UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
FLORENCE JUANA MARIA CUADRA ZELAYA
Identificação de células tronco associadas ao câncer (CTCs) nas
linhagens celulares SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1
Piracicaba 2016
Identificação de células tronco associadas ao câncer (CTCs)
nas linhagens celulares SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Estomatopatologia na área de Patologia.
Orientador: Prof. Dr. Edgard Graner Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Florence Juana Maria Cuadra Zelaya e orientada pelo Prof. Dr. Edgard Graner
Piracicaba 2016
A Deus, como parte de tudo aquilo que acredito e representa na minha vida.
Aos meus pais, Juan Cuadra e Norma de Cuadra, porque eu sou hoje parte de todo aquilo que eles transmitiram em mim, não com palavras se não com fatos dia-a-dia, e pela felicidade de me sentir amada e me expressar que o mais importante agora é minha felicidade.
Às minhas irmãs, Tania e Carmen Dinora, pela companhia, por me fazer crescer e amadurecer em todos âmbitos de minha vida e por estar sempre comigo.
À Universidad de El Salvador, por seu apoio, não apenas económico, por acreditar em mim, esperando um dia, não muito longe, devolver tudo aquilo que me deu desde minha formação.
À Facultad de Odontología de la Universidad de El Salvador (FOUES), e a todos os que formam parte dela, pelo apoio e confiança depositada em mim, na minha formação científica.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas (FOP-UNICAMP), na pessoa do seu diretor Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques por permitir ser parte dela.
À Coordenadoria de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba na pessoa da Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury e ao Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia na pessoa de seu coordenador Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes.
Aos Profs. Drs. Alan Roger dos Santos Silva, Edgard Graner, Jacks Jorge Júnior, Márcio Ajudarte Lopes, Oslei Paes de Almeida, Pablo Agustin Vargas, Ricardo Della Coletta, pelos ensinamentos para o meu crescimento acadêmico.
Ao Prof. Edgard Graner, por ser meu orientador, por me ensinar a entrar no mundo da pesquisa, me fez crescer cientificamente.
A Debora, por chegar no momento justo, para me fazer crescer cientificamente, e ser parte importante da essência de tudo o que aqui está escrito.
A Rebeca, pela amizade, pela força, pela aprendizagem e tua presença me faz lembrar cada dia, uns dos motivos grandes de eu estar aqui.
A Luciana, Fernanda e Renato pelos ensinamentos fundamentais para poder iniciar meus dias dentro do laboratório.
A Luciana, Carine e Debora, pela amizade, apoio e por todos os ensinamentos no laboratório da FOP-UNICAMP, assim como na minha vida.
Às minhas amigas Celeste, Alicia, Marisol, que a través de nosso belo idioma, um dia nos junto para a troca de conhecimentos, conversas descontraídas, além do grande apoio.
Aos amigos de laboratório pela troca de experiências, sugestões para melhoria deste trabalho, cumprimento das funções laboratoriais, momentos de descontração, gentilezas, colaborações e amizade.
Aos amigos da pós-graduação Alícia, Ana Carolina, Camila, Bruna, Bruno, Carmem, Carol, Celeste, Cinthia, Débora, Diego, Fernanda, Gleyson, Harim, Isabel, Jessica, José Laurentino, Juliana Souza, Juscelino, Karina, Leonardo, Ligia, Mauricio, Mariana, Marisol, Natalia, Paola, Patrícia, Priscila, Rebeca, Renata, Renato, Rodrigo, Vinícius, Wagner e a todos aqueles que foram embora nestos últimos dois anos, pelo compartilhamento de conhecimentos e agradáveis momentos de convivência.
Aos amigos sempre presentes mesmo na distância, Karina, Katy, Jaime, Liss, Marisol, Nely Osmín, pela amizade, preocupação, torcida, apoio, por estar ali, nos meus acertos como nos meus erros, nunca deixando de acreditar em mim.
Aos Amigos de uma geração diferente, que me faz sentir parte deles, por me ensinar que amizade e importante ainda com as grandes diferenças de pensamento.
diversas caracterizadas pela capacidade de proliferar indefinidamente e de formar tumores em modelos animais. A literatura recente sugere que a erradicação destas células parece ser necessária para que neoplasias malignas possam ser controladas. Diversos estudos têm sido realizados para identificar CTCs em neoplasias malignas de diferentes órgãos, inclusive no carcinoma de células escamosas (CCE) da cavidade bucal, a partir de marcadores de superfície como CD44, CD133, CD24, CD326, individualmente ou, mais comumente, em associação com CD44. A expressão dos marcadores de superfície celular para CTCs na linhagem SCC-9 não foi tão amplamente descrita na literatura. Pesquisas anteriores de nosso grupo permitiram estabelecer, a partir da seleção in vivo de células SCC-9 ZsGreen, uma nova linhagem altamente metastática de CCE da cavidade bucal humano denominada SCC-9 ZsGreen LN-1. Portanto, o objetivo do presente estudo é identificar e comparar a presença de CTCs nas linhagens celulares SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1. No presente estudo, as CTCs nas linhagens SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1 foram identificadas por citometria de fluxo utilizando-se marcação tripla para os seguintes marcadores de superfície: CD44 “standard” (CD44s, e suas isoformas, CD44v3 e CD44v6), CD133, CD326, CD24 e CD271. Os resultados obtidos em ambas as linhagens celulares revelaram elevada positividade para CD44s, CD44v6, CD133, CD326 e CD271 e baixa expressão de CD44v3 e de CD24. Foram observados os seguintes fenótipos: CD44s+/CD326-, CD44s-/CD133+, CD44s -/CD44v6+ y CD44s-/CD271+, o primeiro fenótipo foi observado somente na linhagem SCC-9Zs Green y os três últimos fenótipos foram encontrados nas duas linhagens celulares com uma presença ligeiramente maior na linhagem SCC-9Zs Green LN-1.-. Estes resultados sugerem que as duas linhagens estudadas possuem subpopulações de CTCs. A caracterização detalhada destas células aliada a ensaios adicionais in vitro e in vivo, como capacidade de crescimento em esferóides, tumorigenicidade em modelo animal e análise do comportamento frente a diferentes agentes quimioterápicos será de grande importância para o melhor entendimento do processo metastático e resistência a terapias em CCE da cavidade bucal.
the ability to proliferate indefinitely being tumorigenic in animal models. The recent literature suggests that eradication of these cells seems to be important for the tumors control. Several studies have been performed in order to identify and isolate CSCs in malignant neoplasms of different organs, including oral squamous cell carcinoma (OSCC). Using surface markers such as CD44, CD133, CD24, CD326, individually or in combination with CD44. The expression of cell surface markers for CSCs in SCC-9 cell line is not well described. Previous studies from our group established a highly tumorigenic cell line of human oral SCC, the SCC-9 ZsGreen LN-1 by the in vivo selection from SCC-9 ZsGreen cells. Therefore, the aim of this study is to identify the presence of CSCs through cell surface markers in SCC-9 and SCC-9 ZsGreen ZsGreen LN-1 cell lines. CSCs in SCC-9 ZsGreen and SCC-9 ZsGreen LN-1 cell lines were identified by flow cytometry using triple staining to the following surface markers: CD44 Standard (CD44s, and their isoforms, CD44v3 and CD44v6), CD133, CD326, CD24 and CD271. Both cell lines showed high positivity for CD44s, CD44v6, CD133, CD326 and CD271 and no expression of CD44v3 and CD24. The following phenotypes were observed: CD44s+/CD326-, CD44s-/CD133+, CD44s-/CD44v6+ and CD44s-/CD271+, the first phenotype was observed exclusively in the cell line SCC-9Zs Green and the last ones were found in both cell lines with a slightly higher presence in the metastasic cell line.. Our results suggest that both, SCC-9 ZsGreen and SCC-9 ZsGreen LN-1 showed subpopulations of CSCs. The characterization of these cells and additional in vitro and in vivo assays, as the ability to growth spheroids, tumorigenicity in animal models and the response of these cells under different chemotherapeutic agents could corroborate to the better understanding of the metastatic process and therapeutic resistance on OSCC.
Câncer.
ABC – "ATP-Binding Cassette" - Transportadores cassetes ligados a ATP. AKT - Proteína cinase B ou também conhecida como PKB.
ALDH - Aldeído desidrogenase.
APC - "Allophycocyanin" – Aloficocianina.
