FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARIANA FERREIRA PISSARRA
ESTUDO DO PAPEL DA PROTEÍNA ARHGAP21 NO NICHO
HEMATOPOIÉTICO
CAMPINAS 2019
ESTUDO DO PAPEL DA PROTEÍNA ARHGAP21 NO NICHO
HEMATOPOIÉTICO
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADORA: SARA TERESINHA OLALLA SAAD COORIENTADORA: MARIANA LAZARINI
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MARIANA FERREIRA PISSARRA, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SARA TERESINHA OLALLA SAAD
CAMPINAS 2019
ORIENTADORA: PROFA. DRA. SARA TERESINHA OLALLA SAAD COORIENTADORA: PROFA. DRA. MARIANA LAZARINI
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. SARA TERESINHA OLALLA SAAD
2. PROF. DR. JORG KOBARG
3. PROF. DR. JOÃO AGOSTINHO MACHADO NETO
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
Dedico este trabalho à minha família, especialmente aos meus pais, Augusto e Sueli, minha estrutura e base, por todo o apoio e compreensão para que eu pudesse chegar até aqui.
o suporte que me deram, mesmo estando fisicamente longe. Por confiarem tanto em mim e me incentivarem em todos os momentos.
À minha orientadora Profa. Dra. Sara Saad, que me recebeu ainda na graduação e confiou em mim. Agradeço por toda a confiança, incentivo e oportunidade de crescimento e aprendizagem profissional.
À minha coorientadora Profa. Dra. Mariana Lazarini, agradeço a oportunidade de trabalharmos juntas e poder aprender tanto ao longo desses anos. Obrigada pela paciência em me ensinar e contribuir para me tornar uma profissional melhor.
À minha amiga Cristiane Okuda, que me ensinou tanto. Obrigada pelo companheirismo, suporte emocional e tanto carinho.
Às minhas amigas Tamara e Fernanda, que me receberam tão bem e me acolheram em todos os momentos. Obrigada pelo carinho e amizade.
À professora Dra. Mary Luci Queiroz, por me permitir utilizar seu laboratório. À Karla, por me ensinar tudo que aprendi sobre os animais Arhgap21+/-. E ao
Marcio por todo o cuidado e zelo com os camundongos. À Irene, por ter me ensinado o que sei sobre citometria.
À querida Vanessa, pela paciência e conselhos em vários momentos. Obrigada pelo suporte e ensinamentos.
Às minhas queridas amigas Ana e Carla, agradeço todos os momentos que passamos juntas, todos os cafés rápidos ou jantares longos. Muito obrigada por me apoiarem e por estarem sempre dispostas a me ouvirem.
Às minhas amigas da graduação: Síntique, Deise e Beatriz. Obrigada por estarem comigo desde a faculdade e me acompanharem em todo meu crescimento.
Ao Rafael por todo carinho, companhia, auxílio e companheirismo.
À Patrícia Juliani por estar sempre disposta a resolver os problemas da forma mais rápida possível.
Rodrigo, Luciana, Marisa, Ada, Fernanda, Rubia, Lucas, Carolina, Adriana, Raquel, Simone.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), processo nº 2011/51959-0, pelo apoio recebido para a realização desse trabalho.
“Somos, enfim, o que fazemos para transformar o que somos.”
Eduardo Galeano
endoteliais e mesenquimais e é responsável por dar suporte às células-tronco hematopoiéticas, mantendo seu equilíbrio entre os processos de quiescência e diferenciação. Alterações neste microambiente têm sido cada vez mais relacionadas a doenças hematológicas, como as síndromes mielodisplásicas (SMD) e a leucemia mieloide aguda (LMA). Assim, proteínas envolvidas na regulação tanto das células hematopoiéticas como dos componentes do nicho medular têm sido alvo de estudos destas neoplasias. A ARHGAP21 é uma proteína RhoGAP envolvida na hematopoese normal, porém estudos sobre seu papel nas células não-hematopoiéticas do microambiente da medula óssea ainda é escasso.
O objetivo geral desse trabalho foi investigar o papel da proteína ARHGAP21 em células do microambiente da medula óssea (MO). Para isso, avaliamos a expressão gênica de ARHGAP21 em medula óssea total e em células mesenquimais de pacientes com SMD e LMA cultivadas in vitro. O cultivo in vitro de células mesenquimais murinas também foi padronizado a fim de possibilitar o silenciamento de Arhgap21. Além disso, camundongos haploinsuficientes para Arhgap21 (Arhgap21+/-) foram utilizados como modelo para caracterização e estudo funcional
das células do microambiente da MO através de imunofenotipagem e transplante de medula óssea.
A expressão gênica de ARHGAP21 se mostrou elevada em células mesenquimais de pacientes com LMA de novo quando comparada com as amostras de doadores saudáveis, enquanto não apresentou diferença em amostras de medula óssea total. Uma vez que a padronização da cultura de células mesenquimais murinas não se mostrou viável devido ao crescimento insuficiente dessas células in vitro e/ou pela contaminação de células hematopoiéticas na cultura, demos continuidade aos estudos utilizando o modelo animal haploinsuficiente. Os camundongos Arhgap21
+/-apresentaram maior frequência de células da linhagem osteoblástica na medula óssea, assim como maior número de colônias celulares da linhagem osteoblástica com atividade de fosfatase alcalina. Esses camundongos também apresentaram maiores níveis de osteocalcina na medula óssea. Camundongos Arhgap21
Juntos, esses dados indicam que o animal Arhgap21+/- apresenta um
microambiente medular alterado, com maior quantidade de células osteoblásticas e menor suporte à reconstituição da MO após transplante, o que sugere um possível papel da ARHGAP21 no suporte à hematopoese e na fisiopatologia de doenças hematológicas, uma vez que alterações no nicho estão a elas relacionadas.
Palavras chaves: Estroma da medula óssea. Hematopoese. Arhgap21. Camundongos.
mesenchymal cells and is responsible for supporting hematopoietic cells and maintaining their balance between the quiescence and differentiation processes. Studies point that alterations in the bone marrow microenvironment are related to hematological diseases as the Myelodysplastic Syndrome (MDS) and Acute Myeloid Leukemia (AML). MDS is a hematological neoplasia characterized by impaired production of blood cells. The syndrome is classified according to different degrees of severity and approximately one third of the patients progress to (AML). Therefore, proteins related to both, the hematopoietic process and the microenvironment components have been the focus of studies. ARHGAP21 is a RhoGAP protein involved in regular hematopoiesis, however information regarding the role of this protein in the hematopoiesis of patients who present such conditions and in non-hematopoietic cells which compose the bone marrow microenvironment remains scarce.
Therefore, the overall objective of this study was to investigate the role ARHGAP21 plays in the bone marrow microenvironment. This research was conducted by the evaluation of ARHGAP21 expression in vitro in mesenchymal cells from bone marrow from MDS and AML patients; by silencing Arhgap21 in the mesenchymal murine cells after the standardization of mesenchymal murine cell culture in vitro; by immunophenotyping the bone marrow microenvironment from haploinsuficient mice for Arhgap21 (Arhgap21+/-) and by the evaluation of the
reconstitution of hematopoiesis through the bone marrow transplant.
This work showed an increased expression of ARHGAP21 in mesenchymal cells from AML de novo patients’ bone marrow when compared to those from healthy donors, while ARHGAP21’s expression presented no significant differences in total bone marrow samples when compared to healthy donors. Since standardization of murine mesenchymal cell culture was not feasible due to insufficient growth of these cells in vitro and / or contamination of hematopoietic cells in the culture, we continued studies using the haploinsufficient animal model. Arhgap21+/- murine model showed a
higher osteoblastic lineage frequency when compared to wide-type animals, as well a larger number of osteoblastic lineage cell colonies with alkaline phosphatase activity. Arhgap21+/-mice also possess higher levels of osteocalcin in their bone marrows than
but not significant differences in the other cell populations of the blood system analyzed when compared with wild-type mice.
Taken together, these data indicate that the Arhgap21+/- mice present an altered
bone marrow microenvironment, with larger amount of osteoblastic cells and less support for BM reconstitution after transplantation, which may indicate a possible role of ARHGAP21 in the pathophysiology of hematological diseases, since disruption in the bone marrow niche is related to these diseases.
