1. Introdução
3.6. Aplicação em amostras reais
3.6.1. Cocaína
Para testar a metodologia desenvolvida, cinco amostras previamente indicadas como positivas através de testes de imunoensaio, fornecidas pelo Laboratório de Toxicologia Analítica (LTA-CIATox) da UNICAMP, foram analisadas e quantificadas através da técnica de DUS.
A quantificação das amostras foi realizada através da construção de uma curva no intervalo de 25 a 1000 ng mL-1, conforme o método validado, com adição do padrão
de referência em acetonitrila em urina em proporção de 9:1 (urina:padrão). Tanto para a curva quanto para as amostras reais, 20 µL foram adicionados no papel Whatman® 903 seguindo o procedimento de preparo de amostra e extração previamente indicados na sessão 3.2.1, porém, uma vez que algumas amostras apresentaram concentrações de cocaína ou seus metabólitos acima do limite superior de quantificação da curva (1000 ng mL-1), estas foram submetidas à diluição conforme o
necessário para que estivessem contidas no intervalo validado. A diluição das amostras positivas foi realizada utilizando amostra de urina controle anteriormente à sua adição no papel.
4. Resultados e discussões
4.1. Cocaína
4.1.1. Otimização Experimental
A mistura de solventes foi otimizada por um planejamento experimental do tipo simplex-centroide, construído através do software Design-Expert (DX 6.0.4.). Para este planejamento, extrações usando metanol (MeOH), acetonitrila (ACN) puros ou misturas de dois solventes (1:1, v/v) ou três solventes (1:1:1, v/v/v) foram testados em triplicata, com um total de 21 experimentos. Para encontrar a combinação ótima, ou seja, aquela capaz de extrair em maior quantidade todos os analitos simultaneamente, a área total de cada analito foi utilizada como resposta. As condições otimizadas são dadas por uma função denominada desejabilidade, a qual fornece, através de uma superfície de resposta, um ponto de ótimo global denominado predição (0 ≤ predição ≤ 1). Para a COC e seus metabólitos a combinação de solventes predita como ótimo global foi de metanol:água (6:4, v/v), onde um valor de 0,96 de predição indica que 96% das respostas, ou seja, área dos analitos, atingirão o seu máximo. Esta informação pode ser encontrada na Figura 11. Além disto, o uso de ácido fórmico 0,1% na extração foi também testado, levando a resultados ainda melhores.
Figura 12. Superfície de resposta da desejabilidade para um planejamento experimental do tipo simplex centroide, onde a predição aponta para o valor de ótimo global.
Após extração dos analitos da matriz do DUS, a separação analítica foi realizada, conforme gradiente informado na Tabela 1, gerando um cromatograma onde é possível identificar e quantificar a cocaína e seus metabólitos, conforme pode ser observado na Figura 12.
Figura 12. Cromatogramas representativos da (a) COC e seus metabólitos (b) BZE, (c) EME and (d) CET mais o padrão interno plus (e) COC-d3 em suas duas principais transições,
quantificação e confirmação respectivamente, obtidos por ESI-(+) para amostras de DUS em concentrações de 500 ng mL-1.
Através de relações matemáticas é possível obter o valor do tempo de retardadamento (𝑡 ) (Eq. 1) da fase móvel para dada vazão de solvente de acordo com as dimensões da coluna cromatográfica.
𝑡 =
,Onde 𝑉 corresponde ao volume da coluna e 𝐹 é a vazão da fase móvel utilizada.
Para este método, cuja vazão de fase móvel utilizada foi de 400 µL min-1 e, de
acordo com a dimensões da coluna utilizada (3.0 x 150 mm) o valor calculado para o 𝑡 foi de 2,11 min. Ao analisar os tempos de eluição dos compostos no cromatograma de separação, concluiu-se que a EME possui uma retenção muito fraca com a fase estacionária, o que faz com que este analito provavelmente co-elua com diversas impurezas contidas nas amostras, chamadas de interferentes, o que pode causar uma supressão iônica, ou seja, uma perda de sinal do composto alvo, gerando desvios maiores na precisão e exatidão de réplicas de injeção e extração.