BSA - "Bovin Serum Albumin" - Albumina sérica bovina. CCE – Carcinoma de células escamosas.
CD - Cluster de diferenciação.
CDKN2A - Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 2A. CTCs - Células tronco associada ao câncer.
DMEM/F-12 - “Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/ Ham’s Nutrient Mixture F-12. DMSO – Di-metilsulfóxido.
EGFR- "Epidermal Growth Factor Receptor"- Receptor do fator de crescimento epidérmico. EPCAM - "Epithelial Cell Adhesion Molecule"- Molécula de adesão das células epiteliais. Também conhecido como CD326.
ERBB2 - "Erythroblastosis oncogene B" também conhecido como HER/2 "human epidermal growth factor receptor 2".
ESA - "Epithelial specific antigen" - Antígeno epitelial específico. FASN - "Fatty Acid Synthase" - ácido graxo sintase.
FGFR1 - "Fibroblast Growth Factor Receptor 1" - Receptor 1 do fator de crescimento fibroblástico. HPV - "Human Papillomavirus" - Vírus do papiloma humano.
IgG - Imunoglobulina G. kDa – Kilodaltons.
NGF - "Neural Growth Factor" - Fator de crescimento neural.
PBS - "phosphate buffered saline" - Solução salina tamponada com fosfato. PE - "Phycoerythrin"- Ficoeritrina.
PerCP - " Peridinin Chlorophyll" - Piridina de clorofila. PTEN - "Phosphatase and tensin homolog".
SCC - "Squamous Cell Carcinoma" - Carcinoma de células escamosas. STAT-3 - "Signal transducers and activators of transcription".
TEM - Transição epitélio-mesenquimal. TME - Transição mesenquimal-epitélio.
Wnt - "Wingless-related integration site" - Local de integração relacionado com Wingless. µl – microlitros.
2. REVISÃO DA LITERATURA 15 2.1. Carcinoma de células escamosas (CCE) da cavidade bucal 15 2.2. Células-tronco associadas ao câncer (“Cancer stem cells” ou CTCs) 17
2.3. Origem das CTCs 19
2.4. Vias que regulam as células-tronco 20
2.5. Métodos de identificação e isolamento de CTCs 21 2.6. Antígenos de superfície celular para a identificação de CTCs 22
2.6.1. CD44 23
2.6.2. CD44 e suas isoformas variáveis em neoplasias malignas 24
2.6.3. CD133 25
2.6.4. CD24 27
2.6.5. CD326 (EpCAM ou ESA) 29
2.6.6. CD271 31
2.6.7. Linhagem celular SCC-9 e marcadores de superfície para CTCs 31
3. PROPOSIÇÃO 33 3.1. Proposição geral 33 3.2. Proposições específicas 33 4. MATERIAL E MÉTODOS 34 4.1. Cultura de células 34 4.2. Imunofenotipagem 35 5. RESULTADOS 39 5.1. Padronização da Técnica 39
5.1.1. Verificação do número de células a serem plaqueadas no início dos
experimentos 39
5.1.2. Velocidade e tempo de centrifugação 40
5.1.3. Diluições dos anticorpos 40
5.2. Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen 41 5.2.1. Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen com o grupo de
anticorpos #3 47 5.2.4. Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen com o grupo de
anticorpos #4 50
5.3. Imunofenotipagem SCC-9 ZsGreen LN-1 52
5.3.1. Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1 com o grupo de
anticorpos #1 54
5.3.2. Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1 com o grupo de
anticorpos #2 56
5.3.3. Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1 com o grupo de
anticorpos #3 59
5.3.4. Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1 com o grupo de
anticorpos #4 61
5.4. Análise comparativa entre os fenótipos das células SCC-9 ZsGreen e SCC-9
ZsGreen LN-1 64
5.4.1. Análise comparativa entre as células SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen
LN-1 com o grupo de anticorpos #1 64
5.4.2. Análise comparativa entre as células SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen
LN-1 com o grupo de anticorpos #2 65
5.4.3. Análise comparativa entre as células SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen
LN-1 com o grupo de anticorpos #3 66
5.4.4. Análise comparativa entre as células SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen
LN-1 com o grupo de anticorpos #4 67
6. DISCUSSÃO 68
7. CONCLUSÃO 76
REFERÊNCIAS 77
ANEXO 1: Tabelas de volumes dos anticorpos para imunofenotipagem 88
ANEXO 2: Tabelas de volumes dos isotipos controles 89
ANEXO 3: Tabelas de volumes dos calibradores 90
1 INTRODUÇÃO
Células-tronco associadas ao câncer (CTCs) formam um subconjunto distinto de células neoplásicas malignas que tem a capacidade de proliferar indefinidamente e de formar tumores e/ou metástases em modelos animais (Trosko and Chang, 1989; Reya et al., 2001; Clarke et al., 2006). Nas últimas décadas, este conceito tem se sedimentado com base principalmente em estudos do sistema hematopoiético, onde tanto as células-tronco normais como as CTCs estão bem caracterizadas (Reya et al., 2001). As neoplasias malignas do sistema hematopoiético fornecem evidências de que as células-tronco normais são alvo de mutações que as transformam em CTCs e governam a proliferação das células malignas. De fato, a leucemia e o mieloma múltiplo proporcionaram as primeiras evidências da existência deste tipo celular, sendo descritas inicialmente como ‘células-tronco leucêmicas” (Park et al., 1971; Reya et al., 2001).
Em reunião organizada pela Associação Americana para Pesquisa do Câncer (AACR- Cancer Stem Cell Workshop) realizada em Lansdowne, VA- EUA, em fevereiro de 2006 concluiu-se que: “A obtenção de evidências para a existência de CTCs em tumores sólidos tem sido prejudicada pelo difícil acesso e ensaios funcionais adequados para detectá-las e quantificá-las” (Clarke et al., 2006). A partir de então, muitos trabalhos têm sido desenvolvidos com o objetivo de identificar estas CTCs em particular.
Os processos de autorrenovação e de diferenciação são as características principais das células-tronco. Sendo assim, para que as CTCs sejam bem caracterizadas, estas capacidades próprias das células-tronco precisam ser identificadas e confirmadas. O ensaio considerado padrão ouro para a identificação destas células é o transplante seriado das CTCs em potencial em animais. Embora imperfeito, este ensaio é considerado uma das melhores formas de caracterizar estas células (Al-Hajj et al., 2003; Clarke et al., 2006; Nguyen et al., 2012). Este ensaio baseia-se, na inoculação seriada (diluições com diferentes concentrações celulares) de potenciais CTCs em animais, desde diluições com baixas concentrações de células até altas concentrações, conseguindo inferir qual a mínima concentração celular consegue formar tumores.
Além disso, diversos estudos estão submetendo as CTCs a diversas análises para identificação e isolamento, incluindo ensaios funcionais (como capacidade de formação de esferóides e a atividade de enzimas como aldeído desidrogenase-ALDH), análise da expressão de
antígenos de superfície celular e análise de assinaturas genéticas e epigenéticas (Costea et al., 2006; Krishnamurthy and Nör, 2012; Mertins, 2014).
A citometria de fluxo consiste em método sensível, específico e robusto para a caracterização e o isolamento de CTCs através da detecção de marcadores de superfície celular, níveis de atividade da enzima ALDH, proteínas transportadoras dependentes de ATP (ATP-binding cassete – ABC) e de fatores de transcrição associados à manutenção da pluripotência, como Oct4, Nanog e Sox2 (Patel et al., 2014). Apesar disso, a utilização da citometria de fluxo para este fim ainda apresenta limitações (Clarke et al., 2006; Dionne et al., 2015).
A expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo vem sendo realizada em espécimes oriundos de pacientes assim como em linhagens celulares de malignidades hematopoiéticas (Huff et al., 2008) ou sólidas (Visvader and Lindeman, 2008). Dentre as CTCs isoladas a partir de tumores sólidos, incluem-se as de mama (Al-Hajj et al., 2003; Iqbal et al., 2013), cérebro (Singh et al., 2004), próstata (Miki et al., 2007), pulmão (MacDonagh et al., 2016), melanoma (Parmiani, 2016), pele e cabeça e pescoço (Zhang et al., 2012; Patel et al., 2014). Os marcadores de superfície mais estudados nestas neoplasias são: CD133, CD44, CD24 individual ou em combinação com CD44, CD90, CD117, CD34 e CD20 entre outros (Routray and Mohanty, 2014). Baseado nos estudos previamente citados, observa-se que os marcadores de superfície utilizados para a identificação de CTCs normalmente são os mesmos utilizados para as células-tronco identificadas no tecido de origem. Este fato representa uma das limitações do uso de marcadores de superfície para a identificação de CTCs, uma vez que os marcadores utilizados podem, muitas vezes, identificar também as células normais do tecido de origem. Além disso, ainda não foi estabelecido nenhum marcador de superfície geral para CTCs em tumores.