Figura 1. Arquitetura celular e molecular do nicho da medula óssea. Figura 2. Representação esquemática da proteína ARHGAP21.
Figura 3. Representação das interações de ARHGAP21 e seus respectivos processos biológicos.
Figura 4. PCR da genotipagem da prole gerada através de cruzamento entre camundongos selvagens e Arhgap21+/-.
Figura 5. Expressão de mRNA de ARHGAP21 em células totais de medula óssea de pacientes com SMD e LMA e doadores sadios.
Figura 6. Expressão de mRNA de ARHGAP21 em células mesenquimais de pacientes com SMD, LMA-ARM e LMA de novo.
Figura 7. Morfologia das células mesenquimais de medula óssea murina semeadas de acordo com diferentes protocolos.
Figura 8
.
Análise dos marcadores celulares para células mesenquimais por citometria de fluxo semeadas de acordo com os protocolos 2, 3, 4 e 5.
Figura 9. Imunofenotipagem das células endoteliais da medula óssea de camundongos selvagens e Arhgap21+/-: células endoteliais sinusoidais (SECs) e
células endoteliais arteriolares (AECs).
Figura 10. Imunofenotipagem da linhagem mesenquimal da medula óssea de camundongos selvagens e Arhgap21+/-: células estromais multipotentes (multipotent
stromal cells – MSCs) e células da linhagem osteoblástica (osteoblastic lineage cells - OBCs).
Figura 11. Análise funcional das populações de células estromais e osteoblásticas da medula óssea dos animais selvagens e Arhgap21+/-.
Figura 12. Avaliação do perfil de citocinas no microambiente da medula óssea em animais Arhgap21+/- e selvagens.
Figura 14. Representação do mecanismo que media a diferenciação de células mesenquimais em células da linhagem osteobástica ou adipocítica
Figura 15. Representação esquemática da suposta função de ARHGAP21 na diferenciação de células mesenquimais via RhoA, inibindo a osteogênese
Tabela 1. Características dos pacientes com SMD e LMA incluídos no estudo. Tabela 2. Sequências e concentrações dos iniciadores utilizados.
Tabela 3. Sequência dos iniciadores usados na genotipagem dos camundongos
Arhgap21+/-.
Tabela 4. Detalhes dos cinco protocolos utilizados para padronizar a cultura de células mesenquimais da MO.
ARHGAP21 - RhoGTPase Activating Protein 21
CFU - colony-forming unit; unidade formadora de colônia cDNA – complementary DNA
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium DNA - Desoxiribonucleic Acid
ELISA – do inglês, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FITC – Fluorescein Isothiocyanate
G-CSF - fator estimulador de colônias de granulócitos HPRT - Hypoxanthine phosphoribosyltransferase IFN-γ - interferon gama
IL – interleucina
IMDM - Iscove modified Dulbecco Medium LMA - Leucemia Mieloide Aguda
LMA-ARM - Leucemia mieloide aguda com alterações relacionadas à mielodisplasia LMA de novo - Leucemia mieloide aguda de novo
M-CSF - fator estimulador de colônias de monócitos MO – Medula óssea
NCBI - National Center for Biotechnology Information OMS – Organização Mundial da Saúde
PBS - tampão fosfato-salino
PepBoy - Black6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ
RhoA - Ras Homolog gene family, member A
RhoGDIs - Guanine nucleotide Dissociation Inhibitors RhoGEFs - Guanine Exchange Factors
RhoGAPs - RhoGTPase activating proteins
R-IPSS – Revised International Prognostic Scoring System RNA - Ribonucleic Acid
RPM - rotações por minuto
RPMI - Roswell Park Memorial Institute
RT-PCR - Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction SE – Soro Equino
SFB - Soro Fetal Bovino
SMD - Síndromes mielodisplásicas
SMD-MLD - SMD com displasia multilinear SMD-SLD- SMD com displasia unilinear SMD-RS - SMD com sideroblastos em anel SMD-del(5q) - SMD com del(5q) isolado SMD-EB-1 - SMD com excesso de blastos-1 SMD-EB-2 - SMD com excesso de blastos-2 SP – Sangue periférico
1. INTRODUÇÃO ... 20
Nicho hematopoiético ... 20
ARHGAP21: uma RhoGAP ... 24
2. OBJETIVOS ... 29
3. METODOLOGIA ... 30
3.1 Casuística ... 30
3.2 Cultivo de células mesenquimais de medula óssea de pacientes com SMD e LMA 32 3.3 Extração de RNA e síntese de cDNA ... 32
3.4 RT-PCR em tempo real... 33
3.5 Camundongos isogênicos e haploinsuficientes para Arhgap21 (Arhgap21+/-) ... 33
3.6 Genotipagem dos camundongos heterozigotos para Arhgap21 (Arhgap21+/-) ... 34
3.7 Padronização da cultura de células mesenquimais de medula óssea de camundongos ... 36
3.8 Análise Morfológica das células mesenquimais em cultura ... 39
3.9 Imunofenotipagem das células mesenquimais ... 39
3.10 Obtenção das células e sobrenadante da medula óssea de camundongos selvagens e Arhgap21+/- ... 39
3.11 Imunofenotipagem das células do microambiente da medula óssea ... 39
3.12 Ensaio de Formação de Colônia (CFU-F e CFU-Ob) ... 40
3.13 Análise da expressão de citocinas ... 41
3.14 Transplante utilizando camundongos Arhgap21+/- como receptores de medula óssea ... 42
3.15 Imunofenotipagem das populações hematopoiéticas murinas ... 42
3.16 Análise Estatística ... 43
4. RESULTADOS ... 44
4.1 Caracterização da expressão de ARHGAP21 em células de medula óssea total e em células mesenquimais de medula óssea de pacientes SMD e LMA e doadores saudáveis. ... 44
4.2 Padronização da cultura de células mesenquimais obtidas de medula óssea murina 47 4.3 Imunofenotipagem das populações do microambiente da medula óssea de camundongo haploinsuficiente para Arhgap21 (Arhgap21+/-) ... 54
4.4 Análise Funcional das populações de células da medula óssea pelo método de CFU 58 4.5 Avaliação de citocinas no microambiente medular ... 60
4.6 Estudo do papel do nicho medular de camundongos Arhgap21+/- na reconstituição da hematopoese através de transplante de medula óssea ... 62
5. DISCUSSÃO ... 65
8.1 Anexo 1 ... 84
8.2 Anexo 2 ... 86
8.3 Anexo 3 ... 87
8.4 Anexo 4 ... 88
1. INTRODUÇÃO
Nicho hematopoiético
A hematopoese é um processo contínuo onde a célula-tronco hematopoiética (CHT) dá origem a todas as células do sangue através de um processo hierarquizado e altamente controlado que envolve proliferação, autorrenovação e diferenciação das CHTs na medula óssea (1–3). O equilíbrio entre quiescência e expansão das CHTs é controlado pelo microambiente da medula óssea (MO), um local muito vascularizado e composto por populações celulares heterogêneas (2,4,5).
O nicho hematopoiético, conceito incialmente proposto por Ray Schofield em 1978 (6), é frequentemente dividido em duas regiões definidas por suas características anatômicas e funcionais, sendo elas o nicho osteoblástico (endosteal) e o nicho vascular (7) (Figura 1). O nicho osteoblástico possui essa nomenclatura pela grande quantidade de osteoblastos presentes nessa região, que se localiza na parte interior da cavidade do osso, e é a responsável por manter as CHTs em seu estado quiescente. Mais próximo aos vasos sanguíneos, na região sinusoidal, está localizado o nicho vascular, composto principalmente pelas células endoteliais. A contribuição específica das células endoteliais na manutenção das CHTs ainda precisa ser melhor estudada, porém seu papel se reflete na diferença de permeabilidade, observada nos capilares sinusoidais e arteríolas, que repercute nas CHTs. Vasos arteriais são menos permeáveis e mantêm as CHTs com níveis reduzidos de espécies reativas de oxigênio, e, portanto, num estado quiescente. No entanto, os capilares sinusoidais expõem as CHTs ao plasma sanguíneo gerando altos níveis de espécies reativas de oxigênio nessas células, aumentando sua habilidade de se diferenciar e migrar (8,9).
