UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
ANNAMARIA DÓRIA SOUZA VIDOTTI
ANÁLISE PROTEÔMICA, CRESCIMENTO E
COMPOSIÇÃO CELULAR DA MICROALGA
Chlorella vulgaris SOB AUTOTROFIA,
MIXOTROFIA E HETEROTROFIA
Campinas 2015
ANNAMARIA DÓRIA SOUZA VIDOTTI
ANÁLISE PROTEÔMICA, CRESCIMENTO E COMPOSIÇÃO
CELULAR DA MICROALGA Chlorella vulgaris SOB
AUTOTROFIA, MIXOTROFIA E HETEROTROFIA
PROTEOMIC ANALYSIS, GROWTH AND CELLULAR
COMPOSITION OF MICROALGAE Chlorella vulgaris UNDER
AUTOTROPHIC, MIXOTROPHIC AND HETEROTTOPHIC
CONDITIONS
Campinas 2015
Tese apresentada a Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Engenharia Química.
Orientadora: Profa. Dra. Telma Teixeira Franco Co-orientadora: Dra. Flávia Vischi Winck
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Annamaria Dória Souza Vidotti e orientada pelo Profa. Dra. Telma Teixeira Franco.
Dedico esta tese ao meu esposo Antonio Carlos e aos meus pais Fábia e Evandro
Agradecimentos
Agradeço à Deus, pela oportunidade e possibilidade de realizar este objetivo.
Aos meus pais, irmãos, e a toda família pelo apoio incondicional, mesmo nos momentos mais difíceis dessa jornada sabia que poderia contar com cada um de vocês. Agradecimento especial a Letícia e Danilo que foram fundamentais nessa reta final! Ao meu esposo Tony pelo amor, incentivo, companheirismo, amizade e pela gigantesca dedicação em cada momento dessa jornada, sem você realmente nada disso seria possível, muito obrigada, te amo!
Às professoras Dra. Telma Franco e Dra. Flávia Winck, pela orientação, apoio e confiança.
Aos amigos do LEBBPOR e aos amigos de Campinas por todos os momentos de companheirismo, conversas, brincadeiras e amizade.
À Dona Bem Vinda e Pitinho, agradeço imensamente, sem a proteção de vocês eu não seria capaz de concluir esse trabalho.
À Rosangela e Fabiane, pelos inúmeros ‘’galhos quebrados’’.
Aos professores membros da comissão avaliadora, agradeço por aceitarem participar da avaliação desse trabalho.
Ao Laboratório de Espectrometria de Massas do Laboratório Nacional de Biociências, CNPEM, pelo suporte nas análises de espectrometria de massas.
À Petrobrás e CNPQ pelo apoio financeiro.
À FEQ/UNICAMP por toda estrutura material e pessoal que tornou a realização desse trabalho possível.
À todas as pessoas, que de alguma forma, contribuíram para que esta Tese se tornasse realidade, o meu agradecimento.
Resumo
Algumas espécies de microalgas podem alterar o tipo de metabolismo como uma resposta às mudanças nas condições ambientais. A Chorella vulgaris (C. vulgaris) é um exemplo de microalga capaz de crescer tanto sob condições de autotrofia (com CO2 e
luz), quanto heterotrofia (com glicose, sem luz, sem CO2) e mixotrofia (com glicose,
CO2 e luz). Embora já existam alguns estudos acerca dos diferentes modos de
crescimento citados, o conhecimento do funcionamento da célula a nível molecular ainda é limitado. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi identificar as modificações nos proteomas da C. vulgaris, além das alterações nos perfis de crescimento e composição celular, sob condições autotróficas, heterotróficas e mixotróficas, incluindo as transições entre elas, a fim de compreender os mecanismos moleculares utilizados pelas microalgas para adaptação e crescimento nas condições estudadas. As três diferentes condições de cultivo afetaram significativamente o crescimento, composição celular e proteoma da C. vulgaris. A condição mixotrófica proporcionou maior e mais rápido crescimento celular, e houve curto período de aclimatação após as alterações nas condições de cultivo. A composição de conteúdo total de lipídios, carboidratos, proteínas, clorofila, amido e nitrogênio da C. vulgaris diferiu significativamente dependendo das três condições de crescimento estudadas. Foram identificadas 204 proteínas nos três regimes de crescimento, incluindo pontos de transições entre eles, sendo ainda 19 proteínas identificadas exclusivamente em mixotrofia, 8 identificadas exclusivamente em heterotrofia e 6 proteínas identificadas exclusivamente em autotrofia. Os resultados sugerem que a condição de crescimento mixotrófico, que fornece a célula ao mesmo tempo, luz, CO2 e glicose, é determinado