Existem relativamente poucos estudos caracterizando CTCs em amostras de tecido ou linhagens celulares de CCE da cavidade bucal ou de cabeça e pescoço. Os marcadores ALDH, CD133, CD44 têm sido utilizados com sucesso para identificar CTCs em CCE bucais ou de cabeça e pescoço (Costea et al., 2006; Albers et al., 2012; Krishnamurthy and Nör, 2012; Papagerakis, 2014; Patel et al., 2014; Dionne et al., 2015; Pozzi et al., 2015; Qian et al., 2015).
No presente trabalho, a expressão de marcadores de superfície celular (CD44 s, CD44v3, CD44v6, CD24, CD133, CD326 e CD271) para CTCs foi estudada em duas linhagens celulares derivadas de CCE de língua, a SCC-9 ZsGreen e em sua derivada altamente metastática
SCC-9 ZsGreen LN-1. A primeira é uma linhagem comercial originalmente isolada de um tumor primário de língua e a segunda foi obtida em nosso laboratório através de seleção in vivo (Agostini et al., 2014). A identificação de potenciais subpopulações de CTCs pode ser de grande importância para o melhor entendimento da biologia do processo metastático e também do efeito de tratamentos quimioterápicos.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Carcinoma de células escamosas (CCE) da cavidade bucal.
O CCE da cavidade bucal é uma neoplasia epitelial invasiva, com diferentes graus de diferenciação escamosa e marcada propensão a metástases linfáticas precoces. Ocorrem predominantemente em adultos que consomem tabaco e álcool na 5ª e 6ª décadas de vida e representa mais de 90% das neoplasias malignas da cavidade bucal (Barnes et al., 2005)
De acordo com a Organização Mundial da Saúde, através do projeto GLOBOCAN 2012 (Ferlay et al., 2015), o CCE da cavidade bucal e lábios representa a décima quinta posição dentre os cânceres com maior incidência (300.000 casos ou 2.7%) e de mortalidade (145.000 casos ou 1.8%) no mundo. No Brasil, o número de novos casos de CCE da cavidade bucal estimado para o ano de 2016 é de 11.140 casos em homens e de 4.350 em mulheres, sem considerar os tumores de pele não melanoma (Coordenação de Prevenção e Vigilância. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, 2015). As maiores incidências de CCE bucais estão presentes nas regiões Sudeste e Nordeste, representando respectivamente a quarta e a nona neoplasia maligna mais frequente.
O CCE da cavidade bucal é resultante da transformação maligna dos queratinócitos que revestem a cavidade bucal, a qual ocorre em associação à exposição ao tabaco, álcool, betél, radiação solar (CCE de lábio) e, possivelmente, por infecções pelo vírus da família HPV (Papiloma Vírus Humano) no CCE de orofaringe, além de imunossupressão causada por transplantes ou pela síndrome da imunodeficiência adquirida (Scully and Bagan, 2009a). Além disto, leucoplasias e eritroplasias, consideradas desordens potencialmente malignas, tem probabilidade de transformação em CCE da cavidade bucal (van der Waal, 2014).
Clinicamente, em seus estágios mais iniciais, o CCE da cavidade bucal geralmente apresenta-se como desordens potencialmente malignas, as quais são frequentemente assintomáticas. Por este motivo, na maioria dos pacientes, a doença é detectada em estágios avançados, caracterizada pela presença de massas tumorais ulceradas, de bordas elevadas e endurecidas, as quais provocam dificuldades para falar, mastigar e deglutir e eventualmente podem apresentar sangramento. Ainda, alguns pacientes apresentam tumefações na região de pescoço correspondentes a metástases regionais já bem desenvolvidas. Do ponto de vista microscópico, as células neoplásicas do CCE da cavidade bucal apresentam diferenciação escamosa, caracterizada
pela queratinização intra ou extracelular e/ou presença de pontes intercelulares (Barnes et al., 2005). Tumores bem diferenciados apresentam queratinização abundante e pontes celulares evidentes (Barnes et al., 2005). No entanto, em tumores pouco diferenciados, a origem escamosa do epitélio é menos evidente porque as células encontram-se bastante pleomórficas, sendo esta identificada pela presença de pontes intercelulares ou pequenos focos de queratinização. O padrão morfológico desta neoplasia pode ser um arranjo em cordões, ninhos, massas, pequenos agrupamentos celulares ou ainda células individuais. As áreas de invasão são caracterizadas pela presença de projeções ou cordões celulares com formato irregular (Barnes et al., 2005).
Com relação aos aspectos moleculares, múltiplos eventos genéticos e epigenéticos podem ocorrer durante o desenvolvimento desta neoplasia, tais como a expressão aumentada de receptores de fatores de crescimento (EGFR, ERBB2, FGFR1), moléculas sinalizadoras intracelulares (RAS, RAF, STAT-3, AKT, PTEN), fatores de transcrição (MYC, FOS, JUN, CMYC), reguladores do ciclo celular (ciclina D1), inibidores da apoptose (BCL-2, BAX), mutação em genes supressores de tumor (p16, p21, p53, FAT1, NOTCH1, SMAD4, CDKN2A), perda de heterozigosidade (principalmente nas regiões 3p, 8p, 9p, 13q, 17p), polimorfismos de nucleotídeo único (que podem afetar a expressão de genes supressores de tumor ou reguladores do ciclo celular), além de hipermetilação na região promotora do gene CDKN2A e de outros genes que codificam proteínas supressoras de tumor (Choi and Myers, 2008; Scully and Bagan, 2009b; Lawrence et al., 2015)
Nosso grupo de pesquisa tem mostrado a participação da ácido graxo sintase (FASN), enzima metabólica responsável pela produção endógena de ácidos graxos, no comportamento clínico e no processo metastático dos CCE da cavidade bucal. Através de reações imuno-histoquímicas, foi demonstrado que a produção de FASN é maior no CCE da cavidade bucal do que no epitélio adjacente morfologicamente normal e em contraste com outras malignidades, a maior positividade para FASN ocorre nos CCE bem diferenciados (Silva et al., 2004). Estes achados podem ser compreendidos com base em experimentos realizados em nosso laboratório, os quais demonstraram que a expressão de FASN é estimulada durante a diferenciação dos queratinócitos bucais (Silva et al., 2008), pois as áreas de queratinização dos CCE bem diferenciados são mais positivas para FASN do que as regiões pobremente diferenciadas. O papel essencial de FASN na proliferação de células derivadas de CCE bucais humanos foi demonstrado em trabalho prévio realizado por nosso grupo, onde a inibição farmacológica desta enzima reduziu
significativamente a proliferação destas células (Agostini et al., 2004). Também já foi demonstrado que a expressão de FASN em CCE de língua está associada com características microscópicas que determinam progressão da doença e prognóstico (Silva et al. 2008). Através de ensaio in vivo foi observado que Orlistat, inibidor farmacológico da atividade de FASN, diminuiu o tamanho e índice de proliferação das neoplasias malignas provocadas pela inoculação ortotópica de células SCC-9 ZsGreen LN-1 nas línguas de camundongos imunossuprimidos (Agostini et al., 2014). Além disso, os resultados deste estudo mostraram que a inibição farmacológica da FASN com Orlistat reduziu o número de metástases linfonodais em aproximadamente 43%, sugerindo que FASN é um importante alvo terapêutico para o tratamento de CCE de língua (Agostini et al., 2014).
Entretanto, apesar da grande quantidade de estudos e das fortes evidências encontradas, não há, até o presente momento, marcadores moleculares isolados que possam ser usados para a estimativa do prognóstico clínico desta neoplasia.