Figura 1. Arquitetura celular e molecular do nicho da medula óssea. Representação do microambiente da medula óssea dividido em nicho sinusoidal com a presença das células estromais Lepr+ e o Nicho Arteriolar com as células estromais NG2+ nestinahigh. CHTs estão
representadas nos dois nichos, mas têm sua principal localização no nicho arteriolar. Macrófagos e megacariócitos se apresentam em proximidade com as CHTs na medula óssea. Células endoteliais e estromais produzem fatores indispensáveis para a manutenção das CHTs. Figura adaptada de Szade et al. (7).
Além das células endoteliais, um importante componente do nicho são as células estromais mesenquimais (CEM). As células estromais mesenquimais são células com capacidade de autorrenovação, e dão origem às células da linhagem osteoblástica, adipocítica e condrocítica (3,10). Uma das primeiras evidências da presença das CEM está descrita no trabalho de Friedenstein et al. (11) em 1974, mostrando que uma única célula, proveniente de uma colônia de células da medula óssea cultivada in vitro, foi capaz de gerar um tecido esquelético com várias linhagens
Macrófago Osso Trabécula Nicho Arteriolar Nicho Sinusoidal Megacariócito Célula Estromal Lepr+ Célula Estromal NG2+ nestinahigh CHT CHT
(osso, cartilagem, adipócitos e fibroblastos) quando transplantada in vivo. Além de sua característica multipotente, as CEM são responsáveis por manter a homeostase do microambiente da medula óssea por meio do contato direto com as CHTs, assim como por meio da secreção de citocinas e fatores de crescimento (2,12).
Os fatores de crescimento CXCL12 (do inglês, C-X-C type chemokine ligand
12; também chamado de SDF-1, do inglês stromal cell-derived factor 1), o ligante do
nicho para CXCR4 das CHTS, e SCF (KITL), o ligante do nicho para o receptor KIT das CHTs, são fatores que participam da manutenção das CHTs. CXCL12 é um fator descrito por sua importância no direcionamento da migração das CHTs, e, assim como SCF, colaboram para a manutenção da quiescência dessas células (13). Esses fatores de crescimento são produzidos por células mesenquimais presentes no microambiente da MO que foram identificadas pela expressão positiva de LepR+
(receptor de Leptina), quando presentes no nicho vascular, ou células Nestinhigh (do
inglês, nestin gene promoter) marcadas pelo antígeno 2 neural (NG2, do inglês
neural/glial antigen 2) quando presentes no nicho arteriolar (7).
A capacidade de autorrenovação e diferenciação das células mesenquimais, além do seu papel como reguladora da hematopoese, tem atraído o foco para estas células em diversas áreas de estudo, como terapia celular, medicina regenerativa e como modelo in vitro para entendimento do papel do microambiente medular na fisiopatologia de doenças hematológicas (2). Alterações em células específicas do microambiente já foram descritas em síndromes mielodisplásicas (SMD), leucemia mielóide aguda (LMA) e neoplasias mieloproliferativas por meio estudos em modelos murinos (10,14–17).
Um estudo utilizando o modelo de camundongo transgênico para Osx-GFP-Cre+Dicer1fl/fl sugere quemodificações no microambiente da medula óssea podem
induzir SMD. Nesse modelo, a deleção do gene Dicer 1 em células osteoprogenitoras levou a uma hematopoese deficiente mimetizando as SMD humana (18). Essas células osteoprogenitoras também apresentaram reduzida expressão do gene SBDS (Shwachman–Diamond–Bodian) e o modelo animal com deleção desse gene também levou ao fenótipo de SMD nos camundongos transgênicos, resultante dos altos níveis de espécies reativas de oxigênio nas CHTs, sugerindo um possível papel do nicho medular no desenvolvimento de doenças mielóides (19).
Em um modelo animal de LMA, a superativação da via de sinalização da β-catenina, por meio da ativação constitutiva da mutação da β-catenina em osteoblastos, reduziu o potencial de diferenciação de células progenitoras mielódes e linfoides, levando à progressão SMD/LMA. Esses osteoblastos que superexpressavam β-catenina também apresentaram um aumento na expressão de Notch (ligante de Jagged-1). Esse resultado foi correlacionado com a elevada sinalização de Notch dos osteoblastos, com β-catenina ativada no núcleo, com as CHTs em biópsias de MO humana de pacientes com LMA, evidenciando a potencial relevância das células do microambiente da MO nas doenças hematológicas (20).
As síndromes mielodisplásicas são desordens hematológicas caracterizadas pela hematopoese ineficaz, resultando em vários graus de citopenias periféricas (21– 23). As SMD ocorrem principalmente em idosos a partir de 60 anos, e está associada com o envelhecimento, com uma idade média de cerca de 70 anos (24). Cerca de 30% dos pacientes podem desenvolver leucemia mieloide aguda. Assim como na LMA, a heterogeneidade da doença torna difícil o diagnóstico, classificação e a conduta terapêutica. A Organização Mundial da Saúde, em colaboração com a Sociedade para Hemopatologia e a Associação Europeia para Hemopatologia publicaram uma classificação para as doenças hematopoiéticas em 2001 e 2008, novamente atualizadas em 2016. A classificação das SMD compreende as categorias: SMD-MLD: SMD com displasia multilinear; SMD-SLD: SMD com displasia unilinear; SMD-RS: SMD com sideroblastos em anel; SMD-del(5q): SMD com del(5q) isolado; SMD-EB-1: SMD com excesso de blastos-1; SMD-EB-2: SMD com excesso de blastos-2. O critério diagnóstico para SMD se dá por meio da porcentagem de blastos presentes no sangue periférico (SP), tipo e quantidade de linhagens celulares com displasias (uma displasia: unilinear; mais de uma displasia: multilinear), presença/ausência de sideroblastos em anel e a presença de anormalidades cromossômicas específicas (21,25).
Análises citogenéticas dos pacientes auxiliam na predição da gravidade da doença e na definição do tratamento. No momento, o sistema internacional de prognóstico revisado (IPSS-R, do inglês Revised International Prognostic Scoring
System) é utilizado para categorizar em 5 níveis de severidade da doença (26). Os
tratamentos para pacientes com SMD incluem transfusões de sangue, terapia com fatores de crescimento e antibióticos, quimioterapia com agentes hipometilantes
(decitabina e 5-azacitidina), agentes imunomodulatórios (ciclosporina, lenalidomida) e transplante de células-tronco hematopoiéticas (21).
O tempo médio de sobrevida desses pacientes varia de acordo com a severidade da doença. Utilizando os grupos de risco do R-IPSS temos uma sobrevida de 8,8 anos para pacientes categorizados como Risco Muito Baixo; 5,3 anos para pacientes do grupo Baixo Risco; 3 anos para o grupo Intermediário; 1,6 anos para o grupo de Alto Risco e 0,8 anos para o grupo Risco Muito Alto (27).
A leucemia mieloide aguda com alterações relacionadas à mielodisplasia (LMA-ARM) desenvolve-se em pacientes previamente diagnosticados com SMD. De acordo com a classificação da Organização Mundial da Saúde, esses pacientes apresentam a partir de 20% de blastos na MO ou SP, anormalidades citogenéticas específicas ou displasia de 50% ou mais das células em 2 ou mais linhagens mieloides (25,28). A LMA é caracterizada pela proliferação descontrolada de blastos imaturos que se acumulam na MO impedindo a hematopoese normal. A incidência da doença em pacientes mais velhos do que 70 anos compreende 55% dos casos de LMA, tendo uma mortalidade aumentada nas idades entre 65-74 anos em relação à população total. Dessa forma a idade do paciente no momento do diagnóstico influencia a gravidade da doença, uma vez que pacientes mais velhos apresentam comorbidades características do processo de envelhecimento (29). Os pacientes com LMA são tratados com quimioterapia e, em alguns casos, transplante de MO, no entanto, a recidiva da doença acontece em uma proporção de pacientes elevada (10%-40%) e apenas cerca de 30% dos pacientes têm sobrevida acima de 5 anos (30,31).
