do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana
de açúcar original, após a concentração e depois do
tratamento 41
TABELA XI 1 - Características dos meios de cultura preparados com hidrolisado
contendo ácido acético em diferentes concentrações .42
em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana, contendo ácido acético em diferentes concentrações 44
TABELA XIV - Ácido acético consumido durante cultivo de C. guilliermondii em
meio formulado él partir de hidrolisado hera .icelulósico de bagaço de cana,
contendo diferentes concentrações de ácido acético .45
TABELA XV - Valores de pH durante cultivo de C. guilliermondii em meio
formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana,
contendo ácido acético em diferentes concentrações .46
TABELA XVI - Concentrações celulares de C. guilliermondii durante as
fermentações em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana, contendo ácido acético em diferentes
concentrações 47
TABELA XVII - Proporções de células inviáveis durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico
de bagaço de cana, contendo ácido acético em diferentes
concentrações 48
TABELA XVIII - Produtividade (Qp), rendimento (Ypts) e eficiência de conversão
(11) de xilitol após 58 horas de cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana,
contendo diferentes concentrações de ácido acético .49
TABELA XIX - Atividades específicas de xilose redutase durante cultivo de C. guil/iermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico
de bagaço de cana, contendo diferentes concentrações de ácido
acético 50
TABELA XX - Atividades específicas de xilitol desidrogenase durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. contendo diferentes concentrações de ácido
acético 50
FIGURA 1 - Esquema do metabolismo de xilose e regeneração de
cofatores 9
FIGURA 2 - Formação de hidroximet.furfural ~LfMF) e furfural a partir da
desidratação de hexoses e pentases respectivamente 18
FIGURA 3 - Mecanismo de acidificação do citoplasma pela forma não dissociada do ácido acético e transporte de prótons através da membrana
pela enzima H+ -A TPase 20
FIGURA 4 - Concentrações de xilose durante cultivo de C. guilliermondíí em
meio sintético simulando a constituição de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético
(A- 5 g/L; 8- 6 g/L; C - 8 g/L; D - 10 g/L) 31
FIGURA 5 - Concentrações de ácido acético durante cultivo de C. guil/iermondii
em meio sintético simulando a constituição de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético
(A - 5 g/L; B - 6 g/L; C - 8 g/L; D - 1 O g/L) 34
FIGURA 6 - Proposta de metabolismo de acetato pela formação de
Acetil-CoA 36
FIGURA 7 - Concentrações de xilitol durante durante cultivo de C. guilliermondii
em meio sintético simulando a constituição de hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético
(A - 5 g/L; B - 6 g/L; C - 8 g/L; D - 1 O g/L) 38
FIGURA 8 - Concentrações de xilose durante cultivo de C. guillíermondii em
meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético (A - 3 g/L; B - 4 g/L;
C - 6 g/L; D - 8 g/L) 43
FIGURA 9 - Concentrações de ácido acético durante cultivo de C. guil/iermondii
em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana, com diferentes concentrações de ácido acético (A - 3 g/L;
B - 4 g/L; C - 6 g/L; D - 8 g/L) .46
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes
concentrações de ácido acético (A - 3 g/L; B - 4 g/L; C - 6 g/L;
D- 8 g/L) 48
FICURA 11 - Atividade específica de xilose redutase por concentração de
acetato de sódio no meio de reação 51
FIGURA 12 - Atividade específica de xilitol desidrogenase por concentração de
acetato de sódio no meio de reação 52
Xilitol é um poliol com propriedades adoçante e anticariogênica, que pode ser utilizado em substituição à sacarose por pessoas diabéticas, obesas
ou com anerr= hemolítica. Além diste o xilitol possui diversas aplicações
clínicas, como prevenção de otite média aguda, proteção contra osteoporose e
prevenção de infecção pulmonar. Este já é empregado em vários países,
inclusive no Brasil, como insumo de produtos como pastilhas, creme dental e
gomas de mascar, porém o seu uso é limitado pelo seu elevado custo.
O xilitol é comercialmente produzido a partir da catálise química da
xilose, obtida de resíduos lignocelulósicos ricos em xilana. Este processo
possui a desvantagem de requerer várias etapas de purificação para a
obtenção de uma solução inicial de xilose de elevada pureza, visto que a
presença de impurezas, como resíduos de lignina, interfere na etapa de redução catalítica. É ainda necessário purificar o produto para remoção de resíduos tóxicos do catalisador e de subprodutos gerados.
Pesquisas vêm sendo desenvolvidas para se estabelecer um processo biotecnológico alternativo à produção convencional de xilitol. Pesquisadores do Grupo de Processos Fermentativos do Departamento de Biotecnologia (DEBIQ) da Faculdade de Engenharia Química de Lorena (FAENQUIL), vem há anos trabalhando para obtenção de xilitol a partir de microrganismos fermentadores da xilose obtida por hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos.
Estes materiais constituem recursos renováveis, e são representados pelos
resíduos agroindustriais, como bagaço de cana de açúcar, palha de arroz e
palha de trigo. Neste sentido, espera-se que, além da redução do custo de
produção do xilitol, o processo microbiológico possa contribuir para a
diminuição do impacto ambiental causado por estes resíduos.
Os trabalhos buscam estabelecer condições ideais para este
bioprocesso, como a hidrólise da fração hemicelulósica da biomassa, o
tratamento do hidrolisado, a suplementação nutricional e as condições ótimas de fermentação para a levedura Candida gui/Jiermondii FTI 20037, uma das
espécies selecionadas mais promissoras para esta bioconversão. Tem sido
também avaliados aspectos quanto à via metabólica envolvida na conversão de xilose em xilitol, a partir do estudo do comportamento das enzimas
intracelulares xilose redutase e xilitol desidrogenase responsáveis pelos passos iniciais desta via metabólica.
