Co-remoção de fósforo e coliformes termotolerantes de efluentes secundários usando microalgas imobilizadas em matriz de alginato de cálcio

Texto

(1)UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICA E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA. CO-REMOÇÃO DE FÓSFORO E COLIFORMES TERMOTOLERANTES DE EFLUENTES SECUNDÁRIOS USANDO MICROALGAS IMOBILIZADAS EM MATRIZ DE ALGINATO DE CÁLCIO. JEANE CÂNDIDO DO NASCIMENTO. CAMPINA GRANDE – PB NOVEMBRO/2011.

(2) JEANE CÂNDIDO DO NASCIMENTO. CO-REMOÇÃO DE NUTRIENTES DE ESGOTO SANITÁRIO, COM MICROALGA CHLORELLA sp. IMOBILIZADA EM MATRIZ DE ALGINATO DE CÁLCIO. Trabalho de conclusão de Curso apresentado ao Departamento. de. Biolologia. da. Universidade. Estadual da Paraíba, em cumprimento às exigências para obtenção da Graduação em Bacharelado e Licenciatura plena em Ciências Biológicas.. Orientador: Dr. Valderi Duarte Leite. CAMPINA GRANDE – PB NOVEMBRO/2011.

(3) F ICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL – UEPB. N244c. Nascimento, Jeane Cândido do. Co-remoção de fósforo e coliformes termotolerantes de efluentes secundários usando microalgas imobilizadas em matriz de alginato de cálcio [manuscrito] / Jeane Cândido do Nascimento. – 2011. 35 f. Digitado. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Biologia) – Universidade Estadual da Paraíba, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, 2011. “Orientação: Prof. Dr. Valderi Duarte Leite, Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental”.. 1. Tratamento de efluente. 2. Contaminação. 3. Microbiologia. 4. Chlorella. I. Título. CDD 21. ed. 579.

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(5) AGRADECIMENTOS. A Deus primeiramente, pois ele é fonte de nossa existência. Aos meus pais, José Cândido do Nascimento (in memorian), Alzira Ana do Nascimento (in memorian). Aos meus filhos Wladimir, Gerlane, minha irmã Maria do Socorro e minha nora Clebiana. O meu netinho Iarley Gabriel que é minha fonte de esperança. Agradeço imensamente ao professor Valderi Duarte Leite que me ajudou na realização desse trabalho. A minha amiga e professora Célia Cavalcante que teve grande participação nesse trabalho. A todos da EXTRABES que, de uma forma ou de outra tiveram grandes participações.. CAMPINA GRANDE – PB NOVEMBRO/2011.

(6) RESUMO. A urbanização desordenada e o crescimento populacional têm desencadeado grandes perturbações nos ambientes aquáticos, pois o homem através do lançamento de efluentes domésticos, industriais e agrícolas sem tratamento, provoca a poluição dos mananciais superficiais. Os coliformes termotolerantes constituem o melhor indicador biológico de contaminação. Os processos convencionais de desinfecção geram subprodutos químicos perigosos e/ou carcinogênicos, os organoclorados. A tecnologia da imobilização de microalgas (Chlorella.) em matrizes de alginato de cálcio aumenta a longevidade fotossintética, viabilidade, durabilidade e atividade biocatalizadora celular. O trabalho realizado levou em consideração a radiação artificial com lâmpadas fluorescentes brancas de 80 μmoles m-2 s-1, tendo uma incidência luminosa de 6h em escala de bancada. A incidência luminosa, aliada ao aumento siginificativo do pH no reator contendo algas imobilizadas, levou a depuração de fósforo e orto-fosfato. As análises de fósforo e orto-fosfato foram feitas seguindo o cronograma de amostras do reator, obtendo como resultados 0,9 (mg PT x L-1) e 0,4 (0,4 mg PT L-1) restantes em cinco horas. Para a remoção de coliformes termotolerantes, os resultados foram analisados através de amostras em triplicatas de quatro experimentos laboratoriais sob luz artificial. Os valores das reduções de todos os experimentos foram expressos em triplicatas na escala logarítmica e em relação à redução dos controles. Após seis horas ocorreu a remoção total dos coliformes. Os principais processos envolvidos na redução das concentrações dos indicadores de contaminação fecal foram a atividade metabólica e de fotossíntese das microalgas. Os resultados obtidos apontam para o grande potencial da microalga Chlorella sp. no tratamento terciário de efluentes. Palavras-chave: Alginato de cálcio, Chlorella, imobilização, microalgas..