por um perfil proteômico específico, que é evidentemente distinguível da autotrofia e heterotrofia. Verificou-se ainda que várias proteínas envolvidas na fotossíntese, fixação de CO2, ciclo do ácido tricarboxílico, glicólise, via das pentoses fosfato, entre
outras vias metabólicas, foram diferentemente reguladas dependendo da fonte de carbono disponível e presença ou ausência de luz. A modulação da expressão proteica em resposta as variações nas condições de cultivo indica heterogeneidade metabólica das condições de crescimento investigadas. A maior contribuição do presente trabalho foi, portanto, estudar as alterações no perfil de proteínas de células nos três regimes de crescimento contribuindo para a compreensão do processo de mixotrofia, que ainda permanece muito pouco elucidado. Os resultados obtidos indicam que a mixotrofia é um regime de crescimento a ser mais profundamente investigado diante do seu potencial de aproveitamento de CO2 com a utilização simultânea de luz e uma
fonte de carbono orgânico que leva ao aumento da produtividade de biomassa, enquanto também mantém um alto teor de compostos de interesse derivados da fotossíntese.
Abstract
Some species of microalgae can change your metabolism as an answer to modifications in the environmental conditions. Chorella vulgaris (C. vulgaris) is an example of microalgae capable to growth in three different cultivation modes: autotrophic (CO2 and light), heterotrophic (glucose, without light) and mixotrophic
(CO2, light and glucose). Although there are some studies about these different modes
of growth in microalgae cultures, knowledge of cell behavior at molecular level at these conditions is still limited. In this context, the aim of this study was to identify the changes in the C. vulgaris proteomes as well as changes in growth profiles and cellular composition under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic cultivation modes, in order to understand the molecular mechanisms used by microalgae to adapt to changes in growth conditions. The three different growth conditions significantly affect cell composition and proteome of C. vulgaris. The mixotrophic condition provided greater and faster cell growth, and there was not observed a period of adjustment after changes in growing conditions. The composition of lipids, carbohydrates, proteins, chlorophyll, starch and nitrogen from C. vulgaris differed significantly depending on the growth conditions studied. 204 proteins have been identified during the three growth regimes and transitions between them, and, while 19 proteins were identified only on mixotrophy, 8 were identified only in heterotrophic and 6 were identified only in autotrophy, indicating more complexity involved in growth condition during mixotrophic growth. It was found that various proteins involved in photosynthesis, CO2 fixation, tricarboxylic acid cycle, glycolysis,
pentose phosphate pathway, among others metabolisms were otherwise regulated depending on the power source available for the cells. The presence of glucose, the light energy and CO2 induced or repressed expression of a large variety of cellular
proteins, confirming the metabolic heterogeneity of growth conditions investigated. The major contribution of this thesis was the characterization of a third growth regime, the mixotrophy, which still remains little understood, and that is a growth regime to be explored due to the potential for CO2 utilization. This growth regime allows
simultaneous use of light and an organic nutrient, increasing the productivity of biomass while also maintaining a high level of interesting photosynthesis compounds.
