Padronização da técnica

Previamente a realização dos experimentos de imunofenotipagem por imunofluorescência no citômetro de fluxo, realizamos os seguintes testes:

5.1.1 Verificação do número de células a serem plaqueadas no início dos experimentos. Uma vez que grau de confluência das culturas pode influenciar na expressão dos marcadores de superfície de membrana que estão sendo avaliados, o número de células mais adequado para semear nas placas de 150 cm2 foi testado de modo a obtermos, após o período de 48 horas, uma confluência de aproximadamente 70%. Os testes de plaqueamento foram realizados com 5x105 a 3x106 células, sendo que 2x106 células propiciou a confluência aproximada de 70%, 48 horas após semeadura (Figura 2).

Figura 2. Fotomicrografias representativas dos diferentes números de células SCC-9 semeadas na etapa de padronização, após 48 horas do plaqueamento. A. Plaqueamento com 5x105 células; B. Plaqueamento com 1.5x106 células; C. Plaqueamento com 2x106 células e D. Plaqueamento com 3x106 células (40x).

As subpopulações de células tronco podem representar um pequeno percentual de células dentro de uma linhagem celular. Sendo assim, com o objetivo de minimizarmos a perda de células e ao mesmo tempo evitar possíveis danos físicos às mesmas durante as sete centrifugações necessárias desde o preparo das células até o final da imunomarcação, realizamos vários ensaios prévios de velocidade e tempo de centrifugação. Foram testadas centrifugações de 394 xg até 10.000 xg, com períodos de tempo variando de 3 a 10 min., obtendo-se que 900 xg por 5 min. foi a combinação que apresentou menor perda de células nos precipitados celulares. É importante mencionar, neste momento, que as centrifugações realizadas em velocidades mais altas foram melhores, pois as velocidades baixas permitiam a formação de um “rastro” celular nas paredes dos tubos plásticos, causando perda. Além disto, observamos que a utilização de tubos plásticos de marca axygen não autoclavados proporcionaram melhores resultados.

5.1.3 Diluições dos anticorpos.

Para o ensaio piloto, realizado com todos os anticorpos em células SCC-9 ZsGreen, testamos as mesmas diluições utilizadas por artigos prévios da literatura obtendo positividade para os marcadores CD44s, CD326, CD44v6, CD133 e CD271 e resultado negativo para os marcadores CD24 e CD44v3. A seguir, foram testadas novas diluições para os anticorpos CD24 e CD44v3. Estas diluições foram as recomendadas nas bulas de cada um destes anticorpos E mesmo assim os resultados ainda foram negativos para ambas as linhagens estudadas. Desta forma, decidimos incluir as linhagens celulares SCC-25 (derivada de CCE da cavidade bucal) e MCF-7 (derivada de carcinoma de mama) como controles positivos para estes marcadores. A linhagem MCF-7 foi estabelecida então como controle positivo para o anticorpo CD24 uma vez que esta apresentou 99,91% de positividade em comparação a SCC25 que apresentou apenas 96,52%. Até o presente momento, não encontramos um controle positivo adequado para os anticorpos contra CD44v3.

Após o plaqueamento, as células SCC-9 ZsGreen foram mantidas em cultura por um período de 48 horas, observando-se periodicamente a morfologia das células (Figura 3) antes da imunomarcação. Tendo em vista que as marcações todas foram realizadas em células vivas, as leituras no citômetro de fluxo foram obtidas logo após as incubações com os anticorpos, evitando assim, alterações celulares ou internalização das proteínas de membrana. Imagem representativa dos resultados obtidos com a tripla marcação são mostradas na Figura 4. Nesta figura, podemos observar, dois gráficos de pontos “dot plot” (Figura 4 A e B). Na Figura 4A visualiza-se um “gate” nomeado R1, o qual representa uma região traçada em torno dada população escolhida para ser analisada.. A Figura 4B exemplifica a dupla marcação pelos anticorpos CD44s e CD44v3, do grupo de anticorpos #1. Neste gráfico, podemos observar 4 quadrantes, o quadrante superior esquerdo (UL), superior direito (UR), inferior esquerdo (LL) e inferior direito (LR), nas quais. Nestes quadrantes observamos as populações CD44s+/CD44v3-, CD44s+/CD44v3+, CD44s-/CD44v3-, CD44s-/CD44v3+ respectivamente. Na tabela adjacente aos gráficos podemos observar o número de eventos em cada um dos quadrantes e sua respectiva porcentagem em relação a população total selecionada no “gate” estabelecido na Figura A, bem como a porcentagem de eventos em relação a população total. Estas análises foram realizadas para todas as combinações de anticorpos de cada um dos grupos de anticorpos para ambas linhagens.