(7) ABSTRACT The unplanned urbanization and population growth have triggered major disruption in aquatic environments, because the man through the launching of domestic sewage, industrial and agricultural untreated, causes pollution of surface. The fecal coliform are the best indicator of biological contamination. The conventional disinfection processes generate hazardous chemical byproducts and / or carcinogenic organochlorines. The technology of immobilization of microalgae (Chlorella.) in calcium alginate matrix increases longevity photosynthetic viability, durability and cell biocatalyst activity. The work took into account the artificial radiation with white fluorescent lamps of 80 μmoles m-2 s-1, having a light incidence from 6 in bench scale. The incidence of light, coupled with increasing SIGNIFICANT pH in the reactor containing immobilized algae led to clearance of phosphorus and ortho-phosphate. The analysis of phosphorus and ortho-phosphate were made following the schedule of samples of the reactor, obtaining as a result 0.9 (EN mg x L-1) and 0.4 (EN 0.4 mg L-1) in the remaining five hours . For removal of fecal coliform, the results were analyzed in triplicate using samples from four laboratory experiments under artificial light. The values of all reductions in triplicate experiments were expressed in logarithmic scale and in relation to the reduction of controls. After six hours was the removal of total coliforms. The main processes involved in reducing the concentrations of fecal indicators were the metabolic activity and photosynthesis of microalgae. The results obtained indicate the great potential of microalgae Chlorella sp. the tertiary treatment of effluents. Keywords: calcium alginate, chlorella, immobilization, microalgae..

(8) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Esfera de alginato de cálcio com Chlorella sp. Imobilizada .... Figura 2. Micrografia de Chlorella sp. em estágio de divisão. 19. (ampliação 400) ...................................................................... 20. Figura 3. Meio de Cultivo autotrófico estacionário ................................. 23. Figura 4. Imobilização- momento em que se formam as esferas .......... 24. Figura 5. Reatores com alginato puro (Branco) e com algas Chlorella (verde) ..................................................................................... 25. Figura 6. Remoção média de Fósforo total ………………………………. 26. Figura 7. Remoção média de Ortofosfato ……………………………..…. 26.

(9) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Valores médios dos dados de fósforo total, para cada miligrama de fósforo dissolvido em um litro do efluente ............ Tabela 2. Valores médios dos dados de orto-fosfato, para cada miligrama de fósforo dissolvido em um litro do efluente ............ Tabela 3. 27. Valores médios de coliformes termotolerantes de três experimentos realizados com tempo de contato de seis horas.. Tabela 4. 27. 29. Valores médios de pH de três ensaios medido a cada hora de contato ....................................................................................... 30.

(10) LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVEATURAS. APHA - American Public Health Association CO2 - Dióxido de Carbono HCO3- - íon bicarbonato. L - Litro MBB - Meio basal Bold‟ s m - Metro mg/L - Miligramas por litro mm - Milímetro M - Molar mm2 - milímetro quadrado mm3 - milímetro cúbico N - Nitrogênio O2 - oxigênio OD - Oxigênio Dissolvido OH- - íons hidroxila P - Fósforo pH - Potencial Hidrogeniônico r.p.m - Rotação por minuto T - Tempo Μg - Micrograma CaCl2 - Cloreto de cálcio.

(11) SUMÁRIO. INTRODUÇÃO………………………………….....………....……....………… 13 2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................... 16 2.1 As consequências da Ação Antrópica no Meio .................................... 16 2.2 Algas imobilizadas ................................................................................ 16. 2.3 O Alginato…………………………………………………...…….……….... 17. 2.4 A Chlorella………………………………………………...….….…………. 18. 3 METODOLOGIA…………………………………………….…………..……. 20. 3.1 Local da Pesquisa…………………………………..……………..……….. 20. 3.2 Equipamentos…………………………………………...……….…………. 20. 3.3 Material e preparo do Meio Basal Bold’s............................................... 20. 3.4 Manutenção da Cultura…………………………………....……….…...…. 21. 3.5 Imobilização das microalgas.................................................................. 22. 3.6 Reatores……………………………………………………....……….….... 23 4 RESULTADOS E DICUSSÃO.................................................................. 25. 4.1 Remoção de fósforo e ortofosfato......................................................... 25 4.2 Remoção de Coliformes Termotolerantes............................................. 27. 4.3 Análise de pH……………………………………………....……….………. 28. CONSIDERAÇÕES FINAIS ….……………………………....……….…….... 29. REFERÊNCIAS………………………………………………....……….……... 30.