Lista de ilustrações
FIGURA 1.CICLO DO CO2 PARA OS COMBUSTÍVEIS FÓSSEIS E RENOVÁVEIS. ... 22
FIGURA 2.ESQUEMA SIMPLIFICADO DE UMA CADEIA DE BIORREFINARIA. ... 24
FIGURA 3.POTENCIAIS PRODUTOS OBTIDOS A PARTIR DA BIORREFINARIA DE MICROALGAS. ... 24
FIGURA 4.GRANDES TANQUES ABERTOS UTILIZADOS NO CULTIVO DE SPIRULINA PELA EMPRESA CYANOTECH. ... 26
FIGURA 5.EXEMPLOS DE FOTOBIORREATORES FECHADOS NO CULTIVO DE MICROALGAS. ... 27
FIGURA 6.ESQUEMA DA IONIZAÇÃO POR ELECTROSPRAY (ESI). ... 41
FIGURA 7.ESQUEMA EM CORTE TRANSVERSAL DO ANALISADOR DE MASSAS ORBITRAP. ... 42
FIGURA 8.ESQUEMA DO LTQORBITRAP. ... 42
FIGURA 9.ESQUEMA DOS DIFERENTES TIPOS DE PROTEÔMICA. ... 43
FIGURA 10.PREPARO DO INÓCULO. ... 46
FIGURA 11.ADAPTAÇÃO DO BIORREATOR NO INTERIOR DE UMA CÂMARA DE LÂMPADAS FLUORESCENTES. ... 49
FIGURA 12.DISTRIBUIÇÃO DOS PONTOS DE AMOSTRAGEM EM CADA CONDIÇÃO DE CRESCIMENTO ESTUDADA. ... 59
FIGURA 13.PERFIL DE CRESCIMENTO CELULAR DA C. VULGARIS. ... 60
FIGURA 14.PERFIS DE CRESCIMENTO CELULAR DA C. VULGARIS. ... 62
FIGURA 15.PERFIL DE PH DA C. VULGARIS. ... 63
FIGURA 16.PERFIS DE CRESCIMENTO CELULAR (-□-) E CONSUMO DE GLICOSE (-▲-) DA C. VULGARIS. ... 64
FIGURA 17.PERFIL DE CONSUMO DE NITROGÊNIO NO MEIO DE CULTIVO DA C. VULGARIS. .. 65
FIGURA 18.PERFIL DE CONSUMO DE FOSFATO NO MEIO DE CULTIVO DA C. VULGARIS. ... 66
FIGURA 19.PERFIL DA BIOMASSA (MASSA SECA) INDIVIDUAL DAS CÉLULAS DE C. VULGARIS. ... 68
FIGURA 20.PERFIL DE CRESCIMENTO CELULAR DA C. VULGARIS EM NÚMERO DE CÉLULAS POR MILILITRO DE MEIO CULTIVO. ... 69
FIGURA 21.PARÂMETROS CINÉTICOS DE CRESCIMENTO CELULAR DA C. VULGARIS. ... 70
FIGURA 22.PERFIL DE CLOROFILA NO (A) MEIO DE CULTIVO E DA (B) CÉLULA DA C. VULGARIS. ... 72
FIGURA 23.PERFIL DE PROTEÍNA NO (A) MEIO DE CULTIVO E DA (B) CÉLULA DA C. VULGARIS. ... 74
FIGURA 24.PERFIL DE NITROGÊNIO NO (A) MEIO DE CULTIVO E DA (B) CÉLULA DA C. VULGARIS. ... 75
FIGURA 25.PERFIL DE CARBOIDRATO NO (A) MEIO DE CULTIVO E DA (B) CÉLULA DA C. VULGARIS. ... 77
FIGURA 26.PERFIL DE CARBONO ORGÂNICO DA CÉLULA AO LONGO DO CULTIVO (A) E DA (B) CÉLULA DA C. VULGARIS. ... 78
FIGURA 27.PERFIL DE AMIDO DA CÉLULA DE C. VULGARIS. ... 80
FIGURA 28. TEOR DE LIPÍDIOS DA BIOMASSA DA C. VULGARIS. ... 82
FIGURA 29.TEORES DE CLOROFILA (A); PROTEÍNA (B), AMIDO (C), CARBOIDRATOS (D), NITROGÊNIO (E) E CARBONO ORGÂNICO (F) DA BIOMASSA DA C. VULGARIS. ... 84
FIGURA 30.REPRESENTAÇÃO DOS PONTOS DE TEMPO COLETADOS. ... 85
FIGURA 31.DIAGRAMA VENN DE PROTEÍNAS IDENTIFICADAS NOS PONTOS DOS TEMPOS T72
(AUTOTROFIA),T120(MIXOTROFIA) E T144(HETEROTROFIA). ... 86
FIGURA 32.DENDOGRAMA E MAPA DE CALOR RESULTANTE DA ANÁLISE DE AGRUPAMENTO.
... 88 FIGURA 33.DENDOGRAMA E MAPA DE CALOR RESULTANTE DA ANÁLISE DE AGRUPAMENTO.