As pesquisas têm evidenciado que apesar do tratamento prévio dos hidrolisados para a redução da concentração de compostos tóxicos oriundos da
hidrólise .;c;Ja como o ácido acético, este ai, ida permanece no meio em
concentrações consideradas inibitórias à conversão de xilose em xilitol. Dados obtidos de fermentação em meio sintético revelaram que na presença deste ácido em concentrações superiores a 3,0 g/L, ocorreu redução na
produtividade do xilitol, enquanto 1,0 g/L deste favoreceu sua formação. No
entanto, na concentração presente nos hidrolisados concentrados e tratados (- 4 g/L) o seu efeito tóxico é potencializado pela presença de outros
compostos tóxicos à célula como furfural, hidroximetilfurfural e fenóis.
A fim de contribuir para o estabelecimento de uma biotecnologia de
produção de xilitol a partir de bagaço de cana de açúcar, este trabalho teve
como principal objetivo estudar o efeito do ácido acético nas atividades das
enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase de C. guillierrnondii cultivada
tanto em meio sintético contendo xilose como principal fonte de carbono, quanto em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 XILITOL
2.1.1 PROPRIEDADES E APLICAÇÕES
O xilitol é um poliol edulcorante com fórmula empírica CsH120s, que
ocorre na natureza em diversos vegetais, líquens e algas, aparecendo também como um intermediário no metabolismo de carboidratos em animais (PEPPER
& OLINGER, 1988; WINKELHAUSEN et ai., 1996).
O poder adoçante do xilitol é comparável ao da sacarose e superior ao de outros polióis como manitol e sorbitol. Possui um terço a menos de calorias que a sacarose, ou seja 2,4 calorias por grama (BAR, 1991). Devido à doçura e ao baixo valor calórico, o xilitol vem sendo utilizado como adoçante desde os anos 60, o que, além de outras características que serão apresentadas a seguir, proporciona aumento no seu valor econômico.
O xilitol tem a propriedade cariostática por não ser metabolizado por microrganismos da microbiota bucal, principalmente Streptococcus mutans, o que impossibilita a proliferação de bactérias e conseqüentemente impede produção de ácidos que atacam o esmalte dos dentes. Além disto, também
pode ser classificado como anticariogênico, por promover a estimulação da
produção de saliva que possui capacidade tamponante, que juntamente com o
aumento na concentração de íons cálcio e fosfato, induz a remineralização,
revertendo lesões de cáries recém formadas (BIRKHED, 1994; MAKINEN et
ai., 1998). Estudos demonstraram que o consumo diário de chicletes contendo
xilitol por crianças de 1 O anos reduziu em 53,5% a incidência de cáries
(ALANEN et ai., 2000). Os efeitos cariostático e anticariogênico impulsionam o
uso de xilitol em cremes dentais, pastilhas, gomas de mascar e outros produtos
para controle e prevenção às cáries.
O xilitol é apropriado para o uso em produtos alimentícios processados em temperaturas elevadas, quando reações de Maillard não são desejadas. Estas reações podem ocorrer quando proteínas são aquecidas na presença de
açúcares redutores, resultando na glicosilação do aminoácido terminal ou de
cetônicos em sua molécula. não participa destas reações de escurecimento,
sendo esta mais uma característica que o torna potencialmente aplicável na
indústria alimentícia (MANZ et ai., 1973; BAR 1991).
Outra vantagem do xilitol é não ser fermentado por muitos microrganismos, permitindo d.,;:,,m seu uso em xaropes e refrescos sem a
necessidade de pasteurização e da adição de conservantes, quando o produto
é estocado por 4 ou 5 meses em frascos fechados (MANZ et ai., 1973).
A sensação de vaporização nas cavidades oral e nasal é outra característica importante do xilitol. Esta sensação é proporcionada pelo valor negativo do calor de dissolução e é explorada em produtos farmacêuticos
(vitaminas e expectorantes), confeitos (pastilhas e balas), sendo este
usualmente combinado a manitol, sorbitol ou ácido cítrico, nestes produtos
(PARAJÓ et ai., 1998a).
Em alguns países europeus o xilitol já vem sendo utilizado como
adoçante, tendo a vantagem de não apresentar sensação desagradável após o
uso (EMODI, 1978). No Brasil sua utilização se limita à composição de
produtos como creme dental, gomas de mascar e pastilhas.
Clinicamente, o xilitol é indicado para obesos por ser menos calórico e
diminuir o nível de ácidos graxos livres no sangue (MANZ et ai., 1973). Pode
ser empregado no tratamento de desordens metabólicas, como em casos de anemia hemolítica que ocorre em indivíduos com deficiência na enzima glicose-
6-fosfato desidrogenase (van EYS et ai., 1974). É também indicado para
consumo por diabéticos em substituição a outros. açúcares, uma vez que seu
metabolismo não ocorre por vias insulino-dependentes (PEPPER & OLINGER,
1988).
A utilização de xilitol também em nutrição parenteral vem sendo amplamente aceita no Japão e em alguns países da Europa. Estudos mostraram que a administração hipocalórica de xilitol juntamente com aminoácidos preserva as proteínas do paciente mais eficientemente que a infusão apenas de aminoácidos ou em combinação com glicose (WAITZBERG,
1995).
Novas descobertas tem sido feitas quanto às aplicações do xilitol,
principalmente em uso clínico. Foi demonstrado que o xilitol pode ser utilizado
espécies de Pneumococcus e a adesão de Haemophilus influenzae em células da nasofaringe. O xilitol foi testado na forma de xarope, de goma de mascar e
de pastilha; diminuindo em 40% a ocorrência de otite em crianças (UHARI et
ai., 1998). Outra aplicação do xilitol é a proteção contra osteoporose, uma vez
que ratos submetidos a ova: iéctemia, em uma dieta suplementada com 10% de xilitol, apresentaram maior densidade óssea, além de manter a constituição mineral dos ossos. Estes resultados protegem contra a perda das propriedades . biomecânicas dos ossos, causada pela osteopenia (redução da calcificação ou da densidade óssea) devido à falta de estrógenos, situação similar a que acontece na menopausa em mulheres (MA TIILA et ai., 1998). Além disto, o
xilitol em aerossol pode também prevenir infecções pulmonares, inclusive em
pacientes com fibrose cística. Ele reduz a concentração salina do líquido que cobre as células do revestimento interno dos pulmões, aumentando a atividade antibiótica corpórea natural contra as bactérias (ZABNER et ai., 2000).