(12) P á g i n a | 13. INTRODUÇÃO. As ações humanas de ordem social ou econômica no meio ambiente têm desencadeado significativas modificações que estão ameaçando a vida no ambiente. Na atualidade os efeitos dessa degradação já são evidentes, pois os diversos resíduos gerados são dispostos de forma incorreta e sem o devido tratamento. Em muitos países do mundo, a urbanização desenfreada, bem como a expressiva concentração da população e das atividades industriais sobre o mesmo espaço o despejo de águas residuárias sem tratamento prévio nos corpos hídricos, gerando a eutrofização nos corpos dágua, comprometendo a qualidade da vida no planeta. É muito grande a quantidade de substâncias e formas de vida que compõem o esgoto, despejo proveniente dos diversos usos da água, organismos, tais como bactérias, vírus, helmintos e protozoários, que em sua maioria são liberados com os dejetos humanos. Dentre esses organismos, alguns são patogênicos e outros são importantes no tratamento dos esgotos, pois, decompõem a matéria orgânica, transformando-a em compostos orgânicos mais simples, minimizando o impacto ambiental negativo causado por esses lançamentos in natura. A Organização das Nações Unidas - ONU (2008), mostra que a população mundial ultrapassa 7 bilhões de habitantes. Destes, 2,6 bilhões, ou seja, 40%, não têm acesso à rede de coleta de tratamento de esgotos. São 200 milhões de toneladas de dejetos humanos lançados anualmente nos rios e lagos. Como conseqüência, a cada 20 segundos uma criança morre em função de doenças de veiculação hídrica (cólera, febre tifóide, salmoneloses, shigeloses, entre outras). Isto significa 1,5 milhões de mortes de crianças a cada ano. Neste contexto, o saneamento básico, considerado uma das mais importantes metas do milênio, ainda inexiste para uma parcela significativa da população mundial. Tratar águas residuárias através da imobilização de microalgas em matrizes de alginato de cálcio (esferas) pode ser uma tecnologia promissora. É necessário o tratamento das águas residuárias, tendo em vista seu reuso ou o lançamento em corpos aquáticos através da remoção de fosfatos e outros nutrientes. Pesquisas em andamento apontam as vantagens operacionais, econômicas e ambientais.

(13) P á g i n a | 14. oferecidas pelo uso da microalga Chlorella sp. em meio imobilizado. Sendo assim, considera-se relevante aprofundar pesquisas focadas nesse tratamento específico. Vários trabalhos (ROBINSON et al., 1985; MEGHARAJ et al., 1992; FORREST, 1998; PAGE, 2000; TAM e WONG , 2000; DE-BASHAN et al., 2002) têm demonstrado. que. esta. técnica. remove. significativamente. os. coliformes. termotolerantes, vírus e nutrientes de águas residuárias provenientes de esgotos, sendo ainda inédita a sua aplicação no Brasil. Na concepção de Megharaj et al. (1992), a imobilização das microalgas é uma técnica que aumenta a longevidade fotossintética, a viabilidade e a atividade biocatalisadora celular, apresenta baixos custos, previne que a biomassa seja levada para fora dos bioreatores, oferece um grande avanço na flexibilidade operacional e na fácil separação das algas dos efluentes tratados (MEGHARAJ et al., 1992; MALLICK e RAI, 1993; TAM e WONG, 2000). Em 1992, um estudo indicou que Chlorella vulgaris, imobilizada em meio de alginato de cálcio era cinco vezes mais eficiente na remoção de nutrientes de água residuária do que quando aquela alga se encontrava livre no meio (MEGHARAJ et al., 1992). As algas constituem um dos grupos mais diversificados de microrganismos existentes nas lagoas de estabilização, onde se verifica a predominância de algas verdes (Chlorophyta), destacando-se as microalgas do gênero Chlorella sp, que são microrganismos fotossintetizantes clorofilados e sem flagelos ( SILVA, 2011) As algas desempenham um papel fundamental no funcionamento do sistema de lagoas de estabilização no tratamento de esgotos, uma vez que aumenta a concentração de oxigênio dissolvido (OD) através da fotossíntese, que é necessário ao metabolismo das bactérias aeróbias heterotróficas; consomem o dióxido de carbono (CO2) produzido pela oxidação bacteriana da matéria orgânica, elevando o pH do meio limitando a proliferação de coliformes e bactérias patogênicas e removem nutrientes da água através de seu metabolismo e crescimento celular, ocorrendo também à precipitação de fosfato.(SILVA, 2011) Zhang et al. (2008), isolaram Scenedesmus sp na densidade de 2 x 108, algas mL-1, de esgoto municipal e posteriormente imobilizaram-nas em camadas de alginato de cálcio , 3 mm de espessura, para remover nutrientes (N e P) de efluentes secundários em um bioreator. Completa remoção de NH4+ e PO4. foi obtida em.

