UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Biologia
LAURA MIGLIORINI DE ARAUJO
CONSTRUÇÃO DE UMA COLEÇÃO DE MICROORGANISMOS REPRESENTATIVOS DO MICROBIOMA DA CANA-DE-AÇÚCAR
CONSTRUCTION OF A COLLECTION OF MICROORGANISMS REPRESENTATIVE OF SUGARCANE MICROBIOME
CAMPINAS
2018
LAURA MIGLIORINI DE ARAUJO
CONSTRUÇÃO DE UMA COLEÇÃO DE MICROORGANISMOS REPRESENTATIVOS DO MICROBIOMA DA CANA-DE-AÇÚCAR
CONSTRUCTION OF A COLLECTION OF MICROORGANISMS REPRESENTATIVE OF SUGARCANE MICROBIOME
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Vegetal e Melhoramento.
Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Genetics and Molecular Biology, in the area of Plant Genetics and Genetic Breeding.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LAURA MIGLIORINI DE ARAUJO, E ORIENTADA PELO PROF.DR. PAULO ARRUDA
ORIENTADOR: PROF. DR. PAULO ARRUDA
CAMPINAS
2018
Campinas, 27 de fevereiro de 2018
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Paulo Arruda (Orientador)
Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia
Profa. Dra. Sara Adrián López de Andrade
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica da aluna.
RESUMO
O ecossistema formado pela interação entre plantas e solo é composto por uma imensa diversidade de microorganismos que desafiam abordagens de estudos quanto as suas características e mecanismos de associação. Métodos tradicionais de isolamento, cultivo e identificação de microorganismos em coleções são laboriosos, de alto custo e consumem grande parcela de tempo. Neste trabalho utilizamos amostras de raiz, rizosfera e colmo da cana-de-açúcar para obtenção dos microorganismos associados. A partir disso, descrevemos uma nova metodologia para construção de uma coleção de microorganismos representativa do microbioma da cana-de-açúcar baseado em um sistema de obtenção de culturas. Este método é baseado em picar colônias de placas de cultura que podem conter um ou múltiplos microorganismos, armazenando-as em placas de 96 poços. Foram usados diferentes meios de cultura, suplementação com xarope de cana-de-açúcar e diferentes temperaturas de incubação em estufa para obtenção de uma ampla diversidade de microorganismos. A coleção completa é composta de 56 placas de 96 poços. Para identificação das bactérias presentes na coleção, foi desenvolvido um sistema multiplex para a amplificação do gene correspondente ao RNA ribossomal 16S constituído por duas etapas de amplificação por PCR com primers contendo barcodes para placas, linhas e colunas que permitiram identificar e rastrear o conteúdo bacteriano de cada poço independentemente do mesmo conter um ou múltiplos microorganismos. O sistema multiplex permite o agrupamento dos amplicons em um único tubo. O sequenciamento foi feito através da plataforma PacBio e permitiu a obtenção de sequências de tamanho quase completo do gene 16S que permitiu uma identificação acurada de cada poço. Comparando os dados obtidos para a coleção de microorganismos (dependente de cultivo) com o perfil do microbioma da cana (independente de cultivo) conseguimos obter 399 bactérias cultivadas que representam 15,9% do microbioma core da rizosfera e 61,6-65,3% dos representantes do microbioma core de colmo. Os resultados mostram que a metodologia utilizada para construção da coleção de microorganismos teve êxito em nosso objetivo de propor uma nova abordagem para obtenção de microorganismos benéficos para plantas a partir de seu microbioma.
ABSTRACT
The soil-plant ecosystem harbors an immense microbial diversity that challenges investigative approaches to study traits underlying plant-microbe association. Traditional methods for isolation, cultivation and identification of microbes on culture collections are time-consuming, laborious and expensive. Here we describe a novel methodology for constructing a microorganism collection representative of the sugarcane microbiome based on a community-based system. We used samples of root, rihizosphere and stalks of sugarcane to obtain the associated microorganisms. The method is based on picking colonies from primary platings that may contain one or multiple microorganisms and storaging the cultures on 96 well plates. We used diferent culture media, supplementation of sugarcane juice and different temperatures of incubation to obtain a broad range of microorganisms. The total culture collection comprises 56 plates of 96 wells. For identification of the bacterial content of the collection we developed a multiplex system for amplification of 16S RNA gene on a two-step PCR amplification with tagged primers for plates, rows and collums witch permited to identificate and track back the well contents regardless if the well contained single or multiple microorganisms. The multiplex systems enables to pooling amplicons on a single tube. The sequencing was performed on PacBio platform and led to recovery of near-full-lenght 16S rRNA gene sequences allowing accurate identification of microorganisms in each plate well. By cross-referencing the collection of microorganisms (culture-dependent) with the sugarcane microbiome profile (culture-independent) we were able to recover 399 unique bacteria representing 15.9% of the rhizosphere core microbiome and 61.6–65.3% of the endophytic core microbiomes of stalks. The results demonstrate that the methodology used to construct the microbial collection successfully provide a new approach to recover beneficial plant microbes from plant microbiota.
Sumário
INTRODUÇÃO ... 9
Potencial de microorganismos associados às plantas ... 9
Promoção direta e indireta de crescimento vegetal ... 10
Fixação de nitrogênio atmosférico ... 11
Produção de compostos fitoestimulantes ... 12
Produção de sideróforos ... 13
Produção de exopolissacarídeos (EPS) ... 14
Indução de tolerância sistêmica ... 14
Microorganismos não-cultiváveis ... 15
Microorganismos em cultura ... 17
OBJETIVOS ... 21
MATERIAIS E MÉTODOS ... 22
1. Construção da coleção de microorganismos associados ... 22
Material biológico ... 22
Coleta e amostragem ... 22
Regiões amostradas ... 22
Amostra de microorganismos Endofíticos de Colmo (EC): ... 23
Amostra de microorganismos Endofíticos de Raiz (ERA): ... 25
Amostra de microorganismos da Rizosfera (RZO): ... 25
Determinação de parâmetros para amostragem ... 27
Diluições, temperaturas de cultivo e tipo de armazenamento ... 29
Diluição seriada ... 29
Contagem de colônias ... 31
Temperaturas de cultivo em estufa ... 35
Meios de cultura ... 35 Plaqueamento ... 38 Picking ... 38 Armazenamento ... 39 Validação ... 40 2. Sequenciamento e classificação ... 42
Etapas para o preparo da biblioteca ... 44
b) Placa Pool e PCR II ... 45
c) Quantificação, preparo da biblioteca e sequenciamento ... 47
d) Identificação e classificação taxonômica ... 49
e) Análise quanto à representatividade em relação ao microbioma da cana-de-açúcar ... 50
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 51
1. Construção da coleção de microorganismos associados ... 51
A coleção de microorganismos ... 58
2. Sequenciamento e classificação ... 60
a) PCR I ... 60
b) Placa pool e PCR II ... 61
c) Quantificação, preparo da biblioteca e sequenciamento ... 62
d) Identificação e classificação taxonômica ... 63
Impacto da coleção na descoberta de novos microorganismos ... 68
CONCLUSÕES ... 72
REFERÊNCIAS ... 73
MATERIAL SUPLEMENTAR ... 90
ANEXOS... 100
Trabalhos publicados em co-autoria ... 100
Autorização de acesso ao patrimônio genético ... 101
Documento referente à bioética/biossegurança ... 103
INTRODUÇÃO
Microorganismos são ubíquos no planeta, com uma estimada quantidade de 106 espécies
bacterianas (Lopez-Garcia e Moreira, 2008) em um total de 4 x 1030 células (Horner-Devineet
al, 2004). Sua composição genética e diversidade fisiológica resulta em um enorme potencial metabólico. Estes contribuem com quase todos os ciclos biogeoquímicos e são os promotores de todos os ciclos globais de nitrogênio, oxigênio, carbono, enxofre e fósforo (Schmidt, 2006), o que os torna de vital importância para manutenção da biosfera. A maior parte desses processos são realizados pela colaboração entre microorganismos com diferentes funções biológicas (De Roy et al., 2013). Tais microorganismos não atuam como indivíduos, mas como uma comunidade dinâmica e mutável, em que todas as células interagem e comunicam-se umas com as outras (Little et al., 2008; Klitgord e Segre, 2010). Eles influenciam o comportamento uns dos outros e, assim, possivelmente alteram seus fenótipos bioquímicos (Wintermute e Silver, 2010). Entender os fatores que moldam e influenciam estes micro-ecossistemas é essencial para uma visão microbiológica, ecológica e biotecnológica.
