DEPARTAMENTO DE HUMANIDADES E EDUCAÇÃO
CURSO DE EDUCAÇÃO FÍSICA
IBERÊ MACHADO KOSTRYCKI
EXERCÍCIO FÍSICO PREVINE AUMENTO DE DANO OXIDATIVO MUSCULAR E ALTERAÇÃO GLICÊMICA CAUSADA PELA EXPOSIÇÃO AO CALOR
SANTA RORA (RS)
IBERÊ MACHADO KOSTRYCKI
EXERCÍCIO FÍSICO PREVINE AUMENTO DE DANO OXIDATIVO MUSCULAR E ALTERAÇÃO GLICÊMICA CAUSADA PELA EXPOSIÇÃO AO CALOR
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado ao Curso de Educação Física do Departamento de Humanidades e Educação (DHE) da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul – Unijuí, como exigência parcial para obtenção do título de Licenciado e Bacharel em Educação Física.
Orientador: Prof. Dr. Thiago Gomes Heck
Grupo de Pesquisa em Fisiologia (GPeF) Santa Rosa (RS)
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a três pessoas de inestimável valor em minha vida que sempre estiveram ao meu lado e incentivaram-me nessa caminhada, Juraci Werlang Machado (in memoriam), minha avó, Xana Machado Kostrycki, minha irmã, e Terezinha Torres, minha esposa.
AGRADECIMENTOS
Certamente não conquistamos nossos objetivos sozinhos. Portanto, gostaria de agradecer a todos que de alguma forma foram importantes nesta etapa:
Aos professores que oportunizaram minha iniciação científica Thiago Gomes Heck, Mirna Ludwig e Antônio Miragem, pela confiança, atenção e compreensão “sempre” que preciso.
Thiago, obrigado por orientar-me ao longo desses últimos três anos de constante aprendizado, mas principalmente pela amizade e paciência. Muito obrigado por tudo!
Aos colegas de laboratório GPeF, Pauline Goettems, Bethânia Salamoni, Fernanda Baldissera, Maciel Bruxel, Maicon Sulzbacher, Analú dos Santos, Eloísa Pelegrini, Eliara Martins e Renan Basso pelos ensinamentos, apoio e companheirismo do início até o final deste trabalho.
Aos professores desta instituição, que fizeram parte de minha formação acadêmica, em especial professores Luiz Loi e Cléia Dorneles, pelo exemplo e oportunidades durante esse período.
Aos colegas de faculdade Marcelo Baron, André Luís, Renato Menezes e Mônica Simon pelos debates e discussões em sala de aula e desabafos fora dela.
RESUMO
A incidência de Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) atinge proporções epidêmicas, demandando alto custo econômico e social para a população brasileira. Neste sentido, a prática de exercício físico pode evitar ou retardar o surgimento desta enfermidade. Embora sejam frequentemente relatados muitos efeitos benéficos do treinamento físico regular no tratamento do DM2, poucos estudos são encontrados relacionando os efeitos imediatos (agudos) de uma sessão de exercício sobre a homeostase glicêmica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao teste de tolerância à glicose em ratas submetidas ao exercício em diferentes intensidades e temperaturas. Neste estudo foram utilizadas 32 ratas Wistar, randomizadas em 6 grupos experimentais para a comparação de condições de repouso em água a 30°C ou 40°C ou natação com 4% ou 8% de carga referente ao peso corporal dos animais por 20 minutos. Foram mensuradas concentrações de lactato sanguíneo e temperatura corporal. Após 4hs do término do exercício, foi realizado teste de tolerância à glicose (do inglês Glucose Tolerance Test - GTT). Os animais foram mortos imediatamente após o término do GTT (6h após o término do exercício) para coleta dos tecidos (fígado, pâncreas e músculo gastrocnêmio). Foi mensurada peroxidação lipídica através da técnica de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) para avaliação do dano oxidativo do músculo gastrocnêmio, fígado e pâncreas. Os resultados sugerem que a exposição aguda a temperaturas elevadas (40°C) leva a menor captação de glicose periférica, e maior dano oxidativo muscular, no entanto, esses efeitos não ocorrem em animais que realizaram exercício físico. Assim, concluímos que uma única exposição ao calor leva ao aumento de dano oxidativo muscular e uma menor captação de glicose periférica, porém esses efeitos não ocorrem em animais que realizaram exercício físico moderado ou intenso, mesmo no calor.
ABSTRACT E KEYWORDS
The incidence of Type 2 diabetes mellitus (DM2) has reached epidemic proportions, requiring high economic and social cost to the Brazilian population. In this sense, the practice of physical exercise can prevent or delay the onset of this disease. Although frequently reported many beneficial effects of regular exercise training in the treatment of DM2, few studies are found about the (acute) immediate effects of exercise on the glycemic homeostasis. The aim of this study was to evaluate the glucose tolerance test response in rats submitted to exercise at different intensities and temperatures. Wistar rats (n=32) were randomized into 6 experimental groups: resting conditions or swimming exercise with 4% or 8% of load applied to the animals' body weight for 20 minutes was used, in water at 30°C or 40°C. Blood lactate concentrations and body temperature were measured. Four hours after of the exercise or rest in 30° or 40°C, was conducted glucose tolerance test (Glucose Tolerance Test - GTT). The animals were killed immediately after the GTT for collection of tissues (liver, pancreas and gastrocnemius muscle). Gastrocnemius muscle, liver and pancreas lipid peroxidation level was measured by Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS). The results suggest that acute exposure to elevated temperatures (40°C) leads to a lower peripheral glucose uptake and increased muscle oxidative damage, however, these effects do not occur in animals that do physical exercise. Thus, we conclude that a single exposure to heat leads to increased muscle oxidative damage and reduced peripheral glucose uptake, but this effect did not occur in animals that performed moderate or strenuous exercise, even in the heat.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Resposta ao Teste de tolerância à glicose de ratas após 20 minutos de repouso ou exercício em diferentes temperaturas da água...37 Figura 2. Área incremental sob a curva do teste de tolerância a glicose em ratas Wistar após 20 minutos de exercício de natação em diferentes intensidades em diferentes temperaturas da água...38 Figura 3. Temperatura corporal de ratas Wistar medida antes e após 20 minutos de exercício ou respouso em diferentes temperaturas da água...40 Figura 4. Concentração de lactato sanguíneo em ratas Wistar após 20 minutos de exercício de natação em diferentes intensidades em diferentes temperaturas da água...41 Figura 5. Avaliação da lipoperoxidação do músculo gastrocnêmio, fígado e pâncreas de ratas Wistar após 20 minutos de natação em diferentes intensidades em diferentes temperaturas...43 Figura 6. Fotos ilustrativas das fases do ciclo estral observadas nas ratas deste estudo...44
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP ... Trifosfato de Adenosina DM1 ... Diabetes Mellitus Tipo 1 DM2 ... Diabetes Mellitus Tipo 2 CAT ... Enzima Catalase
CK ... Enzima Creatina Quinase EO ... Estresse Oxidativo
ERO ... Espécies Reativas de Oxigênio FC ... Frequência Cardíaca
GLUT4 ... Transportadores de Glicose Tipo 4 GPX ... Enzima Glutationa Peroxidase
GTT ... Teste de Tolerância à Glicose (Glucose Tolerance Test) LPO ... Lipoperoxidação
PBS ... Salina tamponada com fosfato (phosphate buffer saline) TBARS ... Teste das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...11
2. REFERENCIAL TEÓRICO...14
2.1 Controle Glicêmico...14
2.2 Papel do Exercício no Controle Glicêmico...16
2.3 Estresse Oxidativo...18
2.4 Exercício Físico e Estresse Oxidativo...20
2.5 Fatores que Influenciam a Resposta do Organismo ao Exercício Físico...21
2.5.1 Intensidade...21
2.5.2 Temperatura...23
2.5.3 Ciclo Estral...25
2.6 Efeito do Exercício Agudo em Diferentes Temperaturas Sobre a Glicemia...27
3. OBJETIVOS...30 3.1 Objetivo Geral...30 3.2 Objetivos Específicos...30 4. MATERIAIS E MÉTODOS...31 4.1 Caracterização da Pesquisa...31 4.2 Local de Realização...31 4.3 Animais...31
4.4 Adaptação ao Meio Líquido...32
4.5 Determinação da Fase do Ciclo Estral...32
4.6 Exercício Físico Agudo e Repouso...33
4.7 Dosagem de Lactato Sanguíneo...33
4.8 Temperatura dos Animais...34
4.10 Preparação dos Tecidos...34
4.11 Dosagem de Proteínas e TBARS...35
4.12 Análise Estatística...35
5. RESULTADOS...36
6. DISCUSSÃO...45
7. CONCLUSÃO...49
1. INTRODUÇÃO
A incidência de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) atinge proporções epidêmicas, demandando um alto custo, econômico e social para a população brasileira. Nesse sentido, muita atenção tem sido aplicada aos diferentes níveis preventivos e no tratamento da doença, sendo a prevenção primária de interesse mais recente e enfoque das atuais diretrizes, com finalidade de impedir o aparecimento da doença. A Organização Mundial da Saúde (OMS) cita ainda um último nível de prevenção, o primordial, que objetiva evitar o surgimento de fatores de risco para DM2 (DIABETES, 2006).