(14) P á g i n a | 15. 4 horas de tratamento. Nove ciclos de tratamento de águas residuárias em 21 dias foram completados, mantendo a eficiência da remoção de NH 4 em 99.1% após 105 minutos e 100% após 135 minutos. A eficiência da remoção de PO4 foi de 100% após 15 minutos no efluente secundário. Segundo os autores, o fator determinante na obtenção desses resultados foi a densidade algal. Assim, imobilizado Scenedesmus sp. mostra ter grande potencialidade na remoção de nitrogênio e fósforo inorgânicos dos efluentes tratados. Moreno-Garrido (2008), revendo pesquisas recentes em técnicas de imobilização usando microalgas de água doce e marinhas, aponta para as vantagens dos sistemas mistos de bactérias-algas imobilizadas para o tratamento de águas residuárias. O autor também enfatiza a promissora aplicação dos sistemas imobilizados em biotecnologia e na produção de energia não poluidora como H 2 nos próximos anos. Nesse contexto, este trabalho pretendeu tratar biologicamente o efluente secundário, oriundo do tanque séptico, através do uso da microalga Chlorella sp. imobilizada em matriz de alginato de cálcio, objetivando remover fosfatos e microrganismos patogênicos de forma a reduzir as doenças de veiculação hídrica e também e minimizar o impacto ambiental que causa a eutrofização dos corpos hídricos no Brasil.. Objetivo Estudar a eficiência de remoção de fósforo e coliformes termotolerantes de esgoto sanitário, usando a microalga Chlorella sp. imobilizada em matriz de alginato de cálcio..

(15) P á g i n a | 16. 2 REVISÃO DA LITERATURA. 2.1 As consequências da Ação Antrópica no Meio. As atividades humanas e os usos múltiplos dos recursos hídricos estão relacionados com a contaminação dos mananciais por esgotos domésticos e industriais e a consequente queda da qualidade dos mananciais. A eutrofização é a expressão mais clara dessas ações, e traduz-se pelo desenvolvimento explosivo das populações de algas, caracterizando-se normalmente, pela formação de uma película verde à superfície das águas. Este processo, conhecido com “flor de água”, é designado na linguagem anglo-saxônica por bloom (MENDES e OLIVEIRA, 2004). O fósforo e o nitrogênio são nutrientes que contribuem para a citado fenômeno, estes, não oferecem risco direto à saúde pública, contudo, seu estudo é de grande importância na gestão dos recursos hídricos por sua capacidade de potencializar o enriquecimento de um corpo aquático. O fósforo está dissolvido nas águas superficiais na forma P–PO43-, podendo resultar da biodegradação das substâncias orgânicas ou da lixiviação dos solos; contudo, o maior contributo para o aparecimento de fosfato decorre de resíduos e efluentes industriais, domésticos e agrícolas, (MACKERETH et al., 1978; LÉVÊQUE, 2002). O principal fornecedor de fósforo provém das águas residuais domésticas, onde se encontra sob a forma de fosfatos provenientes dos detergentes. Como a precipitação química do fosfato com o cálcio é diferente da precipitação como alumínio e com o ferro, estes dois tipos de precipitação química são considerados processos separados. A remoção do fósforo da água residuária envolve a incorporação do fosfato nos sólidos suspensos totais (SST) com subseqüente remoção desses sólidos (METACALF & EDDY, 2003).. 2.2 Algas imobilizadas. Uma célula imobilizada é definida como uma célula que, por meios naturais ou artificiais, é impedida de se movimentar, independentemente dos seus vizinhos, para todas as partes da fase aquosa do sistema em estudo. Vários materiais são.

(16) P á g i n a | 17. usados para fazer o encapsulamento de microrganismos, como por exemplo: alginato, gelatina, goma, poliuterano e gel de álcool polivinil (PRADELA, 2001) O. uso. destes. materiais. na. imobilização. de. células. permite. aos. microrganismos continuar a sobreviver numa matriz relativamente não tóxica, através da qual, gases e líquidos se podem difundir. A cápsula da matriz, juntamente com os microrganismos, ajuda a diminuir a toxicidade do meio ambiente (BRANDENBERGER et al., 1998). O primeiro estudo conhecido envolvendo algas imobilizadas foi em 1966 (Hiller & Park, 1969), porem, apenas na década de 80 que La Noüe e os seus colaboradores aparecem como pioneiros na introdução da tecnologia da imobilização de algas para o tratamento de águas residuais, nomeadamente na remoção de nitrogênio e fósforo (CHEVALIER e DE LA-NOÜE, 1985, 1985b). A partir de 1990, mais de 50% dos registos de estudos de algas referem o seu uso no tratamento de águas residuais (SHINY et al., 2004). De acordo com Curtis e Mara (1994), o cultivo de algas torna o ambiente mais alcalino (com pH acima de 8,5), propiciando. maior formação de bicarbonato. (HCO3). Nestas condições, os coliformes termotolerantes morrem rapidamente (SMALLMAN, 1986).. 2.3 O Alginato. O alginato é extraído de algas marrons, principalmente de espécies dos gêneros Laminaria e Sargassum e das espécies Macrocystis pyrifera, Ascophyllum nodosum e Lesonia negrescens. O gel de alginato não é tóxico, tem baixo custo, possui alta afinidade pela água e as células não sofrem variações físico-químicas extremas durante o processo de imobilização. A gelificação do polissacarídeo é muito rápida e ocorre quando gotas de uma suspensão formada por células ou enzimas e alginato de sódio são misturadas com uma solução contendo íons formadores de gel, geralmente Ca2+. O gel pode ser redissolvido em meio contendo citrato de sódio ou fosfato (MORENO- GARRIDO, 2008). Anisha e Prema (2008) imobilizaram células de Streptomyces griseoloalbus em esferas de alginato de cálcio e conseguiram aumentar a produtividade da enzima galactosidase em comparação com o emprego de células livres. Além disso, 75% da.