2.1.2 TOLERÂNCIA E TOXICIDADE
Em organismos superiores o metabolismo do xilitol ocorre principalmente no fígado, onde pode ser transformado em glicose a uma taxa entre 20 e 80%,
dependendo da necessidade. Sua absorção é lenta e portanto também pode
ser metabolizado indiretamente pela biata intestinal. Além disto é bem tolerado pelo corpo humano em uma dieta contendo acima de 200g por dia (ALAIS & LINDEN, 1991), e em alguns casos pode apresentar efeito laxativo devido ao desbalanço osmótico causado no intestino grosso.
Quanto à segurança do consumo e utilização por humanos, o xilitol já é aceito pela European Economic Community - EEC desde 1984, enquanto a U.S. Food and Drug Administration - FDA o classifica como "geralmente reconhecido como seguro" ( General/y Recognise as Safe - GRAS) desde 1986 e "seguro para os dentes" (Safe for Teeth) desde 1994. A Joint Expert Comittee on Food Additives (JECFA), uma divisão prestigiada da Word Health Organization confirmou os estudos de toxicidade de xilitol e o classificou como
aceitável para consumo diário (Acceptable Daily lntake - ADI). Atualmente, o
xilitol já é utilizado em produtos alimentícios, farmacêuticos ou de saúde oral em mais de 35 países (CCC - Calorie Control Council, 2001 ). No Brasil, o xilitol
foi aprovado como produto dietético pelo Ministério da Saúde em 1980
(AGUIAR et ai., 1999).
2.2 OBTENÇÃO DE XILITOL
O xilitol pode ser recuperado de fontes naturais como vegetais, fungos e
líquens por extração sólido-líquido, porém como ele está presente em pequena
proporção - menos de 900mg/1 OOg, este processo se torna inviável
economicamente (PARAJÓ et ai., 1998a). Sua obtenção convencional ocorre
por via química, porém a via microbiológica vem se destacando nos últimos anos.
A produção de xilitol em larga escala ocorre pelo processo químico, que
consiste na redução de xilose, derivada principalmente de hidrolisados de
materiais lignocelulósicos ricos em xilana. O processo convencional inclui
4 etapas básicas: hidrólise ácida do material vegetal, purificação do hidrolisado
até a obtenção de xilose pura, hidrogenação catalítica da xilose em xilitol e
finalmente cristalização do xilitol. Este processo foi patenteado em 1977 por MELAJA & HAMALAINEN.
O rendimento do processo químico, bem como a qualidade do xilitol são
dependentes da pureza da solução inicial de xilose, uma vez que a presença
de impurezas interfere na redução catalítica. São necessárias operações de
troca-iônica, descoloração e fracionamento cromatográfico para obtenção de
uma solução de xilose de elevada pureza. Além disto, após a remoção do
catalisador por filtração e troca-iônica, a solução de xilitol é concentrada,
fracionada por cromatografia com o emprego de resinas catiônicas e é
cristalizada para obtenção do produto puro (AGUIAR et ai., 1999). Estas
diversas etapas de purificação para remoção de resíduos resultam no aumento de tempo de processamento e encarecimento do produto (PARAJÓ et ai.,
1998a).
O xilitol também pode ser obtido microbiologicamente a partir da fermentação de hidrolisados ricos em xilose obtido de materiais lignocelulósicos, sem a necessidade de purificação prévia da xilose (ONISHI &
SUZUKI, 1971; SILVA et ai., 1996; FELIPE et ai., 1997b; PARAJÓ et ai.,
fermentadores de xilose em xilitol. Dentre os fungos filamentosos pode-se citar espécies dos gêneros Penicil/ium, Aspergi/Jus, Rhizoous, Glicocladium.
Byssoch/amys, Myrothecium, Neurospora, Rhodotorula, Torulopsis (CHIANG &
KNIGHT, 1960); Mucor e Fusarium (PARAJO et ai., 1998a), além de
Peaomyces a/bertensis identificado por DAH({A (1991 ). Poucas bactérias,
como Corynebacterium sp., Enterobacter liquefaciens e Mycobacterium smegmatis formam xilitol, geralmente as bactérias convertem xilose diretamente em xilulose sem os passos de oxirredução (WINKELHAUSEN & KUZMANOVA, 1998).
Quanto às leveduras, várias espécies foram identificadas como
produtoras de xilitol, destacando-se as do gênero Candida pela maior eficiência de conversão (Tabela 1).
TABELA 1 - Leveduras identificadas como produtoras de xilitol a partir de
xilose, adaptado de WINKELHAUSEN & KUZMANOVA (1998).
Levedura Xilitol (g/L)
Candida boídinii NRRL Y-17213 C. guillíermondií FTl-20037 C. íntermedia RJ-248
e.
mogii ATCC 18364 C. parapsilosis ATCC 34078 C. pseudotropicalís IZ-431e.
tropical ise.
tropicalis HXP 2 C. tropicalis 1004 C. tropicalis ATCC 7349e.
tropicalis ATCC 20240e.
utilis ATCC 22023 C. utilis C-40 Debaryomyces hansenii C-98 M-21 Hansenula anomala IZ-1420Kluyveromyces fragilís FTl-20066 K. marxianus IZ-1821
Píchía (Hansenu/a) anomala NRRL Y-366 Pachysolen tannophilus NRRL Y-2460 Saccharomyces SC-13 Saccharomyces SC-37 Schízosaccharomyces pombe 16979 2,9 37,0 5,7 31,0 20,0 4,3 2,1 4,8 17,0 20,0 5,5 1,8 3,0 0,8 6, 1 4,6 6, 1 2,0 2,2 0,7 2,3 0,2
2.3 BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL
2.3.1 ASPECTOS BIOQUÍMICOS
Em microrganismos, o xilitol é um intermediário do metabolismo da
xilose. porém na maioria das bactérias e em algumas leveduras que assimilam
xílose, ela é convertida diretamente a xilulose pela enzima xilose isomerase
(EC 5.3.1.5) sem a formação deste poliol (YOKOYAMA et ai., 1995).