Potencial de microorganismos associados às plantas
Bactérias presentes no solo são de grande importância em ciclos biogeoquímicos e têm sido utilizadas na produção de cultivares por décadas (Jha e Saraf, 2015). Interações entre microorganismos presentes na rizosfera (camada de solo imediatamente aderida à raiz) e plantas são determinantes para a saúde dos vegetais e a fertilidade do solo. Interações entre bactérias promotoras de crescimento vegetal (Plant Growth Promoting Rhizobacteria ou PGPRs) e a planta hospedeira configuram uma relação intrincada e interdependente envolvendo não apenas esses dois Reinos de organismos, mas também fatores bióticos e abióticos da região da rizosfera (Dutta e Podile, 2010). PGPRs são bactérias de vida livre no solo que podem direta ou indiretamente auxiliar no processo de enraizamento (Mayak et al., 1999) e crescimento de plantas (Glick, 1995). Nos últimos dez anos, uma enorme quantidade de PGPRs foram identificadas, principalmente em função do papel desenvolvido pela rizosfera, considerada então, uma unidade ecológica, ganhando crescente importância no funcionamento da biosfera. Além disso, mecanismos de ação de PGPRs têm sido profundamente estudadas (Jha e Saraf, 2015).
Um possível PGPR se qualifica como tal quando demonstra produzir efeitos benéficos para a planta na qual é inoculado, com isso demonstrando grande habilidade de competição
com os microorganismos da comunidade ali instalada. Geralmente, cerca de 2-5% da comunidade constituinte do microbioma dessa região corresponde a bactérias consideradas PGPRs (Antoun e Prevost, 2005). Um dos mecanismos pelo qual bactérias se aderem às partículas de solo é por simples troca iônica, sendo um solo considerado naturalmente fértil quando os organismos desse nicho liberam nutrientes inorgânicos a partir de reservas orgânicas a uma taxa suficiente para sustentar o crescimento vegetal (Jha e Saraf, 2015). Alguns exemplos de PGPR conhecidos são dos gêneros Acetobacter, Acinetobacter, Azoarcus, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Beijerinckia, Burkholderia, Derxia, Enterobacter, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Ochrobactrum, Pantoae, Pseudomonas, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas e Zoogloea, que têm sido alvo de diversos estudos ao longo dos anos (Babalola, 2010).
Na região da rizosfera, uma zona de cerca de 1mm de espessura, essa camada de solo aderido é biologica e quimicamente influenciada pela raiz e pelos microorganismos que metabolizam esses compostos. Microorganismos do solo são geralmente difíceis de serem caracterizados, principalmente pela sua imensa diversidade fenotípica e genotípica (Jha e Saraf, 2015). Populações de bactérias em camadas mais superficiais do solo podem conter cerca de 100 células por grama de solo (Torsvik e Ovreas, 2002), sendo sua maioria não cultivável em laboratório. A fração de células que contribuem para a biomassa do solo que já foram cultivadas em meios de cultura é menor que 5% da população total (Borneman e Triplett, 1997). A comunidade de microorganismos dentro e ao redor da raiz inclui bactérias, fungos, leveduras e protozoários. Muitos desses microorganismos apresentam vida livre enquanto outros formam associações simbióticas com diversas plantas. A comunidade que constitui a rizosfera pode ser tratada como uma comunidade estável em uma determinada espécie vegetal, em um determinado solo (Jha e Saraf, 2015). A interação entre esses microorganismos e a raiz pode ser benéfica, trazer malefícios ou ser neutra para a planta, sendo que em alguns casos esses efeitos podem se alterar conforme as condições do solo (Singh and Varaprasad 2008).
Promoção direta e indireta de crescimento vegetal
O termo Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) foi cunhado há mais de três décadas e refere-se a bactérias não-patogênicas, de grande capacidade de colonização da superfície da raiz e que induzem ao crescimento vegetal de forma direta ou indireta por um ou mais mecanismos (Babalola, 2010). Esse efeito pode ocorrer por mecanismos diretos ou indiretos (Glick, 1995). PGPRs influenciam o crescimento vegetal de forma direta através da
fixação de nitrogênio atmosférico, pela solubilização de fosfato, secreção de fitormônios - auxinas, giberelinas, citocininas e ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico ou (ACC, precursor do etileno) -, produção de deaminase (enzima envolvida no metabolismo de purinas e regulação de etileno) (Glick et al., 1999). Mecanismos indiretos envolvem indução de resistência sistêmica, antibiose, competição com patógenos por nutrientes, parasitismo e produção de metabólitos (como cianeto de hidrogênio e sideróforos) capazes de suprimir a presença de bactérias patogênicas (Glick et al., 1999). Associações de PGPRs e plantas variam de acordo com a proximidade com a raiz e grau de intimidade da associação. No geral, essas bactérias podem ser separadas em extracelulares, presentes na rizosfera, aderidas à epiderme da raiz ou presentes nos espaços extracelulares, e intracelulares, presentes no interior das células do córtex, geralmente especializadas na formação de nódulos (Gray e Smith, 2005).
Fixação de nitrogênio atmosférico
Bactérias associadas à fixação de nitrogênio têm sido cada vez mais utilizadas em plantas não-leguminosas, como beterraba, cana-de-açúcar, arroz, jatrofa, milho e trigo (Sashin et al., 2004). Entre os gêneros mais estudados dentro dessa função metabólica, encontram-se: Bacillus para cereais (Cakmakci et al., 2001) e milho (Pal, 1998); Agrobacterium, que demonstrou auxiliar no rendimento de trigo e cevada em 2-30%, com contribuição de nitrogênio fixado entre 23 e 32% do total assimilado (Bairamov et al. 2001); os gêneros Enterobacter, Klebsiella, Burkholderia, e Stenotrophomonas têm ganhado cada vez mais atenção por sua associação com cultivares economicamente importantes (Ramirez e Mellado 2005); algumas linhagens de Pseudomonas putida RC06, Paenibacillus polymyxa RC05 and RC14, e Bacillus OSU-142 têm sido utilizadas como fertilizantes para maior rendimento e qualidade de trigo, beterraba e espinafre (Cakmakci et al., 2007); também, linhagens de Bacillus e Azospirillum brasilense sp246 também demonstraram efeito no rendimento de trigo e cevada em culturas com baixo teor de nitrogênio no solo (Canbolat et al. 2006).
Solubilização de fosfato mineral
Muitos microorganismos do solo foram descritos com capacidade de solubilizar complexos de fósforo insolúveis naturalmente, tornando-o utilizável para plantas (Tripura et al. 2005). A disponibilidade de fósforo em muitos solos é de cerca de 1umol/L, porém plantas requerem aproximadamente 30umol/L para atingir sua máxima produtividade (Jha e Saraf, 2015). A maioria dos fertilizantes fosfatados aplicados se tornam precipitados em complexos minerais insolúveis, não sendo eficientemente aproveitados pelas plantas. A solubilização de
fosfato inorgânico por intermédio de microorganismos é de grande importância econômica para nutrição vegetal (Gaur, 2002). Representantes de bactérias dos gêneros Achromobacter, Agrobacterium, Bacillus, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Flavobacterium, Mycobacterium, Pseudomonas e Serratia são altamente eficientes quanto à solubilização de complexos de fosfato indisponível em fosfato inorgânico (Goldstein, 2001).