(17) P á g i n a | 18. capacidade de produção da enzima foi mantida após a reutilização das células imobilizadas em oito ciclos de fermentação em batelada. Lins e Leão (2002) utilizaram células de Kluyveromyces marxianus imobilizadas em alginato de cálcio para. a. obtenção. de. leite. com. baixo. teor. de. lactose. A capacidade de. conversão da lactose em etanol e CO2 foi constante mesmo após 23 ciclos. Segundo Wang et al. (2005), o mecanismo clássico de imobilização por engaiolamento é a mistura de células microbianas com um composto polimérico que apresenta cargas negativas, a exemplo do alginato. Essa mistura é gotejada em uma solução com íons Ca. 2+. , e este, promove a formação de ligações iônicas, que. resultam na formação de um gel consistente e insolúvel, o qual imobiliza o microrganismo. Na Figura 1 está apresentada uma esfera de alginato com Chlorella sp. imobilizada com aproximadamente 4 mm de diâmetro.. Figura 1: Esfera de alginato de cálcio com Chlorella sp. imobilizada. 2.4 A Chlorella sp.. O gênero Chlorella compõe a classe Chlorofícea, família Chlorelacea, ordem Chlorococcales (BDIGPELD - Biblioteca Digital Geodiferenciada). Estudos recentes, baseados em caracteres bioquímicos, fisiológicos e ultra estruturais, juntamente com a filogenia molecular ausente na sequência 18s RNA completa, têm sugerido que são quatro as espécies pertencentes ao gênero Chlorella : C. vulgaris , C. iobophora, C. sorokiniana e C. kessleri (HISUAN et al., 2000). O gênero Chlorella é composto por microalgas verdes, unicelulares, que possuem clorofila e realizam fotossíntese, sendo uma das primeiras algas a serem isoladas como uma cultura pura realizada por Beijerinck na década de 1890. As atenções científicas somente se voltaram para o potencial da Chlorella sp. no final.

(18) P á g i n a | 19. de 1940, quando foram cultivadas em meio mineral definido, especificando-se as necessidades ambientais e nutricionais de cada espécie ( HSIUAN et al., 2000). Bicudo e Menezes (2006) caracterizando a Chlorella Beijerink, citam que são indivíduos sempre solitários e de vida livre. A célula é, em geral, esférica, elipsoidal ou ovóide, como também reniforme ou um pouco assimétrica. A parede celular é bem distinta, porém delgada. O cloroplastódio é único na maioria das vezes, raro ocorrem dois. Quando único, tem a forma de taça e quando em número de dois, cada um tem a forma de uma calota rasa e aberta. Pirenóide nem sempre presente. Chlorella vulgaris é uma alga verde, eucariótica, autotrófica e unicelular, em condições normais de cultura, tipicamente tem o tamanho aproximadamente de uma hemácia cerca de 5-6 µm de diâmetro (BORAAS et al.,1998). Na Figura 2 está apresentada uma microfotografia de Chlorella sp. em ampliação de 400x.. Figura 2: Micrografia de Chlorella sp. em estágio de divisão (ampliação 400x). Fonte: Silva, 2011.