ARHGAP21: uma RhoGAP
Rho GTPases são moléculas que controlam o citoesqueleto celular e, portanto, estão envolvidas em diferentes processos celulares. Muitos desses processos ocorrem na hematopoese, como autorrenovação, homing e mobilização celular (32– 34). Os membros da família de proteínas Rho GTPases são classificados em 5 subfamílias de acordo com a homologia: Rho, Rac, Cdc42, Rnd e Rho-BTB (35).
A atividade da maioria das Rho GTPases é regulada por três classes de proteínas: 1) fatores de troca de nucleotídeos de guanina (RhoGEFs, do inglês,
Guanine Exchange Factors), 2) inibidores de dissociação de nucleotídeos de
guanosina (RhoGDIs, do inglês, Guanine nucleotide Dissociation Inhibitors) e 3) proteínas ativadoras de Rho GTPases (RhoGAPs, do inglês, Rho GTPase activating
proteins) (36). A atividade das GEFs leva à troca de GDP para GTP, atuando como
controladores positivos que causam a ativação das Rho GTPases. Já as GDI agem como controladores negativos, impedindo a atividade das GEFs de ativarem as Rho GTPases. As GAPs também agem como inibidoras de Rho GTPases ao promover a catálise do GTP para GDP.
ARHGAP21 é um membro da família de proteínas RhoGAPs, cujo papel é regular negativamente as Rho GTPases. O gene humano codificador da proteína ARHGAP21 foi descrito pelo nosso grupo em 2002 (37). Este gene se localiza no cromossomo 10 e possui 26 éxons, sua proteína codificada é composta por 1958 amino ácidos e tem um peso molecular predito de 217 kDa. Juntamente com o domínio RhoGAP, ARHGAP21 também possui um domínio PH (do inglês pleckstrin homology) e um domínio PDZ (PSD-95/Discs-large/ZO-1) (Figura 2)(37,38). Em camundongos, o gene ARHGAP21 está localizado no cromossomo 2 e apresenta cerca de 84% de homologia ao gene humano e 87,3% de homologia à proteína humana.
Figura 2. Representação esquemática da proteína ARHGAP21. As posições dos domínios PDZ, PH e GAP estão representados de acordo com o Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI, do inglês National Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/57584). Figura adaptada de Pissarra et al. (38).
A expressão gênica de ARHGAP21 se dá em todos os tecidos humanos, porém com diferentes níveis, sendo alta no cérebro, coração, musculo esquelético e placenta
(37). O aumento da expressão gênica de ARHGAP21 foi descrito durante o processo de diferenciação eritroide de células-tronco hematopoiéticas induzidas por eritropoietina, como também das células mieloides da linhagem HL-60 submetidas à diferenciação mieloide (37). A expressão gênica aumentada também foi encontrada em carcinomas escamosos de cabeça e pescoço comparados ao mesmo tecido normal (39).
Especificamente, foi demonstrado que a ARHGAP21 tem uma ação RhoGAP sobre os membros A e C dos genes homólogos Ras (RhoA e RhoC) (40–43), e em Cdc42 (41,42,44,45). ARHGAP21 interage com PKCζ e FAK (45), além da α-catenina nas junções célula-célula (42). Ela também interage com β-arrestina1, formando um complexo que modula a atividade de RhoA, e quando o complexo é desfeito há uma atenuação da formação das fibras de estresse (43). O silenciamento de ARHGAP21 em células beta pancreáticas levou ao aumento de ERK1/2 fosforilado, que foi previamente implicado no rearranjo de actina durante a secreção de insulina (46,47). A ARHGAP21 está localizada primariamente no núcleo, regiões perinucleares e no citoplasma de diversos tipos celulares, porém foi mostrado que ela pode ser recrutada para diferentes regiões, como o complexo de Golgi, através da ligação com ARF1-GTP, onde regula o complexo Arp2/3 e a dinâmica de F-actina através de sua atividade sobre Cdc42 (41). Portanto, a ARHGAP21 pode atuar em diversos locais dentro da célula (Figura 3) (48).
Figura 3. Representação das interações de ARHGAP21 e seus respectivos processos
biológicos. ARHGAP21 interage com FAK e Cdc42 nos processos de migração e proliferação
celular; com PK1 na polaridade celular; Cdc41, RhoA, RhoC e FAK na adesão celular; RhoA e β-Arrestina na formação de fibras de estresse; ARF, Cdc42 e ARP2/3 na regulação e posicionamento do complexo de Golgi na células e Cdc42 e ERK1/2 na secreção de insulina. Figura adaptada de Rosa et al. (48).
Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um modelo murino transgênico para Arhgap21 (49). Xavier-Ferrucio et al. mostraram que os camundongos homozigotos Arhgap21-/- não são viáveis, dessa forma o estudo foi conduzido com o uso dos
camundongos heterozigotos. Os camundongos heterozigotos para Arhgap21 (Arhgap21+/-) apresentaram redução de aproximadamente 50% na expressão gênica
de Arhgap21, portanto se caracteriza como um animal haploinsuficiente (49).
Camundongos Arhgap21+/- apresentam alterações nas populações celulares do
sangue periférico, tendo menores quantidades de eritrócitos, hemoglobina e plaquetas e maior quantidade de leucócitos totais e neutrófilos. Esses animais também apresentaram maiores quantidade de células-tronco hematopoiéticas na medula óssea. Relacionado com as alterações nas populações de células do sangue periférico, esses animais apresentaram um aumento na quantidade de progenitores de megacariócitos junto com uma redução na quantidade dos progenitores eritroides (49). No entanto, apesar do maior número de CHTs, camundongos Arhgap21
+/-apresentaram células progenitoras com menor capacidade funcional, indicando que essas células podem ter uma duração reduzida.
A ARHGAP21 também está relacionada com a migração e adesão das células hematopoiéticas, uma vez que células hematopoiéticas progenitoras de camundongos Arhgap21+/- apresentaram menor capacidade de adesão à fibronectina e redução da
expressão da integrina VLA4 (49). Xavier et al. também mostraram que a ação de ARHGAP21 na hematopoese pode se dar através da modulação de RhoC, uma vez que a atividade de RhoC estava aumentada nas células da medula óssea de camundongos Arhgap21+/-, sugerindo que ARHGAP21 tenha atividade de Rho GAP
Diante dessas informações, a ARHGAP21 parece desempenhar funções importantes em diferentes células, seja por sua atividade RhoGAP ou pela interação com outras proteínas. Portanto, o estudo desse trabalho foi investigar o papel da ARHGAP21 em células que compõem o microambiente da medula óssea e como o silenciamento deste gene alteraria a composição do nicho.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar o papel da proteína Arhgap21 no microambiente da medula óssea.
2.2 Objetivos específicos:
• Caracterizar a expressão gênica de ARHGAP21 em amostras de medula óssea total e de células mesenquimais isoladas de pacientes com SMD e LMA;
• Padronizar a cultura de células mesenquimais de medula óssea de camundongos para o silenciamento de Arhgap21;
• Realizar a caracterização imunofenotípica das populações que compõe o microambiente medular em camundongos Arhgap21+/-;
• Quantificar a expressão de citocinas na medula óssea de camundongos Arhgap21+/-;
• Estudar o papel do nicho medular do camundongo Arhgap21+/- na reconstituição
3. METODOLOGIA
3.1 Casuística
Amostras de células totais de MO de pacientes com SMD e LMA, atendidos no Centro de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Estadual de Campinas, e de doadores saudáveis foram obtidas por punção de MO. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Campinas (anexo 1). As amostras de RNA previamente extraído das células foram adquiridas do biorrepositório sob responsabilidade da Profa. Dra. Sara Teresinha Olalla Saad.
As características dos pacientes com SMD e LMA, classificados conforme as normas da OMS 2016, estão descritas na Tabela 1. A confirmação do diagnóstico dos pacientes incluídos no estudo foi realizada através de mielograma, citoquímica, citogenética e biópsia de MO. Todos os pacientes selecionados estavam há pelo menos seis meses sem tratamento. Os pacientes com diagnóstico de leucemia promielocítica aguda [LPA ou LMA com t(15;17)(q22;q12)] foram excluídos do grupo de pacientes com LMA de novo.
