Desenvolvimento de métodos de análise de drogas de abuso em dried urine spots (DUS) por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

INGRID LOPES BARBOSA

Desenvolvimento de métodos de análise de drogas de abuso em dried urine spots (DUS) por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas

sequencial (LC–MS/MS)

CAMPINAS 2018

INGRID LOPES BARBOSA

Desenvolvimento de métodos de análise de drogas de abuso em dried urine spots (DUS) por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas

sequencial (LC–MS/MS)

Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Analítica

Orientador: Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin Co-Orientador: Prof. Dr. José Luiz da Costa

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA INGRID LOPES BARBOSA, ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN.

CAMPINAS 2018

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin (Orientador)

Profa. Dra. Carla Beatriz Grespan Bottoli (IQ-UNICAMP)

Prof. Dr. Paulo César Pires Rosa (FCF-UNICAMP)

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).

Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pela aluna INGRID LOPES BARBOSA, aprovada pela Comissão Julgadora em 22 de fevereiro de 2018.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao meu irmão e melhor amigo Teddi por todo apoio e por sempre acreditar em mim mesmo quando eu não consigo.

À minha mãe, Mônica, por ser o meu exemplo de mulher guerreira e ao meu pai, Walter, por ter despertado em mim o amor pelas ciências exatas.

Ao meu namorado, Felipe, por ser tão compreensivo, paciente e companheiro.

AGRADECIMENTOS

Agradeço...

... A Deus pela oportunidade de obter e gerar conhecimento, contribuindo para a sociedade.

... À minha família por sempre estar presente, mesmo com mais de 500 km de distância, especialmente minha avó Lilia pelo seu amor infinito.

...Ao meu namorado, Felipe e à sua família, que sempre torceu por mim e me recebeu de braços abertos. Cristina, Paula, Laura e Ilva: muito obrigada!

... Aos meus orientadores Profs. Drs. Marcos e José Luiz pela oportunidade de trabalhar em seus grupos de pesquisa.

...Aos colegas de trabalho não só por compartilharem seus conhecimentos comigo como pelos momentos de riso e de descontração. Não poderia deixar de citar vocês: Gustavo Duarte, Thais Lino, José Paz, Fernanda Negrão, Ana Carolina Aguiar, Pedro Vendramini, Célio Fernando, Fábio Santos, Adriana Godoy, Danielle Rocha, Damila Morais, Kelly Cunha, Jandyson Machado, Ildenize Cunha, Guilherme Tripodi e Mariana Baptistão.

...Às minhas ex e atuais housemates Isadora Lopes, Maria Rodrigues, Ludmila Magalhães e Isabela Sato pelo companheirismo de sempre.

...Aos meus amigos juiz-foranos que nunca deixaram de estar do meu lado, especialmente: Marcelo Machado, Xênia Souza, Gabriele Repossi, Jomara Fernandes e Isabela Lacerda.

...Finalmente, à banca examinadora do exame de qualificação Profas. Dras. Ana Valéria Colnaghi Simionatu Cantú e Carla Beatriz Grespan Bottoli pelas críticas que levaram à construção deste trabalho e também à banca examinadora desta defesa pela disponibilidade e estar presente e contribuir ainda mais.

CITAÇÕES

“Nascer, crescer, morrer, renascer ainda e progredir sempre, tal é a lei.”

(Allan Kardec)

“Sua tarefa é descobrir o seu trabalho e, então, com todo o coração, dedicar-se a ele.”

(Siddhartha Gautama)

“Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do lugar. As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito.”

RESUMO

Para atender ao interesse jurídico da necessidade de armazenamento de amostra, a aplicação de métodos de coleta que garantam alta estabilidade em pequenos volumes de fluidos biológicos tem se tornado popular e tem sido explorado por laboratórios clínicos e forenses. Uma das técnicas mais empregadas neste contexto é a dried blood spots (DBS). De forma análoga ao sangue, é possível realizar análises toxicológicas de drogas de abuso em urina utilizando este tipo de amostragem, que passa a ser conhecido como dried urine spots (DUS) e, embora esta técnica ainda não tenha sido tão difundida, ela é de notável interesse, supondo que compartilhe das mesmas vantagens do DBS. Considerando as baixas concentrações nas quais essas drogas são encontradas em matrizes biológicas, técnicas que possuam grande detectabilidade e sensibilidade são necessárias. Para suprir estas necessidades, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC–MS/MS) tem sido referenciada como padrão-ouro nos laboratórios de toxicologia analítica, e é a técnica escolhida. Neste trabalho, o objetivo foi o desenvolvimento de métodos analíticos simples de amostragem por DUS com análise por LC–MS/MS que pudessem ser aplicados em exames de confirmação e quantificação de duas das drogas de abuso mais utilizadas no mundo, a cocaína (COC) e o tetraidrocanabinol (THC), e seus principais metabólitos encontrados na urina. Para preparar os cartões de DUS, amostras de urina (20 µL) foram adicionadas em cartões Whatman 903 Protein Saver seguido por 2 horas de secagem em condições ambiente. A solução extratora foi otimizada para cada droga separadamente, bem como o procedimento. Para a COC e três de seus principais metabólitos – benzoilecgonina (BZE), éster metilecgonina (EME) e cocaetileno (CET) – o método desenvolvido apresentou boa linearidade em um intervalo de 25 a 1000 ng mL-1 _{(r ≥ 0,996), e as imprecisões intra e}

inter-dias foram sempre inferiores a 18%, com exatidão contida no intervalo de 82-120%. A estabilidade foi mantida por pelo menos 90 dias mesmo quando armazenada em condições ambiente. O método desenvolvido foi aplicado na quantificação de amostras reais com sucesso. Para o THC e seus metabólitos – 11-hidróxi-Δ9

-tetraidrocanabinol (THC-OH) e 11-nor-9-carboxi-Δ9_{-tetraidrocanabinol (THC-COOH) –}

o desenvolvimento de metodologias que ofereçam melhor reprodutibilidade e detectabilidade ainda são necessários, o que requer mais estudos.

ABSTRACT

In order to attend to the juridical necessity of sample storage, the use of collection devices which guarantees higher stability and requires small amounts of biological fluids have become popular and explored in clinical and forensic laboratories. One of the most applied technique in this context is the dried blood spots (DBS). Similarly to blood, it is possible to perform toxicological analysis of drugs of abuse in urine using the same technique, known as dried urine spots (DUS) and, although this technique has not been explored as much, it is of notable interest supposing that they share the same advantages as DBS. Considering the low concentrations in which these drugs are found in the matrices, techniques that hold great detectability and sensitivity are needed. In order to fulfill these necessities, liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) has been heralded as “gold standard” in analytical toxicology laboratories and is the technique of choice. In this work, the goal was to develop simple analytical methods for DUS and LC-MS/MS that could be applied in the confirmation and quantification of two of the most abused drugs worldwide, cocaine (COC) and tetrahydrocannabinol (THC) and their main metabolites found in urine. To prepare DUS cards, spiked urine samples (20 µL) were spotted onto Whatman 903 Protein Saver cards followed by 2 hours air-drying. The extraction solutions were optimized in each case such as the procedures. For COC and three of its main metabolites – benzoylecgonine (BZE), ecgonine methyl ester (EME) and cocaethylene (CET) – the developed method presented good linearity from 25 to 1000 ng mL-1 _{(r ≥}

0,996) and intra-assay and inter-assay imprecision was always inferior to 18% with accuracy in an interval ranging from 82 to 120%. Stability was maintained in up to 90 days even when kept under ambient conditions. The developed method was successfully applied in the quantification of real case samples. For THC and its metabolites - 11-Hydroxy-Δ9_{-tetrahydrocannabinol (THC-OH) and}

11-Nor-9-carboxy-Δ⁹-tetrahydrocannabinol (THC-COOH) – methodologies that offer greater reproducibility are still needed and further studies are required.