A maioria das leveduras metabolizam xilose pela redução em xilitol
catalisada pela enzima xilose redutase (EC 1.1.1.21) na presença de cofatores
reduzidos NADPH e/ou NADH. O xilitol formado pode ser excretado para o meio extracelular ou oxidado a xilulose, sendo esta reação catalisada pela enzima xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9) dependente de cofatores oxidados
NADP+ e/ou NAD+ (JEFFRIES, 1983; SLININGER et ai., 1987). A xilulose é
então fosforilada no carbono 5, pela xilulose quinase e metabolizada pela via
pentase fosfato. A xilulose também pode sofrer isomerização a xilose e reiniciar
a seqüência de reações (DAHIYA, 1991). A Figura 1 apresenta o esquema do
metabolismo inicial de xilose em leveduras.
As enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase podem ter diferentes especificidades, dependendo da levedura estudada. Em Candida utilis, a enzima xilose redutase requer como cofator NADPH, enquanto xilitol
desidrogenase depende de NAD+ (BRUINENBERG et ai., 1984). Já em
C. guilliermondii FTI 20037 observa-se que a enzima xilose redutase é NADPH
dependente e xilitol desidrogenase é NAD+ ou NADP+ dependente (SILVA et
ai., 1996). Nas leveduras Pichia stipitis, Candida shehatae e Pachysolen
tannophilus a enzima xilose redutase utiliza tanto NADPH como NADH, e a
xilitol desidrogenase NADP+ ou NAD+ (HAHN-HAGERDAL et ai., 1994).
VERDUYN et ai. (1985a e b) demonstraram que P. stipitis possui somente uma
xilose redutase, enquanto P. tannophilus possui duas formas de xilose
redutase, com diferentes especificidades por cofatores. YOKOYAMA et ai.
(1995) sugerem que microrganismos que apresentam a enzima xilose redutase
dependente de NADH são melhores produtores de etanol e ao contrário,
aqueles que apresentam xilose redutase dependente de NADPH, acumulam xilitol ao invés de produzir etanol. Em C. intermedia foram isoladas duas formas
de xilose redutase, uma com especificidade apenas por NADPH e outra que pode usar NADH ou NADPH como cofator, porém a razão do cofator disponível no citossol deve determinar qual das duas formas será utilizada para conversão de xilose em xilitol (MAYR et ai., 2000).
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FIGURA 1 - Esquema do metabolismo de xilose e regeneração de cofatores, adaptado de BARBOSA et ai. (1988) e DAHIYA (1991).
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L..___ -~LEE (1998) comparando as seqüências de aminoácidos de xilose redutase de diferentes leveduras observou que os resíduos (Asp43, Tyr48,
Lys77, His110, Lys262) que participam diretamente da catálise ou da ligação
do cofator são conservados em todas elas.
Segundo BRUINENBERG et ai. (1984), a produção de xilitol por leveduras está intimamente relacionada com a regeneração de cofatores reduzidos. Pela via pentase fosfato, 1 mol de glicose-6-fosfato é
completamente oxidado a H20 e C02, gerando 12 moles de NADPH a partir de
NADP+. A fim de manter o balanço de cofatores, o NADPH produzido é usado para reduzir xilose em xilitol, sendo assim o xilitol é catabolizado para produzir
glicose-6-fosfato e regenerar NADP+ suficiente para manter o ciclo
(BARBOSA et ai., 1988).
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SILVA et ai. (1996) explicam que em C. guilliermondii FTI 20037, o acúmulo de xilitol em relação a xilulose ocorre devido às constantes cinéticas
das enzimas, uma vez que o KM da xilose redutase (O, 18 M) é 4 vezes menor
do que o da xilitol desidrogenase (0,75 M), enquanto a Vrnax para xilose
redutase (243 ü/,nl) é maior do que a Vmax da xilitol desidroqenase (168 U/ml).
GIRIO et ai. (1996) sugerem que os valores de KM da enzima xilitol
desidrogenase para o substrato e o cofator podem mostrar qual levedura acumularia maior concentração de xilitol. Comparada ao de outras leveduras, a
xilitol desidrogenase de D. hansenii apresenta KM na mesma ordem de
magnitude para xilitol e de 2 a 5 vezes maior para NAD+. Assim sendo,
diminuindo a concentração do cofator, a oxidação de xilítol cessaria, havendo
acúmulo deste intermediário no meio.
2.3.2 FATORES QUE INFLUENCIAM O METABOLISMO
A eficiência de conversão de xilose em xilitol, assim como a produtividade, dependem do microrganismo e das condições empregadas na
fermentação. A produção de xilitol está relacionada principalmente às
atividades das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase e, por
conseguinte, a indução ou repressão destas enzimas influencia diretamente o
processo.
• Efeito da Presença de Outros Glicídeos
A composição de hidrolisados hemicelulósicos utilizados como meio de cultura para a produção biotecnológica de xilitol varia de acordo com o tipo de
material lignocelulósico utilizado, porém estão sempre presentes nos
hidrolisados outros açúcares além da xilose, normalmente glicose, arabinose,
galactose e manose, em menores concentrações. WALTHER et ai. (2001),
utilizando Candida tropicalis, observaram que glicose (20 g/L) em meio
contendo 60 g/L de xilose reprimiu fortemente (41 %) a formação de xilitol,
enquanto manose (20 g/L), e galactose (20 g/L) causaram moderada inibição
manose e galactose foram simultaneamente consumidas após o esgotamento de glicose, enquanto não se verificou consumo de arabinose.
A presença de hexases, como a glicose, no meio de fermentação é um
dos fatores que regula a produção de xilitol por leveduras. Em fermentações
com C. shehatae e P. stipitis, en, meio de cultura contendo xilose e glicose, foi
verificado o consumo preferencial de glicose em relação a xilose, havendo um
período lag para o consumo desta pentase, necessário para a síntese de
enzimas do metabolismo de xilose (KILIAN & van UDEN, 1988). Contudo, este
período pode ser reduzido com o crescimento do inóculo em meio contendo
xilose como fonte de carbono (SILVA et ai., 1998).