... 90 FIGURA 34.CATEGORIZAÇÃO FUNCIONAL DAS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS (VIAS
METABÓLICAS ENRIQUECIDAS) DOS PROTEOMAS COM BASE NO BANCO DE DADOS
KEGG. ... 91 FIGURA 35.MAPA DE CALOR DO Z-SCORE (*-1) DOS VALORES-P CORRIGIDOS OBTIDOS
ATRAVÉS DE ANÁLISE DE VIAS METABÓLICAS ENRIQUECIDAS PELO KEGG(VALORES DE SIGNIFICÂNCIA DE VIAS METABÓLICAS). ... 92
FIGURA 36.PERFIL DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA FOTOSSISTEMA IID2. ... 93
FIGURA 37.PERFIL DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RIBULOSE BISFOSFATO CARBOXILASE. ... 94
FIGURA 38.INTENSIDADE LFQ DA PROTEÍNA CITRATO SINTASE NAS TRÊS CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO ESTUDADAS. ... 97
FIGURA 39.INTENSIDADE LFQ DA PROTEÍNA 3-OXOACIL SINTASE NAS TRÊS CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO ESTUDADAS. ... 98
FIGURA 40.PERFIL DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA GLICOSE-6-FOSFATO 1-DESIDROGENASE. .. 99
FIGURA 41.PERFIL DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA ATP SINTASE SUBUNIDADE ALFA. ... 100
Lista de tabelas
TABELA 1.MICROALGAS E SEUS PRINCIPAIS PRODUTOS COMERCIALIZADOS. ... 21
TABELA 2.VANTAGENS E LIMITAÇÕES DOS PROCESSOS DE PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS A PARTIR DE MICROALGAS. ... 23
TABELA 3.COMPOSIÇÃO DO MEIO SINTÉTICO BBM MODIFICADO (PH6.8). ... 45
TABELA 4.PARÂMETROS CINÉTICOS AVALIADOS. ... 54
TABELA 5.PARÂMETROS CINÉTICOS DE CRESCIMENTO CELULAR DA C. VULGARIS NAS
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
ANOVA Análise de Variância
BSA Albumina bovina
CID Colisão Induzida por Dissociação
Da Dalton
DDA Aquisição Dependente de Dados
DTT Ditiotreitol
ESI Ionização por Eletrospray
FDR Taxa de Descoberta Falsa
IAA Iodoacetamida
MS espectrometria de massas
LC Cromatografia Líquida
MALDI Dessorção/Ionização a Laser Assistida por
Matriz
TOF Tempo de Vôo
Na2EDTA Ácido etileno diamino tetra-acético dissódico
KOH Hidróxido de potássio
CaCl2.2H2O Cloreto de cálcio dihidratado
MgSO4.7H2O Sulfato de magnésio heptahidratado
K2HPO4 Fosfato de potássio dibásico
KH2PO4 Fosfato de potássio monobásico
NaCl Cloreto de sódio
Fe2SO4.7H2O Sulfato ferroso heptahidratado
H2SO4 (μL/L) Ácido sulfúrico
H3BO3 Ácido bórico
ZnSO4.7H2O Sulfato de zinco heptahidratado
MnCl2.4H2O Dicloreto de manganês tetrahidratado
CuSO4.5H2O Sulfato de cobre pentahidratado
Co(NO3)2.6H2O Nitrato de cobalto II hexahidratado
NaNO3 Nitrato de sódio
% Porcento ∆ Delta °C Graus Celsius µg Microgramas µL Microlitros µm Micrômetros cm Centímetros h Horas L Litros M Molar m/z Massa/carga mM Milimolar mm Milímetros nm Nanômetros V Volume
Px Produtividade celular
Px_máx Produtividade celular máxima
R2 Quadrado do coeficiente de correlação
t Tempo
tg Tempo de geração
txmáx
Tempo para atingir a concentração máxima de biomassa
Xmáx Concentração celular máxima
máx Velocidade máxima específica de crescimento
Abs Absorbância
C/N Razão carbono/nitrogênio
lag latência
ppm Partes por milhão
rpm Rotações por minuto
UV Ultra violeta
v/v Relação volume/volume
vvm Volume de ar por volume de meio por minuto
máx Máximo valor atingido
X Biomassa
IEA Agência Internacional de Energia
Q quadrupólo
QIT quadrupolo íon trap
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 20
2.1. MICROALGAS ... 20
2.2. POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DAS MICROALGAS ... 20
2.3. DESENVOLVIMENTO EM CULTIVOS MICROALGAIS: AUTOTROFIA, MIXOTROFIA E HETEROTROFIA ... 25
2.3.1. Desenvolvimento de cultivos microalgais no laboratório de engenharia bioquímica, biorrefinaria e produtos de origem renováveis – LEBBPOR/UNICAMP ... 30