Lista de Figuras

Figura 1. Relação do número de publicações contendo o termo “dried blood spots” no texto entre 2007 e até fevereiro de 2018. ... 22

Figura 2. Relação do número de publicações contendo o termo “dried blood spots” no texto entre 2007 e até fevereiro de 2018. ... 23

Figura 3. Classificação da cromatografia pelas formas físicas das fases móveis e estacionárias (adaptado, [27]). ... 24

Figura 4. Representação esquemática dos componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência (adaptado, [28]). ... 26

Figura 5. Representação esquemática dos componentes básicos de um espectrômetro de massas (adaptado, [30]). ... 26

Figura 6. Faixas de aplicação das técnicas de ionização utilizadas em associação com a cromatografia líquida de alta eficiência (adaptado, [34]). ... 27

Figura 7. Principais formas de apresentação da cocaína (a) cloridrato de cocaína (b) crack, base livre preparada por alcalinização do cloridrato. ... 30

Figura 8. Principais vias de biotransformação da cocaína quando administrada em humanos. As estruturas moleculares representadas correspondem a (a) benzoilecgonina (BZE), (b) éster metilecgonina (EME) e (c) cocaetileno (CET). ... 31

Figura 9. Estrutura molecular dos principais componentes da cannabis: (a) THC (b) CBN e (c) CBD. ... 33

Figura 10. Principal via de biotransformação do Δ9_{-THC (a), gerando inicialmente os}

metabólitos de fase I (b) 11-OH-THC e (c) THC-COOH por reações de oxidação e posteriormente o metabólito de fase II (c) THC-COOH-gluc através da glicuronidação. ... 34

Figura 11. Representação esquemática do preparo das amostras de DUS em papel Whatman® 903 Protein saver card, próprio para receber matrizes biológicas. ... 39

Figura 12. Superfície de resposta da desejabilidade para um planejamento experimental do tipo simplex centroide, onde a predição aponta para o valor de ótimo global. ... 48

Lista de Tabelas

Tabela 1. Parâmetros de gradiente da fase móvel para separação da cocaína e seus metabólitos por LC-MS. ... 41

Tabela 2. Parâmetros obtidos para os MRM no modo positivo (ESI-(+)) por LC-MS/MS: Íon precursor selecionado (Q1), íons produto (Q3) voltagens das transições para os analitos e padrão interno. ... 42

Tabela 3. Gradientes da fase móvel para separação do THC e seus metabólitos por LC-MS. ... 43

Tabela 4. Valores de condições da fonte operando nos modos de eletrospray positivo (ESI-(+)) e negativo (ESI-(-)). ... 43

Tabela 5. Parâmetros MRM operando no (a) modo positivo (ESI-(+)) e (b) modo negativo (ESI-(-)) de aquisição. ... 44

Tabela 6. Valores de coeficientes das regressões lineares e seus intervalos de confiança (n=5, 95%) onde a representa a inclinação da curva, b o intercepto com o eixo y e r o coeficiente de correlação. ... 51

Tabela 7. Valores de concentração, imprecisão (C.V.) e exatidão (bias) para o LQ do método. ... 52

Lista de Abreviaturas e Siglas

ACN Acetonitrila

AE Acetato de Etila

APCI Ionização Química à Pressão Atmosférica

APPI Fotoionização à Pressão Atmosférica

BZE Benzoilecgonina

CA Controle Alto

CB Controle Baixo

CM Controle Médio

CET Cocaetileno

CID Dissociação Induzida por Colisão

COC Cocaína

COC-d3 Cocaína deuterada

DBS Dried Blood Spots

DCM Diclorometano

DMS Dried Matrix Spots

DUS Dried Urine Spots

EME Éster Metilecgonina

ESI Ionização por Electrospray

FT-ICR Ressonância Ciclotrônica de Íons por Transformada de Fourier

GC Cromatografia Gasosa

GC-MS Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas

HEX Hexano

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

HPLC-MS Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas m/z Razão massa/carga LD Limite de Detecção LQ Limite de Quantificação MeOH Metanol MS Espectrometria de Massas

MS/MS Espectrometria de Massas Sequencial

MTBE Éter metil terc-butílico

QqQ Triplo Quadrupolo

QTOF Quadrupolo-Tempo de Vôo

QTrap Quadrupolo-Armadilha de íons

THC Tetraidrocanabinol Δ9-_{THC Delta-9-tetraidrocanabinol} Δ9-_THC-d 3 Delta-9-Tetraidrocanabinol deuterado THC Tetraidrocanabinol THC-d3 Tetraidrocanabinol deuterado THC-COOH 11-nor-9-carboxi-delta-9-tetraidrocanabinol

THC-COOH-d3 11-nor-9-carboxi-delta-9-tetraidrocanabinol deuterado

THC-COOH-gluc 11-nor-9-carboxi-delta-9-tetraidrocanabinol conjugado com ácido glicurônico

THC-OH 11-hidróxi-tetraidrocanabinol

Trap Armadilha de íons

Sumário

1.

Introdução ... 18

1.1. As Ciências Forenses ... 18

1.2. Dried Urine Spots (DUS) ... 21

1.3. Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas (HPLC-MS) aplicado à Química Forense ... 24

1.4. Drogas de abuso ... 29 1.4.1. Cocaína ... 29 1.4.2. THC ... 33

2.

Objetivos ... 36

3.

Materiais e Métodos ... 37

3.1.2. Padrão referência de cocaína e metabólitos ... 37

3.1.3. Padrão referência de THC e metabólitos ... 37

3.1.4. Equipamentos e acessórios ... 38 3.1.5 Amostras Positivas ... 38 3.2. Metodologia ... 39 3.2.1. Cocaína ... 39 3.2.2. THC ... 40 3.3. Aquisição de Dados ... 41 3.3.1. Cocaína ... 41 3.3.2. THC ... 42 3.4. Processamento de dados ... 44 3.4.1. Cocaína ... 44 3.4.2. THC ... 44

3.5. Validação do Método ... 45

3.5.1. Cocaína ... 45

3.6. Aplicação em amostras reais ... 47

3.6.1. Cocaína ... 47

4.

Resultados e discussões ... 48

5.

Conclusões ... 67

6.

Referências ... 69

7.

Anexos ... 75

1. Introdução

1.1. As Ciências Forenses

Do ponto de vista histórico, considera-se que foi em meados do século XIX, após um grande desenvolvimento das ciências básicas como a química, a toxicologia, a biologia, a física e a medicina que surgiram também os estudos acerca das ciências forenses. Nesta época, o juiz Hans Gross (1874-1915) foi um dos primeiros estudiosos a perceber a importância e aplicabilidade que os conhecimentos científicos adquiridos poderiam ter na resolução dos crimes e ficou conhecido como fundador da criminalística e da criminologia. A partir de então, a investigação de evidências em quantidades traço e mortes suspeitas, antes analisadas de forma subjetiva, ganharam grande destaque [1].

Em janeiro de 1910, Edmond Locard (1877-1966) foi o responsável pela criação do primeiro laboratório científico da polícia no mundo, o Laboratório de Polícia Técnica de Lyon, localizado em Lyon, na França. Além disto, Locard foi o responsável pela criação de um dos princípios fundamentais das ciências forenses: todo contato deixa um vestígio (Princípio da troca). Em 1918, este estudioso publicou o Tratado de Criminalística, uma série de livros de sete volumes produzidos manualmente. Ele continuou seus trabalhos e pesquisas até sua morte [2].

A criminalística tem como objetivo principal o reconhecimento e interpretação de indícios materiais extrínsecos, relativos ao crime ou à identidade do criminoso. A investigação criminal inicia-se pelo exame do local do crime, com a coleta dos vestígios, os quais, caso confirmados possuírem relação com o fato delituoso, tornam-se indícios. Deste modo, a química forentornam-se é uma importante ferramenta aliada da criminalística, uma vez que esta ciência irá se utilizar de análises inorgânicas e orgânicas ou toxicológicas de forma a caracterizar as evidências de um crime [3].

As análises inorgânicas e orgânicas clássicas envolvem a apreciação de vestígios como resíduos de pólvora (GSR, do inglês, Gun Shot Residues – resíduos de disparo de armas de fogo); traços de tintas; fibras; exames metalográficos; de drogas de abuso e outras substâncias orgânicas in natura; vidros e cerâmicas; explosivos e resíduos

de incêndio, entre os mais variados tipos de materiais. Por sua vez, as análises toxicológicas visam isolar, identificar e, sempre que necessário, quantificar álcool, drogas e seus metabólitos, praguicidas e outras substâncias em matrizes biológicas [2].