Os valores das razões m/z para o íon precursor e suas transições, bem como as voltagens utilizadas, juntamente com os tempos de retenção (tR) podem ser
encontrados na Tabela 2 (página 38).
4.1.2. Validação da metodologia
Segundo a SAMHSA (Substance Abuse and Mental Health Services Administration), para que uma amostra seja considerada positiva, emprega-se um valor de corte de 100 ng mL-1 [63] para a BZE. Portanto, a linearidade foi estudada em
um intervalo de 25 a 1000 ng mL-1. As curvas foram construídas com adição de padrão
em amostras de urina controle avaliando a razão das áreas de cada analito (área do padrão de referência/área do padrão interno) em quintuplicata em função de sete níveis distintos de concentração (25, 50, 100, 250, 500, 750 e 1000 ng mL-1).
Aplicando o teste estatístico (Teste F, Eq 2.) para análise da variância foi possível concluir que existe heterocedasticidade, ou seja, uma tendência entre os resíduos.
𝐹 = 𝑠
𝑠
Onde 𝑠 corresponde a variância no nível mais alto de concentração e 𝑠 a variância no nível mais baixo de concentração da curva analítica. Se o valor da F calculado experimentalmente for maior que aquele fornecido em tabela, escolhido de
acordo com o nível e confiança e número de graus de liberdade das replicatas, há heterocedasticidade entre os dados.
Como para todos os analitos avaliados em quintuplicata foi possível notar comportamento heterocedástico, fez-se necessária a aplicação de um método de ponderação a fim de minimizar estas tendências. Para estes analitos, nesta faixa de concentração, foi escolhida a ponderação 1/x, uma vez que esta foi a que apresentou os melhores ajustes, ou seja, menores erros de exatidão para os diferentes níveis da curva. Na Tabela 6 é possível encontrar os valores obtidos para a regressão linear sendo a o coeficiente angular da curva e b o coeficiente linear. Além disto, o coeficiente de correlação (r) também pode ser encontrado.
Os valores de LD e LQ, avaliados respectivamente levando em consideração valores de S/N ≥ 3 e S/N ≥ 10, foram de 0,1 e 1 ng mL-1 para o CET; 1 e 5 ng mL-1
para a COC e BZE; 15 e 25 ng mL-1 para a EME. Uma vez que o maior LQ do
instrumento obtido para os analitos foi de 25 ng mL-1 para a EME, este foi definido
como o LQ para a curva de calibração. Para validação deste valor como LQ do método, amostras fortificadas contendo esta concentração foram avaliada por três dias em triplicatas (n = 9), sendo quantificada por regressão linear através de curva de calibração construída no mesmo dia, fornecendo valores de imprecisão aceitos para o método (C.V. ≤ 11,3%) bem como de exatidão com intervalo de 80,0 a 114,5%. Informações mais detalhadas podem ser encontradas na Tabela 7.
Tabela 6. Valores de coeficientes das regressões lineares e seus intervalos de confiança (n=5, 95%) onde a representa a inclinação da curva, b o intercepto com o eixo y e r o coeficiente de correlação. a ± I.C. (n = 5, 95%) (n = 5, 95%) b ± I.C. (n = 5, 95%) r ± I.C. COC 1,43 ± 0,08 -1,73 ± 3,00 0,996 ± 0,003 BZE 1,15 ± 0,06 -3,60 ± 2,95 0,997 ± 0,001 EME 0,198 ± 0,007 -0,072 ± 1,180 0,996 ± 0,002 CET 1,27 ± 0,09 -2,00 ± 4,06 0,996 ± 0,003
A imprecisão (CV (%)) e exatidão (bias) foram avaliadas dentro de um mesmo dia em triplicata (intra-dia, n = 3) durante 5 dias (inter-dias, n = 15) para 3 diferentes níveis de concentração. A imprecisão mede o quanto as replicatas desviam entre si em relação ao valor de concentração calculado por meio de regressão linear, e a exatidão o quanto elas se aproximam da concentração nominal. Os erros encontrados para as análises de exatidão dentro de um único dia se encontram em uma faixa de 85,6-118,0% e para os 5 dias de análises de 81,6%-119,7%. Os dados estão sumarizados na Tabela 8.