Tabela 1. Características dos pacientes com SMD e LMA incluídos no estudo. Células totais
da MO
Células Mesenquimais
Pacientes Número Número
SMD 48 21
Gênero
Homem/Mulher 27/23 15/6
Idade (anos), mediana
Classificação OMS 2016 RS-SLD / RS-MLD / del(5q) / SLD / MLD EB-1/EB-2 1/11/1/0/20 5/10 3/1/0/1/10 2/4 R-IPSS
Muito Baixo / Baixo Intermediário Alto / Muito alto Não disponível 6 / 20 9 7 / 3 3 2/7 7 1/3 1 Risco Citogético1 Baixo risco 36 15 Intermediário 8 2 Alto risco 1 3 Sem crescimento 3 1 LMA 50 18
LMA de novo / LMA-ARM 42/8 12/6
Gênero
Homem/Mulher 33/17 9/9
Idade (anos), mediana
(intervalo) 69 (22-90) 66 (30-86) Blastos MO (%), mediana (intervalo) 70 (22-96) 50 (20-89) Risco citogenético2 Baixo Risco 5 10 Intermediário/Alto risco 26/9 0/8 Não avaliado 10 0
SMD: Síndrome mielodisplásica; LMA: Leucemia mieloide aguda; LMA-ARM: LMA com alterações relacionadas à mielodisplasia; MLD: SMD com displasia multilinear , SMD-SLD: SMD com displasia unilinear, SMD-RS: SMD com sideroblastos em anel, SMD-del(5q): SMD com del(5q) isolado, SMD-EB-1: SMD com excesso de blastos-1, SMD-EB-2: SMD com excesso de blastos-2, R-IPSS: Revised International Prognostic Scoring System (25).
1SMD: classificação de cariótipo inclui bom: -Y (n=1), normal (n=39), del(5q) (n=1);
intermediário: +8 (n=2), outro (n=4); baixo: -7 (n=1), 3 ou mais anormalidades (n=2). Risco citogenético para SMD definido de acordo com classificação R-IPSS.
2LMA: cariótipo de baixo risco t(8;21) (n=4) and inv(16) (n=1), risco intermediário normal
(n=25), trisomia 8 (n=4) e outras anormalidades (n=8), e alto risco inclui cariótipo complexo (n=2), +8 (n=1), del(5q) (n=1) e normal (n=3). Risco citogenético para LMA foi definido de acordo com Grimwade et al. (50).
3.2 Cultivo de células mesenquimais de medula óssea de pacientes com SMD e LMA
As células mesenquimais foram isoladas e expandidas pelo Dr. Matheus Lopes e previamente utilizadas em trabalhos já publicados (51). Estas células foram obtidas através do cultivo das células mononucleares de amostras de medula óssea isoladas por centrifugação de densidade com Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Após semeadas, as células foram mantidas a 37°C, 5% CO2 e cultivadas em meio
DMEM (suplementado com 1% Penicilina/ Estreptomicina, 1% L-Glutamina e 10% de soro fetal bovino) na densidade de 106 células/cm2 durante 3-4 dias de cultura, quando
as células não aderentes foram removidas. Após atingirem a confluência de 80%, as células foram removidas com tripsina e semeadas novamente, na concentração de 4x103. O RNA foi extraído das células mesenquimais após a 4ª passagem em cultura.
3.3 Extração de RNA e síntese de cDNA
O RNA foi extraído das células de medula óssea total e das células mesenquimais com o uso do reagente Trizol (Invitrogen) e o tratamento com a enzima DNAse I foi realizado para evitar a contaminação por DNA genômico. O kit RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI Fermentas, Amherst, NY, USA) foi utilizado para fazer a transcrição reversa de 1μg da amostra de RNA. As
amostras foram quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop e diluídas a 40ng/μL para serem utilizadas nas reações de RT-PCR em tempo real.
3.4 RT-PCR em tempo real
A técnica de amplificação gênica em tempo real foi realizada utilizando o reagente SYBR Green qPCR master mix (MBI Fermentas) no equipamento ABI 7500 Sequence Detector System (Applied Biosystems). Cada reação de PCR foi realizada em triplicata com 120ng de cada amostra de cDNA com os iniciadores (Tabela 2). Um controle negativo, sem adição de cDNA, foi realizado para cada par de iniciadores. O protocolo de dissociação foi realizado para verificar amplificações não específicas ao final de cada experimento. A expressão gênica de HPRT foi utilizada como controle endógeno das reações. A equação 2–∆∆CT foi utilizada para calcular a quantificação relativa de expressão de cada gene em relação ao controle endógeno (52).
Tabela 2. Sequências e concentrações dos iniciadores utilizados.
Gene Sequência dos Iniciadores Concentração
ARHGAP21 5’-ATGCACTGTACACTCGCTTCGA-3’
5’- CAACGACGCCAGCAAAAAC-3 300nM
HPRT 5’- GAACGTCTTGCTCGAGATGTGA-3’
5’- TCCAGCAGGTCAGCAAAGAAT-3’ 150nM
3.5 Camundongos isogênicos e haploinsuficientes para Arhgap21 (Arhgap21+/-)
Todos os camundongos utilizados nesse trabalho foram mantidos no Biotério do Laboratório de Biologia Molecular e Hemostasia em gaiolas com no máximo 5 animais, em cama de maravalha, com controle de luz e temperatura e sem restrição de água ou ração. Este projeto teve aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UNICAMP: protocolos 4399-1 e 4894-1/2018 anexos.
Camundongos C57BL/6JUnib
Camundongos isogênicos C57BL/6JUnib machos de 06 – 16 semanas de idade foram utilizados para padronização do cultivo de células mesenquimais da medula óssea. Estes animais foram obtidos no Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB - UNICAMP).
Camundongos transgênicos heterozigotos para Arhgap21 (Arhgap21+/-)
Camundongos transgênicos heterozigotos para Arhgap21 (referidos neste trabalho como Arhgap21+/-) foram gerados pelo nosso grupo de pesquisa a partir de
camundongos C57BL/6. A presença do gene reporter β-geo permite a genotipagem dos animais heterozigotos. Além desses animais, a prole também possui animais selvagens, que não possuem o gene reporter, permitindo assim a genotipagem dos animais por meio de PCR do DNA genômico. Os camundongos heterozigotos foram utilizados para ensaios de imunofenotipagem das populações do microambiente medular, ensaio de CFU, análise das citocinas da medula óssea e transplante para estudo do papel do nicho medular alterado na hematopoese.
Cinquenta e um machos, entre 08 e 12 semanas de idade, transgênicos Arhgap21+/- (RRR629) foram autorizados para uso no presente estudo.
Camundongos isogênicos B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ
Sessenta e seis camundongos isogênicos machos B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ,
referidos ao longo do trabalho como PepBoy, entre 08 e 10 semanas de idade também foram utilizados nos transplantes de medula óssea. Os camundongos também foram obtidos no Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB - UNICAMP).
A prole gerada por meio do cruzamento de animais heterozigotos (Arhgap21
+/-) e selvagens foi genotipada por meio de PCR do DNA genômico, utilizando primers
do gene reporter da construção (β-geo) (Tabela 3). O fragmento resultante do PCR está presente apenas nos animais Arhgap21+/- e tem 587 pares de base (bp).
A reação de PCR utilizada foi de desnaturação inicial a 94ºC por 30 segundos; ciclo de 35 vezes: 94ºC por 15 segundos; 58ºC por 40 segundos; 72ºC por 1 minuto; extensão final a 72ºC por 5 minutos, com enzima Taq Polimerase (ThermoScientific).
Tabela 3. Sequência dos iniciadores usados na genotipagem dos camundongos Arhgap21+/-.
β-geo senso GGCGCCTCATGAATATTAACC
β-geo antissenso CACTCCAACCTCCGCAAACTC
A reação de PCR utilizando os iniciadores para o gene reporter β-geo gerou um fragmento de 587bp presentes apenas nos animais Arhgap21+/- (Figura 4).
Figura 4. PCR da genotipagem da prole gerada através de cruzamento entre
camundongos selvagens e Arhgap21+/-. Gel de agarose 1% com brometo de etídio. Setas indicam a amplificação do fragmento de aproximadamente 587bp e que caracteriza os animais Arhgap21+/-. Legenda: +: Controle positivo; B: branco.
3.7 Padronização da cultura de células mesenquimais de medula óssea de camundongos
Para a padronização da cultura de células mesenquimais da medula óssea de camundongos C57BL/6 foram testados cinco diferentes protocolos.