A resistência à insulina é a condição na qual o organismo produz insulina, mas está resistente aos seus efeitos metabólicos, ou seja, a célula não responde de maneira adequada aos sinais endócrinos da insulina. Sendo assim, tecidos musculares, células de gordura e células do fígado não respondem adequadamente a ação insulina. Como resultado, o organismo necessita de mais insulina para que as respostas celulares ao hormônio sejam efetivos no organismo, dentre eles, estimular a captação de glicose pelas células através dos transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4). Portanto, indivíduos com resistência a insulina, têm ao mesmo tempo, altos níveis de glicose e insulina na circulação sanguínea (NIDDK, 2008).
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento de DM2 são o sedentarismo e a obesidade. A prática de exercício físico regular pode evitar ou retardar o surgimento da doença por influenciar diretamente em ambos (UMPIERRE
et al., 2011), por promover aumento de gasto energético, possui relação estreita com
a diminuição do risco do indivíduo desenvolver DM2, sendo que, quanto maior o nível de atividade física (frequência de realização de sessões de exercício) menor este risco (DIABETES, 2006), representando portanto uma estratégia terapêutica não farmacológica bastante eficaz.
Embora sejam frequentemente relatados muitos efeitos benéficos do treinamento físico regular, no tratamento do DM2 (YOUNG et al., 1989; RICE et al., 1999; LIN et al., 2011; UMPIERRE et al., 2011), poucos estudos são encontrados relacionando os efeitos imediatos (agudos) de uma sessão de exercício sobre o controle glicêmico (ROGERS, 1989; VENABLES et al., 2007; MCCLEAN et al.,
2009). Além disso, é atual a discussão sobre qual a modalidade de exercício (MITCHELL et al., 2011; SINGH JOY, 2011), a ser realizada, para que seja promovido benefícios metabólicos. Embora agudamente o exercício melhore a sensibilidade à insulina em indivíduos saudáveis e em pessoas resistentes a mesma (HEAT et al.1983; MIKINES et al.,1988), muitas dúvidas surgem sobre a intensidade do exercício a ser prescrita tanto para indivíduos saudáveis quanto para indivíduos com DM2 (DIABETES, 2007).
No intuito de elucidar estes aspectos, muitos modelos de estudos com animais são utilizados (SHIMA et al., 1997; SEARLS et al., 2004; KIRALY et al., 2007). Um dos pontos mais relevantes da utilização de animais (roedores) para o estudo do exercício é a similaridade fisiológica apresentada por esses animais, quando comparadas a humanos, submetidos a exercício agudo ou crônico. Além dos estudos da relação entre tipos diferentes de exercício, frequência de atividade e duração das sessões, atualmente busca-se um aprimoramento nos conceitos sobre a relação entre a intensidade de exercício e os benefícios do mesmo (YONG et al., 1989; STRACZKOWSKI et al., 2000; KIRALY et al., 2007). A relação entre os benefícios e a intensidade do exercício físico, estudada em modelo experimental de natação, sugere a existência de um ponto ótimo de intensidade para promover benefícios ao organismo (HECK, 2011; HECK et al., 2011).
A maioria dos estudos experimentais de exercício físico utiliza ratos machos em modelo de esteira ou de natação com água a 30°C, por ser considerada uma temperatura adequada para a prática de natação com modelos animais pela maioria dos autores (GOBATTO et al., 2001; VOLTARELLI et al., 2002; VOLTARELLI et al., 2005; VITORINO et al., 2010). No entanto, nesta temperatura da água pode ocorrer hipotermia imediatamente após uma sessão de exercício físico (HECK, 2011) o que sugere ser necessário o uso de temperatura mais elevada, sobretudo em fêmeas, que possuem a temperatura corporal basal mais elevada do que os machos. Além disso, estudos em fêmeas permitirão melhor compreensão da relação entre os efeitos do exercício físico com a ampla variabilidade das respostas celulares dependentes do status hormonal de cada fase do ciclo estral dos animais.
Durante o exercício físico agudo o consumo de oxigênio pode aumentar de 10 a 20 vezes em níveis sistêmicos, que resulta na ativação de vias metabólicas
específicas, desencadeando a formação de radicais livres de oxigênio, também conhecidos como espécies reativas de oxigênio (ERO) (HALLIWELL et al., 1999). O desequilíbrio entre a produção e remoção das ERO leva ao processo denominado estresse oxidativo (EO), sendo que, um dos principais mecanismos de lesão gerado pelo EO é a lipoperoxidação, ou seja, a oxidação da camada lipídica da membrana celular, ou o dano gerado à proteínas e ao DNA, provocando diversas alterações na função celular e, portanto tecidual (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004).
A partir de dados apontados pela literatura, pode-se dizer que existe estreita relação entre exercício físico, estresse oxidativo e estresse térmico (RODRIGUES et al., 2003; NETTO JR. et al., 2007). Durante a prática de exercícios físicos uma significativa quantidade de calor é gerada pelo organismo como subproduto do metabolismo energético e a alteração do estado de equilíbrio entre produção de ERO e sua remoção pelos sistemas antioxidantes celulares podem ser potencializadas em ambientes com temperaturas elevadas (ADACHI et al., 2009).
Embora o tratamento térmico (CHUNG, 2008), a realização de exercício físico regular (RODRIGUES et al., 2003) e o estresse sejam fatores que modificam o controle glicêmico, a associação entre estes não está completamente elucidada. Em função disso, o objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos de diferentes intensidades de exercício físico em diferentes temperaturas da água, na glicemia de ratas Wistar (Rattus norvegicus) sedentárias durante o teste de tolerância a glicose e avaliar o dano oxidativo muscular destes animais.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Controle Glicêmico
Fisiologicamente todas as funções do corpo humano são permanentemente controladas, por dois grandes sistemas que atuam de forma integrada: sistema nervoso e sistema endócrino (CANALI; KRUEL, 2001). Ambos são responsáveis pelo controle de várias funções (cardiovascular, renal, metabólica, etc.), e são estruturados para receber informações, organizar uma resposta adequada e, em seguida, enviar a mensagem aos órgãos ou tecidos apropriados. Frequentemente, os dois trabalham em conjunto para manter a homeostase, mas diferem na maneira como a resposta é enviada. Enquanto o sistema endócrino libera hormônios na corrente sanguínea para efetuar uma resposta ao tecido alvo, o sistema nervoso utiliza neurotransmissores para a transmissão de mensagens em vias neurais específicas (POWERS; HOWLEY, 2000).
A manutenção dos níveis estáveis da glicemia é resultado da coordenação de fatores que regulam a liberação de glicose e a sua remoção da circulação, estes são: produção de glicose, proporção de glicose ingerida na dieta, demanda metabólica, captação de glicose nos tecidos (tecido muscular, adiposo e demais tecidos) e ação hormonal (VALLE, 2002). Concentrações sanguíneas em jejum <100 mg/dl são consideradas normais, >100 a <126 mg/dl é considerada tolerância a glicose diminuída e >126 mg/dl é diabetes (DIABETES, 2009).