Para que as análises toxicológicas sejam realizadas de forma inequívoca, a escolha do material biológico a ser analisado e a metodologia a ser empregada devem ser feitas através de conhecimentos científicos da droga em si, tais como sua origem e mecanismos de ação. Sendo assim, faz-se necessário reconhecer primeiramente três elementos: a existência de uma substância química (agente), os efeitos que as drogas terão nas células ou organismo vivos que influenciarão as funções corporais por meio de mudanças bioquímicas nos fluidos e tecidos (toxicodinâmica), e a forma com que o organismo irá absorver, distribuir, biotransformar e eliminar esta droga (toxicocinética) [4].

Os principais fluidos biológicos utilizados na rotina laboratorial são sangue (ou seus derivados soro e plasma) e urina. Porém, existem diversas outras matrizes biológicas que podem ser utilizadas em análises toxicológicas como: saliva, bile, humor vítreo, líquido cefalorraquidiano, conteúdo gástrico e cabelo. Apesar de o sangue representar um dos fluidos mais importantes nessas análises, uma vez que existem diversas metodologias bem estabelecidas com grande quantidade de dados e informações encontrados na literatura, sua janela de detecção, ou seja, o tempo no qual é possível detectar laboratorialmente drogas em uma amostra é curto. Geralmente, em casos onde se deseja uma janela de detecção um pouco maior, em escala de dias, amostras de urina podem ser usadas no lugar do sangue, onde geralmente os metabólitos, substâncias produzidas no organismo através da biotransformação da droga, serão detectados. Além disto, quando as análises se objetivam a avaliar o uso após alguns meses ou o uso contínuo, o cabelo é a matriz mais empregada, e fornece uma estimativa do tempo em que esta substância foi utilizada [5].

Primeiramente, essas amostras passam por uma triagem, ou seja, exames não específicos cujo objetivo é excluir grupos e indicar uma possível substância. Como exemplo de exames de triagem pode-se citar os imunoensaios. Dentro dos laboratórios, estas amostras seguirão para testes de confirmação e quantificação, que serão feitos utilizando instrumentos analíticos de maior especificidade e sensibilidade, como cromatografia gasosa ou cromatografia líquida de alta eficiência acoplados à espectrometria de massas. É importante também ressaltar que, para que estes resultados tenham validade do ponto de vista judicial, é importante que a cadeia de custódia seja mantida através da documentação de cada etapa pela qual ela for submetida, tornando possível o rastreamento da posse e manuseio, evitando questionamentos sobre a validade do material analisado [6].

Posteriormente à seleção da amostra a ser coletada, o acondicionamento e preservação dos indícios de forma correta é de fundamental importância para a perícia, sobretudo quando se trata de vestígios que serão posteriormente analisados em laboratório, assegurando resultados que representem de fato o material coletado no local do crime. Portanto, recipientes especiais e específicos devidamente etiquetados e identificados são utilizados na coleta dos vestígios. Além disto, conforme preconiza o Artigo 170 do Código de Processo Penal (CPP, Decreto-lei nº 3.689, de 3 de outubro de 1941): Nas perícias de laboratório, os peritos guardarão material suficiente para a eventualidade de nova perícia [7]. Desta forma, para cada amostra submetida à análise em laboratórios forenses, uma parte deverá ser armazenada até o fim do processo judicial, visando garantir o direito de ampla defesa, onde ao acusado é reservado o direito de contestar a prova, caso se mostre pertinente.

No caso da urina, a coleta é feita geralmente em tubos de plástico e as amostras são encaminhadas para a análise logo em seguida. Quando os procedimentos laboratoriais não podem ser realizados imediatamente ou há necessidade de armazenamento da amostra, o ideal é que sejam estocadas em geladeira em temperaturas de 2 a 8 ºC, por até 7 dias, ou em congelador (-20 ºC ou menos) quando mais tempo for necessário. Contudo, nas análises toxicológicas de rotina, a guarda do material coletado frequentemente é dificultada, ou até mesmo inviável, uma vez que a quantidade de amostra disponível nem sempre é suficiente para que as análises

possam ser realizadas mais de uma vez, e muitas substâncias tóxicas e/ou seus produtos de biotransformação são instáveis nos fluidos biológicos [8]. Diversos estudos reportam a estabilidade de diferentes drogas em diferentes matrizes biológicas [9-13], através dos quais é possível notar que perda de analito ocorre, mais frequentemente, por fenômenos químicos como reações de hidrólise e oxidação ou ainda por fenômenos físicos como volatilização e precipitação. Além disso, alguns analitos possuem, ainda, tendência a aderir à superfície plástica ou de vidro do recipiente de acondicionamento dependendo de suas propriedades físico-químicas [14,15]. De maneira geral, a estabilidade é dependente principalmente de três fatores: temperatura, onde amostras armazenadas sob refrigeração tendem a ser muito mais estáveis do que em temperatura ambiente; pH do meio; e tipo de matriz biológica. Porém, mesmo quando armazenadas em condições otimizadas, nem sempre a estabilidade é suficiente para que a amostra seja confiável até o fim do processo judicial. Além disto, os métodos convencionais de análise empregados rotineiramente nos laboratórios forenses se utilizam de volumes muito grandes, na escala de mililitros, de amostras. Sendo assim, a aplicação de novos métodos de coleta de material e amostragem que se utilizam de amostras na escala de microlitros são de grande interesse.

1.2. Dried Urine Spots (DUS)

A técnica de amostragem de sangue seco em papel, denominada dried blood spots (DBS), é amplamente reconhecida e utilizada em casos clínicos desde a década de 1960 [16]. Embora sua principal aplicação seja o monitoramento de distúrbios metabólicos hereditários em recém-nascidos, nos últimos anos tem recebido cada vez mais atenção, levando ao desenvolvimento de diversas técnicas com aplicação em diferentes campos de estudo [17-19]. A amostragem consiste em, através de uma punção no dedo, recolher uma gota de sangue capilar em um papel coletor, próprio para receber a amostra que, após secagem em condições ambientes, é armazenada até que as análises possam ser realizadas.

A Figura 1 retrata que há um número crescente de trabalhos envolvendo esta técnica nos últimos 10 anos, segundo os bancos de dados SciFinder e Scopus, para artigos científicos completos publicados em periódicos. Inclusive, ao comparar uma busca realizada em até fevereiro de 2018 com o ano de 2008 em sua totalidade, o número de trabalhos é similar. O grande interesse acerca deste tipo de amostragem está relacionado às suas inúmeras vantagens, como o uso de volumes de amostra muito baixos, em escala de microlitros, maior estabilidade dos analitos e facilidade de armazenamento e transporte. A maior estabilidade fornecida se deve ao processo de secagem da matriz, o qual inibe as reações de hidrólise química e enzimática, assegurando maior estabilidade mesmo quando armazenadas em condições de temperatura ambiente. Além disto, há inativação de enzimas e patógenos, o que torna a manipulação mais segura para o analista [20].

Figura 1. Relação do número de publicações contendo o termo “dried blood spots” no texto entre 2007 e até fevereiro de 2018.

De forma análoga ao DBS, é possível a realização de análises toxicológicas de drogas de abuso em outras matrizes, como urina (dried urine spots, DUS) [21,22], plasma (dried plasma spots, DPS) [23], soro do sangue (dried serum spots, DSS)e líquido cefalorraquidiano (dried cerebrospinal spots, DCSF) [24]. Entre estas, destaca-se a técnica de DUS, uma vez que, depois do sangue, esta matriz é a mais empregada rotineiramente nos laboratórios de toxicologia clínica e forense, uma vez que a janela de detecção da droga, principalmente na forma de metabólitos, é bem maior que no sangue, fazendo com que esta possa ser encontrada dias após a sua ingestão, enquanto o corpo ainda está eliminando esta substância.

Portanto, supondo que compartilhe as vantagens inerentes ao DBS, o desenvolvimento de técnicas de preparo e de análises para DUS tornam-se de grande interesse. Porém, esta é uma alternativa bem menos explorada até então, e, por ser uma técnica menos desenvolvida, ainda não foi introduzida para uso rotineiro. Na Figura 2, tem-se uma relação do número de trabalhos envolvendo esta técnica nos últimos 10 anos em até fevereiro de 2018, onde é possível notar que o número de publicações acerca desta técnica ainda permanece bastante escasso.