Solos também contém uma grande gama de substratos orgânicos, que podem ser fonte de fósforo para plantas. Para tornar esse elemento disponível para nutrição vegetal, este deve ser hidrolizado em fósforo na forma iônica (Jha e Saraf, 2015). A mineralização de muitos compostos orgânicos ricos em fosfato é realizada por meio de atividade enzimática de fosfatases, fitases, fosfonoacetato hidrolases, D-α-glicerofosfatases e C-P liases (Hayat et al., 2010). A atividade de várias fosfatases presents na rizosfera de milho, cevada e trigo mostraram-se em taxas consideráveis na porção mais próxima da raiz com valores de pH entre ácido e neutro. Bactérias do solo conhecidas por expressarem um nível significativo de fosfatases ácidas inclui representantes dos gêneros Rhizobium, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Proteus, Klebsiella, Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Phyllobacterium, Rhodococcus e Delftia (Chen et al., 2006).
Produção de compostos fitoestimulantes
PGPRs exercem efeitos também através da produção de substâncias que estimulam o crescimento e desenvolvimento vegetal (Jha et al., 2013). Essas substâncias incluem fitormônios como auxinas, citocininas, giberelinas e alguns compostos voláteis, além do cofactor pirroquinolina quinine (PQQ). Diversas bactérias associadas demonstram a capacidade de produção de, principalmente, auxinas - ácido indolacético (IAA) -, que aumenta a produção de raizes laterai e, com isso, a obtenção de nutrientes e exsudação de compostos pela planta, estimulando o crescimento e colonização de microorganismos na região (Jha et al., 2013).
A promoção de crescimento vegetal como resultado da ação de IAA foi documentada em diversas plantas (Spaepen et al., 2007). Contudo, esses efeitos benéficos do IAA produzido por bactérias dependem de uma concentração ideal, que varia para cada espécie vegetal. O papel dos fitormônios produzidos por bactérias associadas a plantas em condições de estresse salino ou seca também foi demonstrado (Egamberdieva, 2009). Como a produção de fitormônios endogenamente produzidos pelas plantas tende a declinar em situações de estresse salino, bactérias associadas tolerantes a esse tipo de condição podem auxiliar no crescimento vegetal através de hormônios pore las sintetizados. De forma similar, o IAA produzido por bactérias
pode auxiliary o desenvolvimento vegetal em condições de estresse hídrico pela estimulação da formação de um sistema radicular desenvolvido o suficiente para obtenção de água presente no solo. Além disso, o papel do IAA na resposta ao estresse vetegal é evidente em casos como a ação de representantes do gênero Azospirillum durante limitação da disponibilidade de carbon e pH ácido do solo (Spaepen et al., 2007).
Além de IAA, algumas bactérias associadas são capazes de produzir outros fitormônios como giberelinas, como Bacillus pumilus e Bacillus licheniformis e alguns representantes de Rhizobium, Acetobacter, Herbaspirillum (Atzorn et al., 1988, Jha et al., 2013) e citocininas. Citocininas produzidas por espécies de Bacillus na rizosfera foram observadas por promover aumento na biomassa em Arabidopsis thaliana através de inibição do crescimento de raiz primária e maior desenvolvimento de raizes laterais secundárias (López-Bucio et al., 2007). Interessantemente, poucos representantes de bactérias são capazes de produzir mais de um fitormônio. Algumas bactérias dos gêneros Bacillus e Enterobacter promovem o crescimento vegetal através de compostos voláteis como acetoína e 2,3-butanodiol (Jha et al., 2013). Esses compostos voláteis produzidos por PGPRs foram descritos como sendo capazes de aumentar o crescimento vegetal através da regulação da homeostase da auxina endógena, sendo isso constatado pela indução de genes correspondents a enzimas participantes do metabolism de produção de IAA endógeno (Zhang et al., 2008)
Produção de sideróforos
Sideróforos são molécular de baixo peso molecular (400-1.500Da) responsáveis pela quelação de íons de ferro e seu transporte para o interior das células através da membrana celular (Jha et Saraf, 2015). As bactérias que sintetizam sideróforos se ligam aos complexos sideróforo-ferro por meio de um receptor em sua membrana externa e o tranporta para seu interior. Uma vez dentro da célula, o ferro é liberado e então disponível para promover o crescimento bacteriano (Jha e Saraf, 2015), sendo este um micronutriente essencial para o metabolismo bacteriano. No solo, o ferro encontra-se indisponível para assimilação por microorganismos pois sua forma natural predominante (Fe+3) é pouco solúvel e apresenta baixas concentrações. Através dessa ligação siderófor-ferro, as bactérias da rizosfera também previnem o desenvolvimento e proliferação de fungos patogênicos privando-os desse nutriente (Kloepper et al., 1980; Mathiyazhagan et al., 2004). A capacidade de produção de sideróforos auxilia na vantagem competitiva dessas bactérias na rizosfera (Jha e Saraf, 2015) promovendo, indiretamente, proteção contra fitopatógenos (Jha e Saraf, 2011) e disponibilização de ferro
para a planta (Jurkevitch et al., 1992). Representantes de Pseudomonas correspondem aos principais responsáveis pela produção de sideróforo (Schroth e Hancock, 1982).
Produção de exopolissacarídeos (EPS)
Exopolissacarídeos são polímeros de carboidratos que são secretados por uma variedade de PGPRs. Esses complexos formam associações com a parede celular formando uma camada protetora de ligação com microorganismos ou podem ser liberados no solo na forma de uma solução gelatinosa (Glick et al., 1999). EPSs apresentam um papel vital em diferentes processos como a produção de biofilmes (Bhaskar e Bhosle, 2005), proteção contra desidratação de bactérias (Pal et al., 1999), manutenção de funções celular primárias para os microorganismos, atividade anti-bacteriana contra patógenos e predadores, podem propiciar a dinâmica na degradação de poluentes (Fusconi e Godinho, 2002) e atividades de biorremediação do solo (Allison, 1998). A síntese de EPS também está relacionada a estresse, como visto para E. coli, que produz enzimas conhecidas pela eliminação de proteínas denaturadas em função de estresse (Stewart et al., 1997).
A produção de EPSs é conhecida em representantes de Pseudomonas, Bacillus e Streptococcus (Vimala e Lalithakumari, 2003). Essa atividade auxilia na multiplicação de bactéria benéficas de gêneros como Vibrio, Pseudomonas, Serratia, Escherichia, Bacillus e Azospirillium (Gygi et al., 1995). Esses polissacarídeos são de grande importância também para a determinação de virulência para alguns patógenos (Peng et al., 2008), significando também que exercem uma importante influência no sucesso de colonização para muitas bactérias. Além disso, auxiliam na agregação celular e propiciam a sobrevivência de microorganismos contra dessecação, privação de nutrientes e até mesmo auxiliam na fixação de nitrogênio controlando altas concentrações de oxigênio (Glick et al., 1999).
Indução de tolerância sistêmica
Algumas PGPRs auxiliam na tolerância de estresses abióticos como seca, estresse salino, deficiência ou excesso de nutrientes, extremos de temperatura e presença de metais tóxicos no solo (Jha et al., 2013). Com isso, alterações físico-químicas nas plantas por intermédio da ação de PGPRs na indução de tolerância contra estresse levou à criação do termo “Tolerância Sistêmica Induzida”, sendo intimamente relacionada à produção de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) deaminase, antioxidantes, citocininas e compostos voláteis. A atividade da enzima ACC deaminase controla os níveis de etileno (sendo o ACC um
precursor imediato desse fitormônio), muitas vezes produzido pelas plantas em resposta a diversos estressores bióticos e abióticos (Yang et al., 2009). O controle de sódio durante estresse salino é feito pela produção de compostos voláteis por representantes de Bacillus (Yang et al., 2009), enquanto que por meio da produção de citocininas, outras PGPRs controlam a produção de ácido abscísico (ABA), um sinalizador de estresse em plantas que leva à produção da enzima antioxidante catalase (Yang et al., 2009).