2.2 Células-tronco associadas ao câncer (“Cancer stem cells” ou CTCs).
O processo de tumorigênese é extremamente complexo e caracterizado por diversas alterações de vias moleculares que levam a aquisição das chamadas “marcas biológicas” das células neoplásicas, descritas por Hanahan (Hanahan and Weinberg, 2011). Estas “marcas” compreendem 8 capacidades biológicas adquiridas durante as várias etapas do desenvolvimento de cânceres humanos e caracterizam a complexidade desta doença. Elas incluem: 1) manutenção da sinalização proliferativa, levando a proliferação constante de células; 2) inibição de supressores de crescimento; 3) resistência à morte celular; 4) imortalidade replicativa; 5) indução da angiogênese; 6) ativação de vias sinalizadoras para invasão e metástase; 7) reprogramação do metabolismo energético e 8) escape do sistema imunológico, impedindo a destruição das células neoplásicas malignas pelos linfócitos T e B, macrófagos e células “natural-killer”. Os processos citados anteriormente são possíveis devido à duas características principais das células neoplásicas: a instabilidade genômica das células neoplásicas malignas, a qual gera mutações aleatórias incluindo rearranjos cromossômicos, e o estado inflamatório das lesões malignas e pré-malignas guiadas pelas células do sistema imunológico.
De uma certa forma, as neoplasias malignas podem ser entendidas como “órgãos aberrantes”, que podem surgir a partir de células que adquirem a capacidade de proliferação indefinida e interagem com células estromais formando um complexo microambiente (Reya et al.,
2001). Estas células adquirem o fenótipo tumoral através do acúmulo de mutações e de eventos de natureza epigenética. Neste contexto, os princípios biológicos das células-tronco também podem ser aplicados (Morrison et al., 1997). Tanto as células-tronco como as CTCs têm potencial proliferativo e capacidade de dar origem a novos tecidos (normais ou tumorais). Os tecidos morfologicamente normais e as neoplasias malignas são compostos por combinações heterogêneas de células com diferentes características fenotípicas e potenciais proliferativos. Sugere-se que as CTCs realizem processos de autorrenovação e diferenciação análogos aos das células-tronco existentes nos tecidos normais (Morrison et al., 1997; Reya et al., 2001; Passegué et al., 2003; Hattori et al., 2016). Principais características das células-tronco normais atribuiveis às CTCs:
a) Diferenciação: Capacidade de dar origem a uma progênie de células heterogêneas que se diversificam e especializam progressivamente, de acordo com um processo hierárquico, reabastecendo constantemente o tecido de elementos maduros de curta duração;
b) Autorrenovação: Capacidade de formar novas células tronco com potencial idêntico de proliferação, expansão e diferenciação, mantendo assim o conjunto de células-tronco;
c) Controle homeostático: Capacidade de diferenciação equilibrada e de autorrenovação, de acordo com os estímulos ambientais e as limitações genéticas.
Na rotina diária de diagnóstico histopatológico de biópsias de pacientes portadores de neoplasias malignas, observam-se tipos celulares heterogêneos, incluindo células do sistema imunológico, células endoteliais e mesenquimais, além de uma variedade de células normais ou malignas. Apesar dos tecidos normais também apresentarem inúmeros tipos celulares, de um modo geral, as neoplasias malignas apresentam células com morfologias nucleares atípicas e variados graus de diferenciação. Isto pode explicar, em parte,a heterogeneicidade das células tumorais que também são influenciadas pelo microambiente e pela instabilidade genômica.
Estas observações conduzem à explicação da origem das neoplasias malignas com dois modelos distintos (Reya et al., 2001; Visvader and Lindeman, 2008; Nguyen et al., 2012): 1) O modelo estocástico ou evolutivo baseia-se em mudanças espontâneas em fenótipos celulares para explicar a heterogeneidade, portanto, cada célula de uma neoplasia maligna teria o mesmo potencial de atuar como CTCs e 2) o modelo hierárquico atribui a heterogeneidade ao processo de diferenciação a partir de uma única linhagem de CTCs monoclonal. Sendo este último modelo mais comun associado na teoria da existência de CTCs.
Algumas observações clássicas definem a existência de uma população de CTCs (revisado por Albers et al. 2012):
1. CTCs iniciam tumores malignos e conduzem processos neoplásicos (Lobo et al., 2007);
2. CTCs podem se duplicar por divisão celular simétrica gerando células com o mesmo fenótipo da célula-mãe (com a mesma capacidade de autorrenovação) (Morrison and Kimble, 2006);
3. Após transplante de um hospedeiro adequado, CTCs recriam o fenótipo heterogêneo do tumor original por divisões celulares assimétricas. Neste processo de divisão celular, uma CTC origina duas células-filhas diferentes: uma CTC idênticas a progenitora, com a mesma capacidade de autorrenovação e outra célula especializada em uma determinada função (Morrison and Kimble, 2006);
4. CTCs são geralmente lentas ou não se dividem portanto, são relativamente resistentes à radiação e aos tratamentos quimioterapêuticos (Cortes-Dericks et al., 2010);
5. Células neoplásicas possuem perfis distintos de marcadores de superfície e podem ser isoladas com o auxílio de citometria de fluxo ou outros procedimentos de imunosseparação (Visvader and Lindeman, 2008).
A hipótese da indução da tumorigênese por CTCs baseia-se em achados do sistema hematopoiético, no qual tanto as células-tronco como células neoplásicas foram bem caracterizadas. Uma das primeiras evidências da existência de CTCs demonstrou que células de mieloma obtidas a partir de ascite de rato eram capazes de formar colônias in vitro (Park et al., 1971). O conceito atual de CTC teve origem nas observacões de John Dick (Lapidot et al., 1994), que identificou em sua pesquisa CTCs de leucemia mielóide aguda por meio de ensaios com diluições limitantes de células leucêmicas transplantadas em camundongos imunocomprometidos, demostrando que uma única célula leucêmica poderia reproduzir o tumor original.
2.3 Origem das CTCs.
Três fontes têm sido propostas como origem de CTCs: 1) as células-tronco normais, 2) as células progenitoras comprometidas ou afetadas por mutações e 3) células somáticas (Croker and Allan, 2008). Células-tronco normais podem dar origem a células tumorais caracterizadas por autorrenovação e pluripotência, que utilizam vias reguladoras das células-tronco normais (Allan et
al., 2007). Já as células progenitoras podem dar origem a células neoplásicas por meio de uma célula intermediária, já envolvida em fenômenos de diferenciação, resultando em células maduras com capacidade parcial de auto-renovação (Kucia and Ratajczak, 2006; Li et al., 2007b) Por fim, células somáticas já diferenciadas podem dar origem a células malignas, que se desdiferenciam para assumir fenótipo semelhante ao da célula tronco e adquirir propriedades de autorrenovação (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007).
Na conferência organizada pelo Grupo de Oncologia “Ludwig Boltzmann”, realizada em setembro do ano de 2011 em Viena, pesquisadores do mundo se reuniram para rever os conceitos e propor uma terminologia para as CTCs (Valent et al., 2012), definindo-as como um subtipo de células malignas clonais capazes de manter o câncer e de se propagarem indefinidamente. Do ponto de vista experimental, são células capazes de reproduzir populações neoplásicas em xenoenxertos realizados em modelos animais.
2.4 Vias que regulam as células-tronco.
A autorrenovação de CTCs através da divisão celular simétrica e assimétrica é mediada pelas mesmas vias de transdução que coordenam o desenvolvimento embrionário e a reparação dos tecidos, em particular, Wnt, Hedgehog, e Notch (Reya et al., 2001; Mertins, 2014). Estas vias contribuem para a autorrenovação das células-tronco e/ou progenitoras em vários órgãos, incluindo o sistema hematopoiético e nervoso (Nickoloff et al., 2003; Karhadkar et al., 2004; Klaus and Birchmeier, 2008). A via Notch normalmente é expressa no sistema vascular, onde ativa as células endoteliais e promove angiogênese. Wnt/catenina são moléculas sinalizadoras intracelulares que regulam o desenvolvimento em vários tecidos como medula óssea (Van Den Berg et al., 1998), epiderme (Zhu and Watt, 1999) e mucosa intestinal(Korinek et al., 1998). Quando desregulada, esta via contribui para a tumorigênese (Peifer and Polakis, 2000; de Sousa E Melo and Vermeulen, 2016). Já a via de sinalização Sonic Hedgehog (SHH) controla a manutenção de CTCs, a diferenciação celular, a polaridade, bem como a proliferação dos tecidos hematopoiético, nervoso e células germinativas (Wechsler-Reya and Scott, 1999; Bhardwaj et al., 2001; Zhang and Kalderon, 2001). Mutações em elementos que pertencem a estas vias têm sido associadas com o desenvolvimento de tumores humanos, incluindo carcinoma de cólon, neoplasias epidérmicas (Wnt), meduloblastoma, carcinoma basocelular (SHH), e leucemias de células T (Notch). Outras
vias de transdução de sinais que podem estar alteradas em CTCs são a do fator de necroses tumoral (TNF), do receptor do hormônio de crescimento (GFR) e da proteína morfogenética óssea (BMP). 2.5 Métodos de identificação e isolamento de CTCs.