Figura 2. Relação do número de publicações contendo o termo “dried blood spots” no texto entre 2007 e até fevereiro de 2018.

Além das vantagens anteriormente citadas, é importante também ressaltar que a quantidade de amostra necessária para análise é muito pequena (em escala de microlitros), gerando menores custo de transporte e armazenamento.

Muito embora o pequeno volume de amostra seja uma vantagem, principalmente do ponto de vista jurídico no que concerne à necessidade de armazenamento, as principais limitações desta técnica no âmbito forense se dão devido ao fato de que geralmente as drogas de abuso e seus metabólitos estão presentes em concentrações muito baixas, em escalas de ng mL-1 _{nas matrizes biológicas. Em virtude destas baixas}

concentrações e da complexidade destas matrizes, técnicas analíticas que garantam boa detectabilidade, sensibilidade e seletividade são necessárias no desenvolvimento de uma metodologia apropriada. Sendo assim, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (HPLC-MS), conhecida por ser tida como técnica

padrão-ouro [25] dentro da química forense, é uma ferramenta poderosa e, por isto, técnica de escolha na grande maioria dos casos onde as técnicas de DBS ou DUS são aplicadas.

1.3. Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas (HPLC-MS) aplicado à Química Forense

Segundo Lanças [26], a cromatografia pode ser definida como uma técnica de separação na qual os componentes são distribuídos entre duas fases: uma fixa e de grande área superficial denominada fase estacionária (FE), e outra denominada fase móvel (FM), um fluído que percola através da fase estacionária carregando os analitos, que terão diferentes coeficientes de distribuição entre essas duas fases. Diversos tipos de cromatografia podem ser encontrados na literatura e estas diferem entre si de acordo com o estado físico da FM e da FE e os diferentes tipos de interação possíveis entre os solutos e estas fases. Existem diversas formas de classificar as diferentes formas de cromatografia, porém, considera-se a mais importante a classificação baseada no mecanismo de separação, que poderá se dar por processos físicos, químicos ou mecânicos, de acordo com as formas físicas presentes nas fases estacionárias e móveis. A Figura 3 retrata as classificações cromatográficas de acordo com as formas físicas das fases móveis e estacionárias.

Figura 3. Classificação da cromatografia pelas formas físicas das fases móveis e estacionárias (adaptado, [27]).

Entre as técnicas convencionalmente utilizadas para atender às necessidades das ciências forenses, destaca-se a cromatografia em diferentes variações: cromatografia em camada delgada (thin-layer chromatography, TLC), cromatografia gasosa (gas chromatography, GC) e a cromatografia líquida de alta eficiência (high performance liquid chromatography, HPLC). Muito embora nos laboratórios de rotina a cromatografia gasosa seja a mais empregada devido ao seu baixo custo e pela existência de uma biblioteca que facilita as interpretações dos resultados, o que é importante quando se trabalha com alta demanda, a HPLC também é bastante utilizada, principalmente para compostos não voláteis ou termicamente instáveis.

Outra classificação bastante importante baseia-se na polaridade relativa das fases. No caso da cromatografia gasosa, a fase móvel é inerte (como os gases hélio e nitrogênio) e a separação ocorre devido a interações das moléculas dos componentes da amostra com a fase estacionária somente. Porém, nas cromatografias líquidas, sejam planares ou em colunas, a polaridade de ambas as fases é importante. Chama-se de “cromatografia líquida com fase normal” quando a FE é mais polar do que a FM, e “cromatografia com fase reversa” quando se tem o inverso. A utilização de uma ou outra é escolhida de acordo com a polaridade dos analitos que se deseja separar. Em aplicações forenses nas quais são monitoradas drogas de abuso e seus metabólitos em matrizes biológicas, a cromatografia líquida em fase reversa é a mais comumente utilizada.

Na cromatografia líquida, a fase móvel é líquida e a fase estacionária é sólida. A HPLC se difere da convencional por utilizar colunas recheadas com material especialmente preparado e fase móvel pressurizada com auxílio de bombas de alta pressão. Na Figura 4 é possível encontrar todas as unidades básicas que compõem um sistema de HPLC.

Após separação cromatográfica na coluna, os analitos são enviados separadamente para um detector. O uso de detectores como ultravioleta, índice de refração, espalhamento de luz, fluorescência, ou outros, quando aliados a um software, permitem análises quantitativas dos componentes da mistura. Contudo, estas técnicas são bastante limitadas quanto a especificidade dos analitos, não sendo sempre adequadas para amostras biológicas. Em laboratórios de química forense, uma técnica confirmatória obrigatoriamente é requerida quando a identidade química,

ou seja, a análise qualitativa dos compostos é necessária. Desta forma, a utilização da espectrometria de massas como técnica hifenada é praticamente imprescindível, uma vez que é a que melhor fornece as informações estruturais necessárias [29].

Figura 4. Representação esquemática dos componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência (adaptado, [28]).

Um espectrômetro de massas é composto de quatro partes principais, conforme descrito na Figura 5: um sistema de introdução de amostra, que pode ser por inserção direta ou utilizando alguma técnica de separação; uma fonte de ionização, um analisador de massas e um detector. Enquanto a fonte de ionização converte moléculas em íons, o analisador de massas resolve estes íons em função da sua relação massa/carga (m/z) antes de serem medidos pelo detector.

Figura 5. Representação esquemática dos componentes básicos de um espectrômetro de massas (adaptado, [30]).

Existem diversas opções de fontes de ionização e uma das formas de escolha adequada é considerar o modo de introdução da amostra no sistema: fontes de ionização para amostras já presentes em fase gasosa são diferentes daquelas que recebem as amostras em fase líquida. Algumas opções de fonte de ionização utilizadas com a cromatografia líquida de alta eficiência incluem a ionização por electrospray (Electrospray Ionization, ESI) [31], ionização química à pressão atmosférica (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) [32] e fotoionização à pressão atmosférica (Atmospheric Pressure Photoionization, APPI) [33]. Esta ionização pode ser feita nos modos positivo e/ou negativo, ou seja, análise de cátions e ânions respectivamente, de acordo com a presença de grupos funcionais presentes na estrutura do composto a ser estudado. Na grande maioria dos trabalhos publicados, ESI é o método de ionização de escolha mais utilizado quando aplicada a técnica de HPLC hifenada à MS (HPLC-MS). De acordo com a Figura 6, é possível notar que, realizando-se a escolha de acordo com a razão m/z e polaridade dos compostos, esse modo de ionização é o mais abrangente, porém APCI e APPI são complementares ao ESI e úteis para análises de compostos apolares e termicamente estáveis.

Figura 6. Faixas de aplicação das técnicas de ionização utilizadas em associação com a cromatografia líquida de alta eficiência (adaptado, [34]).

Quanto aos analisadores de massas, os mais comumente empregados são: quadrupolo [35], armadilha de íons (Ion Trap, Trap) [36], tempo de vôo (Time of Flight, TOF) [37], Orbitrap [38], e Ressonância Ciclotrônica de Íons com Transformada de Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR) [39]; Espectrômetros de massas híbridos ou sequenciais referem-se à combinação de dois ou mais analisadores e podem auxiliar na identificação dos compostos de interesse. Por meio de experimentos de dissociação induzida por colisão (Collision Induced Dissociation, CID), que podem ser realizados tanto em analisadores híbridos (ex. triplo quadrupolo (QqQ), quadrupolo-TOF (QTOF) ou quadrupolo-armadilha de íons (QTRAP)) quanto em analisadores de trap, é possível selecionar compostos e depois fragmentá-los. Desta forma, o perfil de fragmentação da espécie fornece informações adicionais para confirmação do composto de interesse, uma vez que muitas drogas e seus metabólitos possuem massas similares e irão apresentar a mesma razão m/z, os íons produto formados após a colisão serão capazes de diferenciá-las.