(19) P á g i n a | 20. 3. METODOLOGIA. 3.1 Local da Pesquisa. Esta pesquisa foi realizada na Estação Experimental de Tratamento Biológico de Esgotos Sanitários (EXTRABES) localizada na cidade de Campina Grande no Estado da Paraíba, durante o período março de 2010 à fevereiro de 2011.. 3.2 Equipamentos. Centrífuga Excelsa II, modelo 206 BL , marca FANEM; Autoclave vertical Phoenix; Estufa controlador, modelo 515 A. FANEM; Balança Tecnal, modelo Mark 210 A, classe I; Espectrophotometer SP 1105 Tecnal; Phmetro TEC- 3MP – Tecnal; Lâmpadas florescentes; Erlenmeyers de 2 L; Aerador INALAR. 3.3 Material e preparo do Meio Basal Bold’s. Para preparo do meio basal para algas verdes de águas naturais, foram necessárias as etapas: Preparar seis soluções estoque de macro nutrientes, preparadas em água destilada, cada uma contendo um dos seguintes sais por 400 ml:. NaNO3 10 g (290 mM) CaCl2.2H2O 1 g (17 mM) MgsO4. 7H2O 3 g (30 mM) K2HPO4 3 g (43 mM) KH2PO4 7 g (129 mM) NaCl 1 g (27 mM).

(20) P á g i n a | 21. Para cada 940 ml de água destilada, 10 ml de cada solução estoque de macronutriente foi adicionada a 1 ml de cada solução estoque de micronutrientes (elementos traço) que foram preparadas conforme se descreve: 1. 50 g de Na2 EDTA (134mM) e 31 g de KOH (553 mM) foram dissolvidos em 1 litro de água destilada; 2. 4,98 de FeSO4. 7H2O (18 mM) foram dissolvidos em 1 litro de água acidificada ( água acidificada: 1,0 ml de H2SO4 dissolvido em 1 litro de água destilada); 3. 11,42 g de H3BO4 (184 mM) foram dissolvidos em 1 litro de água destilada; 4. Posteriormente foram dissolvidas em 1 litro de água destilada as seguintes quantidades de elemento traços: ZnSO4. 7H2O 8,82 g (31 mM); MnCl2. 4H2O 1,44 g (7 mM); MoO3 0,71 g (0,05 mM); CuSO4. 5H2O 1,57 (6 mM); Co(NO3)2. 6H2O 0,49 g (2 mM); Após o meio estar pronto ajusta-se o pH para 7,0 e posteriormente foi autoclavado.. 3.4 Manutenção da Cultura. As cepas de Chlorella sp. foram cultivadas em erlenmeyers de 2 L, contendo 1600 mL de Meio Basal Bold’s ( BISCHOFF E BOLD, 1943; BOROWITZKA,1988 ). Os frascos foram inoculados com 32 mL de microalgas na fase estacionária e mantidas sob aeração por 4 (quatro) dias e com distância de 15 cm de uma série de 8(oito) lâmpadas fluorescentes, com irradiação aproximada de 60 μmol m -2 s-1 a 27 0. C .As culturas estoque seguindo a metodologia de (GUERRERO III e VILLEGAS,. 1988), foram preparadas em tubos de ensaio e mantidas a 4 0C .As culturas utilizadas nos experimentos tinham 40 dias de cultivo, assegurando concentração algal elevada no interior das esferas de alginato. Na Figura 3 apresenta-se o meio de cultivo da Chlorella sp..

(21) P á g i n a | 22. Figura 3: Meio de Cultivo autotrófico estacionário. Fonte: SILVA, 2011. 3.5 Imobilização das microalgas. Para a imobilização foi utilizado 4 g de alginato de sódio dissolvido em 100 mL de água destilada devidamente autoclavada por 15 minutos a 121 ºC. Também é utilizado 0,4 M de cloreto de cálcio, dissolvido em 100 mL de água destilada, também autoclavado. Passado o preparo dos materiais, foi retirado um volume variável do garrafão de 20 L e centrifugado nas mesmas condições que as algas retiradas da lagoa de estabilização. O extrato final é misturado em proporção igual (1:1) com o alginato. Logo após essa mistura é vertida em uma bureta de 25 ml em baixo de um Becker contendo 100 ml de cloreto de cálcio. Paulatinamente a mistura alga-alginato foi vertida na solução de cloreto de cálcio, e mantida sob agitação por 30 minutos. Cada gota que cai na solução, se transforma em uma esfera verde, com diâmetro médio de 4mm. Ao final da imobilização essas esferas são lavadas e guardadas na geladeira mergulhadas em água destilada, até serem usadas no preenchimento os reatores. Na Figura 4, está apresentada a imobilização no momento em que a mistura de alga-alginato está sendo vertida no cloreto de cálcio..