2.4. FATORES QUE INFLUENCIAM O CRESCIMENTO DE MICROALGAS ... 34
2.4.1. Luz ... 34
2.4.2. Nutrientes ... 35
2.4.3. pH ... 37
2.5. MICROALGAS DO GÊNERO CHLORELLA... 37
2.6. ANÁLISE PROTEÔMICA ... 37
2.6.1. Espectrometria de massas (MS) aplicada à análise proteômica ... 39
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 45
3.1. MEIO DE CULTIVO... 45
3.2. MICROALGA ... 46
3.3. PREPARO DO INÓCULO ... 46
3.4. CONTROLE DA AXENIA DOS CULTIVOS ... 47
3.5. CULTIVO EM BIORREATOR ... 47
3.6. MÉTODOS ANALÍTICOS ... 50
3.6.1. Determinação da concentração celular ... 50
3.6.2. Contagem de células ... 50
3.6.3. Determinação da concentração de glicose ... 51
3.6.4. Determinação da concentração de nitrogênio total, carbono total e carbono orgânico ... 51
3.6.5. Quantificação de carboidratos na célula ... 51
3.6.6. Quantificação de pigmentos na célula ... 52
3.6.7. Análise de fosfato ... 52
3.6.8. Quantificação de amido ... 53
3.6.9. Quantificação de lipídios ... 53
3.7. TRATAMENTO ESTATÍSTICO ... 54
3.8. CÁLCULOS DOS PARÂMETROS CINÉTICOS ... 54
3.9. ANÁLISE PROTEÔMICA ... 55
3.9.1. Extração e quantificação de proteínas ... 55
3.9.2. Identificação de proteínas por espectrometria de massas ... 56
3.10. BIOINFORMÁTICA ... 57
3.10.2. Análise de dados do proteoma e anotação funcional ... 57
3.10.2.1. Perseus ... 57
3.10.2.2. Anotação funcional de proteínas e análise de enriquecimento de vias metabólicas 58 3.10.3. Cálculo de outliers ... 58
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 59
4.1. CRESCIMENTO CELULAR DA C. VULGARIS CULTIVADA SOB AUTOTROFIA, MIXOTROFIA E HETEROTROFIA ... 59
4.1.1. PARÂMETROS CINÉTICOS DE CRESCIMENTO DA C. VULGARIS ... 66
4.2. INFLUÊNCIA DAS DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO NA COMPOSIÇÃO CELULAR DA C. VULGARIS ... 71
4.3. ANÁLISE PROTEÔMICA DA C. VULGARIS SOB CONDIÇÕES DE AUTOTROFIA, MIXOTROFIA E HETEROTROFIA ... 85
5. CONCLUSÕES ... 102
6. CONTINUIDADE DO TRABALHO ... 105
E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 105
6.1. CONTINUIDADE DO TRABALHO ... 105
6.2. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 105
7. REFERÊNCIAS ... 107
ANEXO 1 ... 121
ANEXO 2 ... 132
ANEXO 3 ... 157
1. INTRODUÇÃO
Microalgas são organismos unicelulares, produtoras de uma complexa biomassa, e por isso atraem muito interesse como produtoras de compostos de alto valor agregado (Richmond, 2004). Possuem diferentes aplicações nas indústrias biotecnológica, farmacêutica, nutricional e alimentícia, e mais recentemente as microalgas têm sido extensivamente estudadas como matéria prima promissora para a produção de combustíveis renováveis (Zhu, 2015).
Tanto em ambientes naturais quanto artificiais, as microalgas podem ser expostas a uma variedade de condições ambientais e disponibilidade de nutrientes que afetam a sua taxa de crescimento e sua composição celular (Juneja et al., 2013). Essas condições influenciam a composição da célula em termos de conteúdo de proteínas, carboidratos, lipídios, aminoácidos, pigmentos etc. (Sharma et al., 2012).
Algumas espécies de microalgas podem alterar até mesmo o tipo de metabolismo em resposta às mudanças nas condições ambientais (Menina et al., 2015). Baseado na fonte de carbono disponível e no modo de utilização de energia, são três os regimes de crescimento possíveis das microalgas: autotrofia, heterotrofia e mixotrofia. Microalgas autotróficas, requerem para o seu crescimento sais e uma fonte de carbono inorgânico passível de ser assimilada inicialmente com o uso da energia luminosa; enquanto que para crescer heterotroficamente, as microalgas requerem uma fonte externa de composto orgânico, bem como sais (Brennan e Owende, 2010).