A Sociedade Brasileira de Diabetes (2009) usa como parâmetro para o diagnóstico de diabetes níveis da glicemia de jejum, e, considera normal a glicemia entre 70mg/dl e 99mg/dl e inferior a 140mg/dl 2 horas após o teste de tolerância à glicose.
Alguns hormônios como insulina, glucagon, cortisol, adrenalina e noradrenalina desenvolvem importante papel no controle glicêmico. Os hormônios insulina e glucagon produzem ações opostas em relação à mobilização da glicose hepática e dos ácidos graxos livres do tecido adiposo. A insulina tem papel na captação e no armazenamento de glicose e de ácidos graxos livres, enquanto que o
glucagon é um dos responsáveis pela mobilização desses substratos (SPRAGUE; ARBELÁEZ, 2011).
Ambos são produzidos no pâncreas, especificamente nas células beta (β) e alfa (α) nas ilhotas de Langerhans. O pâncreas contém milhares de ilhotas de
Langerhans, cada uma delas tendo dimensões inferiores a 1mm. As ilhotas são
formadas por vários tipos de células, sendo as mais importantes às células β e as células α (GUYTON, 1988).
A insulina é um importante hormônio durante o estado de absorção, quando os nutrientes passam do intestino delgado ao sangue. Ela estimula os tecidos a captar moléculas de nutrientes, como a glicose e os aminoácidos, e a estocá-los sob a forma de glicogênio, proteínas e gorduras. O principal papel da insulina é a facilitação da difusão da glicose através das membranas celulares, e a falta de insulina, provoca acúmulo de glicose no plasma, uma vez que os tecidos não conseguem captá-la (POWERS; HOWLEY, 2000).
A secreção de glucagon aumenta em resposta a uma baixa concentração plasmática de glicose. Este hormônio estimula tanto a mobilização dos estoques hepáticos de glicose (glicogenólise) quanto os ácidos graxos livres no tecido adiposo. Junto com o cortisol, o glucagon estimula a degradação de proteínas teciduais para formar aminoácidos, que são então utilizados pelo fígado para formar glicose (gliconeogênese) (POWERS; HOWLEY, 2000).
O cortisol é considerado o principal hormônio glicocorticóide secretado pelo córtex adrenal. Ele têm um efeito direto no fígado, onde estimula a gliconeogênese que, por sua vez, eleva os níveis sanguíneos de glicose. No tecido adiposo, o cortisol e a adrenalina, estimulam a degradação de lipídios em ácidos graxos e glicerol (lipólise) (GARRETT JR; KIRKENDALL et al., 2003). A adrenalina também tem um efeito inibitório sobre a liberação de insulina e um efeito excitatório sobre a liberação de glucagon. Assim, os efeitos da adrenalina sustentam os níveis sanguíneos de glicose (GARRETT JR; KIRKENDALL et al., 2003).
Nos vários tipos de célula do corpo humano, o transporte de glicose relaciona-se com suas necessidades desrelaciona-se substrato. A glicorelaciona-se é transportada na maioria das
células por difusão facilitada, através de proteínas transportadoras presentes na membrana plasmática. Está caracterizada a existência de uma família de transportadores (GLUT1-GLUT7), com características funcionais e distribuição tecidual distinta (MACHADO, 1998).
A proteína GLUT4 expressa quase que exclusivamente nos músculos cardíaco e esquelético e no tecido adiposo, branco e marrom, é denominado transportador de glicose dependente de insulina. Além disso, em tecidos musculares de ratos, o GLUT4 é translocado para a membrana plasmática sob influência da contração muscular, podendo ser denominado transportador de glicose regulado pela insulina e contração muscular (PEREIRA; SOUZA JR., 2007).
Quando há um distúrbio no metabolismo, elevando os níveis estáveis da glicemia, causando hiperglicemia, caracteriza-se à doença metabólica diabetes
mellitus. Esta é uma doença inflamatória das ilhotas de Langerhans, que dá início ao
diabetes tipo I (DM1), bem como, a doença inflamatória do tecido adiposo, que dá origem às complicações e à própria instalação do diabetes tipo II (DM2) (CURI, 2010). DM1 é causada pela destruição das células β pancreáticas, e, nesse caso o portador é dependente de insulina exógena para regular o controle glicêmico. Já o DM2 é caracterizado pela resistência à ação da insulina, geralmente associado à obesidade (ZABAGLIA et al., 2009).
2.2 Papel do Exercício Físico no Controle Glicêmico
O exercício físico serve de estímulo para a secreção de determinados hormônios e de fator inibitório para outros (CANALI; KRUEL, 2001), tais ações são necessárias na busca por manter o controle do ambiente interno e fornecimento de substratos energéticos para esforço realizado (WILMORE; COSTIL, 2001). O tipo de substrato e a velocidade com que ele é utilizado no exercício dependem, em grande parte, da intensidade e duração do esforço e pode ser caracterizado por uma sequência de três fases, onde os substratos energéticos predominantes são: glicogênio muscular, glicose e ácidos graxos livres circulantes (KANG et al., 1999).
Para que o organismo satisfaça o aumento da demanda energética do exercício, deve haver mais glicose disponível para os músculos. Quatro hormônios atuam para aumentar a quantidade de glicose circulante no plasma: glucagon, adrenalina, noradrenalina e cortisol. A concentração plasmática de glicose durante o exercício depende de um equilíbrio entre a sua captação pelos músculos e sua liberação pelo fígado (SPRAGUE; ARBELÁEZ, 2011).
Durante o exercício, devido à atividade muscular, a secreção de glucagon e catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) aumentam. Ambos atuam em conjunto para o aumento da glicogenólise. O cortisol, também com concentrações aumentadas durante o exercício, aumenta o catabolismo proteico, liberando aminoácidos para serem utilizados pelo fígado no processo de gliconeogênese. Por tanto, esses quatro hormônios podem aumentar a quantidade de glicose plasmática pelo aumento da glicogenólise e da gliconeogênese (CANALI; KRUEL, 2001; WILMORE; COSTIL, 2001).
A disponibilização de quantidades suficientes de glicose fornecida pelo tecido hepático, não garante que as células musculares terão glicose suficiente para suprir suas demandas energéticas. As células musculares devem ser capazes de captar a glicose disponível na corrente sanguínea. Em repouso, essa tarefa depende fundamentalmente da insulina, que tem o importante papel de facilitar o seu transporte para o interior das fibras musculares (WILMORE; COSTIL, 2001).
Já no exercício, a concentração de insulina diminui e essa é uma resposta que visa favorecer a mobilização da glicose hepática e dos ácidos graxos livres do tecido adiposo, ambos necessários para manter a concentração plasmática de glicose (POWERS; HOWLEY, 2000) para os músculos em atividade, que ativam o GLUT4 pela contração muscular, e assim capta glicose independente da presença de insulina, efeito desejável, por exemplo, no combate ao diabetes (POWERS; HOWLEY, 2000).
Por promover maior captação de glicose pela musculatura esquelética, uma única sessão de exercício físico promove aumento da disposição de glicose mediada pela insulina em sujeitos normais, indivíduos com resistência a insulina, diabéticos
tipo 2 e obesos com resistência à insulina (ERIKSON et al., 1997; KAHN et al., 1990; MILLER et al., 1994).
Para melhor compreender o papel do exercício físico no controle da glicemia, alguns fatores são importantes e devem ser abordados, como a intensidade, temperatura e o metabolismo de espécies reativas de oxigênio, onde todos serão contemplados neste trabalho.
2.3 Estresse Oxidativo
O organismo humano, em consequência da vida aeróbia, produz continuamente radicais livres de oxigênio, substâncias conhecidas simplesmente como radicais livres (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004). O termo radical livre designa de um átomo ou grupo de átomos com um elétron desemparelhado, isto é, um elétron ímpar em sua órbita mais externa, o que lhe confere um caráter altamente reativo e com um tempo de vida incrivelmente fugaz, da ordem de milésimos de segundo.
O aumento dessas moléculas no organismo tem sido constantemente relacionado a várias doenças como enfisema pulmonar, doenças inflamatórias, aterosclerose, câncer, diabetes, insuficiência cardíaca (IC), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e também ao envelhecimento (MENEGUINI, 1987; SOUTHORN & POWIS, 1988).