Todas as células foram semeadas em meio suplementado com 100 U/mL penicilina (Sigma-Aldrich) e 100 ug/mL estreptomicina (Sigma-Aldrich) e cultivadas em incubadora mantida em 37ºC com 5% CO2. Informações adicionais de meio de cultura
e soro utilizado em cada protocolo estão detalhadas na Tabela 4.
Protocolo 1
Animais de 6 semanas de idade foram sacrificados e as células da medula óssea do fêmur foram obtidas por meio da maceração dos ossos em um cadinho com 5mL de PBS. O macerado foi filtrado para retirar os pedaços de osso e lavado com PBS. Todas as células obtidas dos dois fêmures de um único animal foram semeadas em uma garrafa de 25cm2. Após sete dias, apenas metade do meio de cultura foi
retirado e substituído por meio novo. A substituição de metade do meio se deu a cada 7 dias até que a cultura atingisse 80% de confluência na garrafa. O meio de cultivo foi meio DMEM com a suplementação de 10% ou 20% de soro fetal bovino (SFB).
Protocolo 2
Células da medula óssea de camundongos entre 6 e 8 semanas de idade foram obtidas pelo método de flushing e semeadas na concentração inicial de 1x107 células
por garrafa de 25cm2. Como no protocolo 1, apenas metade do meio foi substituído
no 7º após início da cultura e novamente a cada 7 dias, até que a cultura atingisse 80% de confluência. As células foram mantidas em meio RPMI com suplementação de soro equino (SE) e adição de 2µM L-glutamina e 1x10-6mol/L hidrocortisona e
novamente duas concentrações de soro foram testadas: 10% e 20%.
Protocolo 3
A cultura de células realizada de acordo protocolo 3 foi similar à cultura obtida com protocolo 2, com a diferença da densidade celular inicial (2x107 células por
garrafa de 25cm2) e da concentração de soro equino (apenas a concentração 20%
foi testada).
Protocolo 4
Este protocolo foi baseado na metodologia descrita por Meirelles et al, 2003 (53). Células da medula óssea obtidas de camundongos com 16 semanas de idade por meio do método de flushing foram cultivadas na concentração de 17,5x106 células
por poço em uma placa de 6 poços. O meio de cultura utilizado foi o DMEM suplementado com 10% de SFB e a primeira troca do meio foi realizada 72 horas após o início da cultura. O meio de cultura foi completamente substituído sempre que mostrava características visuais de consumo até que as células atingissem 80% de confluência.
Protocolo 5
Células da medula óssea de camundongos entre 8 e 10 semanas de idade foram inicialmente obtidas por centrifugação, como descrito por Peister et al.(54), onde os ossos dos animais são colocados em minitubo adaptado e centrifugados por 1 minuto a 400g. Após a centrifugação, as células restantes no osso foram retiradas pelo método de flushing. Todas as células obtidas de um único animal foram então ressuspendidas em RPMI contendo 9% de SFB e 9% SE com 12µM de L-glutamina e semeadas em uma garrafa de 175 cm2. As células não aderentes foram retiradas após
24 horas através de substituição do meio de cultura, que a partir de então foi substituído a cada 4 dias por 4 semanas. Após as 4 semanas, as células foram tripsinizadas e semeadas novamente em uma garrafa de 175 cm2. O mesmo processo
foi repetido na segunda passagem, quando as células foram semeadas em meio IMDM com a mesma suplementação, na concentração de 50 células por cm2. O meio
de cultura foi substituído a cada 4 dias até as células atingirem confluência de 80% para nova expansão.
Id a d e d o C a m u n d o n g o (s e m a n a s ) M é to d o d e o b te n ç ã o d a s c é lu la s d a M O D e n s id a d e in ic ia l P la c a M e io d e C u lt u ra S o ro R e p o s iç ã o d o M e io d e C u lt u ra P ro to c o lo 1 6 M a ce ra çã o ~ 8 x1 0 7 cé lu la s 2 5 cm 2 g a rr a fa D M E M 1 0 % S F B 2 0 % S F B 7 d ia s P ro to c o lo 2 6 a 8 F lu sh in g 1 x1 0 7 cé lu la s 2 5 cm 2 g a rr a fa R P M I 2 µ M L -g lu ta m in a 1 x 1 0 -6m o l/L h id ro c o rt is o n a 1 0 % S E 2 0 % S E 7 d ia s P ro to c o lo 3 6 a 8 F lu sh in g 2 x1 0 7 cé lu la s 2 5 cm 2 g a rr a fa R P M I 2 µ M L -g lu ta m in a 1 x 1 0 -6m o l/L h id ro c o rt is o n a 2 0 % S E 7 d ia s P ro to c o lo 4 16 F lu sh in g 1 .7 5 x1 0 7 cé lu la s 6 -w e ll p la ca D M E M 1 0 % S F B 7 2 h o ra s P ro to c o lo 5 8 a 1 0 F lu sh in g e ce n tr if u g a çã o ~ 8 x1 0 7 cé lu la s 1 7 5 cm 2 g a rr a fa R P M I IM D M 1 2 µ M L -g lu ta m in a 9 % S F B + 9 % S E 2 4 h o ra s T a b e la 4 . D e ta lh e s d o s ci n co p ro to co lo s u ti liz a d o s p a ra p a d ro n iz a r a cu ltu ra d e cé lu la s m e se n q u im a is d a M O d e ca m u n d o n g o s D M EM - D u lb e c c o 's M o d if ie d Ea g le M e d iu m ; R PM I-1 6 4 0 - R o s w e ll Pa rk M e m o ri a l In s ti tu te ; IM D M - Is c o v e m o d if ie d D u lb e c c o M e d iu m ; SF B - So ro F e ta l Bo vi no e SE – So ro Eq ui no .
3.8 Análise Morfológica das células mesenquimais em cultura
O crescimento e a morfologia das células mesenquimais cultivadas in vitro foram observados por meio de microscópio de luz. As células viáveis foram contadas com uso de azul de tripan em câmera de Neubauer.
3.9 Imunofenotipagem das células mesenquimais
A pureza das células mesenquimais cultivadas in vitro foi avaliada através de citometria de fluxo, com os seguintes anticorpos: CD31/APC (Biolegend), CD44/APC (Biolegend), Ter119/PE (BD Biosciences), CD11b/PE (BD Biosciences), CD45/PerCP (Biolegend) e Sca-1/PE Cy7 (e-Biosciences).
3.10 Obtenção das células e sobrenadante da medula óssea de camundongos
selvagens e Arhgap21
+/-Células da medula óssea de camundongos selvagens e Arhgap21+/- foram
coletadas por meio de flushing do fêmur e tíbia dos camundongos. O método de
flushing consiste no uso de uma agulha de 25G acoplada à uma seringa contendo
200µL de PBS em minitubo tipo eppendorf.
Os minitubos foram centrifugados durante 5 minutos, 1500 rpm, o sobrenadante foi coletado em um novo minitubo e armazenado na temperatura de -20ºC até o uso. As células foram ressuspendidas conforme cada experimento realizado.
3.11 Imunofenotipagem das células do microambiente da medula óssea
As células da medula óssea coletadas como descrito anteriormente foram ressuspendidas em uma concentração de 1x107 células em 100 µL de PBS contendo
os anticorpos anti-mouse apropriados (Lin/APC – coquetel de linhagem hematopoiética, CD45/PerCP-Cy5,5, CD31/FITC, Sca-1/PE-Cy7 e CD51/PE; BD
Pharmigen) e foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente ao abrigo de luz.
As frequências das populações das células endoteliais arteriolares (arteriolar endotelial cells – AECs): CD45-/Lin-/CD31+/Sca1+; células endoteliais sinusoidais (sinusoidal endotelial cells - SECs): CD45-/Lin-/CD31+/Sca1-; células estromais multipotentes (multipotent stromal cells - MSCs): CD45-/Lin-/CD31+/Sca1+/CD51+ e células da linhagem osteoblástica (osteoblastic lineage cells - OBCs): CD45-/Lin-/CD31+/Sca1-/CD51+ foram analisadas por citometria de fluxo (FACSAria, BD Biosciences) e os resultados analisados utilizando o programa FlowJo.