Em C. tropicalis, no entanto, foi observado que quando o meio é
suplementado com glicose, a produção de xilitol é melhorada, inclusive com
menor consumo de xilose. Este efeito, à primeira vista contraditório, foi
explicado pelo uso de glicose como fonte de carbono preferencial pela
levedura, iniciando seu crescimento no meio de cultura mais rapidamente do que na presença de xilose (YAHASHI et ai., 1996) Além disto a glicose permite
a regeneração de NADPH, cofator da enzima xilose redutase, pela via pentase
fosfato (PARAJÓ et ai., 1998b). ROSA et ai. (1998) constataram o
favorecimento da formação de xilitol por C. · guilliermondii, em meio sintético
contendo 30 g/L de xilose e 5,0 g/L glicose. TAVARES et ai. (2000) também
observaram com D. hansenii ,que a adição de 1,0% de glicose em meio
contendo 60 g/L xilose, a produtividade de xilitol aumentou 30%. O mesmo
efeito não foi observado com a adição de galactose.
Segundo LUCAS & van UDEN (1986), o transporte de moléculas para o
interior da célula interfere na eficiência e na produtividade do xilitol. Estes autores estudaram o transporte de monômeros de hemicelulose em C. shehatae e constataram que tanto a glicose como a xilose são transportadas
por sistema de difusão facilitada e também por simporte de prótons. Quando a
levedura cresce sob condições de supressão de fontes de carbono ela produz um sistema de difusão facilitada que reconhece glicose, D-manose e D-xilose e não reconhece D-galactose e L-arabinose. Os açúcares glicose e xilose são mutuamente inibidores competitivos, indicando que as duas atividades nos
sistemas de afinidade correspondem a dois simportes distintos com KS e
KS ± 125 mM, Vmax ± 22,5 mmoles/g.h para xilose). Para P. stipitis, também foi observado dois simportes distintos para o transporte de glicose e xilose, porém com comportamento de inibição não competitiva entre eles (KILIAN & van UDEN, 1988).
LEE et ai. (1996) venncaram que em C. guiffiermondii, D-xilose e
L-arabinose são os melhores glicídeos indutores, enquanto glicose é um
repressor catabólico das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase.
KERN et ai. (1997) também observaram, para xilose redutase de C. tenuis, o
mesmo comportamento de indução por D-xilose e L-arabinose, além de D-lixose e D-arabinose. Então, pela análise das moléculas indutoras, foi sugerido que o efeito pode estar relacionado com a posição equatorial dos grupos hidroxila nos carbonos da posição 3 e 4.
• Concentração Inicial e Idade do lnóculo
CAO et ai. (1994) observaram, em uma linhagem de Candida sp., que
quando a concentração do inóculo foi aumentada de 3,8 a 26 g/L, houve um
aumento de 80% na produção de xilitol em meio com 260 g/L de xilose. Em
hidrolisado de bagaço de cana de açúcar e com C. guilliermondii FTI 20037, a
bioconversão de xilose em xilitol foi favorecida utilizando inóculo de O, 1 a 3,0 g/L, sendo seu aumento limitado pela concentração de substrato e aeração do
meio (FELIPE et ai., 1997a).
PFEIRER et ai. (1996) observaram durante fermentações em meio sintético, que a utilização de inóculos de C. guil/iermondii de 16 a 24 horas
resultou em maior produtividade do xilitol, dados corroborados por FELIPE et
ai. (1997a). Estes autores constataram um aumento de 36% neste parâmetro
com emprego de inóculo de 24 horas em relação ao de 48 horas durante
fermentações em hidrolisado de bagaço de cana.
• Temperatura e pH
A temperatura é um fator importante pois interfere tanto no crescimento
da levedura, como na atividade das enzimas envolvidas na via microbiológica
máxima concentração de xilitol acumulado ocorreu tanto em 30 ºC, como em 35 ºC. Nestas temperaturas a taxa de crescimento foi alta e a xilose foi
consumida rapidamente (BARBOSA et ai., 1988). SOUZA et ai. (1993)
verificaram, durante o cultivo de C. gui/liermondii em hidrolisado hemicelulósico
de palha de arroz, em i:ernperaturas acima de 40 ºC, um decréscimo da
produção de xilitol, enquanto que abaixo de 20 ºC não foi observada formação deste palio!. Em hidrolisado hemicelulósico de bagaço, o maior rendimento de xilitol e as atividades máximas para as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase de C. guifliennondii foram encontrados com a temperatura de fermentação igual a 35 ºC (SENE et ai., 2000a).
O pH é outro parâmetro que interfere no crescimento celular e nas atividades enzimáticas, sendo este efeito dependente do tipo de meio de
cultura. FELIPE et ai. (1997b) constataram que em fermentações de hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana, a produção de xilitol por C. guilliermondii
foi fortemente inibida em pH abaixo de 4,5, o mesmo não foi observado por
SILVA et ai. (1994) em meio sintético. MORITA et ai. (2000a), também
utilizando hidrolisado de bagaço, encontraram melhores resultados para consumo de xilose, produtividade e rendimento de xilitol em pH 7,0. SENE et ai. (2000a) encontraram as máximas atividades de xilose redutase e
xilitol desidrogenase de C. guifliermondii foram em pH 5,5 e 8,5
respectivamente. Em hidrolisado de bagaço de cana, a atividade máxima para
xilose redutase ocorreu quando o pH do meio de cultura foi igual a 6,0,
condição na qual foram também encontrados os máximos valores dos parâmetros fermentativos da produção de xilitol.
WEBB & LEE (1990) relacionaram o efeito do pH nas atividades
enzimáticas aos resíduos de histidina e cisteína, que podem estar envolvidos
na ligação do cofator à enzima xilose redutase de P. stipitis. A histidina é um
resíduo de aminoácido que é frequentemente encontrado em sítios
enzimáticos, seu anel imidazólico varia entre os estados sem carga e com
carga positiva para catalisar a formação e ruptura de ligações. Estes estados são influenciados pelo pH do meio e interferem na atividade enzimática.
• Disponibilidade de Oxigênio
Para a formação de xilitol, outro fator crítico é a disponibilidade de
oxigênio durante a fermentação. Em condições anaeróbicas a xilose não pode ser assimilada pelo fato de que o cofator reduzido NADH não pode ser regenerado através da fosforilação oxidativa (NOLLEAU et ai., 1993), além do que a atividade de transhidrogenase não foi detectada em leveduras e aparentemente o balanço não pode ser restabelecido por esta via (HAHN-
HAGERDAL et ai., 1994). VANDESKA et ai. (1996) concluíram que a taxa de
consumo de oxigênio determina quando a xilose é utilizada em processos
respiratórios ou fermentativos.