Os radicais livres de oxigênio também estão associados a importantes situações de utilidade ao organismo, exemplo disso é quando há necessidade de ativação do sistema imunológico; e também no relaxamento dos vasos sanguíneos através do óxido nítrico (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004).
O desequilíbrio entre a produção e remoção das espécies reativas de oxigênio (ERO) causa o estresse oxidativo (HALLIWEL; GUTTERIDGE, 1999), circunstâncias nas quais o desafio por radicais livres resulta em dano tecidual ou produção de compostos tóxicos danosos aos tecidos, onde o principal mecanismo de lesão é a lipoperoxidação (LPO), que é a oxidação da camada lipídica da
membrana celular, além de poder gerar também danos a proteínas e ao DNA (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004).
A LPO é o processo através do qual as ERO agridem os ácidos graxos polinsaturados dos fosfolipídeos de membranas das células, desintegrando-as (HALLIWEL; GUTTERIDGE, 2007).
Para amenizar os efeitos das ERO, os organismos, ao longo da evolução, têm desenvolvido efetivos sistemas antioxidantes, onde todas as células possuem mecanismos próprios de defesa para seus efeitos agressores (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004).
Os antioxidantes biológicos podem exibir dois modos de ação distintos contra as ERO, atuando como inibidores da síntese de ERO ou como inativadores das espécies já formadas (HECK, 2007). As defesas antioxidantes celulares são convencionalmente divididas em dois grupos: enzimáticas e não enzimáticas.
O sistema de defesa enzimático inclui as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX) (JI, 1999). O sistema não enzimático inclui compostos sintetizados pelo organismo humano como bilirrubina, melatonina, coenzima Q, ácido úrico, e outros ingeridos através da dieta regular ou via suplementação como ácido ascórbico, α-tocoferol e grupos fenóis de plantas (flavonóides) (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004).
Em situação de homeostase, normalmente as enzimas antioxidantes presente nos tecidos são suficientes para controlar a atividade oxidativa (VOLLAARD et al., 2005), mas, quando o exercício físico é realizado, ocorre o aumento do consumo de oxigênio nas células, o qual é diretamente proporcional à formação de ERO (BANERJEE et al., 2003). Em indivíduos não treinados, os tecidos não são capazes de debelar tal demanda oxidativa (FISHER-WELLMAN et al., 2009), podendo gerar processo inflamatório no organismo devido ao estresse oxidativo (VAN HELVOORT et al., 2005).
O exercício físico está relacionado ao estresse oxidativo de duas maneiras: por um lado ele é capaz de acelerar o metabolismo oxidativo gerando maior formação de radicais livres, por meio de ativação de diferentes vias metabólicas, e, por outro, também é capaz de produzir um efeito protetor antioxidante, gerado através de sessões regulares (treinamento) (MOLLER et al., 1996). O treinamento então é capaz de promover uma adaptação ao sistema de defesa antioxidante, protegendo contra potenciais danos oxidativos devido às repetidas exposições das células musculares ao estresse oxidativo (SILVA et al., 2010; FREDERICO et al., 2009; COELHO et al., 2010).
Os mecanismos de geração de ERO durante o exercício físico ocorrem em diversos compartimentos celulares, tais como, mitocôndrias, membranas e citoplasma (TROMM, 2013). Na mitocôndria, uma das formas de produção de ERO durante o exercício é devido a um escape de elétrons na cadeia de transporte de elétrons. O escape de elétrons entre o complexo I e ubisemiquinona e entre ubisemiquinona e o complexo III parecem ser os responsáveis pela maior parte dos superóxidos (O2⦁-) gerados (BOVERIS; CHANCE 1973). Estima-se que de 2 a 4% do oxigênio consumido por seres humanos seja reduzido a O2⦁- por mitocôndrias (HALLIWEL; GUTTERIDGE, 2007).
Nos últimos anos pesquisas têm demonstrado que a formação de radicais livres é a maior causa da lesão tecidual muscular associada ao exercício físico rigoroso (JENKINS, 1988; MEYDANE & EVANS 1993).
No entanto, o organismo treinado pode obter a redução dos efeitos das ERO quanto aos danos no DNA de leucócitos circulantes após exercício exaustivo em esteira quando comparado com indivíduos não treinados (NIESS et al., 1996). Husain (2005) também mostrou que a adaptação do treinamento em animais, esse mesmo efeito foi observado.
Alessio (1993) cita um aumento de LPO em fibras musculares lentas e rápidas de ratos submetidos a cargas de exercício, indicando um aumento do estresse oxidativo induzido pela atividade. Este estresse era mais bem tolerado por ratos treinados, sugerindo uma adaptação dos sistemas oxidantes. No entanto, as
adaptações ao treinamento parecem ser dependentes da intensidade, do volume do treinamento e do tecido específico (SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004).
Como intervenção não farmacológica, o exercício físico auxilia no aporte de glutamina (cujos estoques fisiológicos ficam comprometidos nestas situações inflamatórias) evitando que os estoques caiam ainda mais. Como a glutamina é utilizada pelas células em questão para a síntese de glutationa (GSH), principal proteção antioxidante solúvel de células β pancreáticas, o resultado é que o exercício físico pode evitar que as células β morram por ação nociva do excesso de óxido nítrico (NO) (HELLSTEN et al., 2007; SILVEIRA et al., 2007; HUNG et al., 2008), demonstrando ser uma importante intervenção na prevenção do diabetes.
2.5 Fatores que Influenciam a Resposta do Organismo ao Exercício Físico
2.5.1 Intensidade
Independente do contexto no qual o exercício físico seja realizado, na promoção e prevenção da saúde ou no alto rendimento, existe a necessidade de se quantificar a intensidade do exercício realizado na busca por prescrições mais adequadas de cargas de sessão e/ou treinamento. Alguns métodos podem ser usados como marcadores da intensidade durante o exercício físico, os quais refletem parâmetros fisiológicos e bioquímicos, como consumo de oxigênio máximo (VO2 máx.), frequência cardíaca (FC), níveis séricos de cretina quinase (CK) e de lactato sanguíneo.
Para se estudar a produção de lactato pelo exercício físico utiliza-se normalmente o exercício com intensidade aumentada progressivamente. Nesse caso, a concentração sanguínea de lactato aumenta gradualmente no começo e, mais rapidamente, à medida que o exercício torna-se mais intenso (PEREIRA; SOUZA JR., 2007).
A utilização das concentrações sanguíneas de lactato é constantemente adotada como marcador de intensidade de exercício tanto em humanos, quanto em modelos animais (HECK et al., 1985; HOLLMANN, 2001). As concentrações deste
elemento/substância permite avaliar a predominância da participação do sistema aeróbio/anaeróbio, refletindo qual a intensidade realizada em resposta a uma sessão de exercício: aguda ou crônica (LAURSEN et al., 2002; WELLS, 2009), demonstrando assim, sua importância na predição do exercício físico e as respostas metabólicas ao esforço realizado.
Na realização de exercício físico de alta intensidade por períodos prolongados, sem a presença de oxigênio celular, utiliza-se a rota metabólica anaeróbia lática, onde existe formação de lactato sanguíneo (SPRIET et al., 2000). Este processo ocorre devido ao aumento da demanda metabólica em produzir ATP. As quantidades de elétrons liberadas no citoplasma da célula se sobrepõem à capacidade que o transportador de elétrons NAD apresenta em transportá-los e processá-los no sistema transportador de elétrons (STE) (RIEGEL,1998). No final desta reação, o produto final se dará em ácido pirúvico. O destino deste, produzido durante a glicólise depende da disponibilidade de oxigênio. Se o oxigênio é raro então o ácido pirúvico é reduzido a ácido láctico (lactato). À medida que é produzido ácido láctico, ele rapidamente se difunde para fora da célula e entra na corrente sanguínea. As células do fígado (hepatócitos) removem o ácido láctico do sangue e o convertem de volta em ácido pirúvico (TORTORA; GRAMBOWSKI, 2000).