Algumas microalgas são também mixotróficas, ou seja, elas têm a capacidade de crescer usando uma combinação de processos metabólicos que são necessários para a autotrofia e para a heterotrofia, realizando, por exemplo, a fotossíntese com aquisição simultânea de nutrientes orgânicos exógenos (Brennan and Owende, 2010).
Embora já existam alguns estudos sobre os diferentes modos de crescimento citados, a complexa gama de alterações moleculares e metabólicas que propiciam o crescimento das microalgas nas variadas condições de cultivo ainda não está totalmente esclarecida.
Sistemas de produção envolvendo diferentes combinações de regimes de crescimento, em várias configurações de reatores, estão sendo estudadas e otimizadas, buscando maximizar a produtividade de biomassa (Chen et al., 2011). Entretanto, o conhecimento do funcionamento da célula a nível molecular ainda é limitado e seu aprofundamento pode auxiliar na identificação de vias biológicas importantes para o incremento do acúmulo de biomassa, impulsionando estratégias de melhoria das cepas.
Neste contexto, os recentes avanços na caracterização do proteoma de microalgas podem representar a chave para compreender os mecanismos que regem o crescimento celular, metabolismo e a biossíntese de produtos de valor agregado, a fim de melhorar a eficiência dos sistemas de produção, qualidade e rendimento dos produtos finais.
Os recentes trabalhos de proteômica de microalgas têm se centrado preponderantemente no estudo da biossíntese de lipídios (Yang et al., 2014; Nojima et al., 2013; Li et al., 2015b). A compreensão de como os regimes de crescimento influenciam os processos biológicos, crescimento e funções metabólicas mais amplas (não apenas indução lipídica) é fundamental para que o aumento de escala de processos seja bem sucedido para as culturas de microalgas em sistemas comerciais e industriais.
Assim, o objetivo do presente trabalho foi identificar as modificações nos perfis de proteínas da microalga C. vulgaris, além das alterações nos perfis de crescimento e composição celular em diferentes condições de cultivo, quais sejam: crescimento autotrófico (com CO2 e luz), crescimento heterotrófico (com glicose, sem luz, sem CO2)
e crescimento mixotrófico (com glicose, CO2 e luz), além das transições entre cada
regime, a fim de compreender melhor os mecanismos moleculares utilizados pelas microalgas para se adaptarem a tais alterações nas condições ambientais.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Microalgas
As microalgas estão entre os seres vivos mais antigos do planeta e são encontradas no mundo todo, estando distribuídas principalmente em ambientes aquáticos, tais como oceanos, rios e lagos, e na superfície de alguns tipos de solo (Mata et al., 2010). Esta ampla distribuição geográfica se reflete na vasta gama de espécies, e a surpreendente tolerância a ambientes extremos e condições adversas que esses microrganismos apresentam (Richmond, 2004).
A grande maioria das espécies de microalgas conhecidas são microrganismos simples, fotossintetizantes, eucarióticos, e apresentam altas taxas de crescimento e eficiência fotossintética devido a sua estrutura celular relativamente simples (Li et al., 2007). Microalgas eucarióticas são classificadas em uma variedade de classes definidas principalmente por sua pigmentação e estrutura celular. Algumas classes importantes são: as algas verdes (Chlorophyta), algas vermelhas (Rhodophyta) e diatomáceas (Bacillariophyta) (Brennan e Owende, 2010).
2.2. Potencial biotecnológico das microalgas
As microalgas possuem vários usos na indústria biotecnológica atual, possuindo aplicabilidade na produção de diversos compostos de elevado valor agregado. Esses produtos apresentam diferentes aplicações nas indústrias cosmética, alimentícia, química, farmacêutica, entre outras. Alguns desses usos estão listados na Tabela 1 (Markou e Nerantzis, 2013).
Tabela 1. Microalgas e seus principais produtos comercializados.
Microalga Principais produtos*
Arthrospira sp. Proteína: fazendas de pesca, alimentos nutricionais; Lipídeos: ácidos graxos de elevado valor; Pigmentos: carotenóides.
Botryococcus braunii Hidrocarbonetos; Pigmentos
Chlorella sp. Proteínas: fazendas de peixes, alimentação de bovinos, suínos e aves
C. vulgaris Proteínas: alimentos nutricionais, fazendas de peixes, alimentação de bovinos, suínos e aves; Aplicações cosméticas
Lipídeos, especialmente ácidos graxos poli-insaturados de elevado valor agregado
Dunatiella salina Pigmentos (caroteno)
Haematococcus pluvialis Pigmentos
Nannochloropsis oculata Lipídeos, especialmente ácidos graxos poli-insaturados de
elevado valor agregado * Fonte dos dados: Zhu (2015).