A identificação e caracterização de CTCs representa uma nova área com aplicações promissórias no prognóstico e na terapêutica em câncer. Vários métodos laboratoriais têm sido utilizados para identificação, isolamento e caracterização de CTCs, como expressão de antígenos de superfície, ensaio de formação de esferóides e de formação de colônias, caracterização da atividade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH), ensaio para detecção chamada “side population” (descrita a seguir) e de tumorigenicidade a partir de diluições limitantes.
No ensaio de formação de esferóides, células obtidas por diluições limitantes são colocadas em cultura em placas de baixa aderência de 24 ou 96 poços com meio definido (incluindo certos fatores de crescimento, como por exemplo EGF e FGF, e sem adição de soro fetal bovino). A formação de esferoides é avaliada, a partir de aglomerados de células de flutuantes. Quando as esferas são desagregadas e replaqueadas, propagando-se e reformando essas mesmas estruturas, a presença de CTCs é caracterizada (Pastrana et al., 2011). O ensaio de formação de colônias demostra a capacidade que as CTCs possuem para formar colônias a nível clonal em ágar, o que é considerado um critério de tumorigenicidade (Collins et al., 2005). Acredita-se que a divisão celular nestas colônias está associada ao processo de diferenciação e, portanto, quanto maior for a colônia gerada, menos diferenciada são suas CTCs.
O método para a determinação de “side population” baseia-se no fato de que as CTCs são intrinsecamente resistentes a drogas devido à capacidade de extrusão pelos transportadores ABC, como ABCB5. Uma característica única de células-tronco é a elevada expressão de membros das proteínas transportadoras ABC, os quais usam ATP para translocar vários substratos através da membrana. Em condições normais, as bombas de efluxo de drogas são responsáveis pela rápida eliminação dos produtos metabólicos, compostos tóxicos ou drogas. Sendo assim, as proteínas transportadoras ABC têm um potencial de proteção e garantem uma maior quimioresistência, tanto para as células-tronco normais como para as CTCs em comparação com células diferenciadas da massa tumoral. Este mecanismo tem sido especialmente analisado em glioblastomas, carcinoma de cólon, câncer da mama, entre outros. A alta expressão de proteínas transportadoras ABC nas CTCs permite a identificação destas células por citometria de fluxo como uma ''Side Population"(SP). Na
análise por citometria de fluxo, as células SP formam uma população distinta, normalmente células pequenas (tipicamente menos de 0,1%), mostrando pouca ou nenhuma fluorescência de DNA com corantes vitais como Hoechst 33342. Corantes vitais são eficazmente eliminados pelas células que expressam proteínas transportadoras ABC. ( revisado por Greve et al., 2012)
O padrão ouro para a identificação de CTCs é o ensaio de tumorigenicidade por diluição limitante, no qual uma população de células tumorais, presumivelmente contendo CTCs, é diluída (em aproximadamente 10 vezes) até que a solução atinja níveis extremamente baixos (de uma a dez células) que a seguir são injetadas em camundongos. Com isso, é possivel estabelecer as concentrações da diluição em que as neoplasias são formadas. Nesse experimento, controle de fatores como tipo de camundongos utilizados, sítio e forma da inoculação, adição de matriz extracelular disponíveis comercialmente, parecem ter uma influência positiva nos resultados (O’Brien et al., 2007; Quintana et al., 2008). Por fim, a expressão de antígenos de superfície vem sendo realizada em espécimes oriundas de pacientes assim como em linhagens celulares de malignidades hematopoiéticas, como o mieloma múltiplo (Huff et al., 2008), ou sólidas (Visvader and Lindeman, 2008). Em uma população heterogênea de células tumorais em suspensão são aplicados anticorpos conjugados a fluoróforos, geralmente em combinações duplas ou triplas, para antígenos associados com atividade de CTCs. A lista de potenciais marcadores é bastante grande, incluindo CD133, CD44, CD24 (em combinação com CD44), CD90, CD117, CD34 e CD20, dentre outros (Routray and Mohanty, 2014). Sendo muitos deles já avaliados em múltiplas neoplasias malignas de cérebro (Singh et al., 2004), próstata (Miki et al., 2007), pulmão (MacDonagh et al., 2016), cólon, pâncreas, fígado, melanoma (Parmiani, 2016), pele e cabeça e pescoço (Zhang et al., 2012; Patel et al., 2014).
2.6 Antígenos de superfície celular para a identificação de CTCs.
Os marcadores de superfície mais comumente utilizados para a identificação e isolamento de CTCs em neoplasias malignas sólidas, especificamente de origem epitelial, pertencem à família de proteínas conhecidas coletivamente como moléculas de adesão celular. São glicoproteínas de superfície celular que possuem extensos domínios extracelulares, uma região transmembrânica e uma porção intracelular (ou domínio citoplasmático). Estas são denominadas moléculas de adesão por causa da sua ligação relativamente forte à ligantes específicos de componentes da MEC ou de outras células. Este tipo de interação é complexo e pode estar
envolvido com os mecanismos que permitem a célula interagir e detectar alterações físicas ou mecânicas do ambiente extracelular. As proteínas de adesão celular não só estão envolvidas em interações célula-célula ou célula-matriz, como também participam da motilidade, diferenciação, sinalização celular e transcrição de genes (revisado por Goodison et al., 1999).
2.6.1 CD44.
As glicoproteínas CD44 são membros bem caracterizados da família das moléculas de adesão celular ligantes de hialuronato. CD44 é codificada por um gene mapeado no locus cromossômico 11p13 (Goodfellow et al., 1982). CD44 interage com proteínas da MEC, sendo seu principal ligante o hialuronato, um polissacarídeo extracelular abundante encontrado na MEC de mamíferos. Além do hialuronato, outros ligantes de CD44 são a osteopontina, a serglicina, o colágeno I e IV, a fibronectina e a laminina. O gene que codifica o CD44 é composto por dois grupos de éxons, um que compreende os éxons 1 a 5 e 16 a 20, e formam um transcrito que codifica a forma “standard” ubiquamente expressa (CD44s), e outro grupo que compreende os éxons variáveis 6 a 15 (também conhecidos como v1-10) e podem ser alternativamente expressos e incluídos dentro dos éxons “standard” em um sítio de inserção entre os éxons 5 e 16. Moléculas que contêm os éxons variáveis são designadas CD44v e, em teoria, o splicing alternativo permitiria a geração de mais de 1000 diferentes variantes de CD44 (Screaton et al., 1992). As isoformas de CD44 possuem os mesmos domínios intracelulares e transmembrânicos, variando apenas a estrutura do domínio extracelular que por fim determinam as suas diferentes funções.
A proteína CD44 codificada pelos éxons invariáveis do seu gene codificante é denominada CD44 “standard” (CD44s), sendo esta a molécula mais abundante quando comparada às formas variáveis desta proteína. O CD44s contém 363 aminoácidos, com uma massa molecular aproximada de 37 kDa. Esta proteína possui três regiões, uma de 72 aminoácidos correspondente ao domínio citoplasmático C-terminal, um domínio transmembrânico de 21 aminoácidos e um domínio extracelular de 270 aminoácidos (Goodison et al., 1999).
2.6.2 CD44s e suas isoformas variáveis em neoplasias malignas.
A expressão de CD44, sozinho ou em conjunto com marcadores adicionais, tem sido amplamente utilizada para a identificação das CTCs em cânceres de mama, da cavidade bucal, de
próstata, do cólon e do pâncreas (Al-Hajj et al., 2003; Collins et al., 2005; Dalerba et al., 2007b; Li et al., 2007a; Prince et al., 2007)
O câncer de mama foi a primeira malignidade sólida na qual se identificou e isolou CTCs com os marcadores CD44 e CD24, sendo que a população C44+/CD24- apresentou alta tumorigenicidade (Al-Hajj et al., 2003). A primeira identificação de CTCs em CCE de cabeça e pescoço foi realizada também com base na expressão de CD44 (Prince et al., 2007). Ao mesmo tempo, um estudo de Mack and Gires, (2008) demonstrou por imuno-histoquímica que, tanto os tecidos de mucosa oral normal como de lesões pré-malignas e malignas da mesma região, apresentaram positividade tanto para CD44s como para sua forma variável CD44v6. Sendo assim, sugere-se que a expressão destes marcadores não distingue epitélio benigno e maligno em cavidade bucal, deixando em dúvida a especificidade destes marcadores para CTCs.