Figura 3. Fotomicrografias em contraste de fase das células SCC-9 ZsGreen nos aumentos originais de 40x (A) e 100x (B).

Figura 4. Análise representativa por citometria de fluxo da expressão de CD44s, CD44v3 e CD326 na linhagem SCC-9 ZsGreen. (A) Gráfico “2D dot plot” de Foward scatter e Side Scatter utilizado

de dupla marcação realizadas neste trabalho.

5.2.1 Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen com o grupo de anticorpos #1. Conforme descrito anteriormente, o Grupo de Anticorpos #1 foi constituído pelos marcadores: CD44s, CD44v3 e CD326. Os resultados de três experimentos independentes realizados com a linhagem SCC-9 ZsGreen revelaram alta positividade individual e dupla para os anticorpos CD44s e para CD326 e baixa marcação para CD44v3. Portanto, o fenótipo geral deste grupo pode ser descrito como CD44s+/ CD326+/CD44v3-/baixo. É importante observar que diferente do que foi apresentado no experimento 1 (Figura 5A), os experimentos 2 e 3 demonstraram 3 subpopulações bem definidas, CD44s+/CD326+, CD44s-/CD326+ e CD44s+/CD326- (Figuras 5 A, B e C). Observamos que a população CD44s+/CD326- não foi encontrada no experimento 1. Sendo assim, é importante ressaltar que um experimento adicional poderia ser útil na interpretação dos resultados. Na Tabela 2, se pode observar a presença de 10 subpopulações fenotípicas evidentes, das 12 esperadas, assim como as médias dos três experimentos.

grupo 1 (A). Gráfico obtido com o experimento 1 mostrando a expressão dos marcadores CD44s, CD44v3 e CD326. Os gráficos mostrados em B e C representam os experimentos 2 e 3, respectivamente.

Tabela 2. Resumo dos fenótipos encontrados com as análises de imunofenotipagem obtidas nos experimentos 1 a 3, utilizando o primeiro grupo de anticorpos.

O segundo grupo de anticorpos utilizados para as análises de imunofenotipagem foi constituído pelos marcadores CD44s, CD44v3 e CD44v6. Os resultados de três experimentos independentes realizados na linhagem SCC-9 ZsGreen revelaram alta positividade individual e dupla para CD44s e CD44v6 e baixa marcação para CD44v3, caracterizando o fenótipo geral CD44s+/CD44v6+/CD44v3-/baixo (Figuras 6 A, B e C). Neste grupo de marcadores, 4 subpopulações bem definidas são observadas, CD44v3-/ CD44s+, CD44v3-/ CD44v6+, CD44s+/ CD44v6+ e CD44s-/ CD44v6+. No primeiro experimento deste grupo (Figura 6A), foi observada percentualidades importantes de subpopulações duplo negativas para os marcadores de CD44v3/CD44v6 e CD44s/CD44v6. Estas mesmas subpopulações foram quase inexistentes nos experimentos 2 e 3 (Figura 6 B e C). Experimentos adicionais ainda precisam ser realizados para que estes achados sejam confirmados. Na tabela 3, nove fenótipos predominantes podem ser observados com a coexpressão destes 3 marcadores, assim como as análises das médias destes três experimentos.

Figura 6. Experimentos de imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen com os anticorpos do grupo 2 (A). Gráfico referente ao experimento 1, mostrando a expressão dos marcadores CD44s, CD44v3 e CD44v6. Os gráficos B e C representam os experimentos 2 e 3, respectivamente.