Estudos clássicos (HERMANSEN & STENSVOLD, 1972; BONEN & BELCASTRO, 1976) mostraram que a recuperação ativa, com intensidade entre 25-65% do VO2max (BONEN & BELCASTRO, 1976), realizada após exercícios de alta intensidade, aumenta a velocidade de remoção do lactato do músculo e da circulação, em relação ao repouso passivo.
Neste trabalho buscaremos identificar as diferentes intensidades do exercício físico realizado através da mensuração de lactato sanguíneo.
2.5.2 Temperatura
O estresse do esforço físico frequentemente é complicado pelas condições térmicas ambientais. Alterações ambientais extremas podem gerar estresse ao organismo, podendo causar danos irreparáveis e/ou até a morte, enquanto
alterações moderadas podem modificar capacidades fisiológicas e influenciar no crescimento, reprodução ou na interatividade social (HECK, 2011).
Os seres vivos têm mecanismos que controlam a temperatura corporal. Estes são receptores sensoriais (termorreceptores) que em qualquer alteração de temperatura comunicam o hipotálamo a ativar mecanismos que regulam o aquecimento ou o resfriamento do corpo (WILMORE; COSTIL, 2001).
Os seres humanos são homeotermos, significando que sua temperatura corporal interna é mantida quase constante durante a vida. Embora sua temperatura possa variar no dia-a-dia, essas flutuações geralmente são inferiores a 1°C (WILMORE; COSTIL, 2001).
No homem a temperatura corporal basal é de aproximadamente 37°C, mas segundo dados clínicos podem variar de 35,6°C a 38,2°C (MACKOWIAK et al., 1997) em diferentes horários ao longo do dia (HECK, 2011). Em ratos machos a temperatura corpórea varia entre 35,9 e 37,5°C (GUIMARÃES; MÁZARO, 2004). Já em fêmeas a temperatura corporal se mostra acima dos machos da mesma espécie, variando entre 37,1°C e 39,9°C (KOSTRYCKI et al., 2012).
Durante a realização de exercícios físicos, uma quantidade de calor é gerada pelo organismo como subproduto do metabolismo energético (HECK, 2011). Em resposta, o sistema nervoso produz alterações fisiológicas e metabólicas como aumento da frequência cardíaca, débito cardíaco, e, respostas hormonais (AFONSO et al., 2003). Essas ações aumentam a perda de calor corporal e minimizam o aumento da temperatura. A perda de calor do corpo pode ocorrer por quatro processos: (1) radiação, (2) condução, (3) convecção e (4) evaporação, este último o meio mais eficaz na perda de calor durante o exercício (POWERS; HOWLEY, 2000). O exercício contínuo em ambientes quentes representa um desafio particularmente estressante para a manutenção da temperatura corporal normal e da homeostase de fluídos (POWERS; HOWLEY, 2000). Nessas situações, respostas como aumento da frequência cardíaca, débito cardíaco, aumento da temperatura interna e cutânea ocorrem quando comparados com o mesmo exercício em ambiente de temperatura moderada (NETTO JR, et al., 2007). O efeito combinado
da perda líquida e da temperatura central elevada aumenta o risco de ocorrência de hipertermia por esforço e podem levar os sistemas fisiológicos aos seus limites (PIRES et al., 2013).
Em decorrência da perda acentuada de líquidos corporais, um dos aspectos importantes dos ajustes circulatórios é a modificação de perfusão sanguínea, direcionando do centro para região periférica, mecanismo que ocorre através de vasodilação do sistema arterial e venoso periférico, consequentemente gerando vasoconstrição de outras regiões como fígado, rins e músculo utilizados durante o exercício (LAMB, 1985). A redistribuição sanguínea pode gerar uma sobrecarga no sistema cardiovascular, aumentando a frequência cardíaca, e interferindo diretamente na capacidade de desempenho do indivíduo.
Já em ambientes frios, a maior parte do calor corporal perdido ocorre por meio dos mecanismos de condução e de convecção, assim, quando a temperatura ambiente é menor do que a temperatura corporal, o gradiente térmico resultante favorece a perda de calor corporal (GARRETT JR; KIRKENDALL et al., 2003).
A exposição ao frio promove vasoconstrição, resultando em diminuição do fluxo sanguíneo periférico e reduzindo a transferência de calor por convecção entre o interior e a periferia do corpo. A vasoconstrição em humanos começa quando a temperatura da pele cai a valores inferiores a 35°C e torna-se máxima quando a temperatura está ao redor de 31°C ou menos (VEICSTEINAS et al., 1982). A vasoconstrição causada pela exposição ao frio retarda a perda de calor e contribui para a conservação da temperatura interna, mas às custas da diminuição da temperatura tecidual periférica (GARRETT JR; KIRKENDALL et al., 2003).
No meio líquido existe maior capacidade térmica do que o ar, e o poder de resfriamento desse ambiente é muito favorecido sob condições de baixa temperatura. Durante a imersão na água, a transferência de calor condutivo e conectivo pode ser 70 vezes maior do que no ar sob mesma temperatura (GAGGE; GONZALEZ, 1996), dependendo da profundidade, da superfície corpórea e do nível metabólico individual (LEE et al., 1997). Dessa forma inclusive quando a temperatura da água é razoável, o organismo pode perder uma considerada quantidade de calor.
No meio aquático, os mecanismos reguladores da temperatura corporal atuam da mesma forma que em outro ambiente, ressaltando-se que há acentuação nas respostas fisiológicas devido à diferença de temperatura ambiental à corporal, podendo haver perda intensa de temperatura em ambiente aquático frio e aumento de temperatura corporal devido ao ambiente de calor (BATES; HANSON, 1998).
O exercício físico, como já foi detalhado neste texto, é capaz de produzir espécies reativas de oxigênio (ERO) (SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004), e como visto neste tópico, durante a prática de exercícios físicos uma quantidade significativa de calor é gerada pelo organismo como subproduto do metabolismo energético (HECK, 2011). Assim, existem evidências de uma estreita relação entre exercício físico, estresse oxidativo e estresse térmico gerado por temperaturas elevadas (RODRIGUES, et al., 2003).
2.5.3 Ciclo Estral
O ciclo reprodutivo é composto por uma série de alterações morfológicas que ocorrem tanto no ovário para a produção dos gametas, quanto no útero para a formação de um ambiente favorável à implantação do embrião (UZUELLI, 2006).
A partir da produção do hormônio liberador de hormônio luteinizante (LHRH) no hipotálamo, a hipófise é estimulada a produzir os hormônios luteinizantes (LH) e folículo estimulante (FSH), que acionam o ovário a produzir o estradiol e progesterona, estes, fazem o útero sofrer alterações endometriais de maneira cíclicas e marcantes (UZUELLI, 2006).
O período de variação dos níveis hormonais é conhecido na maioria das espécies de mamíferos como ciclo estral, cuja duração varia segundo a espécie (BAIRD et al., 1975).
Detalhadamente, o ciclo estral das ratas, dura de quatro a cinco dias e tem quatro fases, denominadas: Estro, Metaestro, Diestro e Proestro (LONG & EVANS, 1922; YOUNG et al., 1945). O Estro corresponde à ovulação e nesta fase a progesterona encontra-se em seu nível máximo. As células da vagina
apresentam-se cornificadas, com intensa descamação. O Metaestro corresponde à faapresentam-se entre os ciclos, na qual não há ação hormonal identificável e as células vaginais se mostram diversificadas. O Diestro corresponde à ação inicial do estradiol sobre o organismo, com níveis de estradiol correspondentes à metade da taxa máxima, sendo que as células da vagina não apresentam descamação e há grande número de leucócitos. O Proestro corresponde ao pico da ação do estradiol, com as células da vagina apresentando-se grandes e nucleadas, sem leucócitos (GOUVEIAet. al.,2002).