HPLC-MS utilizando ionização por electrospray é a técnica de escolha para aplicação de análises qualitativas e quantitativas em amostras biológicas complexas. A separação cromatográfica prévia pode reduzir a complexidade e amenizar os efeitos de matriz durante a ionização. As colunas mais utilizadas são a C18 em fase reversa para aplicação em drogas com características mais apolares e a HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) para separação cromatográfica de compostos polares e hidrofílicos. A escolha da coluna deverá ser realizada de acordo com a abrangência requerida pelo estudo.

1.4. Drogas de abuso

Para este estudo, a cocaína (COC) e a maconha (THC) foram as escolhidas, uma vez que, segundo ao Escritório das Nações Unidas sobre Drogas e Crimes (UNODC), estas se encontram entre as drogas mais cultivadas, traficadas e consumidas do mundo [40]. Além disto, é importante ressaltar que uma vez que a matriz biológica de trabalho é a urina, o desenvolvimento do método deve ser realizado focando nos principais produtos de biotransformação, ou metabólitos encontrados.

1.4.1. Cocaína

Com registros que datam de mais de 5000 anos, o costume de mascar as folhas da planta Erythroxylum coca era uma prática historicamente difundida e rotineira principalmente nos países da América do Sul, porém, apenas no final do século XIX é que a cocaína foi extraída pela primeira vez desta planta e seu uso foi empregado em várias finalidades, como o terapêutico. No início do século XX ocorreu a popularização do seu consumo por aspiração nasal, prática que acarretou em milhares de mortes e, consequentemente, à sua proibição [41]. De acordo com o relato anual da UNODC em 2017, o Brasil representa o país de tráfico mais intenso de COC e crack na América do Sul e o segundo maior mercado do mundo [40].

Em sua forma purificada, o sal cloridrato de cocaína (Figura 7 (a)) é um sólido branco hidrossolúvel e seu uso ocorre, mais frequentemente, por aspiração intranasal ou dissolvida em água para uso endovenoso. Além disto, através da alcalinização do sal há formação do crack (Figura 7 (b)), variante que, por sua vez, é mais volátil e por este motivo é consumida através do fumo.

Figura 7. Principais formas de apresentação da cocaína (a) cloridrato de cocaína (b) crack, base livre preparada por alcalinização do cloridrato.

Independentemente da forma como é consumida, esta droga de abuso é um estimulante do sistema nervoso central (SNC), e seus efeitos incluem euforia, excitação, insônia e supressão do apetite. Estes efeitos se dão por conta do mecanismo de ação da droga no SNC onde tal substância bloqueia a reabsorção de noradrenalina, dopamina e serotonina, monoaminas relacionadas à função da memória. Os níveis altos de concentração sinápticas dessas aminas resultam em maior senso de alerta, bem-estar e euforia. Subsequentemente, a depleção destas substâncias resulta em depressão e desconforto, levando ao usuário a tomar novas doses e mais elevadas [42].

No organismo, a COC rapidamente é quase completamente biotransformada e desativada. Ela sofre extensa biotransformação, e a benzoilecgonina (BZE), formada por hidrólise hepática mediada pela carboxilesterase no fígado ou espontânea, é o principal metabólito formado. Embora este produto de transformação não possua atividade farmacológica alguma, o grande interesse nesta substância se dá devido ao seu tempo de vida nas matrizes biológicas, que é seis vezes maior do que ao da COC. Além disto, reações de hidrólise mediadas por esterases plasmáticas e hepáticas através da enzima colinesterase dão origem a um segundo metabólito, o éster metilecgonina (EME). Na urina, cerca de 1 a 5 % da droga ingerida é eliminada na forma de composto inalterado, 15 a 50 % na forma de BZE, 15 a 35 % na forma de EME e o restante em demais metabólitos que podem ser formados [43].

Além disso, quando há consumo concomitante de etanol pelo indivíduo, um outro metabólito pode estar presente, resultante do processo da transesterificação da COC, o cocaetileno (CET) [44]. Este produto de transformação é bioativo e pode colaborar para o aumento do tempo de efeito da cocaína no organismo, além dele próprio apresentar maior toxicidade. As estruturas moleculares dos principais metabólitos da COC podem ser observadas na Figura 8.

Figura 8. Principais vias de biotransformação da cocaína quando administrada em humanos. As estruturas moleculares representadas correspondem a (a) benzoilecgonina

(BZE), (b) éster metilecgonina (EME) e (c) cocaetileno (CET).

Diversos trabalhos na literatura [8,45,46] reportam a estabilidade da COC e seus metabólitos em matrizes biológicas. Estes estudos apontam que os principais fatores que irão influenciar na estabilidade ao longo do tempo são a temperatura de armazenamento, pH e a matriz biológica. De maneira geral, a estabilidade das drogas de abuso e seus metabólitos aumenta com a diminuição da temperatura e, para a cocaína, uma vez que em urina somente a hidrólise não-enzimática pode ocorrer, o pH é o fator de maior importância na estabilidade dos analitos, sendo que condições mais ácidas (pH = 5) são favoráveis em relação a condições mais básicas (pH = 8). Em 1994, Dugan et al. [11] demonstraram que mesmo após 12 meses de armazenamento em condições de pH = 5 e sob refrigeração em congelador (-20 ºC),

a BZE ainda continuava estável, diferentemente da COC, demonstrando que este metabólito é mais estável que a própria droga de abuso.

Para a técnica de DBS, é possível encontrar na literatura alguns trabalhos que reportam o desenvolvimento de métodos de análise e quantificação para a COC e seus principais metabólitos. [21,47,48]. Através do estudo da estabilidade para COC, BZE e EME em concentrações de 10 e 50 ng mL-1_{, mantidos em condições de 4 e}

-20 ºC, foi possível observar que estes analitos se mantiveram estáveis por pelo menos 6 meses sob condição de -20 ºC. Porém, o mesmo não ocorreu em 4 ºC.

Para análises em DUS, dois trabalhos já foram reportados na literatura para COC ou metabólitos. Em 2013, Otero-Fernández et al. [48] otimizaram um método de extração para opióides, COC e BZE. Porém, não existe dado algum de estabilidade para estes compostos nesta matriz. Ainda em 2013, Lee et al.[21]desenvolveram um método de análise e quantificação de 19 drogas em DUS, entre elas a BZE. A estabilidade foi testada por 30 dias em temperatura ambiente, sem exposição ao ar ou à luz. Em uma concentração de 100 ng mL-1_{, este analito apresentou uma perda}

menor que o erro permitido para o método, sendo ainda útil para análise. Apesar disto, ainda não existem trabalhos que estudem a estabilidade da EME e CET e em períodos mais longos. Sendo assim, pode-se dizer que, quanto ao DUS, os trabalhos presentes na literatura ainda são bastante limitados e estudos mais detalhados são necessários.

1.4.2. THC

A Cannabis é um gênero de angiosperma da família Cannabaceae, que, sendo classificada em somente uma espécie (Cannabis sativa L.), suas variedades são divididas em diversas subespécies, sendo as três principais a sativa indica (C. sativa subsp. sativa), indica (C. sativa subsp. indica) e ruderalis (C. sativa subsp. ruderalis) [50]. De uma maneira geral, estas plantas possuem mais de 489 constituintes, dentre os quais cerca de 70 são canabinóides, localizados especialmente em suas folhas e inflorescências. Estas substâncias são classificadas em dois grupos: psicoativas, as quais são as responsáveis pelos efeitos fisiológicos e psicológicos, como o tetraidrocanabinol (Δ9_{-THC ou simplesmente THC), e não-psicoativas, como}

canabinol (CBN) e canabidiol (CBD), mostrados na Figura 9 [50].

Figura 9. Estrutura molecular dos principais componentes da cannabis: (a) THC (b) CBN e (c) CBD.

Muito embora os primeiros registros de uso destas plantas datem de mais de 2700 anos a.C. pela farmacopeia chinesa, apenas em 1964 o THC foi isolado pela primeira vez, levando ao descobrimento de um importante sistema neurotransmissor endógeno denominado sistema endocanabinóide. Este sistema é amplamente distribuído no cérebro e no corpo, sendo responsável por inúmeras funções vitais significativas [51].