3.12 Ensaio de Formação de Colônia (CFU-F e CFU-Ob)
A quantidade e a atividade de fosfatase alcalina de células estromais da medula óssea (CFU-F) e a quantidade e atividade de fosfatase alcalina de células da linhagem osteoblástica (CFU-Ob) foram determinadas através de ensaio de formação de colônia (CFU). As células totais da MO de animais selvagens e Arhgap21+/- foram
coletadas como descrito anteriormente e cultivadas de acordo como descrito a seguir. A fosfatase alcalina é uma glicoproteína com função hidrolítica, que atua na desfosforilação de várias moléculas e é considerada como medida da atividade celular (55). A coloração pelo método de Von Kossa nos permitiu identificar as colônias de células da linhagem osteoblástica, uma vez que a coloração aparece quando há a presença de mineralização óssea.
Ensaio de CFU-F
Para o ensaio de CFU-F, células na concentração de 1x106 por poço foram
cultivadas em uma placa de 6 poços, em triplicata, em meio alpha MEM com adição de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) por 6 dias. No 6º dia de cultura, o meio de cultura foi substituído por novo meio e as células foram mantidas até o 14º dia quando foram fixadas em tampão de formalina 10%.
Após a fixação, as células foram coradas com cristal violeta (0,5% em metanol) para identificação de colônias; e coradas para identificar atividade de fosfatase
alcalina (0,005% peso/volume de naphtol AS MX-PO4 e 0,03% peso/volume de Fast
Red Violet LB Salt em 100mM de Tris-HCl).
Ensaio de CFU-Ob
Para o ensaio de CFU-Ob, 4x106 células por poço foram cultivadas em
triplicata, em placas de 6 poços, em meio alpha MEM suplementado com 20% de SFB por 6 dias. Após este período, o meio de cultura foi substituído pelo meio específico para diferenciação de células da linhagem osteoblástica (alpha MEM contendo 20% SFB, 50 ug/mL L-ascorbic acid 2-phosphate e 10 mM glycerol2-phosphate disodium salt hydrate). Este meio mineralizante foi substituído a cada 2-3 dias, até o 17º de cultura, quando as células aderidas à placa foram fixadas com tampão 10% formalina.
As células fixadas foram coradas com o método de Von Kossa (2,5% peso/volume de AgNO3) para identificação de depósito de cálcio, e marcação da
atividade de fosfatase alcalina (0,005% peso/volume de naphtol AS MX-PO4 e 0,03%
peso/volume de Fast Red Violet LB Salt em 100mM de Tris-HCl).
Todos os reagentes utilizados foram adquiridos do fabricante Sigma-Aldrich.
3.13 Análise da expressão de citocinas
O plasma do sangue periférico, assim como o sobrenadante recolhido a partir do flushing das células da medula óssea de animais selvagens (n=10) e Arhgap21+/-
(n=11) foram utilizados para análise dos níveis de osteocalcina (Mouse OC/BGP (Osteocalcin) ELISA Kit, 96T (Elabscience Biotechnology Co.) e a expressão das citocinas G-CSF, M-CSF, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-10, IL-17 e VEGF-A foi analisada com o kit Miliplex MAP Mouse Cytokine Magnetic Kit (Milipore, MCYTMAG-70K-PX32), de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de TGF-β foram determinados utilizando o kit Multi-species TGFb-Singleplex (Milipore, TGFBMAG-64k-01), de acordo com as intruções do fabricante.
3.14 Transplante utilizando camundongos Arhgap21+/- como receptores de
medula óssea
Para avaliar a função do microambiente medular com expressão reduzida de
Arhgap21 no suporte à reconstituição da hematopoese de curto prazo utilizamos
camundongos Arhgap21+/-, que possuem células positivas para a marcação
anti-CD45.2, como os receptores de transplante de medula óssea. Os camundongos selvagens (provenientes da mesma prole) foram utilizados como controle. Camundongos PepBoy (B6.SJL-Ptprca Pep3b/BoyJ - Jackson`s Lab, USA) que são animais com células expressão de CD45.1 foram utilizados como doadores de medula óssea utilizadas nos transplantes.
Um total de 1x106 células da medula óssea dos camundongos PepBoy foi
injetada em cada camundongo receptor pela veia caudal, oito camundongos receptores selvagens e cinco camundongos Arhgap21+/- foram utilizados. Os
camundongos receptores já haviam sido previamente irradiados com dose sub-letal (9,5Gy), no Hospital de Clínicas da UNICAMP.
Coletas de sangue periférico foram realizadas mensalmente para avaliação do quimerismo (CD45.1 e CD45.2) por citometria de fluxo até 16 semanas após o transplante. Em seguida, os camundongos foram sacrificados e as células da medula óssea e sangue periférico foram coletadas e imunofenotipadas para avaliação das populações hematopoiéticas.
3.15 Imunofenotipagem das populações hematopoiéticas murinas
Células da medula óssea ou de sangue periférico foram marcadas com anticorpos específicos para análise das populações hematopoiéticas. Os anticorpos utilizados foram: Lin/APC, CD45 (CD45.1/APC e CD45.2/PE), CD3/FITC, B220/APC, Sca-1/PerCP, c-Kit/FITC, CD11b/FITC, Gr1/PerCP e Mac1/PE. As populações de células identificadas foram as CHTs (Lin- Sca-1+ c-Kit+), células mieloides (Gr1+
Mac1+), linfócitos B (B220+), linfócitos T (CD3+) e monócitos (CD11b+). Todos os
anticorpos foram previamente diluídos 1:100 em PBS e então incubados com as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente. As marcações foram avaliadas
por citometro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences) e as análises foram realizadas com o software FlowJo.
Os parâmetros hematopoiéticos foram analisados pelo hemocitômetro CELL-DYN Emerald Haematology System counter (Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA).
3.16 Análise Estatística
O programa GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) foi utilizado para fazer as análises estatísticas. O teste T de Student foi utilizado para os experimentos com camundongos e Mann Whitney foi utilizado nos testes com células humanas e os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando P≤0,05.
4. RESULTADOS
4.1 Caracterização da expressão de ARHGAP21 em células de
medula óssea total e em células mesenquimais de medula óssea de
pacientes SMD e LMA e doadores saudáveis.
Para avaliar o papel da ARHGAP21 no microambiente da medula óssea de pacientes com SMD e LMA, inicialmente analisamos sua expressão gênica por PCR quantitativo em amostras de células totais da medula óssea de pacientes com SMD e LMA e doadores saudáveis.
Os níveis de expressão do mRNA de ARHGAP21 em amostras de células totais de medula óssea de pacientes com SMD (RS-SLD / RS-MLD / del(5q) / SLD / MLD) (n=33), SMD (EB-1 / EB-2) (n=15), LMA-ARM (n=8) e LMA de novo (n=42) não apresentaram diferenças significativas quando comparados às amostras de doadores saudáveis (n=19) (Figura 5). 0 5 10 15 25 30 Doadores Saudáveis LMA-ARM LMA de novo n = 19 n = 33 n = 15 n = 8 n = 42 RS-SLD / RS-M LD / de l(5q) / SLD / M LD EB-1 / EB-2 P=0,0036 P=0,0093 E x pr e s s ã o de m R N A AR HGAP 2 1 /HP RT
Figura 5. Expressão de mRNA de ARHGAP21 em células totais de medula óssea de
pacientes com SMD e LMA e doadores sadios. A expressão de ARHGAP21 das células de
pacientes com SMD estratificados em dois grupos (RS-SLD / RS-MLD / del(5q) / SLD / MLD) (n=33) e (EB-1/EB-2) (n=15), LMA-ARM (n=8) e LMA de novo (n=42) não apresentou diferença significativa quando comparada às células de doadores saudáveis (n=19). As células de pacientes com LMA de novo apresentaram maior expressão de ARHGAP21 quando comparados ao grupo de pacientes com SMD (RS-SLD / RS-MLD / del(5q) / SLD / MLD) (P=0,0036) e (EB-1 / EB-2) (P=0,0093). Uma das amostras de doador saudável foi utilizada como calibradora (valor = 1). As linhas horizontais representam a mediana. Para análise estatística foi utilizado o teste de Mann Whitney.