Hormônios sexuais femininos como o estradiol e a progesterona liberados durante o exercício físico ou em situações de estresse ativam e/ou influenciam algumas respostas metabólicas (BIANCHI, 2004). Kendrick & Ellis (1991) mostraram o efeito do estradiol no metabolismo de glicogênio em ratas submetidas ao estresse. A administração de estradiol por cinco dias diminuiu a utilização de glicogênio tecidual comparada a ratas castradas sem suplementação, evidenciando que outra forma de energia estaria sendo utilizada. Níveis elevados de estrógeno resultam em uma redução na utilização do glicogênio muscular, provavelmente por um aumento do metabolismo lipídico (HACKNEY, 1999). Já foi demonstrado que células de gordura (adipócitos) apresentam receptores para esteroides sexuais, o que evidencia a participação destes hormônios no controle da lipólise e lipogênese (GRAY et al., 1985; REBUFFE-SCRIVE, 1987; PEDERSEN et al., 1996). Mulheres submetidas a exercício físico oxidam mais lipídios e menos carboidratos que
homens, assim, apresentam menor utilização do glicogênio muscular
(TARNOPOLSKY & RUBY, 2001).
Existem estudos que mostram a influência da progesterona no metabolismo. Sancho et al. (1988) relataram que a progesterona atua no fígado e ativa a enzima glicogênio fosforilase responsável pela quebra deste polissacarídeo de reserva, tendo um efeito glucagon-símile. Campbell & Febbraio (2002) também encontraram uma diminuição nos receptores de GLUT4 no músculo esquelético em ratas castradas tratadas com progesterona.
A variação hormonal durante o ciclo reprodutivo também pode levar a alterações no metabolismo oxidativo, a partir do momento que esses hormônios possuem comprovada ação sobre enzimas antioxidantes e sobre a formação de radicais de oxigênio e nitrogênio (DURAN et al., 1998).
Hoje existem trabalhos que mostram que o estradiol é o hormônio mais relacionado a mudanças oxidativas que ocorrem nos órgãos chave do ciclo reprodutivo (ZIRKIN ; CHEN, 2000). Essa influência poderia ocorrer através da ação direta, com seus metabólicos gerando radicais, tendo assim um papel pró-oxidante, ou através do controle das vias de transdução de sinal onde exerceria o controle genômico de enzimas antioxidantes e da síntese de antioxidantes endógenos (LIEHR, 2000).
Pelo exposto acima, estudos com fêmeas permitirão melhor compreensão da relação entre os efeitos do exercício físico com a ampla variabilidade das respostas celulares dependentes do status hormonal de cada fase do ciclo estral dos animais.
2.6 Efeito do Exercício Agudo em Diferentes Temperaturas sobre a Glicemia
Atualmente é amplamente divulgado na literatura científica e,
consequentemente nos meios de comunicação em geral, os benefícios gerados por um estilo de vida saudável, tendo como fator de destaque para a obtenção a prática de exercícios físicos (HECK, 2007).
Atividade física é considerada qualquer movimento corporal produzido pelos músculos esqueléticos que resulta em gasto energético acima dos níveis basais. O exercício físico é uma atividade física planejada, estruturada e repetitiva que tem como objetivo final ou intermediário a melhoria ou manutenção da aptidão física (ACSM, 2011).
Estudos relacionando os benefícios do exercício físico de forma aguda (uma única sessão) com melhores prognóstico de doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) têm sido realizados nos últimos anos. O exercício agudo é capaz de provocar diminuição da pressão arterial (FORJAZ et al., 1998) em indivíduos normotensos e hipertensos, fazendo que os níveis pressóricos sistólicos e diastólicos medidos no período pós-exercício permaneçam inferiores àqueles observados no período pré-exercício (WILCOX et al., 1982; BENNETT et al., 1984). Efeitos de hipotensão geradas após uma única sessão de exercício físico podem persistir de 60min (SOMMERS et al., 1991) até aproximadamente 22 horas
subsequentes ao exercício (NEGRÃO et al., 1994). Dependendo do tempo e intensidade da sessão (REBELO et al., 2001).
Muito se tem discutido sobre o benefício do efeito agudo do exercício físico na resistência à insulina. Foi demonstrado que o efeito do exercício pode persistir de 12 a 48 horas sobre a sensibilidade à insulina e que esse efeito não é observado de 3 a 5 dias após a sessão de exercício (BURSTEIN et al., 1985; MIKINIS et al., 1988). Persghin et al. (1996), demonstraram que o efeito de uma sessão de exercício aeróbico (>60% do VO2max) em Aerostep (subida em escada), em indivíduos resistentes a insulina, melhorou a sensibilidade à insulina em 22%. Tal efeito deve-se há mecanismos moleculares que aumentam a atividade dependente de insulina e o número de transportadores de glicose (GLUT- 4) na membrana celular (DOUEN et al., 1990; GOODYER et al., 1990).
Sessões agudas de exercício físico são capazes de modular adaptações do organismo quanto à produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), tais modulações, são dependentes da intensidade e duração de cada sessão (SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004). As reduções completas do oxigênio no sistema de transporte de elétrons mitocondriais ocorrem com 95% do O2, enquanto que o restante é reduzido pelo metabolismo celular formando ERO tanto em repouso como durante o exercício (HECK, 2007). Portanto, o que é alterado durante o exercício é o consumo de O2 por minuto e não a taxa de formação de ERO (SIGNORINI & SIGNORINI, 1993).
Desta forma, podemos relacionar o estresse oxidativo com a intensidade do exercício, uma vez que intensidades moderadas não parecem induzir danos oxidativos ao organismo, diferente do que ocorre com exercício de alta intensidade (SOUZA et al., 2005; ALESSIO, 1993). A correlação existente entre a concentração de lactato sanguíneo, um marcador de intensidade, e a lipoperoxidação lipídica, principal mecanismo de ação dos radicais livres, ambas diminuídas em exercício de baixa intensidade, sugere haver menor dano oxidativo gerado em exercícios submáximos (HECK, 2007).
Já em exercício intenso, quando o organismo não é capaz de manter a condição de equilíbrio, há a instalação de acidose metabólica e um rápido aumento
na respiração mitocondrial (HECK, 2007). Assim, fica clara que quanto maior for à intensidade do exercício físico realizado, mais rápido é o aumento no consumo de oxigênio, levando a maior produção de ERO.
No intuito de elucidar aspectos relacionados ao efeito de diferentes intensidades de exercício físico no controle glicêmico e na formação de dano oxidativo tecidual foi realizado o presente trabalho. Destacamos ainda, que a partir de uma exploração mais aprofundada sobre os temas citados, sobretudo em fêmeas, entendeu-se como pertinente, elaborar um modelo experimental que se investiga tal questão.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos de diferentes intensidades de exercício físico em diferentes temperaturas da água, na glicemia de ratas Wistar (Rattus norvegicus) sedentárias durante o teste de tolerância a glicose e avaliar o dano oxidativo muscular destes animais.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar o efeito do exercício físico realizado em diferentes temperaturas e intensidades quanto:
a) A resposta ao Teste de Tolerância a Glicose;
b) A concentração plasmática de lactato pós - exercício; c) A temperatura corporal dos animais;
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Caracterização da Pesquisa
Este estudo se caracteriza por ser do tipo experimental, o qual envolve a aplicação de tratamentos na tentativa de estabelecer relações de causa e efeito (THOMAS et al., 2007).
Os procedimentos experimentais seguiram as normas éticas brasileiras de manipulação com animais (GOLDIM, 1995). O manejo dos animais obedecerá ao disposto na Lei nº 11.794 de 08/10/2008, na Lei nº 6.899 de 15/07/2009 e nas demais normas aplicáveis à utilização de animais para ensino e pesquisa, especialmente nas resoluções do CONCEA.
4.2 Local e Realização
Este projeto foi realizado no Laboratório de Ensaios Biológicos – Departamento de Ciências da Vida – na Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul (UNIJUÍ), localizada na Rua do Comércio no3000, Bairro Universitário, Ijuí/RS.
4.3 Animais
Foram utilizadas 32 ratas da linhagem Wistar (Rattus norvegicus albinus), entre 12 e 14 semanas de idade, com peso corporal entre 150 e 250g, provenientes do Biotério da UNIJUÍ. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno (33x17x40cm), forradas com maravalha, distribuídos por experimento (6 animais por caixa), temperatura ambiente controlada de 22 ± 2 ºC, umidade relativa do ar entre 50 e 60%, sob iluminação com ciclo de claro/escuro de 12h. Os animais receberam água e ração ad libitum, dieta padrão para ratos de laboratório. Os animais foram mortos com uso de guilhotina, sendo observados os cuidados éticos para minimizar riscos e sofrimentos dos animais. O índice de severidade do protocolo de natação utilizado pode ser considerado como moderado, tendo em vista o desconforto
apenas no momento da realização do exercício tendo em vista que os animais não se exercitaram à exaustão.