Biddle et al., (2013) demostraram que as CTCs com fenótipo epitelial expressavam predominantemente as formas variáveis de CD44 e que as CTCs que sofreram uma transição epitélio-mesênquima diminuem a expressão das isoformas variáveis e aumentam a expressão de CD44s. Neste mesmo estudo, os autores compararam diferentes agentes de dissociação celular e concluíram que o tratamento enzimático usado para dissociação de células em cultura ou de amostras de tumores causa destruição das isoformas variáveis de CD44 sem afetar a expressão de CD44s. Esta observação é de extrema importância para estudos que pretendam avaliar corretamente a identificação das isoformas variáveis de CD44 (Biddle et al., 2013).
Spiegelberg et al., (2014) avaliaram a expressão de CD44s e suas variantes v3, v4, v5, v6, v7, v7/8 e v10 em 4 diferentes linhagens celulares de CCE de cabeça e pescoço (SCC-25, H314, UT-SCC7 e UT-SCC12) e verificaram que todas as linhagens apresentaram alta expressão de CD44s. Importantemente, as linhagens UT-SCC7, UT-SCC12 e SCC25 apresentaram alta expressão de CD44v6 e as linhagens UT-SCC7 e UT-SCC12 demostraram alta expressão da isoforma CD44v3 (Spiegelberg et al., 2014). Além disso, foi demonstrado que a expressão destes marcadores em diferentes linhagens de CCE de cabeça e pescoço foi aumentada quando submetidas à privação de soro (Okamoto et al., 2009; Spiegelberg et al., 2014).
Em relação a isoforma variável CD44v3, uma característica peculiar é que esta proteína apresenta um sítio de ligação para fatores de crescimento (tais como fator de crescimento fibroblástico básico e fator de crescimento epidérmico ligado a heparina) e este mesmo domínio
parece ser crítico para o desenvolvimento do fenótipo metastático (Bennett et al., 1995; Reategui et al., 2006). CD44 v3, em algumas linhagens celulares de CCE de cabeça e pescoço, está associado com migração, formação clonal, resistência à cisplatina, além da atividade de metaloproteinases de matriz (Wang et al., 2007). A interação de CD44v3 com as vias de sinalização Oct4-Sox2-Nanog (induzida pelo hialuronato) desempenha um papel fundamental na produção de miR-302, levando a uma repressão de AOF1/AOF2/DNMT1 e ativação de proteínas de sobrevivência (Bourguignon et al., 2012). Todos esses eventos parecem ser extremamente importantes para a aquisição de propriedades das CTCs, incluindo a autorrenovação, a formação clonal e a resistência à quimioterapia no câncer de cabeça e pescoço.
CD44v6 é atualmente o antígeno tumoral mais estabelecido entre todas as isoformas variáveis de CD44, o qual é expresso em diversos tipos de cânceres humanos, incluindo o CCE de cabeça e pescoço. Esta molécula funciona como um co-receptor da proteína c-Met (Orian-Rousseau et al., 2002) e está associada à formação de tumores, invasão e metástases (Heider et al., 2004). Papaefthymiou et al., (2008), demostraram que esta isoforma é abundantemente expressa em CCE de cabeça e pescoço avançado e metastático, ao contrário dos queratinócitos bucais normais, sugerindo uma associação entre a expressão de CD44v6 e metástase. Por outro lado, Mack & Gires, (2008) observaram positividade para CD44s e CD44v6 em tecidos de mucosa bucal normal e de CCE da cavidade bucal.
Bánky et al. (2012) demonstraram que tumores primários desenvolvidos pela inoculação ortotópica de três diferentes linhagens celulares de adenocarcinoma coloretal revelaram expressão gênica de CD44v3 e CD44v6 menores que suas respectivas metástases sugerindo uma participação importante destas moléculas no processo metastático. Estes autores concluíram ainda que estas isoformas atuam como “genes de metástases” guiados pelo microambiente tumoral. No estudo realizado por Biddle et al., (2013) foi mostrado que as CTCs com um fenótipo epitelial expressam predominantemente as isoformas que contém os éxons variáveis de CD44. No entanto, as CTCs que sofreram o processo de TEM possuem a expressão das isoformas variáveis diminuída e a expressão de CD44s aumentada.
2.6.3 CD133.
CD133 humano (também conhecido como AC133 ou prominina-1) é uma proteína de 865 aminoácidos, codificada pelo gene PROM1, mapeado no cromossomo 4p15. Esta proteína
contém cinco domínios transmembrânicos e dois grandes domínios extracelulares que podem ser glicosilados. CD133 possui massa molecular de 97 kDa e, quando glicosilada, apresenta uma massa molecular de 120 kDa (Miraglia et al., 1997a; Weigmann et al., 1997; Wu and Wu, 2009). Em grande parte, CD133 é distribuída em protuberâncias de membrana citoplasmática em vários tipos de células e, nas células epiteliais, é concentrado em microvilosidades. Esta proteína é considerada como um marcador de células tronco em diversos tecidos e é usada também para identificar CTCs de tumores hepáticos, pulmonares e de melanoma (Wu and Wu, 2009).
CD133 foi inicialmente identificada como um marcador de superfície para células tronco hematopoiéticas CD34+ (Miraglia et al., 1997b), assim como para células nervosas, células de próstata e rins (revisado por Wu & Wu 2009). Atualmente, este marcador tem sido utilizado na identificação de CTCs em neoplasias malignas de cólon (Ricci-Vitiani et al., 2007), cérebro (Fan et al., 2010) e cabeça e pescoço (Zhou et al., 2007). As células CD133 positivas isoladas de tumores de cabeça e pescoço possuem uma considerável capacidade de autorrenovação, proliferação e diferenciação in vitro (Zhou et al., 2007). Chiou et al., (2008), foram os primeiros pesquisadores a avaliar CD133 como marcador de superfície em linhagens de CCE de cavidade bucal, demostrando que a expressão deste marcador encontra-se aumentada em cerca de 60% naquelas células submetidas a ensaios de formação de esferóides ou em culturas primárias de CCE de cavidade bucal com meios de cultura livres de soro.
Felthaus et al. (2011) estudaram os níveis de expressão de CD133 por PCR e citometria de fluxo em linhagens celulares de CCE de cavidade bucal com diversos graus de diferenciação (PCI-4A, PCI-8, PCI-9A e PCI-13). Apesar de os níveis de expressão gênica do CD133 terem sido relativamente altos em todas as linhagens, apenas a linhagem pobremente diferenciada PCI-13 foi positiva para o CD133 em citometria de fluxo. A seguir, todas as linhagens foram submetidas a ensaios de formação de esferas, porém apenas a linhagem PCI-13 foi capaz de formar as estruturas na ausência de FBS, um indicativo de que esta linhagem pode possuir populações semelhantes a células tronco. Para enriquecer esta população, células monoclonais foram isoladas de holoclones (formação de colônias de células-tronco, que tem um maior potencial de crescimento por não conter células diferenciadas) das células PCI-13. As células monoclonais obtidas apresentavam proliferação reduzida e elevada marcação para CD133, sugerindo que o enriquecimento de populações semelhantes a células-tronco foi positivamente obtido a partir das esferas formadas
pela linhagem PCI-13. Adicionalmente, estas células foram submetidas a ensaios de proliferação na presença de ativadores e inibidores da via Wtn, resultando, respectivamente, em uma resposta estimulatória e inibitória a estes compostos, ao contrário das células parentais. Estas células-tronco “like” também apresentaram resistência ao tratamento com o Paclitaxel, ao contrário das células parentais. Estes resultados sugerem que a expressão de CD133 em conjunto com a realização de ensaios funcionais pode auxiliar no enriquecimento e no isolamento de populações de células-tronco a partir de linhagens de CCE da cavidade bucal.