Microorganismos não-cultiváveis
Todos os microorganismos crescem em seu ambiente natural, isso é axiomático. Muitos daqueles que não são passíveis de se cultivar em laboratório hoje, certamente o serão no futuro (Stewart, 2012). A primeira evidência de que nem todas as bactérias presentes no ambiente podem ser cultivadas em laboratório surgiu com a microscopia; o número de células visualizadas microscopicamente é esmagadoramente maior do que o número de colônias que se formam nas placas de petri - lembrando que cada colônia corresponde à multiplicação de uma única célula original – foi chamado “The Great Plate Count Anomaly” (ou A Grande Anomalia da Contagem de Colônias”) (Amann, 1911). A magnitude dessa discrepância varia entre os ambientes, mas pode chegar a muitas ordens (Staley e Konopka, 1985). Enquanto pesquisadores investiam em esforços para o cultivo, essa observação também levantou a questão a respeito da identidade filogenética de tais bactérias não cultiváveis. Primeiramente foi proposto que se tratavam de células mortas que jamais cresceriam, explicando potencialmente a anomalia, porém ignorando a possibilidade de novos grupos taxonômicos a serem descobertos (Spieckermann, 1912). Contudo, foi mostrado que muitas dessas células se apresentavam ativas metabolicamente, mesmo sendo incapazes de serem replicadas em meios de cultura (Roszak e Colwell, 1987). Evidências adicionais a respeito da existência de tais grupos veio de ferramentas moleculares (Stewart, 2012). A capacidade de se obter informações sobre sequências de DNA de amostras ambientais (através de PCR, amplificação seguida de clonagem ou sequenciamento direto) permitiu a caracterização de marcadores filogeneticamente importantes, como a região 16S da sequência do gene ribossomal (rRNA), independentemente da viabilidade dos microorganismos presentes na amostra (Amann et al., 1995).
Essas análises revelaram um oceano de diversidade nunca observado através do cultivo em laboratório (Stewart, 2012). Partindo de 11 filos de bactérias (Woese, 1987), esse número
cresceu ultrapassando 85 filos, enquanto a maior parte destas continuam sem representantes cultivados (Woese, 1987; Rappe et al., 2003; Keller, 2004; Achtman, 2008). Sendo assim, esses grupos diversos devem estar crescendo em algum ambiente dada a presença de seu DNA amplificado e sequenciado, mostrando que os esforços de cultivo dos últimos dois séculos restringiram-se a metodologias restritivas, com condições favoráveis a uma pequena fração da diversidade total de microorganismos (Stewart, 2012). O sequenciamento de DNA de populações mistas está sujeito a artefatos que acabam por gerar uma grande diversidade que é apenas aparente, sendo utilizados muitos tipos de controles para minimizar esse fenômeno (Huse et al., 2010). Além disso, a constante repetição da obtenção de sequências não pertencentes aos filos já descritos, reforça sua possível presença na natureza. Por exemplo, o filo candidato “TM7” foi encontrado repetidamente em diferentes ambientes. Sequências correspondentes ao gene rRNA 16S de “TM7” foram primeiramente encontradas em turfas (Rheims et al., 1996), e desde então foi encontrado nos mais diversos ambientes incluindo solo, água, efluentes de indústrias, esponjas marinhas, microbioma humano e muitos outros (Hugenholtz et al., 2001; Hardoim, 2009; Bik et al., 2010; Dinis et al., 2011). O filo “TM7” é amplamente distribuído e ainda resistente às técnicas de cultivo. Como indicado, a maior parte dos táxons de bactéria nunca foram estudados em laboratório, representando uma enorme diversidade genética e bioquímica a ser descoberta (Stewart, 2012).
A dificuldade de classificação em espécies para microorganismos é única entre os ramos da “Árvore da Vida”. Certamente a maior parte dos organismos macroscópicos conhecidos foram descritos como observados na natureza, sem necessidade de replicá-los em laboratório. Essa distinção, requerendo o crescimento em culturas puras para descrição e classificação de espécies de microorganismos, é consequência direta da dificuldade em determinar informações relevantes fisiologicamente para microorganismos sem sua presença em uma cultura manipulável (Stewart, 2012).
Os microorganismos desconhecidos, representados pelo filo de bactérias descrito e também por subgrupos filogenéticos menores, provavelmente carregam a maior parte da diversidade metabólica não apenas entre bactérias, mas também entre todos os domínios da vida (Stewart, 2012). Produtos naturais e derivados obtidos de bactérias correspondem a metade dos farmacêuticos comercialmente disponíveis (Demain e Sanchez, 2009), sendo a falta de diversidade de bactérias culviváveis parte da atual estagnação do pipeline de descoberta de novos antibióticos, sendo grande parte dos atuais medicamentos apenas derivações de classes já existentes (Silver, 2011). A necessidade de mudanças na taxa em que novas espécies são
descobertas é fundamental e, para que isso seja possível, o acesso a essa maioria até então não-cultivável também o é (Lewis et al., 2010; Silver, 2011). A gama de produtos derivados desses microorganismos não se restringe a antibióticos, mas também são utilizados metabólitos secundários em transplantes de órgãos, tratamento do câncer, controle do colesterol, inseticidas, fungicidas e anti-parasitas (Demain e Sanchez, 2009).
O principal ponto na busca por novas espécies até então não cultiváveis é a dificuldade em replicar aspectos essenciais do ambiente em que seu DNA é encontrado (Stewart, 2012). Isso não se dá por falta de tentativas ou esperteza, mas sim pelo desconhecimento de qual parâmetro do ambiente não está corretamente replicado em meio de cultura (nutrientes, pH, condições osmóticas, temperatura e muitos outros) (Stewart, 2012). Tentativas de alterar todos esses fatores de uma vez resulta em uma complexa matriz de possibilidades que não pode ser colocada em prática com tempo e esforço razoáveis, porém é um começo para se obter alguns desses microorganismos em laboratório. Milhares de bactérias são hoje consideradas cultiváveis devido, principalmente, a duas estratégias: empregar o ambiente per se junto ao meio de cultura e co-cultivo com microorganismos oriundos do mesmo ambiente (Stewart, 2012).
Outro método utilizado atualmente é o de “diluição até extinção” (Logares et al., 2010; Stewart, 2012). Trata-se de um processo de diluição em série até que apenas um ou poucos microorganismos estão presentes num dado volume de amostra. Em casos em que um único representante da comunidade da amostra tem grande abundância, ocupando quase a totalidade do volume da amostra, aqueles mais raros são impedidos de crescer ou até mesmo nem chegam a ser inoculados em meio de cultura (Rappe et al., 2002; Stewart, 2012).
Microorganismos em cultura
Métodos dependentes de cultivo permitem o isolamento de um único microorganismos dentro de uma comunidade diversa para estudo profundo de suas características genéticas e fisiológicas (De Roy et al., 2013). A literatura envolvendo pesquisas realizadas com microorganismos isolados é, naturalmente, enorme (Jessup et al., 2005), em função das metodologias até então utilizadas para tal. Com o crescimento das pesquisas utilizando métodos independentes de cultivo, muito conhecimento foi agregado a esse modelo simples. Estudos de transcriptômica, proteômica e metabolômica produzem cada vez mais informação quanto a
funções biológicas, resistência a estresses e adaptação, enquanto que essa crescente compreensão leva ao aumento de estudos focados na manipulação desses microorganismos (De Roy et al., 2013). A biologia sintética, que compreende a aplicação da metodologia de engenharia genética tem se mostrado bastante útil (Endy, 2005; Leonard et al., 2008), sendo modificados para melhorias em sua resistência a estresse, produtividade, degradação de compostos tóxicos e recalcitrantes, sintetizar novos compostos químicos ou para aquisição de outras características não naturais (Benner e Sismour, 2005).
As numerosas capacidades de ambos os microorganismos engenheirados e os selvagens os torna interessantes para diferentes aplicações. Podem ser utilizados como probióticos nas indústrias médica e alimentícia (Steidler et al., 2000; Huibregtse et al., 2012), como fábricas celulares para produtos específicos nas indústrias alimentícia, farmacêutica, química e agrícola, com a produção desde drogas contra o câncer até biocombustíveis (Du et al., 2011; Waegeman e Soetaert, 2011).