experimentos 1-3 utilizando o segundo grupo de anticorpos

5.2.3 Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen com o grupo de anticorpos #3. A imunofenotipagem realizada com o terceiro grupo de anticorpos, constituído pelos marcadores CD44s, CD24 e CD133 realizados na linhagem SCC-9 ZsGreen, revelaram alta positividade individual e dupla para CD44s e para CD133 e baixa para CD24. O fenótipo geral encontrado foi CD44s+/CD133+/CD24-/baixa (Figura 7 A, B e C). Na coexpressão de CD44s e CD133, duas subpopulações evidentes foram observadas, CD44s+/ CD133+ e CD44-/ CD133+. Esta última subpopulação não foi tão predominante no experimento 2 (Figura 7B) em comparação ao experimento 1 (Figura 7A) e experimento 3 (Figura 7B). Alta variabilidade na subpopulação CD24- /CD44s- foi observada entre os três experimentos, sendo esta subpopulação mais evidente no experimento 1. A Tabela 4, mostra o resumo dos resultados obtidos dos três experimentos assim como a média, e as 9 subpopulações observadas com estes marcadores.

grupo 3 (A). Gráfico referente ao experimento 1 mostrando a expressão dos marcadores CD44s, CD4424 e CD133. Os gráficos B e C mostram os resultados dos experimentos 2 e 3, respectivamente.

Tabela 4. Resumo dos resultados obtidos nos experimentos mostrados nas Figuras 7 A, B e C e a respectiva média.

A imunofenotipagem realizada como o quarto grupo de anticorpos, constituído pelos marcadores CD44s, CD24 e CD271 revelou que a linhagem SCC-9 ZsGreen apresenta alta positividade individual e dupla para CD44s e CD271 e baixa para CD24. O fenótipo geral encontrado foi CD44s+/CD271+/CD24-/baixa (Figuras 8 A, B e C). Observou-se duas subpopulações: CD44s+/CD271+ e CD44s-/CD271+, sendo a última mais evidente no experimento 1 (Figura 8A) e três (Figura 8C). Na tabela 5, pode se observar o resumo dos resultados obtidos dos três experimentos deste grupo e as médias, assim como os fenótipos observados com estes marcadores. Figura 8. Experimentos de imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen com os anticorpos do grupo 4: (A). Gráfico do experimento 1 mostrando a expressão dos marcadores CD44s, CD24 e CD271.Os gráficos B e C representam os resultados dos experimentos 2 e 3, respectivamente.

suas respectivas médias.

5.3 Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1.

As células SCC-9 ZsGreen LN-1 foram mantidas em cultura por um período de 48 horas, observando-se periodicamente a morfologia das células (Figura 9). Considerando-se que as marcações foram todas realizadas em células vivas, não fixadas, as leituras no citômetro de fluxo foram realizadas logo após a imunomarcação, evitando assim alterações celulares ou internalização dos anticorpos. Os resultados dos experimentos realizados na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1 estão apresentadas de maneira sequencial desde o grupo de anticorpos #1 até o grupo de anticorpos # 4, descrito previamente em Materias e Métodos. No final de cada grupo de marcadores se apresenta uma tabela resumo, na qual se mostra os dados de todos os experimentos, assim como as respectivas médias. Imagens representativas dos resultados obtidos das triplas marcações com cada grupo de anticorpos são mostradas na Figura 10A e B. Na Figura 10A podemos visualizar um “gate” nomeado R1, o qual representa uma região traçada em torno à população escolhida para ser analisada. Na Figura 10B observamos um dos gráficos que foi utilizado para avaliar as marcações de dois anticorpos do grupo 1, exemplificando a dupla marcação pelos anticorpos CD44s e CD44v3. Nos 4 quadrantes da figura 10B, o quadrante superior esquerdo (UL), superior direito (UR), inferior esquerdo (LL) e inferior direito (LR). Pode-se observar as populações CD44s+/CD44v3-, CD44s+/CD44v3+, CD44s-/CD44v3-, CD44s-/CD44v3+ , respectivamente. Na tabela adjacente aos gráficos podemos observar o número de eventos em cada um dos quadrantes

Figura 10 A, bem como a porcentagem de eventos em relação a população total. Estas análises foram realizadas para todas as combinações de anticorpos de cada um dos grupos de anticorpos.

Figura 9. Fotomicrografias em contraste de fase das células SCC-9 ZsGreen LN-1, nos aumentos originais de 40x (A) e 100x (B).

Figura 10. Análise representativa por citometria de fluxo da expressão de CD44s, CD44v3 e CD326 na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1. (A) Gráfico “2D dot plot” de Foward Scatter com Side Scatter utilizado para a seleção da população a ser analizada. (B) Gráfico “2D dot plot” representativo das análises de dupla marcação realizadas neste trabalho, nas células SCC-9 ZsGreen LN-1.

anticorpos #1.