Para os estudos de interferência, primeiramente 10 amostras controle foram analisadas com intuito de testar falsos positivos, o que não foi encontrado. Outro estudo realizado foi a adição de 28 outras drogas de abuso ou fármacos comumente encontrados em usuários de cocaína, contidos na Tabela 9 e adicionadas em concentrações finais de 1000 ng mL-1 em amostras contendo o limite de quantificação
inferior da curva. Conc. ± I.C. (ng mL-1) (n = 9, 95%) C.V. (%) (n = 9) bias (%) (n = 9) 26,4 ± 0,1 9,8 102,3-114,5 26,6 ± 0,8 7,6 105,8-108,2 25,6 ± 1,1 11,3 80,0-109,0 26,4 ± 0,7 6,6 109,1-110,5
Os valores calculados das concentrações obtidas dos analitos após adição dos potenciais interferentes estão presentes na Tabela 10. Os valores de exatidão foram calculados em relação à concentração nominal (LQ = 25 ng mL-1) e estiveram sempre
em um intervalo de 80,1 a 119,6% de exatidão. Intra-dia Inter-dia Conc. ± I.C. (ng mL-1) (n=3, 95%) C.V. (%) (n=3) bias (%) (n=15) Conc. ± I.C. (ng mL-1) (n=15, 95%) C.V. (%) (n=15) bias (%) (n=15) COC CB 72,6 ± 0,8 3,0 93,6-99,2 78,5 ± 0,5 7,6 93,6-119,7 CM 399,6 ± 6,8 4,4 95,5-104,3 402,2 ± 1,9 6,1 93,3-111,7 CA 851,6 ± 15,0 4,6 102,0-111,6 791,9 ± 5,6 8,0 83,5-114,8 BZE CB 75,4 ± 1,9 6,6 95,8-108,1 78,1 ± 0,3 4,8 95,8-108,5 CM 405,4 ± 7,2 4,6 96,1-105,1 39,3 ± 1,1 3,6 94,1-105,1 CA 809,3 ± 20,6 6,6 93,7-106,7 768,9 ± 4,8 8,2 83,4-112,0 EME CB 73,4 ± 5,0 17,9 87,6-118,0 75,9 ± 0,6 11,3 81,6-118,2 CM 375,9± 13,5 9,3 85,6-103,1 387,8 ± 2,3 7,7 85,6-106,8 CA 763,8 ± 28,6 9,7 86,2-104,8 774,7 ± 4,8 8,0 84,2-111,3 CET CB 77,8 ± 2,0 6,6 96,9-110,6 80,4 ± 0,4 7,12 92,9-115,0 CM 416,5 ± 7,6 4,7 98,5-107,8 400,1± 1,3 4,2 93,2-107,8 CA 811,7 ± 20,9 6,7 94,1-107,4 791,9 ± 4,8 8,0 89,7-113,8
Tabela 9. Relação dos fármacos e drogas adicionadas às amostras a fim de testar a seletividade do método.