Considerando que apenas uma pequena porção de microorganismos presentes em uma comunidade pode ser cultivada em laboratório e, além disso, o comportamento dos microorganismos em culturas puras é diferente do daquele observado quando em culturas em que há uma comunidade (De Roy et al., 2013), tornou-se crescente a atenção para estudos envolvendo microorganismos em culturas não puras, exigindo, portanto, novas metodologias para obtenção e acesso ao genoma desses representantes nos mais diversos microbiomas. Contudo, mesmo com o mais avançado método para identificação de tais características e propriedades através das ferramentas de bioinformática disponíveis e tecnologias de sequenciamento – levando em conta a quantia enorme de dados produzida a cada ano – é praticamente impossível acessar os genes e proteínas expressos e ativos e, com isso, a funcionalidade de certas espécies de microorganismos apenas com esses dados (Temperton e Giovannoni, 2012; Zengler e Palsson, 2012). Não é possível, também, mapear e compreender as interações entre microorganismos, muitas vezes sendo esta a força motriz da dinâmica da comunidade em questão (De Roy et al., 2013). Quando comparada à literatura disponível para estudos com microorganismos isolados, culturas não-puras são ainda pouco exploradas (De Roy et al., 2013).
Muitos fatores bióticos e abióticos influenciam a formação de ecossistemas e seu funcionamento. Alterando alguns parâmetros, um ecossistema pode colapsar. Contudo, o oposto também pode acontecer podendo até apresentar uma performance melhor, além de
funções novas poderem ser observadas. Através de pesquisas e aumento do conhecimento acerca de culturas não-puras (ou até mesmo sintéticas), será cada vez mais acessível a obtenção e manutenção de culturas capazes de otimizar a performance de um dado nicho ecológico (De Roy et al., 2013).
Comunidades são intrínsecas a qualquer amostra de microorganismo na natureza, e quando coexistentes, é esperada sua interação e troca de metabólitos. Essa interação pode ser através de contato físico, comunicação através de sinais químicos, troca horizontal de genes, cenários competitivos ou cooperativos (com consumo ou produção de recursos) e alteração do meio levando à promoção de crescimento de diferentes organismos (Brenner et al., 2008; Wintermute, 2010; Mee, 2012; Song et al., 2014; Yaung, 2014; De Roy et al., 2014). Culturas que consistem em múltiplas espécies de microorganismos, por definição, possuem uma maior quantidade de genes e metabólitos do que monoculturas. Essa diversidade propicia a utilização desses microorganismos em grande escala e com melhor divisão de trabalho, configurando uma ferramenta alternativa no cultivo de culturas vegetais (Silver et al., 2015). A grande escala aqui mencionada se refere às propriedades de tais culturas de microorganismos de sobreviver a perturbações, visto que a manutenção dessas culturas é de vital importância para sua administração e aplicação (Stenuit, 2015). Quanto à divisão de trabalho, muitos microorganismos coexistem de forma a exercerem diferentes funções dentro daquele meio de forma simbiótica (Brenner et al., 2008, Mee, 2012), embora esses papeis nem sempre estejam bem definidos. Estudos independentes de cultivo colaboram para a definição da composição das diferentes comunidades e ajudam a atribuir determinadas funções de acordo com os grupos taxonômicos encontrados (Silver et al., 2015).
Interações entre microorganismos são elementares para a dinâmica de uma comunidade, bem como de sua estabilidade e sua identificação pode facilitar a produção de novos consórcios com novas propriedades (Song et al., 2014). Comunidades sintéticas têm também um papel fundamental na fermentação industrial. A produção de bioetanol, a maior parte do álcool é produzido pela fermentação de glicose e sucrose a partir do milho, beterraba e cana-se-açúcar. Como esse processo compete com a produção de alimentos, fontes alternativas são constantemente procuradas (De Roy et al., 2013). Glicose e xilose são os principais açúcares dominantes e abordagens recentes mostraram-se ineficientes quanto à procura de microorganismos nativos capazes de converter açúcares em etanol em grande escala. Com isso, co-culturas de microorganismos com alta capacidade para diferentes açúcares têm sido utilizadas (Chen, 2011). Por exemplo, uma simples co-cultura de Zymomonas
mobilis e Candida tropicalis (Patle et al., 2007) é capaz de transformar biomassa lignocelulósica enzimaticamente com um rendimento de 97,7%. A aplicação de culturas mistas na fermentação de biomassa lignocelulósica para produção de etanol pode aumentar suas taxas de produção e reduzir custos (Patle et al., 2007), ressaltando a importância da obtenção de microorganismos em forma cultivável e não apenas de forma isolada.
Na aplicação de microorganismos no ambiente, a forma de culturas ou consórcios tem vantagens quando comparada a culturas axênicas. Por exemplo, compostos complexos costumam envolver uma série de microorganismos para que se formem ou se degradem, como observado para biorremediação e geração de bioenergia (Silver et al., 2015). Assim sendo, a administração de consórcios de microorganismos leva a economia global por um caminho mais sustentável e adequado às necessidades modernas.
OBJETIVOS
O objetivo geral do trabalho é propor um novo método para isolar e identificar microorganismos representativos do microbioma associado à cana-de-açúcar em uma coleção, fornecendo material biológico para estudos envolvendo este microbioma e a exploração de novas espécies. Além disso, estudos sobre potenciais interações entre os microorganismos armazenados e também seu potencial biológico quanto às funções e propriedades apresentadas podem ser analisadas.
Objetivos específicos:
- Construir uma coleção representativa das comunidades de microorganismos que habitam as porções interna (espécies endofíticas) e externa (espécies exofíticas) do colmo e raiz da cana;
- Identificar e avaliar a diversidade de bactérias presentes na coleção através de sequenciamento de regiões filogeneticamente informativas;
- Comparar os dados de diversidade e abundância da coleção com dados a respeito da composição do microbioma da cana-de-açúcar (de Souza et al., 2016), de modo a validar quais espécies são possíveis de se obter através de cultivo quando comparadas à total diversidade e abundância presentes na planta.
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Construção da coleção de microorganismos associados Material biológico
Plantas de cana-de-açúcar (Saccharum sp.) da variedade SP80-3280 foram amostradas em 2009 na usina Santa Helena na fazenda Santo Antônio (coordenadas GPS: −22.735657, -47.305069) de propriedade da empresa Cosan localizada na cidade de Piracicaba, Estado de São Paulo, Brasil. Toletes dessas plantas foram plantados na casa de vegetação do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética da UNICAMP (CBMEG/UNICAMP, coordenadas GPS: -22.8201541, -47.059779) e mantidos sem adição de qualquer tipo de fertilização, somente irrigação. As plantas foram cortadas anualmente no fim do mês de outubro, para renovação dos colmos. As amostras utilizadas neste projeto são provenientes da quarta rebrota.
Coleta e amostragem
Regiões amostradas
Neste trabalho as regiões escolhidas para amostragem dos microorganismos representantes do microbioma da cana-de-açúcar foram: porção interna do colmo (regiões inferior, média e superior) e porções endofítica e exofítica da raiz (rizosfera), sendo esta última correspondente à porção de solo imediatamente aderida à sua superfície (Figura 1).
Figura 1: Regiões amostradas. Interior do colmo (porção endofítica), interior da raiz (porção endofítica) e região externa da raiz (rizosfera).
Amostra de microorganismos Endofíticos de Colmo (EC):
Diversos colmos de uma touceira madura foram amostrados a fim de isolar microorganismos associados à sua região interna (porção endofítica). Os colmos foram picados em porções menores para facilitar o manejo. Cada porção foi lavada em água corrente com auxílio de uma escova previamente esterilizada até que toda a camada de cera fosse removida, juntamente com microorganismos associados a regiões externas da planta (porção exofítica). Foram utilizadas porções do colmo inferior, médio e superior em partes iguais para melhor amostragem.
Em seguida, 100g de tecido foram triturados com 500mL de solução estéril de tampão fosfato salina PBS (NaCl 137mM, KCl 2,7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 2mM, pH 7.0)
gelado em liquidificador esterilizado, a fim de preservar as células ali presentes. A solução resultante foi filtrada através de seis camadas de gaze estéril para remoção da porção vegetal remanescente (Figura 2). Em seguida, a solução obtida foi dividida em garrafas de 250mL e centrifugadas a 6000 rpm por 10 minutos em condições refrigeradas (Figura 4). O sobrenadante foi descartado e os pellets contendo os microorganismos foram ressuspendidos com solução PBS gelada e estéril. Os volumes de cada garrafa foram reunidos em uma única com volume final de 20mL uma vez que apresentavam aparência homogênea.