No mesmo trabalho, foi demonstrado também, através imuno-histoquímica em biópsias de CCE da cavidade bucal com diferentes graus de diferenciação assim como biópsia de tecido epitelial bucal normal, que as células CD133 positivas, de ambos tecidos, possuem pouca ou nenhuma expressão de Ki67, indicando que estas células são de proliferação celular lenta, uma característica importante das células-tronco segundo o modelo hierárquico. Em estudo realizado por Zhang et al., (2010), foi observado que as células CD133+ possuem maior clonogenicidade, poder de invasão e aumento da tumorigênese in vivo, em comparação com as CD133-. Demonstraram também que as células CD133+ foram substancialmente resistentes ao tratamento com paclitaxel, tanto in vivo como in vitro, sugirindo que esta subpopulação pode contribuir para a quimioresistência em CCE de cavidade bucal.
2.6.4 CD24.
Springer et al., (1978) identificaram uma molécula resistente ao calor, a qual foi nomeada por estes autores como “antígeno termo-estável” (Springer et al., 1978). Em 1990, o gene CD24 de ratos foi clonado e verificou-se que codifica uma pequena proteína cuja forma madura consiste de apenas 30 aminoácidos (Kay et al., 1990). Logo em seguida, o gene que codifica a proteína CD24 humana foi identificado e localizado por hibridização in situ, no cromossomo 6q21 (Hough et al., 1994).
A proteína CD24 humana isolada a partir de diferentes tecidos ou tipos celulares apresenta diferentes pesos moleculares, variando entre 20 e 70 kDa dependendo do grau de glicosilação, demonstrando que este processo pós-traducional é altamente variável e dependente do tipo de célula (revisado por Fang et al., 2010). Além disso, o CD24 possui diferentes funções de acordo com o tecido no qual é expresso. Em tecido endotelial, o CD24 promove a ligação à selectina P (molécula de adesão celular presente no endotélio), contribuindo no processo de
"rolamento" que desacelera os leucócitos e os faz parar nas proximidades da região inflamada. A via de ligação CD24/ selectina P pode ser importante na disseminação das células tumorais, facilitando a interação com plaquetas ou células endoteliais (Aigner et al., 1997; Fang et al., 2010). Uma outra função atribuída ao CD24 é a de proteção contra patógenos, pois este se liga a moléculas que expressam a proteína ”Damage Associated Molecule Pattern” (DAMPs) em células hematopoiéticas. Em cérebro, CD24 está associada a ligação com moléculas de adesão como contactina e a TAG-1 que estão relacionadas a regeneração dos prolongamentos de neurônios.
Baumann et al., (2005) superexpressaram CD24 em células 1AS e MTly, derivadas de carcinoma de mama de ratos, e realizaram ensaios de migração, invasão, disseminação e tumorigênese. Os resultados obtidos demonstraram que a expressão de CD24 induziu a proliferação de células tumorais tanto in vivo como in vitro. Além disso, o CD24 promoveu a ligação à selectina P, estimulando a adesão celular à fibronectina, colágeno tipo I e IV e laminina, processos que foram dependentes, ou não, da ativação das integrinas α3β1 e α4β1. Com isso, foi observado um rápido espalhamento e um aumento da motilidade celular e invasão. As observações anteriores implicam que CD24 participa na regulação de várias propriedades das células tumorais de relevância direta para o crescimento de tumores e metástases.
CD24 é um marcador de superfície celular para CTCs utilizado frequentemente em conjunto com CD44 para a identificação e/ou fenotipagem de células-tronco. Hurt et al., (2008) demonstraram que a linhagem celular LNCap, proveniente de adenocarcinoma de próstata metastático humano, possui o fenótipo CD44+/CD24−, possuindo características de CTCs. Estas células foram capazes de promover o desenvolvimento de tumores xenográficos em camundongos imunossuprimidos, em concentrações mínimas de até 100 células por inoculação (Hurt et al., 2008). Em estudo prévio com células de câncer de mama, células CD44+/CD24− exibiram propriedades clonogênicas e tumorigênicas (Al-Hajj et al., 2003). Portanto, também a negatividade para CD24 pode ser evidência de agressividade em tumores de mama e próstata.
Por outro lado, neoplasias malignas de pâncreas (Li et al. 2007), cólon (Yeung et al., 2010), fígado (Lee et al., 2011) e ovário (Gao et al., 2010) apresentaram altos níveis de CD24. Han et al., (2014), demostraram que linhagens celulares derivadas de CCE de língua e de carcinoma de glândula salivar, com o fenótipo CD24+/CD44+, possuem características de autorrenovação e diferenciação. Segundo estes autores, estas células apresentaram maior invasão in vitro, maior
formação de colônias celulares em géis de colágeno, elevada resistência à cisplatina e maior tumorigenicidade quando comparadas as células CD24-/CD44+.
Em outro estudo desenvolvido por Chen et al. (2011), foi estudada a presença de subpopulações celulares com o fenótipo CD44+/CD24- em cinco diferentes linhagens celulares de CCE de cabeça e pescoço. No entanto, a expressão deste fenótipo foi altamente variável (0,5 a 96%) nas linhagens celulares estudadas. Porém, quando a enzima ALDH1 foi analisada em conjunto com o CD24 e o CD44, as células estudadas apresentaram o fenótipo CD44+/CD24 -/ALDH+ entre 0 e 33%. As cinco linhagens estudadas foram submetidas à formação de esferóides, isoladas a partir destes e comparadas com as células cultivadas em monocamadas. As células derivadas dos esferóides realizados com as 5 linhagens celulares apresentaram maior quantidade de células CD44+/CD24-/ALDH+ quando comparadas com as suas células parentais cultivadas em monocamadas.A seguir, as células derivadas dos esferóides e as células parentais cultivadas em monocamadasforam utilizadas em ensaios funcionais de invasão, ciclo celular, clonogenicidade, expressão de fatores de transcrição associadas CTCs e de genes relacionados a TEM. Estes ensaios demonstraram que as células derivadas de esferóides possuem maior capacidade de formação de colônias, atividade de invasão, parada do ciclo celular na fase G0, assim como um incremento significativo de mRNA de genes relacionados a CTCs e a TEM. Em resumo, estes resultados mostram que a população de CTCs pode ser enriquecida por meio de técnicas de cultura independente de ancoragem.
2.6.5 CD326 (ESA ou EpCAM).
Devido ao seu descobrimento simultâneo por diversos grupos de pesquisa, a molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM) recebeu uma variedade de nomes, dentre eles: CD 326, antígeno de superfície epitelial (ESA) e antígeno de epitélio humano (HEA 125) (revisado por Schnell et al., 2013).
O CD326 humano é um polipeptídio de 314 aminoácidos, composto por um domínio extracelular grande (N-terminal) de 242 aminoácidos um domínio transmembrânico simples de 23 aminoácidos e um domínio citoplasmático de 26 aminoácidos (C-terminal). O gene que codifica o CD326 humano está localizado no cromossomo 2p21 e tem um tamanho estimado de 14 kb (Strnad et al., 1989; revisado por Schnell et al., 2013). A comparação das sequências de cDNA e genômicas têm mostrado que o gene que codifica CD326 é composto por 9 éxons, sendo o domínio
extracelular de CD326 e o peptídeo sinal (sequência que possui entre 15 e 30 aminoácidos geralmente localizada na região N-terminal de proteínas), que são codificados pelos éxons 1 a 6, a região transmembrânica pelo éxon 7 e o domínio intracelular pelos éxons 8 e 9.
Em tecidos saudáveis, altos níveis de CD326 estão associados com proliferação durante a morfogênese (Cirulli et al., 1998), regeneração tecidual (de Boer et al., 1999; Trzpis et al., 2007) e manutenção de células tronco (Sundberg et al., 2009). No câncer, alta expressão de CD326 parece favorecer a progressão de tumores de natureza epitelial e estar associada a prognóstico pobre para o paciente (Baeuerle and Gires, 2007; Trzpis et al., 2007; van der Gun et al., 2010; Patriarca et al., 2012), Sendo que no câncer de próstata, estes altos níveis estão associados com incidência de metástases, quimio e radioresistência através da via de sinalização PI3K/Akt/mTOR (Ni et al., 2013).
A transição epitélio-mesenquimal (TEM) é um processo no qual as células epiteliais adquirem um fenótipo mesenquimal migratório (revisado por Hay, 2005) que é frequentemente reativado nas neoplasias malignas, auxiliando o processo de invasão tumoral e de geração de metástases (Yang et al., 2008; Gjerdrum et al., 2010). Já transição mesenquimal-epitélio (TME) é um processo no qual células migratórias revertem o seu fenótipo para epitelial sendo também observado em neoplasias malignas e parece ser necessária para permitir novo crescimento do tumor em sítios metastáticos (Tsai et al., 2012). Sendo assim, ambos os processos levam a uma plasticidade fenotípica, característica importante das células neoplásicas, que está associada com a progressão do tumor (Brabletz, 2012).