Conforme descrito anteriormente, o grupo de anticorpos # 1 foi constituído pelos marcadores CD44s, CD44v3 e CD326. Os resultados dos 3 experimentos independentes realizados na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1 revelaram alta positividade individual e dupla para CD44s e para CD326 e baixa para CD44v3, nos três experimentos. Neste grupo observou-se quatro subpopulações distintas: CD44-_/CD326+_{, CD44v3}-_/CD44s+_{, CD44v3}-_/CD326+ _{e CD44s}+_/CD326+_. O fenótipo encontrado nos 3 experimentos foi CD44s+_/CD326+_/CD44v3-/baixo _{(Figuras 11 A, B e} C). A Tabela 6 mostra um resumo dos resultados obtidos dos três experimentos com este grupo de anticorpos e a média geral; assim como os 9 fenótipos observados.

Figura 11. Experimentos de imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1 com os anticorpos do grupo 1: (A). Gráfico obtido a partir do experimento 1, mostrando a expressão dos marcadores CD44s, CD44v3 e CD326 (B). Os gráficos B e C representam os resultados dos experimentos 2 e 3, respectivamente.

suas respectivas médias.

5.3.2. Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1 com o grupo de anticorpos #2.

O segundo grupo de anticorpos, foi constituído pelos marcadores: CD44s, CD44v3 e CD44v6. Os resultados dos três experimentos independentes realizados na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1, revelaram alta positividade individual e dupla para CD44s e para CD44v6 e baixa para CD44v3. O estudo de CD44s e CD44v6 mostrou duas subpopulações distintas: CD44s+/CD44v6+ e CD44s-/CD44v6+. No experimento 3 (Figura 12C), observou-se que a subpopulação CD44v3-/CD44s+ foi menor que nos experimentos 1 e 2 (Figuras 12A e C). O fenótipo geral encontrado neste grupo foi CD44s+/CD44v6+/CD44v3-/baixo (Figuras 12A, B e C). Na tabela 7 é apresentado um resumo dos resultados obtidos dos três experimentos independentes do grupo dois de anticorpos, a média destes experimentos, assim como os fenótipos encontrados.

anticorpos do grupo 2. (A). Gráfico obtido a partir do experimento 1, mostrando a expressão dos marcadores CD44s, CD44v3 e CD44v6. Os gráficos B e C contém os resultados dos experimentos 2 e 3, respectivamente.

Tabela 7. Resumo dos resultados obtidos individualmente nos experimentos mostrados nas Figuras 12A, B e C e a média dos dados dos três experimentos.

5.3.3 Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1 com o grupo de anticorpos #3.

O terceiro grupo de anticorpos foi constituído pelos marcadores CD44s, CD24 e CD133. Os resultados dos três experimentos independentes realizados na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1 evidenciaram alta positividade individual e dupla para CD44s e CD133 e baixa marcação para CD24. No estudo de CD44s e CD133, duas subpopulações foram encontradas: CD44s+/CD133+ e CD44s-/CD133+. O fenótipo geral encontrado foi CD44s+/CD133+/CD24-/baixo (Figuras 13 A, B e C). No experimento 2 observou-se que a subpopulação CD24-_/CD44s+ _{foi maior} (Figura 13B) que nos experimentos 1 e 3 (Figuras 13 A e C). Na Tabela 8 é apresentado um resumo dos resultados obtidos dos três experimentos independentes, a média e os fenótipos obtidos da combinação dos anticorpos testados.

Figura 13. Experimentos de imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1 com os anticorpos do grupo 3. (A) Gráfico representativo do experimento 1, mostrando a expressão dos marcadores CD44s, CD24 e CD133. Os gráficos B e C representam os resultados dos experimentos 2 e 3, respectivamente.

as suas respectivas médias.