A solução de 20mL obtida constitui a amostra bruta da porção endofítica do colmo (EC). Alíquotas de 1,5mL dessa solução foram armazenadas em microtubos e mantidas a 4ºC até a etapa de plaqueamento para conservação das células.
Figura 2: Preparo da amostra de microorganismos endofíticos do colmo da cana-de-açúcar. Colmos foram obtidos de uma touceira madura, lavados e escovados até a remoção da cera externa juntamente com os microorganismos ali associados. Uma vez limpos, 100g de colmo foram picados e triturados em liquidificador estéril juntamente com 500mL de solução PBS gelada e estéril. A solução obtida foi filtrada através de gaze estéril.
Amostra de microorganismos Endofíticos de Raiz (ERA):
As amostras de raízes são provenientes de um quadrante de aproximadamente 1m³ ao redor da base de uma touceira. Sulcos foram cavados para delimitar o quadrante e facilitar a remoção da planta com auxílio de uma alavanca. Com seu sistema radicular exposto, amostras foram dissecadas utilizando uma tesoura previamente esterilizada. Grandes particulados de solo foram removidos por chacoalhamento. Em seguida, as raízes coletadas foram lavadas em 1L de solução PBS gelada e estéril acrescida de Tween 20 a 0,05% (PBS-Tween) em bandejas também esterilizadas até que toda a camada de solo a elas agregada passasse para a solução.
As raízes lavadas foram separadas da solução tampão e sonicadas enquanto imersas em água destilada, para que qualquer partícula de solo ainda agregada pudesse ser removida, bem como microorganismos associados à porção exofítica. A água utilizada foi descartada e o processo repetido mais uma vez até que as raízes estivessem visualmente limpas.
Em seguida, 100g da porção radicular foi então picada e triturada com 500mL de solução PBS gelada e estéril em liquidificador esterilizado (Figura 3). A solução resultante foi filtrada através de seis camadas de gaze esterilizada. A solução obtida foi também dividida em garrafas de 250mL e centrifugadas a 6000 rpm por 10 minutos em condições refrigeradas (Figura 4). O sobrenadante foi descartado e os pellets ressuspendidos com solução PBS gelada e estéril. Os volumes de cada garrafa foram reunidos em uma única com volume final de 20mL homogêneos.
A solução obtida corresponde à amostra bruta de microorganismos endofíticos de raiz (ERA). Alíquotas de 1,5mL foram feitas e mantidas a 4ºC até a etapa de plaqueamento.
Amostra de microorganismos da Rizosfera (RZO):
A rizosfera corresponde à camada de solo imediatamente associada à superfície da raiz. Para esta amostra, a solução estéril de 1L de PBS-Tween que foi utilizada para a lavagem da amostra de raiz, contendo a camada de solo a ela associada, foi separada e filtrada através de seis camadas de gaze estéril (Figura 3).
A solução filtrada foi transferida para garrafas estéreis de 250mL e centrifugada por 10 minutos a 1700 rpm para remoção do excesso de solo em condições refrigeradas. O sobrenadante foi transferido para novas garrafas estéreis e então centrifugado, também em
condições refrigeradas, por 15 minutos a 6000 rpm, desta vez a fim de concentrar os microorganismos correspondentes à porção exofítica na porção pelletizada de cada garrafa (Figura 4). O novo sobrenadante foi descartado e os pellets, contendo os microorganismos, foram ressuspendidos em solução PBS gelada e estéril até que ficasse homogênea.
Esse procedimento foi repetido até que todo o volume fosse concentrado, sendo os pellets ressuspendidos com solução PBS gelada e estéril e reunidos em uma única garrafa de 250mL, até que o volume final de 20mL apresentasse aparência homogênea.
Dessa solução, alíquotas de 1,5 mL foram feitas representando a amostra bruta de rizosfera (RZO), sendo estas então mantidas a 4ºC até a etapa de plaqueamento.
Figura 3: Preparo da amostra de microorganismos endofíticos de raiz e rizosfera da cana-de-açúcar. A porção da raiz foi removida do solo e os grandes particulados de solo foram retirados por chacoalhamento. Foi feita então a lavagem das raízes em 1L de solução PBS-Tween gelada até que o máximo de partículas de solo fossem removidas, utilizando bandejas esterilizadas. A solução de 1L resultante da lavagem foi filtrada através de gaze estéril e separada para compor a amostra de rizosfera. A porção de raiz foi lavada e sonicada, em seguida foi picada e 100g desta foram trituradas com 500 mL de solução PBS estéril e gelada em liquidificador estéril, sendo então filtrada através de gaze estéril para remoção do particulado vegetal.
Figura 4: Sequência de etapas até obtenção das amostras brutas a partir das soluções em PBS. Após a trituração em liquidificador, cada amostra passou por filtração e centrifugações até a obtenção das amostras finais para cada uma das três porções. A solução foi centrifugada e os pellets obtidos foram ressuspendidos em solução gelada de PBS e, da solução final obtida, alíquotas de 1,5mL foram feitas e armazenadas a 4ºC até a etapa de plaqueamento, correspondento às amostras brutas de endofítico de colmo (EC) e endofítico de raiz (ERA). Já a amostra de rizosfera foi centrifugada duas vezes até a obtenção de pellets contendo os microorganismos, conforme mostra o esquema. Os pellets foram ressuspendidos em solução gelada e estéril de PBS e desta foram feitas alíquotas de 1,5mL constituindo a amostra bruta de rizosfera (RZO).
Determinação de parâmetros para amostragem
No início do projeto, foi necessária a determinação de alguns parâmetros como meios de cultura, concentração ou diluição da amostra, temperaturas e tempo de crescimento para cada um dos três tecidos alvo da cana. Para isso, alguns testes foram feitos para estabelecer então uma abordagem para a melhor amostragem dos microorganismos pertencentes à microbiota da cana-de-açúcar.
Outro ponto diferencial da construção desta coleção de microorganismos é que ela deve apresentar a possibilidade de obtenção, cultivo, armazenamento e análise em larga escala de forma rápida e prática quando comparada aos métodos comuns já estabelecidos para isolamento de bactérias e fungos através de técnicas como estriamento, testes bioquímicos e morfologia (Ferguson, 1984; Eilers, 2000, Fuchs et al., 2013).
Foi feito um teste inicial de plaqueamento com amostras armazenadas em glicerol em meio de cultura Luria-Bertani (LB) meia-força, a fim de termos um primeiro contato com o crescimento dos microorganismos isolados.
Essas amostras foram obtidas conforme descrito na metodologia. Cada amostra foi armazenada em glicerol com concentração final de 20% e armazenadas em freezer a -80ºC. O plaqueamento foi feito dentro de fluxo laminar previamente esterilizado durante todo o processo. O procedimento consistiu em descongelar cada uma das amostras e aplicar 100uL de cada uma sobre meio sólido LB meia-força, espalhando-as com alça de Drigalski, em placas de Petri comuns de 9 cm de diâmetro. As amostras foram colocadas em estufa a 37ºC e incubadas durante três dias.
O aparecimento e crescimento de colônias foram acompanhados durante esse período, deixando clara a disparidade entre cada amostra. Em todas as amostras, o número de colônias aumentou significativamente ao longo desse período, sendo a amostra de endofíticos de colmo a menos concentrada enquanto que as amostras de raiz, tanto endofíticas quanto exofíticas (rizosfera), apresentaram um crescimento muito mais acelerado. A partir deste primeiro teste (Figura 5) foi decidido que seriam feitas diluições para cada amostra e também determinado que o tempo de crescimento teria que ser variado para cada uma.
Figura 5: Diferenças entre concentração de colônias e tempo de crescimento entre amostras. Ao final de três dias em incubação a 37ºC em meio LB meia-força sólido, é visível a disparidade no número e tamanho de colônias obtidas para cada amostra cultivada nas mesmas condições.