Amostra Seleção de compostos adicionados (1000 ng mL-1)
1 1-fenobarbital, fenitoína, carbamazepina, secobarbital,butalbital, pentobarbital, ácido valpróico, carbamazepina, fenobarbital-d5
2 fentanil, tiofentanil, acrilfentanil, valenilfentanil
3 diazepam, nitrazepam, alprazolam, bromazepan
4 acetaminofem, sildenafil, piperazina, fluoxetina, cetamina
5 pirrolidinopentiofenona, metilona, etilona, metilenodioxipirovalerona, nafirona, 4- fluormetcatinona
Os valores foram obtidos através de análises em triplicata para um mesmo dia (n = 3) durante cinco dias diferentes (n = 15) e foram avaliados para concentrações de CB (75 ng mL-1), CM (400
O efeito matriz foi avaliado considerando as concentrações teóricas finais dos controles baixo e alto (CB e CA) e comparando em percentual a área total dos cromatogramas dos analitos obtidas em solvente (metanol, puro) e quando adicionada em matriz após extração de amostras controle. Comparando as áreas obtidas do padrão em matriz e do padrão em solvente foi possível notar um efeito de matriz positivo, aumentando a área dos cromatogramas e variando entre 101,1 e 119,7% para o controle baixo, e um efeito de matriz negativo, reduzindo a área total dos cromatogramas de 99,4 até 88,7% para o controle alto. Os valores para cada analito podem ser encontrados na Tabela 11. De acordo com o guia de validação utilizado, os erros, imprecisão e exatidão, devem ser sempre inferiores a 20%. Neste caso, com o efeito da matriz gerou erros menores do que os limites permitidos pelo guia, seria possível o desenvolvimento do método e validação dos compostos em solvente puro, sem necessidade de adição em matriz biológica uma vez que seu efeito é relativamente baixo. Contudo, por ser mais confiável, o método foi validado com adição de matriz, mas em rotinas laboratoriais onde curvas devem ser constantemente
Amostra Concentração (ng mL-1) Exatidão (%) COC 1 26,8 93,0 2 26,6 93,7 3 25,3 99,0 4 26,4 94,6 5 29,1 83,6 BZE 1 25,3 98,8 2 23,9 104,5 3 25,0 100,1 4 23,9 104,3 5 25,0 100,0 EME 1 30,0 80,1 2 22,5 110,2 3 20,1 119,6 4 27,3 90,7 5 25,0 99,9 CET 1 27,5 89,9 2 28,4 86,3 3 27,3 91,0 4 26,3 94,6 5 25,8 96,8
construídas para quantificação, não haveria necessidade de adição de padrão em urina para avaliar amostras positivas.
Tabela 11. Valores percentuais da interferência da matriz na área total dos cromatogramas nas concentrações de controle (CB = 75 ng mL-1 e CA = 800 ng mL-1).
Muito embora para o método desenvolvido o limite de concentração superior seja de 1000 ng mL-1, em muitos casos a concentração de cocaína e seus metabólitos
encontrados na urina fornecem valores acima, principalmente para usuários crônicos. Nestes casos, diluições devem feitas de forma a obter um valor de concentração que possa ser quantificado pela curva analítica proposta. A integridade da diluição é um parâmetro importante a ser avaliado nestes casos, uma vez que estes testes asseguram que a exatidão e a precisão não sejam impactadas significantemente quando a amostra é diluída. Desta forma, testaram-se dois diferentes níveis de diluição: 1:10 e 1:20, em quintuplicatas (n = 5) para as quatro substâncias de interesse (COC, BZE, EME e CET). De uma maneira geral, exceto no caso da EME, o erro associado à diluição se mostrou crescente conforme a amostra foi mais diluída. Para as diluições de 1:10, os valores de imprecisão foram sempre inferiores a 11,3%, e a exatidão esteve sempre contida em intervalo de 89,0 a 114,7%. No caso das diluições de 1:20, a imprecisão esteve sempre menor que 7,4%, e a exatidão contida em intervalo de 86,1 a 112,6%. Os valores de erro individuais bem como as concentrações calculadas, levando em conta o fator de diluição, podem ser encontrados na Tabela 12 e se encontram dentro dos limites requeridos pelo método, confirmando que estas diluições podem ser feitas sem prejuízos às análises.