As duas formas de abuso predominantes são por via oral ou inalatória (pulmonar), sendo esta última a mais utilizada. Quando fumado, o THC é rapidamente

absorvido, sendo prontamente distribuído para o cérebro e outros órgãos. Uma vez que este composto é muito lipossolúvel, sua biotransformação ocorre no fígado, catalisada pelas enzimas citocromo P450, cuja função é oxidar esta espécie de forma a torná-la mais hidrossolúvel para que seja facilmente excretada do organismo. Ao todo, mais de 100 produtos de biotransformação do Δ9_{-THC já foram identificados,}

porém, a rota majoritária é uma primeira oxidação desta droga formando a 11-hidroxi-Δ9_{-tetrahidrocanabinol (11-OH-THC) que, sendo ainda mais ativo que o Δ}9_{-THC, irá}

sofrer uma nova oxidação e gerando o 11-nor-9-carboxi-Δ9_{-tetrahidrocanabinol}

(THC-COOH). Este último, por fim, é conjugado com o ácido glicurônico (THC-COOH-gluc) sendo esta a forma mais abundantemente presente na urina [52]. Um esquema representativo deste processo pode ser observado na Figura 10.

Figura 10. Principal via de biotransformação do Δ9_{-THC (a), gerando inicialmente os}

metabólitos de fase I (b) 11-OH-THC e (c) THC-COOH por reações de oxidação e posteriormente o metabólito de fase II (c) THC-COOH-gluc através da glicuronidação.

Desta forma, a excreção do Δ9_{-THC do organismo se dá majoritariamente}

através dos produtos de biotransformação hidroxilados e carboxilados, conjugados ou não com o ácido glicurônico. Deste total, 65% é eliminado nas fezes e 25% na urina Entre os metabólitos ácidos, THC-COOH conjugado ao ácido glucuronídeo é o principal em urina, enquanto que o THC-OH predomina nas fezes. Menos de 1% do Δ9_{-THC é eliminado inalterado na urina [53].}

O tempo transcorrido desde a última utilização da droga até a obtenção do último resultado positivo em uma amostra de urina é chamado “período de detecção”. De acordo com a literatura, dentro de 5 dias de 80 a 90% do THC é excretado em forma de seus metabólitos [54,55]. Sendo assim, o tempo de detecção adotado após o fumo de cigarros, utilizando o valor de 15 ng mL-1 _{como valor mínimo (cut off) para}

concentração de seus principais metabólitos, é de 2 a 5 dias, podendo ser maior em usuários crônicos.

Em análises laboratoriais de rotina, geralmente é analisada e quantificada a concentração de THC-COOH livre total presente na urina. Para que isto seja possível, é necessário que, antes que a amostra seja quantificada, se realize uma etapa de clivagem do ácido conjugado geralmente realizada através de hidrólise básica ou enzimática [56].

Quanto à estabilidade destes metabólitos, estudos realizados demonstram a sua dependência com a temperatura, pH e o tipo de material onde está armazenado [57,58]. Apesar de Dugan et al. [11] reportarem perda de apenas 1% para canabinóides e seus metabólitos em urina após um ano de armazenamento a -20 ºC, outros autores [59] apresentaram perdas muito mais significativas em menos tempo, exibindo resultados contraditórios.

Em DBS, é possível encontrar dois estudos na literatura onde há desenvolvimento de métodos de identificação e quantificação de THC e seus principais metabólitos [60,61]. Mercoli et al. [61]testaram a estabilidade do THC, THC-OH e THC-COTHC-OH em até 3 meses de armazenamento, obtendo resultados satisfatórios uma vez que ao final do estudo a perda foi menor que 10%. Para o DUS não foi possível encontrar na literatura estudos reportando o desenvolvimento de um método de análise do THC e seus metabólitos, levando a necessidade de estudos neste sentido.

2. Objetivos

Este trabalho tem como objetivo principal o desenvolvimento de métodos de análise de drogas de abuso em DUS por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS). Para isto, foram selecionadas duas substâncias psicoativas amplamente empregadas como drogas de abuso e seus respectivos metabólitos: a cocaína (COC) e o tetraidrocanabinol (THC).

Para o desenvolvimento de um método de amostragem em DUS, o trabalho contou com etapas como otimização do preparo de amostra e da extração. Posteriormente, o método desenvolvido necessitou passar por um processo de validação utilizando o guia da Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX) [62], onde as principais figuras de mérito avaliadas foram linearidade, precisão e exatidão, limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), integridade de diluição e estudos de interferência como efeito matriz e seletividade. Além disto, uma vez que umas das potenciais vantagens oferecidas pelo método seria a grande estabilidade fornecida, um estudo foi realizado a fim de verificar se os critérios desejados foram atendidos.

Uma vez desenvolvido e validado o método de DUS, o trabalho teve como objetivo aplicar em amostras reais para análises qualitativas e quantitativas.

3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais

3.1.1. Materiais e solventes

Para as manchas de urina secas, utilizou-se o papel Whatman Protein Saver Card 903, próprio para receber matrizes biológicas. Como solventes foram utilizados metanol e acetonitrila grau HPLC (J.T.Baker, USA), hexano, acetato de etila, éter metil-terc-butílico, clorofórmio e diclorometano grau HPLC (Sigma-Aldrich, USA) e água ultrapurificada ou Milli-Q (Merck, BRA).

3.1.2. Padrão referência de cocaína e metabólitos

Os padrões certificados de referência e marcados isotopicamente (deuterados) utilizados na preparação da curva de calibração foram a cocaína (COC) e a cocaína deuterada (COC-d3), e seus principais metabólitos encontrados na urina:

benzoilecgonina (BZE), éster metilecgonina (EME) e cocaetileno (CET) (Cerilliant, USA).

3.1.3. Padrão referência de THC e metabólitos

Os padrões certificados de referência e marcados isotopicamente (deuterados) utilizados na preparação da curva de calibração foram o delta-9-tetraidrocanabinol (Δ9_{-THC) ou simplesmente tetraidrocanabinol (THC) e o delta-9-tetraidrocanabinol}

deuterado (Δ9_-THC-d

3) ou simplesmente tetraidrocanabinol deuterado (THC-d3) e

seus principais metabólitos: 11-hidroxi-Δ9_{-tetrahidrocanabinol (11-OH-THC),}

11-nor-9-carboxi-Δ9_{-tetrahidrocanabinol COOH) de referência e deuterado}

(THC-COOH-d3) e conjugado com o ácido glicurônico (THC-COOH-gluc) (Cerilliant, USA).

3.1.4. Equipamentos e acessórios

Para o preparo das amostras, cartões de papel filtro Whatman® 903 (Sigma-Aldrich, USA) foram obtidos para coleta e armazenamento das amostras.

Na extração das amostras, utilizou-se um agitador do tipo multi-vórtex (Heidolph, GER), referido neste trabalho somente como “vórtex” e uma centrífuga cllínica (Benchmark Scientific, USA). Além disto, para secagem do solvente foi utilizado um concentrador a vácuo do tipo SpeedVac (Eppendorf, GER).

Para análise dos compostos, a separação cromatográfica foi realizada através de uma coluna para HPLC do tipo C18 (Atlantis T3, 3.0 x 150 mm, 3 μm, Waters®_{). Os}

equipamentos de cromatografia líquida de alta eficiência e espectrômetros de massas utilizados foram um shimadzu LCMS-8040 (Shimadzu Corp., JPN), sistema que possui um cromatógrafo líquido de alta eficiência acoploado à um espectrômetro de massas que utiliza fonte de ionização por electrospray e analisador de massas sequencial do tipo triplo quadrupolo e um HPLC Agilent 1260 Infinity Binary (Agilent Technologies, USA) acoplado a um espectrômetro de massas ABSciex 5500QTRAP (ABSciex, SIN), utilizando como fonte de ionização por electrospray e analizador sequencial do tipo QTrap.

3.1.5 Amostras Positivas

Amostras positivas foram fornecidas pelo Laboratório de Toxicologia Analítica (LTA-CIATox), localizado no Centro de Controle de Intoxicações do Hospital de Clínicas da UNICAMP. As amostras foram armazenadas em freezer (-20 °C) até o fim das análises para posterior descarte apropriado. Os experimentos foram conduzidos usando protocolos e condições aprovadas pelo Comitê de Ética (CAAE 58187816.6.0000.5404) presente no Anexo 1.