Diluições, temperaturas de cultivo e tipo de armazenamento
Um novo plaqueamento foi feito com as amostras de ERA e RZO, que visivelmente apresentaram um número maior de colônias no primeiro teste, sendo necessária uma diluição adequeada. Nesse teste, as amostras foram espalhadas em placas de petri de 150mm de diâmetro, afim de estabelecer um método em que pudéssemos obter um maior número de colônias, bem como o estabelecimento de colônias de crescimento menos acelerado durante o tempo de incubação. Dessa forma, as chances de obtermos uma maior variedade de microorganismos ainda não descritos ou de função essencial para o desenvolvimento da cana-de-açúcar se tornaram maiores, ao mesmo tempo em que a análise de redundância e abundância desses microorganismos poderia ser mais fiel aos reais valores para a análise metagenômica do microbioma quando comparados.
O plaqueamento foi feito em meio LB meia-força para as mesmas amostras de ERA e RZO do primeiro teste. Foram utilizadas, além das amostras armazenadas em glicerol, amostras armazenadas em DMSO a 7% e amostras frescas recém-coletadas sem adição de crioprotetor (Fresh). Para cada processo de plaqueamento uma placa controle do meio de cultura, em que nenhuma amostra foi plaqueada, foi adicionada. Além disso, uma placa controle do fluxo laminar permaneceu aberta durante todo o procedimento a fim de garantir que as condições do processo fossem estéreis e as colônias obtidas representassem microorganismos oriundos exclusivamente das amostras. As condições de cultivo em estufa foram de 37ºC e incubação por três dias.
Diluição seriada
Devido ao teste inicial de abordagem dos microorganismos foi estabelecida a necessidade de diluição das amostras, especialmente de ERA e RZO, amostras que geraram um maior número de colônias.
O processo de diluição foi feito para cada um dos tipos de amostras (glicerol, DMSO e Fresh). Todo o procedimento foi realizado em fluxo laminar estéril, com material previamente esterilizado em autoclave (120ºC por 15 minutos) e amostras mantidas em gelo para preservação dos microorganismos.
As diluições escolhidas foram: 500 vezes (1/500), 2000 vezes (1/2000), 8000 vezes (1/8000) e 32000 vezes (1/32000). As diluições foram feitas a partir das amostras brutas armazenadas (glicerol e dmso) e recém-coletada (fresh).
O procedimento de diluição seriada deu-se da seguinte maneira: a partir da amostra bruta mantida em gelo, 100uL foram transferidos para um microtubo contendo 900uL de meio LB meia-força líquido, completando 1 mL de volume. Esse novo tubo foi vortexado por 15 segundos para homogeneização sendo esta diluição de 10 vezes. Em seguida, 100uL dessa solução foi transferida para um novo microtubotubo contendo 900uL de meio líquido, correspondendo à diluição de 100 vezes. Após a vortexar este último, 200uL desta solução foram transferidos para um microtubo contendo 800uL de meio líquido correspondendo à amostra 500 vezes diluída (1/500). Esta foi vortexada e dela 250uL foram transferidos para um microtubotubo contendo 750uL de meio líquido, correspondendo à amostra 2000 vezes diluída (1/2000). Após vortexá-la, 250uL foram transferidos para um novo tubo contendo 750uL de meio, constituindo à amostra 8000 vezes diluída (1/8000). Finalmente, após vortexação desta última, 250uL foram transferidos para um novo microtubo contendo 750uL de meio líquido, constituindo 1mL da amostra 32000 vezes diluída (1/32000) (Figura 6).
Cada uma dessas diluições (1/500, 1/2000, 1/8000 e 1/32000) foi plaqueada em placas de petri de 150mm contendo meio LB meia-força sólido tanto para amostras de ERA como de RZO. Para cada diluição foram feitas cinco réplicas, totalizando 60 placas que foram mantidas em estufa a 37ºC por três dias a fim de estabelecer estes parâmetros para a construção da coleção.
Figura 6: Diluição seriada das amostras. O processo foi realizado dentro do fluxo laminar para amostras de ERA e RZO armazenadas em glicerol, dmso ou recém coletadas (fresh). As diluições plaqueadas são de 1/500, 1/2000, 1/8000 e 1/32000 para cada tipo de amostra. As amostras foram encubadas em estufa a 37ºC. As colônias que se estabeleceram foram contadas para cada um dos três dias de incubação afim de determinarmos uma diluição ideal para cada tipo de amostra
Contagem de colônias
Com a ferramenta multi-point do programa ImageJ 1.48v (Figura 7), contamos manualmente o número de colônias visíveis para cada uma das 30 réplicas de cada amostra. O processo foi simples visto que a ferramenta faz a contagem automática de número de pontos selecionados. Esta abordagem foi escolhida depois de tentativas não satisfatórias com vários programas disponíveis de contagem de colônias, visto que no nosso trabalho, as colônias variam muito quanto ao formato, coloração e tamanho, critérios estes utilizados nos vários softwares descartados.
O objetivo foi definir as diluições necessárias para cada amostra para um número viável de contagem, o tipo de amostra a ser utilizada (na presença ou ausência de crioprotetor) e temperaturas de incubação a serem utilizadas, baseando-nos em resultados e diferenças observadas para cada um desses parâmetros.
A contagem foi feita para cada tipo de amostra e para cada um dos três dias de incubação.
Figura 7: Contagem de colônias. Exemplo de 20 colônias contadas em amostra de RZO do tipo fresh diluída 2000X, ao final do terceiro dia de incubação em estufa a 37ºC.
Para cada dia de incubação e tipo de amostra foi feita a contagem de todas as placas. Ao final de três dias, os valores foram analisados através de ANOVA e cada tipo de amostra foi comparado entre si quanto aos valores obtidos (Fresh X DMSO, Fresh X Glicerol e DMSO X Glicerol) (Tabela 1).
Com os dados obtidos foram feitos gráficos no programa Prism, tornando mais visíveis as diferenças e valores encontrados para cada dia de contagem, tipo de amostra analisado e respectiva diluição (Figura 8). Os parâmetros foram estabelecidos com intervalo de confiança de 1 e 5%. Essa comparação foi feita com o intuito de decidirmos qual o tipo e diluição ideais a serem utilizados para a construção da coleção. Foi decidido que o número de colônias a serem contadas não passaria de 100 por placa para viabilidade do projeto (Figura 9). Com isso, ficou estabelecido que as diluições seriam de 32000 vezes para RZO, 8000 vezes para ERA e 2000 vezes para EC. Com esses valores, as placas podem ser cultivadas por três ou mais dias (Figura 10), favorecendo o aparecimento de colônias de crescimento mais lento em um total de colônias ainda viável para as próximas etapas da construção da coleção.
Tabela 1: Contagem de colônias de diferentes tipos de amostra de RZO. Para cada diluição foi obtida a média de colônias a cada dia, o erro padrão dessa média e o número de placas utilizadas. No caso de n<5, a placa foi descartada da contagem pelo fato de alguma colônia ter tomado o espaço das demais, impossibilitando a contagem.
Figura 8: Contagem de colônias de RZO ao final do terceiro dia. Através do gráfico é possível notar a diferença entre os tipos de amostra, sendo a tipo fresh sempre maior quanto ao número de colônias do que aquelas armazenadas em glicerol ou DMSO, apresentando significância de até p<0,001. Definido o número máximo de contagem como 100, é possível notar também que a diluição ideal para RZO é, no mínimo, menor que 1/2000, já que acima disso a contagem das colônias se torna impraticável quando em larga escala, característica esta essencial para o projeto. C.f.u: Colony Forming Units (Unidades Formadoras de Colônias).
Figura 9: Número de colônias para a) RZO e b) ERA. O número de colônias obtidas entre amostras é claramente diferente quando comparados. A faixa ideal de contagem (área rasurada) para a) RZO é próxima de 1/8000 para três dias, enquanto que para b) ERA é próxima da diluição 1/2000 durante o mesmo período de tempo. Average of CFU: Média de Unidades Formadoras de Colônias.
Figura 10: Placas ao final do terceiro dia para a) RZO e b) ERA. Para cada amostra, uma diluição foi escolhida de acordo com o número de colônias para a próxima etapa. É visível a diferença entre amostras quanto à diluição. No canto inferior direito estão os números de colônias contadas para cada placa.