COC-d3 COC BZE EME CET
CB 101,0 105,4 104,3 119,7 106,4
Para o estudo de estabilidade, as amostras foram armazenadas nos controles baixo (75 ng mL-1) e alto (800 ng mL-1) em três diferentes condições de
armazenamento: ambiente, geladeira (4 °C) e freezer (-20 °C), utilizando sílica em gel para manter as amostras livres de umidade. As amostras preparadas foram quantificadas para a COC e seus metabólitos no dia em que foram preparadas, e as amostras armazenadas foram analisadas em intervalos de 3, 7, 15, 30, 60 e 90 dias para que a estabilidade fosse testada. Para que o analito fosse considerado estável, era necessário que as concentrações calculadas após cada intervalo de tempo apresentassem desvios menores do que aqueles aceitos pelo método. Ou seja, que os valores de concentração encontrados deveriam estar entre 80 a 120% do inicial. Após o estudo para todo o intervalo proposto, foi possível notar que a estabilidade da COC, BZE e CET foi mantida para até 90 dias em todas as condições de armazenamento. Para a EME, inicialmente observou-se uma queda da concentração com valores de concentração abaixo de 80% do valor inicial no intervalo de 15 dias, Tabela 12. Valores obtidos para estudo da integridade de diluição para uma amostra padrão de concentração nominal 5000 ng mL-1. Fator de Diluição Concentração (ng mL-1) C.V. (%) (n=5) bias (%) COC 1:10 5269,2 0,5 104,8-106,1 1:20 5189,1 6,7 98,2-111,9 BZE 1:10 4765,8 3,1 91,5-98,5 1:20 4625,7 4,8 87,2-98,7 EME 1:10 5105,4 11,3 89,0-114,7 1:20 4647,0 6,0 86,1-98,5 CET 1:10 4970,7 1,6 97,7-101,9 1:20 5071,1 7,4 92,2-112,6
quando mantido em geladeira para ambos CB e CA; porém, no dia 30, as concentrações voltaram a se encaixar no intervalo permitido, levando a acreditar que os erros tenham sido devido à curva construída neste dia. Uma vez que a EME coelui logo no início da corrida juntamente com outros interferentes, os erros para este analito geralmente são os maiores. Sendo assim, este estudo foi repetido neste mesmo intervalo obtendo valores de concentração onde a estabilidade foi mantida para 15 dias, confirmando a suspeita de que tenha sido um erro pontual. Os resultados obtidos podem ser observados para o CB pela Figura 13 e para o CA na Figura 14.
Através dos gráficos de estabilidade foi possível notar que todos os analitos provaram ser igualmente estáveis em todas as situações de armazenamento, demonstrando que, para técnica de DUS, a temperatura de armazenamento não possui grande influência na estabilidade.
Figura 13. Estabilidade em 0, 3, 7, 15, 30, 60 e 90 dias para amostras do controle baixo (75 ng mL-1) para as amostras de (a) COC, (b) BZE, (c) EME e (d) CET, mantidas em três
Figura 14. Estabilidade em 0, 3, 7, 15, 30, 60 e 90 dias para amostras do controle alto (800 ng mL-1) para as amostras de (a) COC, (b) BZE, (c) EME e (d) CET mantidas em três
4.1.3. Aplicação
Através do método de DUS com análise por LC-MS/MS foi possível quantificar as cinco amostras positivas. Uma vez que a maioria destas amostras apresentaram valores de concentrações de cocaína ou metabólitos maior do que o limite superior da curva, diluições das amostras foram necessárias. As amostras que apresentaram valores acima do LQ do método (25 ng mL-1) foram quantificadas em triplicata, e as
concentrações encontradas, tais como seus desvios, estão presentes na Tabela 13.
Tabela 13. Resultados encontrados na aplicação do método de DUS para amostras positivas em triplicata (n=3).