(22) P á g i n a | 23. Figura 4: Imobilização- momento em que se formam as esferas.. 3.6 Reatores. O estudo foi feito a partir da monitoração de um bioreator de bancada, formado por duas buretas de vidro transparente, com 60 cm de comprimento, 0,5 cm de diâmetro externo e 3 mm de espessura, ambas as colunas foram enchidas com esferas de alginato, cada uma com aproximadamente 4mm de diâmetro, um com algas imobilizadas e outra sem algas. As colunas, antes da fixação das matrizes, foram esterilizadas na superfície com etanol 70%, lavadas internamente com água destilada e posteriormente, conectadas ao suporte, onde passaram a receber o efluente secundário, oriundo do tanque séptico, contendo uma concentração média de 10 5 a 106 coliformes termotolerantes/ 100 mL. Os reatores foram colocados em contato com a radiação de lâmpadas florescentes, durante 6 h, e a cada hora uma amostra de 10 mL era coletada, aferido seu pH, e realizada as análises de coliformes termotolerantes segundo o método da membrana filtrante preconizado por APHA, 1998, fósforo total e ortofosfato. Ao final de cada análise esses reatores eram submetidos a um período de quarentena, no qual passava duas semanas cheios de meio basal, com a finalidade de testar a resistência das algas as impurezas do efluente secundário. No final da terceira semana os reatores foram cheios novamente com efluente, e todo o procedimento foi repetido por quatro vezes. Passado três meses de experimento, as.

(23) P á g i n a | 24. esferas com Chlorella sp. apresentavam-se íntegras em relação ao material imobilizante, de modo que continuaram removendo significativamente bem, fósforo e os coliformes termotolerantes. Os resultados foram analisados através de amostras em triplicatas de três experimentos laboratoriais sob luz de 4 lâmpadas florescentes. Os valores de decaimentos de todos os experimentos foram expressos em triplicatas na escala logarítmica e em relação à redução dos controles, sedo posteriormente submetidos à análise estatística através do software Microsoft Excel 2007 Na Figura 5 está apresentado o bioreator com algas imobilizadas e o bioreator controle (esferas de alginato).. Figura 5: Reatores com alginato puro (Branco) e com algas Chlorella (verde)..

(24) P á g i n a | 25. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO. 4.1 Remoção de Fósforo e Ortofosfato. As microalgas imobilizadas realizaram ao final de um perfil de 5 h, índices médios de remoção em torno de 88,24% para ortofosfato e 79,07% para fósforo total. Os resultados estão representados na Figura 6 e 7.. Figura 6: Remoção média de Fósforo total.. Figura 7: Remoção média de Ortofosfato.. As algas imobilizadas obtiveram maior eficiência na remoção de fósforo em.

(25) P á g i n a | 26. relação ao controle, em todos os tempos de contato, atingindo seus maiores percentuais na 3a hora de contato para o ortofosfato (82,61%) e na 4 a hora para fósforo total (71,43%). A remoção química, realizada pelas esferas controle foi aproximadamente 31% para as duas modalidades de fosfatos. Os valores médios de três experimentos realizados em triplicata estão representados nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1: Valores médios dos dados de fósforo total, para cada miligrama de fósforo dissolvido em um litro do efluente em 5 horas de contato, inclusive no tempo zero (coleta). FÓSFORO TOTAL (mg P.L -1) HORA. REATORES SEM ALGAS Mg p . L-1. COM ALGAS Mg p . L-1. To. 4,3. 4,3. T1. 2,1. 1,7. T2. 2,6. 1,2. T3. 2,7. 0,7. T4. 2,8. 0,8. T5. 3,0. 0,9. Tabela 2: Valores médios dos dados de orto-fosfato, para cada miligrama de fósforo dissolvido em um litro do efluente. em 5 horas de contato, inclusive no tempo zero (coleta). ORTO-FOSFATO (mg P.L -1) HORA. REATOR SEM ALGAS Mgp . L-1. COM ALGAS Mgp . L-1. To. 3,4. 3,3. T1. 1,3. 1,2. T2. 2,3. 0,7. T3. 2,2. 0,4. T4. 1,7. 0,7. T5. 2,3. 0,4.

(26) P á g i n a | 27. As algas assimilam o fósforo inorgânico para o seu metabolismo e através do processo fotossintético, favorecem as condições ambientais para que se desenvolvam outros mecanismos de remoção química, tais como a adsorção e a precipitação do fosfato na matriz. As algas imobilizadas realizaram ao final de um perfil de 5 h, eficiência média de remoção em torno de 87% para ortofosfato e 81,7% para fósforo total e obtiveram maior eficiência na remoção de fósforo em relação ao controle em todos os tempos de contato, atingindo expressivos percentuais na 4a hora de contato para fósforo total (71,43%), e na 3 a hora para ortofosfato (82,61%). Este trabalho levou em consideração a radiação artificial com lâmpadas fluorescentes brancas de 80 μmols m- 2 s-1, tendo uma incidência luminosa de 6 h em escala bancada. Essa incidência luminosa, aliada ao aumento significativo do pH no reator contendo algas imobilizadas provavelmente justificam expressiva depuração de fósforo e orto-fosfato no sistema.. 4.2 Remoção de Coliformes Termotolerantes. As concentrações de coliformes termotolerantes foram determinadas pelo método de membrana filtrante, com membranas de celulose (Millipore ®) de 0,45µm e 47 mm de diâmetro e expressa em unidades de colônias filtradas (UFC/100 mL). A Tabela 3 apresenta a média dos valores obtidos nos ensaios Tabela 3: Valores médios de coliformes termotolerantes de três experimentos realizados com tempo de contato de seis horas.. COLIFORMES TERMOTOLERANTES REATOR COM ALGAS. REATOR SEM ALGAS. HORA. UFC 100ml. HORA. UFC 100ml. To. 1,42 x 106. To. 1,42 x 106. T1. 2,18 x 105. T1. 1,38 x 106. T2. 1,17 x 104. T2. 1,45 x 106. T3. 0,4 x 104. T3. 1,40 x 106. T4. 2 x 103. T4. 1,32 x 106.