Para melhor compreender o papel da ARHGAP21 no microambiente medular, a expressão desse gene foi analisada em células mesenquimais isoladas da MO de pacientes com SMD e LMA.
Interessantemente, observamos aumento nos níveis de expressão de
ARHGAP21 em pacientes LMA de novo (n=12) comparados aos doadores saudáveis
(n=7) (P=0,0035, Teste de Mann Whitney), aos pacientes com SMD (RS-SLD/RS-MDL/del(5q)/SLD/MLD) (n=15) (P=0,0001), aos pacientes com SMD (EB-1/EB-2) (n=6) (P=0,02) e aos pacientes com LMA-ARM (n=6) (P=0,0009)
.
Os níveis de expressão de ARHGAP21 nas amostras de pacientes com SMD (RS-SLD / RS-MLD / del(5q) / SLD / MLD) (n=15), SMD (EB-1/EB-2) (n=6) e LMA-ARM (n=6) não apresentaram diferença significativa quando comparados entre si ou aos doadores saudáveis (Figura 6).0 1 2 3 4 SM D RS-SLD / RS-M LD / de l(5q) / SLD / M LD LM A-ARM Doadore s Saudáv e is n = 7 n = 15 n = 6 LM A de novo n = 12 SM D EB-1/EB-2 n = 6 P=0,0035 E x pr e s s ã o de m R N A AR HGAP 2 1 /HP RT P=0,0001 P=0,02 P=0,0009
Figura 6. Expressão de mRNA de ARHGAP21 em células mesenquimais de pacientes
com SMD, LMA-ARM e LMA de novo. Expressão relativa de ARHGAP21 em células
mesenquimais de medula óssea de pacientes com SMD e LMA em comparação com doadores saudáveis. Pacientes com LMA de novo (n=12) apresentaram aumento de expressão de ARHGAP21 em comparação aos doadores saudáveis (n=7) (P=0,0035), aos pacientes com SMD (RS-SLD/RS-MDL/del(5q)/SLD/MLD) (n=15) (P=0,0001), aos pacientes com SMD (EB-1/EB-2) (n=6) (P=0,02) e aos pacientes com LMA-ARM (n=6) (P=0,0009). Não houve diferenças significativas dos demais grupos entre si ou se comparados aos doadores saudáveis. Uma amostra de doador saudável foi utilizada como amostra calibradora (valor = 1). As linhas horizontais representam a mediana. Para análise estatística foi utilizado o teste de Mann Whitney.
4.2 Padronização da cultura de células mesenquimais obtidas de
medula óssea murina
Com o objetivo de fazer o silenciamento de Arhgap21 em células mesenquimais, decidimos utilizar células murinas cultivas in vitro, uma vez que camundongos têm sido usados como modelo animal para pesquisa há alguns anos por suas características de fácil manuseio, baixa variabilidade genética e baixo custo de manutenção. No entanto, diferente das células mesenquimais humanas, as células mesenquimais murinas são mais desafiadoras para serem cultivadas, devido à baixa quantidade de células presentes na medula óssea e alto grau de contaminação da cultura por células hematopoiéticas e endoteliais (14,16,56,57).
As culturas celulares apresentaram características iniciais similares em todos os protocolos seguidos. Durante a primeira semana, as culturas mostraram a presença de células pequenas e arredondadas e não aderentes, enquanto as células aderentes começavam a demostrar uma morfologia mais alongada.
Porém, nossos resultados mostraram que em nenhum dos protocolos seguidos houve obtenção de células mesenquimais puras, isto é, sem a contaminação de outras células hematopoiéticas ou endoteliais.
Protocolo 1
A cultura celular realizada de acordo com o protocolo 1 com 20% SFB apresentou células mais alongadas e com mais protusões do que as células semeadas de acordo com o mesmo protocolo, mas com 10% SFB (Figura 7A). A variação na concentração de soro bovino presente no meio de cultura não alterou a taxa de crescimento celular e as células foram mantidas durante 7 semanas sem, alcançarem a confluência necessária para serem expandidas (Tabela 5). A cultura celular feita de acordo com esse protocolo não teve seus marcadores celulares analisados por número insuficiente de células.
Protocolo 2
A cultura gerada de acordo com o protocolo 2 (10% e 20% SE) apresentou células com características morfológicas de fibroblastos no 7º dia. No entanto, no 10º dia, as células mantidas com 20% de SE se apresentaram mais alongadas, enquanto as células cultivadas com 10% SE estavam mais arredondadas e escuras ao microscópio de luz (Figura 7B). As células mantidas em meio com 20% SE atingiram 80% de confluência e foram expandidas pela primeira vez no 22º dia em cultura, enquanto as células mantidas em 10% SE necessitaram de 35 dias para atingir a mesma confluência. No 56º dia em cultura, as células das duas condições atingiram a novamente a confluência de 80% e sua pureza foi avaliada (Tabela 5).
As células semeadas de acordo com o protocolo 2 tiveram expressão positiva para CD45, CD31, CD11b, Sca-1 e CD44, mas sem expressão para Ter119 (Figura 8A).
Protocolo 3
A cultura celular gerada de acordo com o protocolo 3 apresentou morfologia similar às células cultivadas de acordo com o protocolo 2 na condição de 20% SE (Figura 7C). A adição de L-glutamina e hidrocortisona à cultura não mostrou benefícios em relação à taxa de crescimento das células e a cultura foi terminada depois de 35 dias, uma vez que a confluência necessária para a expansão não foi atingida e as células não apresentaram os marcadores celulares necessários para células mesenquimais (Tabela 5), tendo apresentado expressão positiva CD45, CD31, CD11b, Sca-1 e CD44, mas não expressaram Ter119 (Figura 8B).
Protocolo 4
A cultura celular baseada no protocolo 4 apresentou um crescimento celular rápido, atingindo a confluência de 80% em apenas 7 dias. No 7º dia em cultura ainda era possível observar a presença de células não aderentes junto com as células aderentes mais alongadas (Figura 7D). No entanto, após a primeira passagem, as células não mantiveram o crescimento necessário para atingirem a confluência
novamente, além de mostrarem expressão positiva para todos os marcadores analisados (Figura 8C), o que não as caracteriza como células mesenquimais.
Protocolo 5
Já as células semeadas de acordo com o protocolo 5 apresentaram um crescimento celular mais lento levando 28 dias para atingirem 80% de confluência quando então foram expandidas. Antes da primeira passagem, a cultura celular apresentava células aderentes com mais de uma morfologia: células menores e mais arredondas espalhadas pela garrafa e células mais alongadas organizadas em conjunto (Figura 7E). As células foram expandidas até a sexta passagem, quando os marcadores celulares foram analisados por citometria de fluxo e as células apresentaram expressão positiva para os marcadores CD31, CD11b, Sca-1 e CD44, baixa expressão para CD45 e não apresentaram expressão de Ter119 (Figura 8D).
Figura 7. Morfologia das células mesenquimais de medula óssea murina semeadas de
acordo com diferentes protocolos. (A) Células semeadas de acordo com o protocolo 1 no
21º dia em cultura. Células semeadas com 10% SFB eram menores e mais arredondadas em comparação às células semeadas com 20% SFB, as quais eram mais alongadas, organizadas em grupos e apresentando mais protusões. (B) Células semeadas de acordo com o protocolo 2 após 10 dias em cultura com suplementação de 10% e 20% SE. É possível observar que as células semeadas com 20% SE eram mais alongadas e com características de fibroblastos e estavam em maior confluência, enquanto as células semeadas com 10% SE estavam em menor quantidade e possuíam uma morfologia mais arredondada e escura. (C) Células semeadas de acordo com o protocolo 3 após 7 dias em cultura. As células apresentaram diferentes morfologias: presença de células mais alongadas e espalhadas na garrafa e de células mais arredondadas e escuras organizadas em grupos. (D) Células semeadas de acordo com o protocolo 4 após 7 dias em cultura apresentaram células aderentes com formato alongado coexistindo com células não aderentes (sombras mostram as células não aderentes no meio de cultura). (E) Células semeadas de acordo com o protocolo 5, após 25 dias em cultura, apresentaram morfologias diferentes: células pequenas com formato arredondado estavam espalhadas na garrafa e as células mais alongadas estavam organizadas em grupos (imagem de contraste de fase). Escala = 100µm.