5.3.4 Imunofenotipagem das células SCC-9 ZsGreen LN-1 com o grupo de anticorpos #4.

O quarto grupo de anticorpos, foi constituído pelos marcadores: CD44s, CD24 e CD271. Os resultados dos três experimentos independentes realizados na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1 revelaram alta positividade individual e dupla para CD44s e CD271 e baixa para CD24. O estudo de CD44s e CD271 revelou duas subpopulações bem definidas: CD44s+_/CD271+ e CD44s-_/CD271+_{. No experimento 3 (Figura 14A), observou-se que a subpopulação CD24}- /CD44s+ _{foi menor em relação aos experimentos 1 e 2 (Figura 14A e B). O fenótipo geral} encontrado foi CD44s+_/CD271+_/CD24-/baixo _{(Figura 14A, B e C). Na tabela 9, podemos encontrar} o resumo dos resultados dos três experimentos realizados com este grupo de marcadores, a média, assim como as subpopulações encontradas.

anticorpos do grupo 4: (A). Gráfico com os resultados do experimento 1, mostrando a expressão dos marcadores CD44s, CD24 e CD271. Os gráficos B e C mostram os resultados dos experimentos 2 e 3, respectivamente.

Tabela 9. Resumo dos resultados obtidos nos experimentos mostrados nas Figuras 14 A, B e C e a média dos três experimentos.

Após as análises individuais dos três experimentos desenvolvidos com os quatro grupos de anticorpos, foi realizada a comparação das subpopulações com todos os fenótipos observados nas duas linhagens.

5.4.1 Análise comparativa entre as células SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1 com o grupo de anticorpos #1.

A pesquisa com os anticorpos CD44s e CD326 na linhagem SCC-9 ZsGreen revelou três subpopulações distintas: CD44s+/CD326-, CD44s+/CD326+ e CD44s-/CD326+ em 2 dos 3 experimentos realizados (Figura 15 A). No entanto, na linhagem SCC- 9 ZsGreen LN-1, estes mesmos anticorpos detectaramapenas duas subpopulações bem definidas, CD44s+/CD326+ e CD44s-/CD326+ nos três experimentos realizados (Figura 15 B).

Figura 15. Médias dos três experimentos com o grupo de anticorpos #1. (A). Médias dos três experimentos, na linhagem SCC-9 ZsGreen e na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1.

5.4.2 Análise comparativa entre as células SCC-9 ZsGreen e SCC-9 ZsGreen LN-1 com o grupo de anticorpos #2.

O segundo grupo de anticorpos revelou uma subpopulação celular CD44s-/CD44V6+ bastante definida, tanto na linhagem SCC-9 ZsGreen como na SCC-9 ZsGreen LN-1, com porcentagens de 6,67% e 14,15%, respectivamente (Figuras 16 A e B). Apesar de não ter apresentado diferenças estatisticamente significantes, é evidente que a linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1possuí mais células deste tipo em comparação com a SCC-9 ZsGreen. A análise da coexpressão de CD44s com CD44v6 na linhagem SCC-9 ZsGreen revelou três subpopulações: CD44s+/CD44v6+, CD44s-/CD44v6+ e CD44s-/CD44v6- com porcentagens de 90,72%, 6,67% e 2,37%, respectivamente (Figura 16 A). Na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1 foram observadas apenas duas subpopulações, CD44s+_/CD44v6+ _{e CD44s}-_/CD44v6+_, com porcentagens do 85,36% e 14,15%, respectivamente (Figura 16 B).

Figura 16. Médias dos três experimentos com o grupo de anticorpo #2. (A) linhagem SCC-9 ZsGreen e (B) linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1.

O grupo de anticorpos # 3 revelou uma subpopulação celular CD44s-/CD133+ bem definida, tanto na linhagem SCC-9 ZsGreen como na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1, com porcentagens de 9,77% e 14,34%, respectivamente. Apesar de não ter apresentado diferenças estatisticamente significantes, a linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1 parece possuir uma subpopulação maior do que a SCC-9 ZsGreen (Figuras 17 A e B).

Figura 17. Médias dos três experimentos com o grupo de anticorpo #3. (A) linhagem SCC-9 ZsGreen e (B) linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1.

O grupo de anticorpos # 4 detectou uma subpopulação celular CD44s-/CD271+ bem definida, tanto na linhagem SCC-9 ZsGreen como na linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1, com porcentagens de 10,42% e 15,48%, respectivamente (Figuras 18 A e B). Apesar de não ter apresentado diferenças estatisticamente significantes, a linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1 apresentou uma subpopulação maior em comparação com a SCC-9 ZsGreen.