(27) P á g i n a | 28. T5. 0,5 x 102. T5. 1,34 x 106. T6. 0. T6. 1,25x 106. 4.3 Análise de pH. O potencial hidrogeniônico ou potencial hidrogênio iônico, foi medido nos dois reatores, um com algas imobilizadas e outro sem algas. A cada hora, era coletada uma amostra de 10 mL de ambos os reatores e medido seu pH, o reator controle (sem algas) a variação de pH foi de 0,085, e a do reator com algas foi de 0,61 a cada hora. Em ambos os reatores o pH inicial foi de 7,28, havendo uma pequena variação no reator controle que em 5 horas se encontrava com 7,77, ao contrário do reator com algas Chlorella sp. que após 5 horas estava com valores de 10,63, indicando que esses organismos tem uma ação significativa no aumento deste parâmetro. Na Tabela 4 estão apresentados os valores médios de pH dos ensaios realizados. Tabela 4: Valores médios de pH de três ensaios medido a cada hora de contato.. Bioreatores HORA. REATOR COM ALGAS. SEM ALGAS. To. 7,28. 7,28. T1. 8,84. 7,38. T2. 9,74. 7,47. T3. 10,14. 7,53. T4. 10,41. 7,62. T5. 10,63. 7,77. T6. 10,99. 7,79.

(28) P á g i n a | 29. CONSIDERAÇÕES FINAIS. Os resultados obtidos indicam a eficiência potencial das microalgas imobilizadas no tratamento das águas residuárias, devendo ser aprofundadas as investigações, principalmente relacionadas ao metabolismo das algas e da matriz de imobilização. O sistema de algas imobilizadas pode vir a suprir a deficiência do sistema de lagoas de estabilização, uma vez que ocupam pouco espaço no perímetro urbano. A Chlorella sp.. é uma microalga de boa adaptação ao ambiente e as. condições adversas, sendo por isso, apropriada no tratamento de efluente secundário..

(29) P á g i n a | 30. REFERÊNCIAS. APHA, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. th18. Washington, DC: American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, 1998. ARCEIVALA, S. J. Wastewater treatment and disposal. York. p. 892. 1981.. Marcel Dekker, New. ANISHA, G. S.; PREMA, P. Cell immobilization technique for the en haced production of galactosidase by Streptomyces griseoloalbus. Bioresource Technology , v. 99, n. 9, p. 3325-3330, 2008. BAUDISOVA, D. Evolution of Escherichia coli as the main indicator of faecal pollution. Water Science and Technology, v. 35, n.11-12, 1997. p. 333-336. BASHAN LE, HERNANDEZ JP, MOREY T, YOAV B. Microalgae growthpromoting. 2003 BABEL, S.; TAKIZAWA, S.; OZAKI, H. Factors affecting seasonal of membrane filtration resistance caused byChlorella algae. Water Research, v. 36, n.5, p.1193 –1202, 2002. BICUDO, C. E. M., MENEZES, M. Gênero de Algas de Águas Continentais do Brasil: Chave para identificação e descrições. Rima.2006. 508p. BISCHOFF, H. W.; BOLD, H. C. Physiologic studies. IV. Some algae from Enchanted Rock and related algae species. University of Texas Publications, v. 6318, 1963. p.1- 5. BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A.; AQUARONE, E. Biotecnologia Industrial: Fundamentos. São Paulo: Edgard Blücher, 2001. 4 v. v. 1, p. v-viii. BOROWWITZKA, M. A. Micro-algal Biotechnology Cambridge. University Press. Cambridge. 1988. BORAAS, ME, SEALE DB, BOXHOM, JE (1998) – Phagotrofy by a flagellate selects for colonial prey: A possible origin of multicellularity, Evolutionary Ecology, 12, 153-164..

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