Biddle et al. (2011), identificaram duas subpopulações distintas de CTCs em CCE da cavidade bucal, a CD44+/CD326alto, que são epiteliais proliferativas, e a CD44alto/CD326baixo/-, que sofrem TEM e são migratórias e metastáticas. Subpopulações de CTCs equivalentes também já foram identificadas no câncer da mama (Sarrio et al., 2012; Liu et al., 2014). Parece existir uma hierarquia de plasticidade dentro da subpopulação de CTCs que sofreram TEM, de forma que apenas um subconjunto delas pode passar pela TME e readquirir fenótipo epitelial (Biddle et al., 2011).
2.6.6 CD271.
O CD271, também conhecido como receptor do fator de crescimento neural de baixa afinidade (NGF) ou p75NTR, é um receptor de neurotrofina e um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral. No sistema nervoso, tem funções críticas na sobrevivência celular, diferenciação e migração de células neuronais. Recentemente, esta molécula foi identificado como um marcador de CTCs em melanoma humano (Boiko et al., 2010; Civenni et al., 2011), carcinoma esofágico (Huang et al., 2009) e carcinoma da hipofaringe (Imai et al., 2013). CD271 é expresso tanto en células do epitelio bucal normal como em neurônios. Além de ser expresso em células da camada basal do epitélio bucal normal (Thompson et al., 1989; Nakamura et al., 2007), CD271 também é expresso em displasias epiteliais bucais e em CCE bucais (Kiyosue et al., 2013). É importante ressaltar que a expressão aumentada de CD271 está associada com pior evolução clínica em carcinomas de esôfago, de hipofaringe e bucais (revisado por Murillo-Sauca et al. 2014). Nestes últimos, as células que expressam CD271 formam um subconjunto de células CD44+ (CD44+/CD271+) que possuem a maior capacidade de iniciar tumores (Murillo-Sauca et al. 2014).
Subpopulações de células com alta ou baixa expressão de CD271 foram isoladas na linhagem celular CalH3, derivada de CCE da cavidade bucal, e comparadas quanto a formação de colônias, esferóides e capacidade de formação de tumores in vivo (Osman et al. 2015). Neste trabalho, todos os ensaios evidenciaram que as células CD271alto apresentam propriedades de CTCs significativamente mais elevadas do que as células CD271baixo. No entanto, a subpopulação de células CD271baixo apresentou algumas características de CTC em menor proporção.
2.7 Linhagem Celular SCC-9 e marcadores de superfície para CTCs
Dois estudos sobre CTCs foram desenvolvidos na linhagem SCC-9 (Zhu et al., 2012; Yang et al., 2013). Zhu et al.(2012) e demonstraram que células SCC-9 que superexpressam Snail tiveram uma positividade acentuada de CD24 quando comparadas a SCC-9 transfectadas com o vetor vazio. Snail é um fator de transcrição que pode induzir TEM e preservação da função de células-tronco, o que pode induzir a resistência à radio e quimioterapia. No mesmo estudo, foi demonstrado que tanto as SCC-9 que superexpressavam Snail quanto células controle tiveram alta expressão de CD44 e baixa expressão de CD133. A superexpressão de Snail nas células SCC-9 induziu um fenótipo fibroblástico nestas células, diminuiu a expressão de marcadores epiteliais
como E-caderina e b-catenina e induziu a expressão de vimentina. Além disso, a superexpressão de Snail nestas células resultou em menor proliferação celular, maiores taxas de formação de colônias e maior expressão de marcadores associados a CTCs, mostrando que a superexpressão de Snail induz TEM e promove traços de CTCs nas células SCC-9.
Yang et al., (2013) observaram que a superexpressão de MMP-MT1 (proteinase da superfície celular envolvida na degradação de componentes da MEC) induziu um fenótipo fibroblástico, diminuiu a expressão de marcadores epiteliais (E-caderina, cytokeratin18 e β-catenina) e induziu a expressão de marcadores mesenquimais (vimentina e fibronectina) nas células SCC-9. Estas células foram avaliadas para os marcadores de superfície CD24, CD133 e CD44, por citometria de fluxo. As células SCC-9 que superexpressavam MMP-MT1 apresentaram baixa expressão de CD24 em contraste com as células SCC-9 controle, sem alterar a alta expressão de CD44. A expressão de CD133 mostrou uma positividade de 0,89% ou 0,29% em células SCC-9-M e SCC-9-N, respectivamente.Em conclusão, este estudo indicou que a superexpressão de MMP-MT1 induz TEM, resultando na aquisição de propriedades de CTCs nas células SCC-9.
Os dados da literatura sobre os marcadores de superfície para identificação de CTCs na linhagem SCC-9 são escassos, sendo fundamental a utilização de múltiplos marcadores de superfície, em experimentos com condições adequadas de cultura, a fim de que populações corretas de CTCs sejam identificadas nesta linhagem celular.
3 PROPOSIÇÃO
3.1. Proposição geral
Identificar a presença de CTCs através de marcadores de superfície de membrana nas linhagens SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1.
3.2. Proposições específicas
Avaliar a existência de imunoexpressão dos marcadores de superfície de membrana: CD44“standard”, CD44v3, CD44v6, CD24, CD326, CD133 e CD271 nas linhagens SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1.
Identificar e comparar a expressão da combinação dos marcadores de superfície: CD44s/CD44v3/CD326 nas linhagens SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1.
Identificar e comparar a expressão da combinação dos marcadores de superfície: CD44s/CD44v3/CD44v6 nas linhagens SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1.
Identificar e comparar a expressão da combinação dos marcadores de superfície: CD44s/CD24/CD133 nas linhagens SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1.
Identificar e comparar a expressão da combinação dos marcadores de superfície: CD44/CD24/CD271 nas linhagens SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Cultura de células.
As linhagens celulares SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1 foram utilizadas nesta pesquisa. A linhagem SCC-9 ZsGreen (Agostini et al., 2014) foi obtida pela transdução com o vector retroviral pLNCX2 (Clontech) contendo a sequência que codifica proteína ZsGreen nas células SCC-9, adquiridas da “American Type Culture Collection” (ATCC, E.U.A.). De acordo com as informações obtidas no catálogo da ATCC, esta linhagem foi estabelecida a partir de um CCE primário de língua de um paciente do gênero masculino, com 25 anos de idade. A linhagem metastática de CCE oral humano SCC-9 ZsGreen LN-1 foi criada por nosso grupo por seleção in vivo a partir de células SCC-9 ZsGreen (Agostini et al., 2014).
O cultivo de ambas linhagens celulares foi feito em frascos plásticos de 75 cm2 (NUNC, Dinamarca) em meio de cultura DMEM/F-12 (Invitrogen, E.U.A) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB, Cultilab, Brasil), 400 ng/ml de hidrocortisona (succinato sódico de hidrocortisona – Eurofarma, Brasil) e solução antibiótica e antimicótica (Invitrogen) na diluição de 1:100 a 37°C em atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% de umidade. As células foram cultivadas até cerca de 70% de confluência, quando o meio de cultura era removido e estas lavadas com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4). Em seguida, realizou-se incubação com 2 ml de tripsina a 2%, até o desprendimento total das células da superfície de cultura, o que foi acompanhado por observação com um microscópio de contraste de fase invertido (Nikon Eclipse TI). A ação da tripsina foi interrompida pela adição de 8 ml de meio de cultura suplementado com 10% de SFB. A suspensão de células foi transferida para tubos cônicos de plástico de 15 ml (Corning, E.U.A.) e centrifugadas a 800 xg por 3min, o sobrenadante descartado, o pellet ressuspendido em 5ml de meio de cultura suplementado com 10% de SFB e as células replaqueadas em novos frascos de cultura. O meio de cultura foi trocado em intervalos de 48 horas. Visando manter o estoque congelado em nitrogênio líquido e trabalhar sempre com as células em passagens semelhantes, congelamos várias amostras das linhagens celulares estudadas antes da realização dos experimentos. Para isto, depois de ressuspendidas em solução contendo 10% de di-metil sulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich, E.U.A.) e 90% de SFB, as células foram congeladas em nitrogênio líquido. Para o descongelamento, os criotubos (Nunctm, Denmark) foram colocados em