3.2. Metodologia

Às amostras de urina negativas (coletadas de indivíduos que não fazem uso de fármacos ou drogas de abuso), foram adicionadas soluções padrão das drogas de abuso e seus metabólitos em proporção de 9:1(v/v) urina:padrão em diferentes níveis de concentração. Para o preparo das amostras, procedimentos já descritos na literatura foram utilizados como ponto de partida [17,19,21] e, posteriormente, adaptados para otimização da extração.

3.2.1. Cocaína

A partir das amostras de urina dopadas com padrão de referência da COC e seus principais metabólitos (BZE, EME e CET), em sete níveis distintos de concentração (25; 50; 100; 250; 500; 750 e 1000 ng mL-1_{), 20 µL foram coletados e}

adicionados ao papel Whatman® 903. Este volume foi otimizado de forma a ser o suficiente para preencher o círculo contido no papel suporte (Ø = 12 mm) sem ultrapassar as bordas tracejadas. Em seguida, deixou-se secar as amostras por 2 horas em condições ambientes. Após secagem, discos (Ø = 5 mm) foram retirados do cartão utilizando um furador de papel e transferidos para tubos de polipropileno, onde puderam seguir para extração ser armazenadas. A representação esquemática do preparo de amostra do DUS pode ser encontrada na Figura 11.

Figura 11. Representação esquemática do preparo das amostras de DUS em papel Whatman® 903 Protein saver card, próprio para receber matrizes biológicas.

A extração foi realizada com 300 µL de uma solução de metanol:água (6:4, v/v) e ácido fórmico 0,1% contendo o padrão interno, COC-d3 (10 ng mL-1) com agitação

em vórtex durante 15 minutos seguidos por 5 minutos de centrifugação a 10.000 rpm em temperatura ambiente. Finalmente, 150 µL do sobrenadante foram transferidos para vials e submetidos a análise.

3.2.2. THC

Às amostras de urina foram adicionados os padrões de Δ9_{-THC e seus}

metabólitos em uma proporção de 9:1 entre urina:padrão (v/v), obtendo concentrações finais em um intervalo de 10 a 500 ng mL-1_{, em seis níveis diferentes de concentração}

(10, 25, 50, 100, 250 e 500 ng mL-1_{), e padrão interno (THC-COOH-d}

3 e Δ9-THC-d3)

com concentração de 100 ng mL-1_{. O preparo das amostras seguiu procedimento}

similar ao descrito na sessão 3.1.1 para a cocaína, e, após secagem os discos (Ø = 5 mm) transferidos para tubos de polipropileno foram submetidos a uma etapa de hidrólise básica.

Nesta etapa, foram adicionados 250 µL de uma solução de NaOH com concentração de 1 mol L-1_{, seguida de incubação à 70 ºC por 25 minutos em estufa.}

Ao esfriar a solução, adicionou-se 250 µL de ácido acético glacial P.A.

Para extração, 1000 µL de solvente orgânico, a ser detalhado na sessão 4.2., foram adicionados e a extração foi realizada com agitação em vórtex por 15 minutos seguidos de centrifugação por 5 minutos (10.000 rpm). Em seguida, 800 µL da fase orgânica foram transferidas para outro tubo de polipropileno e levados a evaporação em um concentrador a vácuo (SpeedVac) por cerca de 45 minutos a 45 ºC. Após secagem, os analitos foram reconstituídos em 150 µL de metanol, transferidos para vials e levados ao sistema para análise por LC-MS/MS.

3.3. Aquisição de Dados

3.3.1. Cocaína

A separação cromatográfica foi realizada através da injeção de 15 µL das amostras em um sistema Shimadzu UHPLC NEXERA acoplado a um Shimadzu MS 8040, com analisador de massas do tipo triplo quadrupolo. Utilizou-se uma coluna C18 (Atlantis T3, 3.0 x 150 mm, 3 μm, Waters®_{) para separação dos componentes em uma}

corrida em modo de eluição gradiente com duração total de 16 minutos, de acordo com a Tabela 1, onde a fase móvel consistiu de formiato de amônio 2 mM e 0,1% de ácido fórmico em (A) água e (B) metanol.

No espectrômetro de massas, os experimentos foram realizados utilizando o modo de aquisição conhecido como monitoramento múltiplo de reações (MRM), operando em modo positivo de ionização por eletrospray (ESI-(+)), onde cada analito foi identificado por sua razão massa/carga (m/z) em pelo menos duas transições: uma primeira, de quantificação, e uma segunda, de confirmação dos compostos. As condições da fonte para operar no modo de ESI(+) foram otimizadas e estabelecidas como: voltagem do capilar 4.5 kV, temperatura de dessolvatação 250 ºC, temperatura do bloco de aquecimento a 400 ºC, vazão do gás de secagem (N2) de 15 L min-1,

vazão do gás nebulizador (N2) a 3 L min-1 e gás de colisão (Ar) 230 kPa. As razões

m/z das transições MRM, bem como as energias necessárias para estas foram estabelecidas para cada analito e podem ser encontradas na Tabela 2.

Tabela 1. Parâmetros de gradiente da fase móvel para separação da cocaína e seus metabólitos por LC-MS. Tempo (min) Vazão (μL min-1₎ A (%) B (%) 0,5 400 95 5 10 400 5 95 13 400 5 95 13,10 400 95 5 16 400 95 5

3.3.2. THC

Para as análises foram injetados 20 µL de amostra, utilizando a separação cromatográfica em um HPLC 1260 Infinity através de uma coluna C18 (Atlantis T3, 3.0 x 150 mm, 3 μm, Waters®_{) em eluição por gradiente de acordo com a Tabela 3, onde}

a fase móvel (A) consiste de 0,1% de ácido fórmico em água e (B) metanol. Após separação cromatográfica, os analitos foram detectados por espectrometria de massas através de um ABSciex 5500QTRAP, utilizando como fonte de ionização por electrospray e analizador sequencial do tipo QTrap. Para cada substância, foram selecionadas duas transições, sendo a mais intensa utilizada para quantificação e a segunda para confirmação. Como o THC apresentou melhor comportamento para ionização por eletrospray em modo positivo (ESI-(+)) e os demais analitos em modo negativo (ESI-(-)), o método foi construído utilizando a técnica de polarity switch. Esta técnica permite monitorar íons positivos e negativos concomitantemente através da mudança de polaridade constante durante a corrida.

Tabela 2. Parâmetros obtidos para os MRM no modo positivo (ESI-(+)) por LC-MS/MS: Íon precursor selecionado (Q1), íons produto (Q3) voltagens das transições para os analitos e padrão interno. Q1 (m/z) (m/z) Q3 (min) tR Q1 (V) CE (V) Q3 (V) COC 304 182 ₈₂ 7,20 _7,20 -14 _-14 -20 _-31 -20 _-16 BZE 290 168 7,30 -14 -17 -19 105 7,30 -30 -28 -21 EME 200 182 2,15 -21 -14 -21 82 2,15 -20 -27 -17 CET 318 196 ₈₂ 7,80 _7,80 -14 _-14 -19 _-30 -22 _-16 COC-d3 307 185 7,20 -15 -20 -19 85 7,20 -15 -33 -16

As condições da fonte operando nos modos de ESI-(+) e ESI-(-) otimizadas podem ser encontradas na Tabela 4. Ainda, os valores de m/z dos íons monitorados nas transições MRM, bem como as energias necessárias para gerar estes foram estabelecidas para cada analito e estão presentes na Tabela 5.

Tabela 3. Gradientes da fase móvel para separação do THC e seus metabólitos por LC-MS.

Tempo (min) Vazão (μL min-1₎ A (%) B (%) 0 300 95 5 1 300 95 5 7 300 5 95 14 300 5 95 14,3 300 95 5 22 300 95 5

Tabela 4. Valores de condições da fonte operando nos modos de eletrospray positivo (ESI-(+)) e negativo (ESI-(-)). Curtain Gas (CUR) (V) Collision Gas (CAD) (V) IonSpray Voltage (IS) (V) Temperature (TEM) (°C) Ion Source Gas 1 (GS1) (V) Ion Source Gas 2 (GS2) (V) Entrance Potencial (EP) (V) ESI-(+) 30 4 5000 650 55 70 10 ESI- (-) 30 6 -4500 650 55 70 -10

3.4. Processamento de dados

3.4.1. Cocaína

Os dados adquiridos foram processados utilizando o software Labsolutions (versão 5.53 SP2, Shimadzu, Kyoto, Japan), onde foi realizada a análise no programa Quant Browser na identificação e integração dos picos cromatográficos e construção das curvas analíticas para quantificação.