Através da quantificação das amostras positivas foi possível observar que, como citado anteriormente, a maior parte da droga de abuso em estudo é excretada na urina na forma de seus metabólitos, sendo o BZE o metabólito presente em maior concentração seguido pelo EME. Assim, estas duas substâncias apresentaram valores de concentração expressivos em todas as amostras, diferentemente da
Amostra Fator de
Diluição (ng mLConc. ± I.C. -1) (n=3, 95%) C.V. (%) (n=3) COC 1 1:10 - - 2 1:500 28822,7 ± 1461,2 2,0 3 1:1 - - 4 1:10 3364,2 ± 74,3 0,9 5 1:1 - - BZE 1 1:10 2300,3 ± 464,9 8,1 2 1:500 237647,2 ± 3515,7 0,6 3 1:1 369,6 ± 13,3 1,5 4 1:10 3122,8 ± 122,7 1,6 5 1:10 1609,8 ± 309,0 7,7 EME 1 1:10 1219,4 ± 69,8 2,3 2 1:500 103856,2 ± 144,2 0,6 3 1:1 49,6 ± 7,9 6,4 4 1:10 2850,6 ± 188,1 2,7 5 1:1 423,5 ± 91,0 8,6 CET 1 1:10 - - 2 1:500 - - 3 1:1 - - 4 1:10 2254,6 ± 82,2 1,5 5 1:1 34,8 ± 4,9 5,7
cocaína que apresentou valores considerados positivos pelo método apenas para duas das cinco amostras (2 e 4).
Uma vez que as amostras analisadas foram cedidas por um centro de controle de intoxicações, estas geralmente vêm de usuários frequentes ou que consumiram a droga em altas quantidades, o que justifica as altas concentrações encontradas e que levaram à necessidade de diluição na maior parte das amostras, exceto para a amostra 3 e a 5 para alguns dos compostos. Muito embora no caso da amostra 2 o fator de diluição necessário tenha sido de 1:500, e, do ponto de vista dos guias de validação fosse interessante testar a credibilidade deste fator, a concentração das soluções dos padrões de referência presentes no laboratório não permitiram este estudo. Todavia, as triplicatas das amostras apresentaram um coeficiente de variação baixo (C.V. ≤ 8,6%), indicando uma boa precisão nas análises.
Como também mencionado anteriormente, o CET é um metabólito que será encontrado apenas em casos em que, juntamente com o uso da cocaína, houve consumo de álcool. Sendo assim, a amostra 4 foi a única que apresentou este metabólito em quantidades expressivas, próximas aos demais metabólitos.
4.2. THC
A primeira etapa para iniciar o desenvolvimento do método consistiu-se na otimização instrumental. Após a obtenção dos parâmetros instrumentais por infusão direta para o espectrômetro de massas (ABSciex 5500QTRAP) e a otimização das condições cromatográficas, foi possível obter os dados apresentados na Tabela 5 (página 39) que geraram os cromatogramas representado na Figura 15. Uma vez que o THC apresentou uma melhor ionização no modo positivo (ESI-(+)) e seus metabólitos no modo negativo (ESI-(-)), a cromatografia foi otimizada no modo de polarity switch, que permite a aquisição de ambos modos de ionização em uma única análise.
Conforme mencionado, grande parte do principal metabólito encontrado na urina, o THC-COOH, encontra-se conjugado com ácido glicurônico, o que faz com que uma etapa de hidrólise seja necessária para quantificá-lo em sua forma livre. Portanto, uma reação de hidrólise básica foi adicionada utilizando-se de procedimentos empregados na rotina e encontrados na literatura [64].