Segundo GIRIO et ai. (1990), condições de forte aeração favorecem o aumento de biomassa e prejudicam a produção de xilitol. Na cadeia transportadora de elétrons, o oxigênio oxida o NADH em NAD+ e a alta proporção de NAD+ /NADH favorece a oxidação de xilitol em xilulose. A xilulose seria então degradada através da via da pentase fosfato e pela via glicolítica para formar piruvato, que é o substrato do ciclo dos ácidos tricarboxílicos,
resultando no aumento de massa celular (FURLAN et ai. 1991). Para favorecer
a bioconversão de xilose em xilitol o meio deve ser mantido sob condições de
baixa aeração, pois ocorre uma elevação da concentração de NADH,
paralisando as etapas posteriores do catabolismo do xilitol e consequente acúmulo do mesmo (NOLLEAU et ai., 1993; HAHN-HAGERDAL et ai., 1994).
BRUINENBERG et ai. (1984) demonstraram que a taxa de fermentação anaeróbica de xilose por P. tannophilus e P. stipitis está relacionada à atividade de xilose redutase NADH dependente, que é a chave para a fermentação aeróbica em leveduras porque depende da cadeia respiratória para repor o cofator reduzido. PREEZ et ai. (1989) sugerem que o grau de aeração pode modular a razão entre xilose redutase NADH dependente e xilose redutase NADPH dependente em P. tannophi/us. Foi observado para Candida boidinii, que as atividades de xilose redutase NADH dependente e xilitol desidrogenase NAD+ dependente foram diminuídas com o aumento da disponibilidade de
oxigênio (VANDESKA et ai., 1995). O mesmo foi observado para
C. guilliermondii, porém esta só possui uma forma da enzima xilose redutase, que é NADPH dependente (SENE, 2000b).
• Concentração Inicial de Xilose
O efeito da concentração inicial de xilose na produção de xilitol foi
estudado em diferentes microrganismos, demonstrando que a produção é
favorecida com o aumento da concentração de xilose inicial (PARAJÓ et ai.. 1998b). O aumento na produção é observado até o ponto em que a concentração de xilose prejudica o crescimento celular. A queda no rendimento pode estar associada à alta pressão osmótica no meio de cultura ou a inibição
das enzimas pelo substrato (DAHIYA, 1991; DOMINGUEZ et ai., 1997;
PARAJÓ et ai., 1998b).
SILVA et ai. (1996) verificaram que a levedura C. guilliermondii cultivada em meio sintético apresentou maior produtividade de xilitol com a concentração de xilose inicial de 70 g/L e maior rendimento com concentração igual a 90 g/L, porém seus resultados demonstraram que a melhor produção de xilitol e as
maiores atividades de xilose redutase e xilitol desidrogenase ocorrem na faixa
de 70 a 170 g/L de xilose inicial. Segundo ROSA et ai. (1998), os maiores valores de atividades para xilose redutase e xilitol desidrogenase de C. guilliermondii cultivada em meio sintético foram obtidos em meio contendo 15 g/L de xilose, entretanto, quando esta concentração foi aumentada até 609/L observou-se uma redução em cerca de 50% nas atividades enzimáticas.
Em pesquisas com C. tropicalis, WAL THER et ai. (2001) observaram que a xilose na concentração de 156,5 g/L não causou estresse osmótico sob
baixa taxa de aeração (condições semi-aeróbicas), contudo, com o aumento da
aeração a produtividade de xilitol foi prejudicada em 50% quando a concentração de xilose foi de 120 g/L.
2.4 MATÉRIA-PRIMA
Um dos objetivos do desenvolvimento de tecnologia para produção biotecnológica de xilitol é apresentar uma alternativa mais barata possível à via
química, forma atualmente empregada para obtenção deste adoçante, a fim de
possibilitar a produção em larga escala com custos mais baixos. Seguindo este
objetivo, busca-se como fonte de xilose, materiais lignocelulósicos por serem
Lignocelulose é o material orgânico mais abundante na biosfera, compondo cerca de 50% da biomassa no mundo. Sua produção anual tem
sido estimada em 10 a 50x109 toneladas (KUHAD, 1993). A lignocelulose é
composta de 20 a 35% de celulose, 20 a 39% de hemicelulose e 20 a 30% de
, lignina, considerando 0 cceo seco . de diferentes í-i .ateria is. Os componentes
hemicelulósicos das paredes de células vegetais incluem uma variedade de polissacarídeos lineares ou ramificados compostos de açúcares tais como
D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glicose e L-arabinose (FERREIRA FILHO,
1998). J
Em madeiras e em diversos resíduos agroindustriais a porção hemicelulósica contém alto teor de xilanas, que são polímeros compostos principalmente por unidades xilanopiranosídicas. Diferentes métodos de hidrólise são utilizados para romper a ligação entre as unidades monoméricas e consequente liberação de sacarídeos, entre eles, principalmente a xilose. Entre os métodos empregados podem ser citados: extração com soluções alcalinas
(TOIT et ai., 1984), "steam explosion" (MARCHAL et ai., 1986), hidrólise
enzimática (TSAO, 1986) e hidrólise ácida (PESSOA JR., 1997).
Entre os diversos resíduos agroindustriais, pesquisas confirmam que a xilose presente nos hidrolisados hemicelulósicos de palha de arroz
(ROBERTO et ai., 1994), eucalipto (FELIPE et ai., 1996), bagaço de cana de
açúcar (FELIPE et et., 1997a e b) e palha de trigo (CANILHA, 2002) pode ser
convertida em xilitol por C. guilliennondii FTI 20037. Dentre estes materiais, o
bagaço de cana de açúcar tem se destacado pela sua disponibilidade,
principalmente no estado de São Paulo, o que o torna alvo de inúmeras
pesquisas para o seu aproveitamento no processo microbiológico de obtenção de xilitol.