4.4 Adaptação ao Meio Líquido
Os animais foram submetidos a um período de adaptação ao meio líquido (natação) por três dias consecutivos, entre 8 e 11 horas da manhã. A adaptação consistiu em manter os animais nadando sem carga por 10 minutos em tanque de natação de vidro (45x45x56cm) com capacidade para quatro animais nadarem simultânea e individualmente (20x20x56cm para cada animal), preenchidos com 45cm de água a 30±1ºC ou 40±1ºC. O procedimento tem como objetivos, adaptar os animais ao meio líquido, para reduzir a ocorrência de estresse durante o experimento. Após adaptação, os animais foram secos e devolvidos a sua respectiva caixa e mantidos sem nenhuma manipulação por 24hs (KOSTRYCKI et al., 2011; HECK, 2011).
4.5 Determinação da Fase do Ciclo Estral
No dia do experimento, foram colhidos esfregaços vaginais para identificação da fase do ciclo estral das ratas participantes. Os esfregaços eram distribuídos em lâminas de vidro, fixados em solução de álcool-éter (1:1) sendo então submetidos à técnica descrita por Shorr (1941).
4.6 Exercício Físico Agudo e Repouso
No exercício físico agudo os animais foram divididos em 6 grupos experimentais, sendo que, 4 animais realizaram exercício simultaneamente (20min de natação em água a 30±1 ou 40±1°C, entre 9h e 10h da manhã) em diferentes intensidades graduadas, por meio de adição de sobrepeso na cauda (chumbos de pesca presos com fita adesiva), relativo ao peso corporal (4 e 8% do peso corporal) perfazendo então os grupos G4 e G8 respectivamente. Animais permaneceram
mantidos em repouso (RE) por 20min em água rasa na mesma temperatura da água (30 ou 40°C) (3 a 5 cm de profundidade) (Tabela 1).
GRUPOS EXPERIMENTAIS
Identificação do grupo RE-30 RE-40 G4-30 G4-40 G8-30 G8-40
Temperatura da água 30°C 40°C 30°C 40°C 30°C 40°C
Profundidade da água 3-5cm 3-5cm 45cm 45cm 45cm 45cm
Carga adicionada à cauda (%relativo ao peso do próprio
animal)
---- ---- 4% 4% 8% 8%
Tempo de exercício/repouso 20min 20min 20min 20min 20min 20min
Número de animais 5 4 5 7 4 7
Tabela 1. Tabela ilustrativa dos grupos experimentais.
4.7 Dosagem de Lactato Sanguíneo
Imediatamente após a sessão de exercício ou repouso foram extraídos ~25 μL de sangue dos animais por punção caudal para medição de lactato sanguíneo. As amostras foram analisadas em lactímetro (Accutrend® Lactate, Roche), sendo expresso em mMol/L de sangue.
4.8 Medida da Temperatura dos animais
Todos os animais foram monitorados quanto à temperatura retal com termômetro retal (TECHLINE) para pequenos animais, sendo a primeira aferição realizada antes do exercício e a última aos 60min após a execução do exercício. A temperatura da água foi medida com termômetro de mercúrio padrão de laboratório
sendo que não houve, em nenhum experimento, perda de temperatura da água superior a 1°C.
4.9 Teste de Tolerância à Glicose
Após 4hs do exercício, foi realizado o teste de tolerância à glicose (GTT –
Glucose Tolerance Test). Foi administrado, via intraperitoneal (IP), 1g/kg de solução
de glicose a 80%. A mensuração dos valores da glicemia dos animais ocorreu antes da administração da glicose (T=0) e consecutivamente 30, 60, 90 e 120min após a administração da mesma, por meio de punção caudal (~25 μL de sangue), analisado em glicosímetro (Optium XCEED, Abbott) e expresso em mg/dL de sangue.
4.10 Preparação dos Tecidos
Os animais foram mortos imediatamente após o término do GTT com o uso de guilhotina para coleta dos tecidos (músculo gastrocnêmio, fígado e pâncreas) para análises bioquímicas.
O músculo gastrocnêmio, o fígado e o pâncreas foram dissecados e 1/2 foi homogeneizado em 9 volumes de 120mM KCl, 30 mM de Tampão Fosfato de Sódio (PBS pH7,2), com PMSF, para análises bioquímicas de TBARS (Neves et al., 1997), e 1/2 foi congelado para futuras análises bioquímicas e moleculares.
4.11 Dosagem de Proteínas e Teste das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
A concentração de proteína e determinação da peroxidação lipídica nos homogeneizados de tecidos dos animais, foi determinada pelo método espectrofotométrico de Bradford, a 595nm, utilizando curva padrão de albumina (BRADFORD, 1976) e curva padrão de MDA (BUEGE & AUST, 1978). A
concentração de TBARS formada foi expressa em nmol de malonaldeído (MDA) por mg de proteína.
4.12 Análise Estatística
Os dados obtidos foram analisados em programa estatístico SPSS Versão 18 por ANOVA seguido de Teste de Tukey nas variáveis Peso e Lactato, e ANOVA de Medidas Repetidas seguido por teste T de Student ou ANOVA para os dados de temperatura e de Glicemia. Foi considerado, para fins de estatística, p< 0,05 e intervalo de confiança de 95%. Os dados relativos ao dano oxidativo foram analisados no programa Graph Pad 3.0, os resultados foram expressos como médias ± desvio padrão e analisados por Teste T de Student (comparações entre as temperaturas 30°C e 40°C) considerando nível de significância estatística o limite de 5% (p<0,05).
5. RESULTADOS
Resposta ao teste de tolerância à glicose – GTT
Todos os grupos, independente da temperatura e da intensidade do esforço realizado, tiveram aumento na glicemia verificada aos 30 minutos do GTT em relação à glicemia basal (Figura 1A, B e C). No entanto, o grupo RE-40 apresentou maior pico glicêmico quando comparado ao grupo RE-30 (Figura 1A). Esta influência da condição de temperatura na glicemia durante o GTT não foi observada nos animais que realizaram exercício moderado (Figura 1B) ou intenso (Figura 1C).
Figura 1. Teste de tolerância a glicose mensurado em ratas Wistar 4hs após 20 minutos de exercício de natação em diferentes intensidades do exercício em diferentes temperaturas da água (30 e 40°C). Teste de tolerância a glicose mensurado 4hs após 20 minutos de natação em ratas Wistar em diferentes intensidades de acordo com o peso adicionado a cauda do animal. (A) Teste de tolerância a glicose dos grupos RE-30, RE-40, (B) dos grupos G4-30 e G4-40 e (C) dos grupos G8-30 e G8-40. G4= 4% de carga e G8=8% de carga. (% = carga percentual do peso corporal de cada animal
adicionada). RE= grupo de ratas que permaneceu em repouso pelo mesmo período, em água a 30°C 30) ou 40°C (RE-40).*p<0,05 em relação ao RE-30; ANOVA de medidas repetidas uma via.
Foi calculada a área incremental sob a curva de glicemia do GTT, o que representa resposta à carga glicêmica imposta ao organismo durante o teste em cada grupo experimental. Deste modo, foi observado novamente um aumento na glicemia do grupo RE-40 em relação ao grupo RE-30 (*P<0,05). Adicionalmente, o grupo RE-40 teve a glicemia aumentada em relação ao grupo que foi submetido à mesma temperatura, mas realizou exercício com 4% de carga (**P<0,05) (figura 2).
Figura 2. Área incremental sob a curva do teste de tolerância a glicose em ratas Wistar após 20 minutos de exercício de natação de diferentes intensidades em diferentes temperaturas da água (30 e 40°C). Área incremental sob a curva do teste de tolerância a glicose mensurada imediatamente após 20 minutos de natação em ratas Wistar em diferentes intensidades de acordo com peso adicionado a cauda do animal. G4=4% de carga e G8=8% de carga. (% = carga percentual do peso corporal de cada animal adicionada). RE= grupo de ratas que permaneceu em repouso, em água a 30ºC (RE-30) ou 40ºC (RE-40). *p<0,05 em relação ao RE-30; **p<0,05 em relação a e G4-40. ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Student-Newman-Keuls.