Atualmente, muitas empresas operam a nível global e em escalas relevantes comercialmente visando a produção de biomassa de microalgas para aplicação em produtos de elevado valor agregado, exemplos são: Cyanotech, Seambiotic, Mera pharma e FujiChemical.
Além dessas importantes aplicações, ao longo dos últimos anos, estes microrganismos estão sendo muito estudados para aplicação na indústria de bioenergia visando diversificar a matriz energética global (Ullah et al., 2015). A Figura 1 apresenta o ciclo do CO2 a partir das rotas fósseis e dos biocombustíveis.
Figura 1. Ciclo do CO2 para os combustíveis fósseis e renováveis.
*Modificado de Zhu (2015).
Conforme apresentado na Figura 1, uma das principais vantagens associadas ao uso de microalgas como fonte de energia reside na elevada capacidade de biofixação do dióxido de carbono na etapa de cultivo dos mesmos.
Microalgas são apontadas na produção de vários tipos de biocombustíveis: o metano, produzido por digestão anaeróbia da biomassa, o bio-hidrogênio, produzido fotobiologicamente, o biodiesel produzido a partir do óleo de microalgas, bioetanol e outros produtos também são citados na literatura (Spolaore et al., 2006; Chisti, 2007; John et al., 2011). Os principais produtos, bem como as vantagens e limitações encontradas em cada uma das rotas para a produção destes são apresentadas na Tabela 2.
Um problema comum a muitos dos processos apresentados na Tabela 2, é o não aproveitamento de todas as frações úteis e valorosas da biomassa microalgal. Diante dessa problemática, o conceito de biorrefinaria vem sendo apontado em estudos recentes como uma forma promissora de promover a indústria de microalgas.
A Agência Internacional de Energia (IEA) define biorrefinaria como o processamento combinado e sustentável de biomassa em uma vasta gama de bioprodutos (alimentos, rações, químicos, etc.) e bioenergia (biocombustíveis, energia/calor) (www.iea.org). O principal interesse por trás da biorrefinaria é que ela
possibilita a produção de diferentes produtos partindo de uma mesma matéria prima. A cadeia esquemática de uma biorrefinaria é apresentada na Figura 2.
Tabela 2. Vantagens e limitações dos processos de produção de biocombustíveis a partir de microalgas.
Processo Vantagens Limitações
Pirólise Elevados rendimentos
(superiores a 57,5%) são relatados
Processo requer biomassa seca, resultando em um elevado gasto energético Liquefação termoquímica Rendimentos superiores a
60% são relatados, possível uso da biomassa com seu conteúdo natural de umidade
Reatores são complexos e caros
Fermentação Os coprodutos podem ser utilizados, é possível converter açúcar a etanol por essa rota
Tempos de processamento elevados e a biomassa precisa ser processada a açúcares através de processos caros
Transesterificação Comercialização de biodiesel já está presente no mercado
As frações de proteínas e carboidratos não são utilizadas e a produção de biodiesel é limitada a conversão dos lipídeos.
Fonte dos dados: Juneja et al. (2013).
O conceito de biorrefinaria se aplica muito bem ao cultivo de microalgas, devido a vasta gama de possibilidades de produtos que esses microrganismos podem produzir. A Figura 3 apresenta as diferentes possibilidades de produtos que podem ser gerados a partir da biorrefinaria de microalgas.
Microalgas são ricas em lipídeos, proteínas, carboidratos e muitos outros compostos de elevado valor agregado. Os lipídeos extraídos das células de microalgas podem ser convertidos em biodiesel, enquanto os carboidratos, tal como amido,
podem ser convertidos em bioetanol a partir de processos fermentativos. Além dessas rotas, os carboidratos, proteínas e lipídeos podem ser convertidos em metano e bio-hidrogênio através do processo de digestão anaeróbia (Ullah et al., 2015).
Figura 2. Esquema simplificado de uma cadeia de biorrefinaria. Modificado de Zhu (2015).
Figura 3. Potenciais produtos obtidos a partir da biorrefinaria de microalgas. Modificado de Zhu (2015).