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2.4.1 BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR
O bagaço de cana de açúcar é um resíduo gerado pela indústria sucroalcooleira após o esmagamento da cana de açúcar para extração do suco contendo sacarose. Este resíduo é normalmente utilizado pelas próprias
empregado na geração de produtos de alto valor agregado, como no caso do xilitol.
O bagaço de cana de açúcar possui aproximadamente 50% de celulose,
25% de hemicelulose, 20% de lignina e 3% de cinzas. Comparado a outros
resíduos lignoceluló5;c;:;:;, como palha de arroz, casca de a, .oz e palha de trigo,
entre outros, o bagaço de cana é o que apresenta maior proporção de xilose
(23,3%) em relação aos carboidratos totais (LEE, 1997). Além disto pode ser
considerado uma reserva abundante de energia solar pela sua alta produtividade (cerca de 80 toneladas/hectare) e capacidade de regeneração
anual (PANDEY et ai., 2000). Estas características têm impulsionado pesquisas
em tecnologias de aproveitamento do bagaço de cana, principalmente em processos biotecnológicos utilizando microrganismos fermentadores de xilose.
2.5 EFEITO TÓXICO DOS HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS
Para que os hidrolisados hemicelulósicos sejam utilizados como meios
de cultivo para obtenção de xilitol, alguns problemas devem ser contornados,
como a presença de compostos tóxicos inerentes ao processo de hidrólise da
biomassa. Diversos destes compostos já foram identificados, tais como
minerais e metais contidos no material lignocelulósico ou resultantes do
processo de corrosão de equipamentos; produtos da hidrólise de hemicelulose
como hidroximetilfurfural,. furfural e ácido acético; produtos derivados da
degradação de lignina como compostos fenólicos, ácidos aromáticos e
aldeídos; e ainda compostos derivados de extrativos (PARAJÓ et ai., 1998c).
Para minimizar os efeitos destes compostos, diversas técnicas já foram
empregadas, como adaptação de células das leveduras, adição de substâncias
redutoras, neutralização e "overliming", evaporação e "steam stripping",
extração por solvente e adsorção por carvão ativo (CONVERTI et ai., 1999). O Furfural e o hidroximetilfurfural (HMF) são compostos quimicamente relacionados, ambos possuem um anel furano e um grupo aldeídico e são
, formados a partir da quebra de carboidratos (Figura 2). Foi demonstrado que
tanto o furfural, como o HMF, exercem efeito inibitório no crescimento de C. guilliermondii; furfural em concentrações maiores que 1,0 g/L, e HMF em
o o Hexases Desidratação HMF
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(
Desidratação FurfuralFIGURA 2 - Formação de hidroximetilfurfural (HMF) e furfural a partir da desidratação de hexases e pentases, respectivamente (adaptado de TAHERZADEH et ai., 2000).
O consumo de furfural é mais rápido em relação ao HMF. Quando os dois estão presentes no meio, HMF é convertido lentamente até que todo o
furfural seja metabolizado. Esta característica é importante porque a presença
de HMF é prolongada durante o processo. O metabolismo destes compostos pode ocorrer pela enzima piruvato descarboxilase, que catalisa a formação do grupo acilo, como na reação entre piruvato e acetaldeído. Assim HMF e furfural competem com a reação com acetaldeído, interferindo na via glicolítica e
prejudicando o crescimento do microrganismo. Além disto, foi demonstrado que
a redução de HMF consome NADH, sendo necessária uma adicional formação deste cofator para manter o balanço na célula (TAHERZADEH et ai., 2000).
O efeito inibitório dos compostos fenólicos é devido à capacidade de se
associarem a membranas biológicas, causando perda de integridade, afetando assim sua habilidade de servir como barreira seletiva e matriz de enzimas
transmembrânicas. Os compostos fenólicos comumente encontrados em
hidrolisados hemicelulósicos são ácido 4-hidroxibenzóico, vanilina e catecol
(PALMQVIST et ai., 2000).
O efeito de metais foi pesquisado por WATSON et ai. (1984), que
observaram, para P. tannophilus, que o crescimento em meio sintético não foi
alterado na presença de íons como cobre e cromo em baixas concentrações, inferiores a 0,05 g/L, enquanto na presença de O, 1 g/L de níquel, observou-se redução rio crescimento.
O efeito dos compostos tóxicos sobre o metabolismo de xilose é bastante complexo, havendo algumas evidências de que a inibição da
(LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998). Dentre os compostos presentes no
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar considerados como
potencialmente tóxicos à C. guilliermondii, destaca-se o ácido acético,
encontrado em concentrações superiores a 3,0 g/L (RODRIGUES, 1999).
2.5.1 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO
O ácido acético, proveniente dos grupos acetil das cadeias laterais da
hemicelulose, é considerado o principal inibidor do metabolismo de xilose
(ZYL et ai., 1988; FERRARI et ai. 1992; CONVERTI et ai., 2000). Sua
toxicidade está relacionada com o pH do meio de cultura (NODA et ai., 1982;
FERRARI et ai., 1992), a disponibilidade de oxigênio (ZYL et ai. 1988), a
temperatura (PINTO et ai., 1989), a relação xilose/ácido acético (PREEZ et ai.,
1991 ), a concentração do ácido (FELIPE et el., 1995) e o microrganismo
empregado (FELIPE et ai., 1997b).
O efeito tóxico do ácido acético é aumentado em pH ácido, pois nestas
condições predomina a sua forma não dissociada no meio de cultura (PREEZ,
1991 ). Isto pode explicar a inibição do crescimento de C. guilliermondii em
hidrolisado com pH inferior a 4,5, onde o ácido acético, que possui pKa igual a
4,74 está, em sua maioria, não dissociado (NODA et ai., 1982). Quando este
ácido é transportado para dentro da célula, a molécula se dissocia em íon
acetato mais próton, devido ao pH do citossol ser próximo a neutralidade. Com
o aumento da concentração de prótons, o pH interno diminui. Para a manutenção homeostática do pH, as células dependem da enzima transmenbrânica H+ -ATPase que transporta íons H+ para fora das células
consumindo ATP (HOLYOAK et ai., 1996). Como resultado da restauração da
neutralidade, ocorre o desacoplamento da produção de energia e do transporte
de nutrientes, resultando na diminuição do crescimento e do metabolismo do
microrganismo (HERRERO et ai., 1985; lYL et ai. 1988; LOHMEIER-VOGEL
et ai., 1998). HERRERO et ai. (1985) atribuíram o decréscimo no
desenvolvimento celular de C/ostridium thermocellum na presença de ácido
acético ao fato de grande quantidade de ATP ser consumido via H+ -ATPase, a
fim de manter o fluxo de prótons para restaurar o pH intracelular, resultando em
estima-se que o consumo de ATP pela atividade de A TPase é de 10-15% durante o crescimento celular, tendo uma relação estequiométrica de uma
molécula de ATP hidrolisada por próton expulso da célula.