Figura 18. Médias dos três experimentos com o grupo de anticorpo #4. (A) linhagem SCC-9 ZsGreen e (B) linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1.

O carcinoma de células escamosas (CCE) da cavidade bucal, subtipo mais frequente de câncer oral, apresenta um comportamento agressivo e sua incidência varia de acordo com idade, gênero, hábitos, ocupação, grupos étnicos e localização geográfica. O tabaco e o álcool são os dois fatores de risco mais importantes não só para o desenvolvimento da neoplasia, como também para seu prognóstico (Oliveira et al., 2006). O CCE da cavidade bucal e orofaringe acometem principalmente indivíduos do sexo masculino e acima de 50 anos (Dedivitis et al., 2004; Oliveira et al., 2006; Chi et al., 2014). As lesões apresentam agressividade variável e a sobrevida livre da doença dos pacientes portadores depende diretamente da presença de metástases, falhas no tratamento e recorrências locais. Estudos sugerem que uma possível causa para estas falhas no tratamento reside na presença de CTCs, uma pequena população de células tumorais, altamente tumorigênicas, autorrenováveis e capazes de se diferenciarem em células constituintes da massa tumoral (Reya et al., 2001; Dalerba et al., 2007a; Chinn et al., 2012; Mertins, 2014). Além disso, evidências sugerem que as CTCs são resistentes a terapia convencional e podem guiar a recorrência do tumor e metástases (Dean et al., 2005; Wang et al., 2009).

Através da cultura primária dos linfonodos metastáticos provocados pela inoculação de células SCC-9 ZsGreen na língua de camundongos imunossuprimidos, foi desenvolvido, em nosso laboratório, uma linhagem celular de CCE oral altamente metastática, a SCC-9 ZsGreen LN-1 (Agostini et al. 2014). No presente estudo, a presença de CTCs tanto na linhagem celular SCC-9 ZsGreen, como em sua derivada metastática SCC-9 ZsGreen LN-1, foi avaliada através de dos seguintes marcadores de superfície: CD44s, CD44v3, CD44v6, CD24, CD326, CD133 e CD271. Para que os experimentos no citômetro de fluxo fossem realizados utilizando os 3 canais disponíveis do equipamento, os marcadores de superfície acima citados foram combinados em quatro diferentes grupos. O grupo 1 consistiu da combinação dos anticorpos anti-CD44s, anti- CD44v3 e anti-CD326. O segundo grupo de marcadores foi formado pelos anticorpos anti-CD44s, anti-CD44v3 e anti-CD44v6. Anti-CD44s, anti-CD24 e anti-CD133 foram os marcadores escolhidos para o grupo 3 e, finalmente, o grupo 4 foi constituído dos marcadores anti-CD44s, anti- CD24 e anti-CD271.

Estudos prévios relacionados ao isolamento de CTCs a partir amostras de pacientes e de linhagens celulares derivadas de neoplasias malignas têm descrito o uso de inúmeros marcadores.

amplamente utilizada para a identificação das CTCs nos cânceres da mama, próstata, cólon e pâncreas (Al-Hajj et al., 2003; Collins et al., 2005; Li et al., 2007a; Ricci-Vitiani et al., 2007). Além disto, CD44s foi altamente positivo na identificação de CTCs em CCE de cabeça e pescoço (Prince et al., 2007), assim como em queratinócitos orais normais (Mack and Gires, 2008; Calenic et al., 2010). Sendo assim, decidimos por utilizar o CD44s como marcador de superfície constante nas quatro combinações utilizado no presente trabalho. Nossos resultados demonstraram que este marcador foi altamente positivo tanto na linhagem SCC-9 ZsGreen como na SCC-9 ZsGreen LN- 1, com uma média do 89,1% e 83,86% respectivamente, não apresentando assim diferenças estatisticamente significantes.

Em relação as combinações de anticorpos utilizadas para o grupo 1, encontramos alta positividade para os marcadores CD44s e CD326, e baixa positividade ou ausência de marcação para o marcador CD44v3, resultando no fenótipo CD44s+/CD326+/CD44v3-. A alta positividade para o CD44s e para o CD326 está de acordo com os achados de Biddle et al., (2011), no qual dois fenótipos distintos de CTCs são descritos. Este trabalho relata a presença de uma subpopulação