Temperatura Corporal dos animais
A temperatura corporal dos animais em repouso não foi modificada pela temperatura da água, ou seja, a temperatura corporal dos animais dos grupos RE-30 e RE-40 não foram diferentes antes ou após o período de exposição à água (Figura 3A). Os animais que realizaram exercício a 30°C – G4-30 e G8-30 – tiveram perda de temperatura corporal imediatamente após os 20 minutos de exercício de natação quando comparados aos grupos que realizaram exercício a 40°C – G4-40 e G8-40 – (Figuras 3B e 3C, respectivamente para 4% de carga e para 8% de carga).
Figura 3. Temperatura corporal de ratas Wistar medida antes (T.A. EXER) e após 20 minutos de exercício (T.P.EXER) ou repouso em diferentes temperaturas da água (30 e 40°C). (A) Temperatura corporal dos grupos RE-30, RE-40, (B) dos grupos G4-30 e G4-40 e (C) dos grupos G8-30 e G8-40. G4=4% de carga e G8=8% de carga. (% = carga percentual do peso corporal de cada animal adicionada). RE= grupo de ratas que permaneceu em repouso por 20 min., em água a 30°C (RE-30) ou 40°C (RE-40). *p<0,05 em relação ao G4-40 (B) e G8-40 (C); ANOVA de medidas repetidas uma via.
Intensidade de esforço
Neste modelo de natação, as diferentes intensidades de exercício físico foram confirmadas pela dosagem de lactato, pois em todos os grupos que realizaram exercício houve aumento da concentração de lactato sanguíneo em comparação com o grupo que permaneceu em repouso (Figura 4). Além disso, os animais com 8% de carga tiveram maior concentração de lactato comparado com os animais que usaram 4% de carga, sendo que os animais que realizaram com 8% em água com temperatura de 40°C apresentam valores mais elevados que todos os demais grupos.
Figura 4. Concentração de lactato sanguíneo em ratas Wistar após 20 minutos de exercício de natação em diferentes intensidades em diferentes temperaturas da água (30 e 40°C). G4=4% de carga e G8=8% de carga. (% = carga percentual do peso corporal de cada animal adicionada). RE = grupo de ratas que permaneceu em repouso pelo mesmo período, em água a 30°C (RE-30)) ou 40°C (RE-40). *p<0,05 em relação ao RE; **p<0,05 em relação a RE e G4.*** p<0,05 em relação a todos os grupos. ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Student-Newman-Keuls.
Lipoperoxidação Tecidual
A temperatura da água aumentou os níveis de peroxidação lipídica (nmol de MDA/mg de proteína) no músculo gastrocnêmio dos animais mantidos em repouso a 40°C. Este efeito não foi observado nos animais que realizaram exercício em intensidade moderada ou alta intensidade (Figura 5A). A temperatura da água e/ou exercício não foram fatores capazes de modificar os níveis de lipoperoxidação no fígado e no pâncreas dos animais em repouso em intensidade moderada de exercício (p=0,08), em alta intensidade (Figura 5B e 5C).
Figura 5. Avaliação da lipoperoxidação do músculo gastrocnêmio (A), fígado (B) e pâncreas (C) de ratas Wistar após 20 minutos de natação em diferentes intensidades em diferentes temperaturas (30 e 40°C). G4=4% de carga e G8=8% de carga. (% = carga percentual do peso corporal de cada animal adicionada). RE = grupo de ratas que permaneceu em repouso por 20 min., em água a 30°C (RE-30) ou 40°C (RE-40). *p<0,05 em relação ao RE-30; Teste T de Student.
Fase do ciclo estral
No dia do experimento, 60% das ratas encontravam-se na fase de estro e 40% em diestro (Figura 6).
6. DISCUSSÃO
Estudos referentes aos efeitos do exercício físico no controle glicêmico estão sendo realizados em nosso laboratório com o objetivo de desenvolver conhecimento, na área da saúde na perspectiva de contribuir para a qualidade de vida de indivíduos com diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Embora sejam frequentemente relatados muitos efeitos benéficos do treinamento físico regular no tratamento do DM2 (UMPIERRE et al., 2011), poucos estudos são encontrados relacionando os efeitos imediatos de uma sessão de exercício sobre a homeostase glicêmica (Mcclean et al., 2009). Nosso trabalho buscou avaliar a resposta do teste de tolerância à glicose (GTT), onde após uma carga glicêmica imposta ao organismo, a glicemia é monitorada por duas horas, em ratas submetidas ao exercício de diferentes intensidades em diferentes temperaturas.
A mudança de temperatura corporal pode ser um fator modificador na tolerância à glicose (CHUNG et al., 2008), ou seja, o tratamento com choque térmico por 12 semanas é capaz de proteger o organismo do desenvolvimento de resistência à insulina. No entanto, os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que a exposição aguda a temperaturas elevadas (40°C) pode levar a menor captação de glicose periférica em animais em repouso. No entanto, esses efeitos não ocorrem em animais que realizaram exercício físico moderado em mesma temperatura, assim, acreditamos que o exercício seria capaz de reverter ou evitar esse efeito na glicemia durante o teste de tolerância a glicose (Figura 2).
Estes resultados (Figura 2) caracterizam uma maior demanda metabólica prévia ao GTT nos grupos que realizaram exercício, corroborando assim, com estudos que obtiveram resultados similares ao comparar a massa muscular envolvida durante o esforço (BAYNARD et al., 2005; VENABLES et al., 2007) e a resposta glicêmica.
Esse efeito (Figura 2) poder estar relacionado à capacidade da atividade contrátil muscular em ativar transportadores de glicose no músculo através da indução de GLUT-4 do plasma para a membrana celular (KENNEDY et al., 1999; KING et al., 1993), causando maior captação de glicose independente da ação da insulina. Evidências apoiam a ideia de que é magnitude de GLUT-4 que determina a
capacidade de um músculo esquelético para melhorar o transporte de glicose durante e após a atividade (HOLLOSZY & HANZEN, 1996).
Sobre essas observações, o exercício físico moderado pode representar um importante potencial de intervenção para melhorar o estado metabólico de indivíduos com resistência à insulina. A melhora na captação de glicose através do exercício poderia reduzir as taxas de indivíduos diabéticos como também reduzir a mortalidade cardiovascular (HENRIKSEN, 2002). Deste modo, a intensidade do exercício físico passa a ser uma variável em evidência na prescrição do mesmo, sobretudo do ponto de vista dos benefícios ao indivíduo quanto ao metabolismo da glicose.
A medida de lactato sanguíneo pode ser uma estratégia de identificação da intensidade de exercício realizado em modelos experimentais. Em nosso estudo, essa medida confirmou a condição de repouso (RE), a condição de exercício moderado para o G4 e a condição de exercício intenso para o G8, independente da temperatura da água (30 ou 40°C) (Figura 4). Estes resultados são similares aos obtidos em ratos machos submetidos a um protocolo de natação com as mesmas intensidades, confirmando em nosso trabalho o grupo G4 como intensidade moderada de exercício, sugerindo realizar exercício em torno de 70% do consumo máximo de oxigênio (KREGEL, et al., 2006) e abaixo do 2° limiar de transição metabólica. Além disso, os valores elevados de lactato sanguíneo nos animais exercitados com 8% de carga (Figura 4) sugerem a realização de exercício de alta intensidade (VOLTARELLI et al., 2002), acima do limiar e transição metabólica (VOLTARELLI et al., 2005).
Estudos referentes ao controle da temperatura corporal em modelos experimentais são realizados em nosso laboratório, onde os animais são submetidos a diferentes condições de desafio metabólico como o exercício físico ou de estresse térmico (choque térmico). Tendo em vista que protocolos de exercício com água a 30°C causam hipotermia imediatamente após o exercício de ratos Wistar (Heck, 2011), o uso de temperaturas mais elevadas, como neste estudo, tem o intuito de atenuar a queda de temperatura corporal durante o exercício. Nossos resultados concordam com Heck (2011), já que nos grupos G4-30 e G8-30 foram observadas