O processo de acidificação do citossol pela entrada de ácido acético
pode também mcdificar o controle da via glic~lítica (P/\MPULHJ\ & LOUREIRO-
DIAS, 1990). A Figura 3 apresenta o mecanismo de acidificação do citoplasma
pela dissociação da molécula de ácido acético e o transporte de prótons para o meio extracelular via enzima H+ -ATPase.
Meio Extracelular Meia Intracelular
FIGURA 3 - Mecanismo de acidificação do citoplasma pela forma não
dissociada do ácido acético e transporte de prótons através da membrana pela
enzima H+-ATPase (adaptado de LAWFORD & ROUSSEAU, 1993).
FELIPE et ai. (1995) demonstraram que o efeito inibitório do ácido
acético no metabolismo de xilose por C. guil/iermondii é dependente da
concentração deste no meio de cultura. Em meios com baixa concentração do
ácido, até 1,0 g/L, houve aumento de 20% no rendimento e de 33% na
produtividade de xilitol em relação ao meio ausente de ácido. Foi demonstrado que esta levedura foi capaz de metabolizar ácido acético em meio sintético e,
segundo os autores, este efeito pode ser devido à entrada deste ácido
diretamente no ciclo dos ácidos tricarboxílicos via acetil-CoA. A assimilação de ácido acético por C. guilliermondii também é constatada quando a levedura é cultivada em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, sendo favorecida
com o esgotamento de xilose (FELIPE et ai., 1997a). Melhor crescimento
celular foi observado em condições aeróbicas, com aeração correspondente a
um kLa igual a 35 h-1 e pH inicial igual a 7,0. A capacidade de metabolizar ácido
acético pela levedura, sugere a possibilidade de detoxificação do hidrolisado
O metabolismo de acetato por leveduras ainda não foi completamente
elucidado. Sabe-se que o acetato pode ser utilizado como fonte de carbono,
sendo convertido em acetil-CoA pela enzima acetato quinase, com consumo de
ATP. SOUSA et ai. (1998) observaram que para Zygosaccharomyces bailii,
nem o ciclo
=~
glioxilato, nem a glk,,:meogêr..Jse estão envolvidos nometabolismo de ácido acético, mas sim o ciclo de Krebs. LEE et ai. (1996)
verificaram que o nível de mRNA e a atividade da enzima acetil-CoA hidrolase são aumentados em meio contendo acetato, o que indica que a expressão
desta enzima pode estar envolvida na utilização de ácido acético. Acetil-CoA
hidrolase é uma das enzimas que controlam o nível de acetil-CoA e CoASH no citossol.
3. OBJETIVOS
3.1 GERAL
Contribuir para o desenvolvimento de uma tecnologia de obtenção de
xilitol po: via biotecnológica a partir de bagaço de cana de açúce..
3.2 ESPECÍFICOS
• Avaliar a influência da adição de diferentes concentrações de ácido acético na atividade das enzimas intracelulares xilose redutase (XR) e xilitol
desidrogenase (XDH) de C. guillíerrnondíí cultivada em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar.
• Avaliar a influência da adição de diferentes concentrações de ácido
acético na atividade das enzimas XR e XDH de C. guí/Jíerrnondií cultivada em
meio sintético, simulando a composição de açúcares do hidrolisado de bagaço.
• Avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de acetato de sódio nas atividades de XR e XDH.
• Verificar a existência da relação entre a concentração de ácido acético nas atividades de XR e XDH e o rendimento e produtividade em xilitol.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MICRORGANISMO E PREPARO DO INÓCULO
Os ensaios foram conduzidos com a levedura Candida gui/liermondii
FTI 20037, selecionada por BARBOSA et ai. (1988) para produção de xilitol.
Foi utilizada uma cultura estoque do DEBIQ/FAENQUIL, mantida em ágar
extrato de malte 5% a 4 ºC.
Para o preparo de inóculo, o cultivo da levedura foi realizado em frascos
Erlenmeyer de 125 ml, contendo 50 mL de meio composto de xilose (30 g/L),
suplementado com sulfato de amônia (2 g/L), cloreto de cálcio dihidratado
(O, 1 g/L), solução de extrato de farelo de arroz (20 g/L), conforme tem sido
empregado nos trabalhos do grupo (FELIPE et ai., 1997a; ALVES et ai., 1998;
RODRIGUES, 1999; SILVA, 2001). O cultivo foi feito em incubadora de
movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) com agitação de 200 rpm,
a 30 ºC, por 24 horas.
As células foram recuperadas por centrifugação a 2000xg (Cu-5000 - Damon/lEC Division) e lavadas com água destilada estéril. Após a segunda centrifugação as células foram utilizadas para o preparo da suspensão que foi empregada como inóculo, com concentração igual a 1,0 g/L.
4.2 PREPARO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR
O bagaço de cana foi obtido na Usina Guarani, em Olímpia-SP.
Primeiramente o bagaço teve seu teor de umidade determinado através da
secagem de amostras em estufa a 100 ºC até peso constante. Em seguida foi hidrolisado na planta de hidrólise ácida da FAENQUIL, em reator de aço inox
AISI 316, com capacidade volumétrica de 250 litros, com aquecimento indireto
por resistência elétrica em camisa de óleo térmico. A hidrólise foi realizada
conforme metodologia estabelecida por PESSOA JR. (1997), empregando as
seguintes condições: temperatura de 121 ºC, por 10 minutos e 100 mg de ácido sulfúrico por grama de matéria seca, para uma relação