3.4.2. THC

Os dados foram adquiridos utilizando o software Analyst® (versão 1.5.2, Applied Biosystems, Foster City, USA) e analisados utilizando o software MultiQuant (versão 3.0.1, Applied Biosystems, Foster City, USA) para integração dos picos cromatográficos e construção das curvas de calibração para análises quantitativas. Tabela 5. Parâmetros MRM operando no (a) modo positivo (+)) e (b) modo negativo (ESI-(-)) de aquisição. (a) Q1 (m/z) Q3 (m/z) tr (min) DP (V) CE (V) CXP (V) THC 315,0 193,2 17,20 51 29 17 123,1 17,20 51 45 13 THC-d3 318,2 196,2 17,25 111 31 5 122,9 17,25 111 41 19 (b) Q1 (m/z) Q3 (m/z) tr (min) DP (V) CE (V) CXP (V) THC-COOH 343,03 299,1 15,60 -50 -28 -13 245 15,60 -50 -38 -25 THC-OH 329,35 311,1 15,30 -175 -26 -15 268 15,30 -175 -36 -17 THC-COOH-d3 346,39 302,2 15,60 -165 -28 -13 248,1 15,60 -165 -38 -11

3.5. Validação do Método

3.5.1. Cocaína

Para validação, seguiu-se o guia internacional de toxicologia forense, SWGTOX [63] e foram avaliadas as figuras de mérito anteriormente citada nos objetivos: linearidade, LD e LQ, precisão e exatidão, presença de interferentes, efeito de matriz e integridade de diluição. Além disto, foi realizado um estudo de estabilidade em três diferentes condições de temperatura de armazenamento em um período de até 90 dias.

A linearidade foi testada estabelecendo um intervalo no qual geralmente se encontram os valores de amostras em casos reais, englobando principalmente o valor de corte (cut off) dos metabólitos em urina, ou seja, a concentração mínima para que a amostra seja considerada positiva nos laboratórios de rotina forense internacionais. Para avaliação da linearidade, estas curvas foram construídas em quintuplicatas obtendo assim os parâmetros da curva e avaliando, através de testes estatísticos, a variância entre os resíduos apresentados, a fim de escolher o melhor método de ponderação.

Os valores LD e LQ representam, respectivamente, a menor concentração da substância avaliada que pode ser detectada e quantificada no procedimento experimental. Estes parâmetros foram calculados baseando na razão sinal/ruído (S/N) do pico (S/N = 3 para o LD, S/N = 10 para o LQ). Uma vez que diferentes analitos apresentam diferentes LQ, foi escolhido como limite inferior do método a concentração do analito que apresentou maior LQ.

Para que fossem avaliadas a exatidão e precisão do método foram construídas, por cinco dias distintos, curvas analíticas para quantificação de amostras de concentrações conhecidas, denominadas controle (quality control, QC). Três concentrações escolhidas, sendo definidas como controle baixo (CB), controle médio (CM) e controle alto (CA) foram avaliadas em triplicata em cada dia, a fim de avaliar exatidão e precisão dentro de um dia (intra-dia, n=3) durante cinco dias (inter-dias, n=15). A precisão é expressa através do coeficiente de variação (C.V.), sendo que

este deve ser sempre menor ou igual a 20%, ou seja, o método pode ter até 20% de imprecisão. A exatidão é medida por um intervalo (bias) em que mostra o quanto, também em porcentagem, cada amostra desvia do valor teórico ou nominal, sendo aceita amostras com até 20% de inexatidão (80-120% da concentração nominal).

Os estudos de interferência foram realizados para testar a credibilidade do método. Sendo assim, a seletividade do método foi avaliada quando em presença de outros compostos comumente encontrados conjuntamente com a COC e para o efeito de matriz, uma vez que a matriz biológica pode conter compostos que podem interferir na análise e afetar a ionização dos analitos ao se trabalhar com ESI. Além disto, amostras negativas de voluntários foram testadas para avaliar a presença de falso positivo. A integridade de diluição foi avaliada uma vez que estes analitos podem ser encontrados na matriz biológica frequentemente em concentrações maiores que o limite de quantificação superior do método.

Para o estudo de estabilidade, amostras armazenadas em três condições diferentes de temperatura: ambiente, geladeira (4 ºC) e freezer (-20 ºC); mantidas livre de umidade através da utilização de sílica em gel, foram avaliadas em intervalos de 3, 7, 15, 30, 60 e 90 dias.

3.6. Aplicação em amostras reais

3.6.1. Cocaína

Para testar a metodologia desenvolvida, cinco amostras previamente indicadas como positivas através de testes de imunoensaio, fornecidas pelo Laboratório de Toxicologia Analítica (LTA-CIATox) da UNICAMP, foram analisadas e quantificadas através da técnica de DUS.

A quantificação das amostras foi realizada através da construção de uma curva no intervalo de 25 a 1000 ng mL-1_{, conforme o método validado, com adição do padrão}

de referência em acetonitrila em urina em proporção de 9:1 (urina:padrão). Tanto para a curva quanto para as amostras reais, 20 µL foram adicionados no papel Whatman® 903 seguindo o procedimento de preparo de amostra e extração previamente indicados na sessão 3.2.1, porém, uma vez que algumas amostras apresentaram concentrações de cocaína ou seus metabólitos acima do limite superior de quantificação da curva (1000 ng mL-1_{), estas foram submetidas à diluição conforme o}

necessário para que estivessem contidas no intervalo validado. A diluição das amostras positivas foi realizada utilizando amostra de urina controle anteriormente à sua adição no papel.

4. Resultados e discussões

4.1. Cocaína

4.1.1. Otimização Experimental

A mistura de solventes foi otimizada por um planejamento experimental do tipo simplex-centroide, construído através do software Design-Expert (DX 6.0.4.). Para este planejamento, extrações usando metanol (MeOH), acetonitrila (ACN) puros ou misturas de dois solventes (1:1, v/v) ou três solventes (1:1:1, v/v/v) foram testados em triplicata, com um total de 21 experimentos. Para encontrar a combinação ótima, ou seja, aquela capaz de extrair em maior quantidade todos os analitos simultaneamente, a área total de cada analito foi utilizada como resposta. As condições otimizadas são dadas por uma função denominada desejabilidade, a qual fornece, através de uma superfície de resposta, um ponto de ótimo global denominado predição (0 ≤ predição ≤ 1). Para a COC e seus metabólitos a combinação de solventes predita como ótimo global foi de metanol:água (6:4, v/v), onde um valor de 0,96 de predição indica que 96% das respostas, ou seja, área dos analitos, atingirão o seu máximo. Esta informação pode ser encontrada na Figura 11. Além disto, o uso de ácido fórmico 0,1% na extração foi também testado, levando a resultados ainda melhores.

Figura 12. Superfície de resposta da desejabilidade para um planejamento experimental do tipo simplex centroide, onde a predição aponta para o valor de ótimo global.

Após extração dos analitos da matriz do DUS, a separação analítica foi realizada, conforme gradiente informado na Tabela 1, gerando um cromatograma onde é possível identificar e quantificar a cocaína e seus metabólitos, conforme pode ser observado na Figura 12.

Figura 12. Cromatogramas representativos da (a) COC e seus metabólitos (b) BZE, (c) EME and (d) CET mais o padrão interno plus (e) COC-d3 em suas duas principais transições,

quantificação e confirmação respectivamente, obtidos por ESI-(+) para amostras de DUS em concentrações de 500 ng mL-1_.

Através de relações matemáticas é possível obter o valor do tempo de retardadamento (𝑡 ) (Eq. 1) da fase móvel para dada vazão de solvente de acordo com as dimensões da coluna cromatográfica.

𝑡 =

Onde 𝑉 corresponde ao volume da coluna e 𝐹 é a vazão da fase móvel utilizada.