Posteriormente à hidrólise, a adição de ácido acético glacial é necessária uma vez que o pKa do THC e seus metabólitos são, respectivamente, pKaTHC = 10,6 (THC),
pKaTHC-OH = 3,7 (THC-OH) e pKaTHC-COOH = 4,1 (THC-COOH). Portanto, uma maior
recuperação da extração é fornecida quando realizada em valores de pH em torno de THC-OH THC-COOH + THC-COOH-d3 THC + THC-d3 ESI (+) ESI (-)
Figura 15. Cromatograma de polarity switch da separação do THC (ESI-(+)) e seus metabólitos (ESI-(-)).
3, nos quais todas as espécies de interesse se encontram em suas formas não dissociadase possuem maior afinidade com os solventes orgânicos.
De acordo com a SAMHSA [63], os valores sugeridos de corte (cut off) em ensaios preliminares e confirmação do THC e seus principais metabólitos em urina são, respectivamente, 50 e 15 ng mL-1 em análises de rotina, geralmente realizadas
por GC-MS. Sendo assim, houve uma necessidade de que a curva analítica fosse construída em um intervalo de, pelo menos,10 a 500 ng mL-1 em seis níveis de
concentração (10, 25, 50, 100, 250 e 500 ng mL-1) e padrão interno (THC-COOH-d3 e
Δ9-THC-d3) com concentração em 100 ng mL-1. Devido à baixa reprodutibilidade na
extração destes analitos, a adição de padrão interno se fez necessária juntamente com a adição dos analitos na urina de forma com que ambos fossem extraídos juntos, minimizando os erros das razões entre as áreas dos analitos pelas áreas do padrão interno.
Após realizar o preparo de amostra conforme previamente detalhado e submetê-la à hidrólise e subsequente acidificação do meio, foi necessário otimizar a extração dos analitos. Como solvente de extração foram testados aqueles mais comumente utilizados para esta droga de abuso: hexano (HEX), acetato de etila (AE), éter metil-terc-butílico (MTBE), diclorometano (DCM) e clorofórmio (CHCl3). Além
disto, foram testadas misturas de solventes, como HEX:AE (8:2, v/v) e CHCl3:AE (6:4,
v/v) conforme propostos na literatura [65]. Para cada um destes solventes, um volume de 1000 µL foi adicionado, uma vez que em extrações líquido-líquido é recomendado que se utilize um volume de solvente orgânico que possua pelo menos duas vezes o volume da fase aquosa. A área total extraída dos analitos para os diferentes solventes e misturas destes foram comparadas e analisadas individualmente para cada analito, e podem ser observadas na Figura 16.
Figura 16. Gráfico de colunas referentes à área total extraída de cada analito nos diferentes solventes de extração para amostras em concentração de 100 ng mL-1.
Analisando as áreas totais extraídas, foi possível perceber que solventes mais polares irão favorecer a extração dos metabólitos, uma vez que estes também se mostram polares. Porém, as misturas de solventes foram, de fato, as mais favoráveis para todos, o que está de acordo com o relatado por Nestic et al [65].
Além disto, outros parâmetros testados com intuito de melhorar a recuperação dos analitos foram o tempo de extração e o material do recipiente utilizado nesta etapa. A necessidade de se testar o material do tubo no qual a extração é realizada se deu devido ao fato de que diversos trabalhos na literatura reportam que o THC, por possuir propriedades lipofílicas, possui grande afinidade principalmente pelos materiais plásticos como polipropileno, o que poderia diminuir a área total extraída uma vez que poderia haver perda de analito por adesão às paredes do tubo [66].
Assim, foi construído um planejamento experimental do tipo Planejamento Fatorial (D-Optimal) (Design-Expert 6.0.4). Neste planejamento, três fatores foram avaliados: tempo de extração (1), solvente de extração (2) e material do tubo (3). O fator 1 foi avaliado em três níveis (15, 30 e 45 minutos); o fator 2, em dois níveis (hexano ou hexano: acetato de etila 9:1, v:v), e o fator 3, também em dois níveis (polipropileno ou vidro). As áreas totais obtidas para a extração utilizando as diferentes