Temperaturas de cultivo em estufa
Os testes foram feitos com incubação a 37ºC em estufa e após essa primeira abordagem decidimos incluir também as temperaturas de 25 e 30ºC como parâmetros. Essa decisão foi tomada após mensuração da temperatura do solo na casa de vegetação em que se encontra nosso objeto de estudo. Essas temperaturas são mais próximas da real temperatura do solo em uma profundidade de 20cm, sendo isso relevante principalmente para as amostras de ERA e RZO.
O objetivo foi de ampliar a variação nas condições para resultados mais abrangentes quanto à diversidade e abundância dos microorganismos cultiváveis.
Meios de cultura
Estima-se que apenas 1% das espécies de microorganismos pode ser cultivável (Rothschild, 2006), levando à busca por diferentes técnicas e abordagens de cultivo. Isso se
deve, naturalmente, à discrepância entre as condições ambientais e os meios de cultivo feitos em laboratório. Alguns fatores fisiológicos, como o estado de dormência, podem impedir o crescimento e adaptação de microorganismos quando em condições artificiais (Deming, 2000). Em muitos casos, as condições para crescimento são muito específicas, sendo necessária a adição de nutrientes específicos ou até mesmo a adequação da concentração de compostos orgânicos complexos ou demais moléculas no caso de espécies oligotróficas e fastidiosas, como diversos exemplos de microorganismos comuns na natureza que exigem condições e técnicas específicas para cultivo (Baxter, 1984; Boogerd, 1989; DeBruyn, 1990; Koops, 1992; Schut, 1993; Ferris, 1996; Button, 1998; Partensky, 1999).
Métodos convencionais de cultivo de microorganismos costumam ser laboriosos, consomem grande parcela de tempo e acabam por gerar um viés na seleção das espécies (Ferguson, 1984; Eilers, 2000, Fuchs et al., 2013), além se serem mais caras quando consideradas a longo prazo. Tais características não correspondem ao nosso objetivo neste projeto, que é a de criar uma coleção através de técnicas práticas e rápidas, permitindo a identificação dos microorganismos de uma nova maneira.
A modificação de técnicas de cultivo e meios de cultura têm se mostrado eficazes no crescimento de microorganismos até então não cultiváveis (Bruns, 2002; Janssen, 2002; Lundberg et al., 2012; Bulgarelli et al., 2012, 2013, 2015; Edwards et al., 2015; Panke-Buisse et al., 2015; Zarraonaindia et al., 2015; Coleman-Derr et al., 2016; Castrillo et al., 2017), especialmente através da utilização de componentes do próprio ambiente em que vivem (Zengler, 2002). Microorganismos responsáveis por efeitos benéficos para plantas costumam ser obtidos com base em características já conhecidas, com meios de cultivo definidos para cada um, reduzindo assim, a possibilidade de descoberta de novos exemplares (Kelley et al., 2013; Lebeis et al., 2012; Turner et al., 2013). Além disso, métodos tradicionais visam à obtenção de colônias puras, de forma que potenciais microorganismos possam ser preteridos em função de outros (Turner et al., 2013), sendo esse um fator importante que não condiz com o aquilo que aqui é proposto, ou seja, a contrução de uma coleção de microorganismos representativa do microbioma associado à cana-de-açúcar.
A construção de uma coleção representativa do microbioma da cana-de-açúcar na forma de culturas não-puras, se baseia na obtenção de colônias que possam apresentar um ou mais tipos de microorganismos, não sendo possível dintingui-las visualmente nas placas de cultura. Assim, com uma menor demanda de tempo, podemos obter nesta coleção posssíveis amostras
de microorganismos cuja interação - com outros microorganismos e também com a planta hospedeira - pode ser futuramente estudada (Armanhi et al., 2016).
Neste trabalho foram utilizadas diferentes condições de cultivo não seletivas visando à obtenção de uma ampla diversidade de bactérias e fungos na forma de comunidades para construção da coleção e análise comparada com aos resultados obtidos por metagenômica da real composição do microbioma (Armanhi, 2016; de Souza et al., 2016).
Meios de cultura seletivos permitem a seleção de microorganismos específicos, porém impedem o crescimento de outros cuja função na natureza permanece desconhecida (Schloss and Handelsman, 2005; Lebeis et al., 2012; Stewart, 2012; Turner et al., 2013). Assim, a escolha de cada meio utilizado deu-se em função da abrangência de espécies que poderiam ser obtidas, de acordo com a literatura e testes prévios em laboratório. Em função disso, foram escolhidos meios classificados como complexos e ricos em nutrientes.
Em busca de mimetizar o ambiente interno da cana-de-açúcar, bem como seus exsudados da raiz, alguns meios tiveram adição de suco de cana dos exemplares amostrados. Todos os testes realizados até então para definição das diluições e tempos de cultivo foram realizados com meio LB meia-força acrescido de suco de cana (Tabela 2).
Posteriormente, devido ao trabalho de obtermos o suco da cana e também para a padronização das placas futuras que seriam de fato utilizadas para a construção da coleção - considerando que cada amostragem de suco da cana teria concentrações diferentes de açúcares e demais componentes - optamos por utilizar um xarope pronto.
O xarope, solução de suco da cana concentrado, foi fornecido pela empresa Amyris Biotechnonogy (Campinas/SP Brasil). O processo de obtenção ocorreu na própria empresa, sendo sua esterilização a vapor. Sua concentração é dada em função da sua quantidade de açúcares redutores totais (sacarose, glicose e frutose) que é medida pela escala numérica do índice de refração Brix, de unidade 1 grau Brix (ºBx). A concentração Brix foi confirmada por cromatografia líquida (HPLC) também na própria empresa.
Para fins de padronização, o Brix do suco da cana utilizado para os testes foi medido, sendo este próximo de 8g/L (0,08 ºBx). O xarope concentrado fornecido apresenta 731,2g/L (73,12 ºBx), sendo a concentração de açúcares do suco natura previamente utilizado a base para o cálculo e determinação da concentração e volume do xarope a ser adicionado aos meios de cultura finais.
Meios de Cultura Composição Abrangência Meio LB meia-força Xarope 8g/L (LB2SY8) Triptona: 5g/L Extrato de levedura: 2,5g/L NaCl: 5g/L Água: 989,1mL pH: 7.0 Autoclave Adição de 10,9mL de xarope Volume final: 1L Concentração de açúcares redutores finais semelhantes ao
suco natural da cana, com potencial para cultivo das colônias
já obtidas em teste Meio LB meia-força Xarope 35g/L (LB2SY35) Triptona: 5g/L Extrato de levedura: 2,5g/L NaCl: 5g/L Água: 952,2mL pH: 7.0 Autoclave Adição de 47,8mL de xarope Volume final: 1L
Maior concentração de açúcares redutores para seleção diferenciada de microorganismos YPD Peptona: 20g/L Extrato de levedura: 10g/L Dextrose: 20g/L Água: 1L pH: 6.5 Autoclave Volume final: 1L
Diferente composição, comumente utilizada para cultivo de fungos e
leveduras, para seleção mais abrangente de microorganismos Tabela 2: Meios utilizados para construção da coleção e respectiva composição. Através da adição do xarope de cana que é composto por açúcares e demais metabólitos, procuramos mimetizar o ambiente interno da planta. O xarope foi adicionado após a esterilização em autoclave para que sua fervura não modificasse seus componentes. Para meios sólidos, foram acrescentados 15g de ágar para cada litro antes da esterilização.
Plaqueamento
Uma nova coleta foi feita, da forma aqui descrita, para cada um dos meios de cultura utilizados, mantendo sempre a condição de amostras frescas a serem plaqueadas.
A diluição para cada amostra foi feita em fluxo laminar conforme aqui previamente descrito, com o respectivo meio de cultura utilizado para o crescimento. Para cada série de diluição, seis amostras brutas foram utilizadas e três séries de diluição independentes foram feitas, fornecendo o volume necessário e também garantindo a replicabilidade do processo. Picking
Uma vez que cada placa em cada condição apresentasse um número adequado de colônias (sendo estas encubadas por, no mínimo, três dias), estas foram removidas da estufa e cada colônia foi picada com um palito de dente estéril. Cada colônia picada foi colocada em