Outras rotas alternativas apontam para a produção de biobutanol, bio-óleo, gás de síntese e combustível de aviação a partir da biomassa de microalgas utilizando processos químicos, termoquímicos ou bioquímicos de conversão (Harun et al., 2010; Freitas e Guirardello, 2013).
2.3. Desenvolvimento em cultivos microalgais: autotrofia, mixotrofia e heterotrofia
Tanto em ambientes naturais quanto artificiais, as algas podem ser expostas a uma variedade de condições ambientais que afetam a sua taxa de crescimento e sua composição celular. O metabolismo das microalgas é extremamente dinâmico, devido a isso elas são capazes de alterar sua composição celular sob diferentes condições de crescimento (Menina et al., 2015).
Baseado na fonte de carbono disponível e no modo de utilização de energia, são três os regimes de crescimento possíveis das microalgas: autotrofia, heterotrofia e mixotrofia. Algas autotróficas requerem apenas compostos inorgânicos, tais como o CO2 e sais, e uma fonte de energia para o crescimento (ex. Luz); enquanto que para
crescer heterotroficamente, requerem uma fonte externa de composto orgânico, bem como outros nutrientes como fonte de energia (Brennan e Owende, 2010).
Algumas microalgas são também mixotróficas, ou seja, elas têm a capacidade de crescer usando uma combinação de processos metabólicos que são necessários para a autotrofia e para a heterotrofia, realizando, por exemplo, a fotossíntese com aquisição simultânea de nutrientes orgânicos exógenos (Brennan e Owende, 2010).
No crescimento de microalgas fotossintetizantes, a luz é a fonte de energia para o crescimento autotrófico e é usada para converter dióxido de carbono em compostos orgânicos, especialmente açúcares. A intensidade da luz também afeta o crescimento e a composição celular de microalgas, com crescimento prejudicado quando os níveis de iluminação são muito baixos (fotolimitação) ou muito altos (fotoinibição) (Andrade e Costa, 2007).
Sistemas de produção envolvendo diferentes combinações de regimes de crescimento, em várias configurações de reator, têm sido propostos numa tentativa de maximizar a produtividade de microalgas. Dentre as configurações de reator, temos de forma geral os processos abertos e os fechados (Chen et al., 2011).
Grandes tanques abertos ao ar livre, que imitam ambientes naturais de microalgas (Figura 4) são os sistemas a mais tempo utilizados em indústrias de cultivos de microalgas (Richmond, 2004), por possuir custos de construção e operação mais baixos. A forma mais comum é o tanque em forma de pista, uma forma oval que se assemelha a um circuito de corrida de carros (Chisti, 2007). Outra vantagem desse sistema de tanques abertos é que podem ser construídos em áreas degradadas e de terras não férteis (Chen e Johns, 1996).
Figura 4. Grandes tanques abertos utilizados no cultivo de Spirulina pela empresa Cyanotech.
Disponível em: www.cyanotech.com.
As desvantagens dos tanques abertos são: (i) a distribuição de luz diminui com a profundidade, em consequência disso, o tanque precisa ser muito raso, o que acarreta num volume pequeno em relação à área construída; (ii) a possibilidade de
contaminação é aumentada por ser um sistema aberto; (iii) o crescimento celular fica dependente das condições do clima local e (iv) por conta das baixas densidades celulares, a separação da biomassa do meio de cultivo é cara e limitada (Suali e Sarbatly, 2012; Chisti, 2007).
Os fotobiorreatores fechados (Figura 5) permitem resolver alguns dos inconvenientes apresentados pelos tanques abertos (Lee, 2001). Eles podem reduzir os custos de produção de biomassa através da modelagem do fotobiorreator, maior controle dos parâmetros durante o cultivo, controle operacional para superar limitações de velocidade de crescimento, tais como pH, temperatura e difusão de gás, eles ainda evitam evaporação, permitem atingir concentrações celulares e produtividades volumétricas mais elevadas e ainda evitam possíveis contaminações (Suali e Sarbatly, 2012).
Figura 5. Exemplos de fotobiorreatores fechados no cultivo de microalgas.
Entretanto, fotobiorreatores fechados utilizados para o cultivo autotrófico de microalgas ainda possuem alguns problemas se construídos em grande escala, como por exemplo: dispersão de luz de forma eficiente e uniforme, desenvolvimento de biofilme de algas na superfície limitando a penetração de luz no fotobiorreator e custos bem mais altos de construção e operação, quando comparado a tanques abertos (Perez-Garcia et al., 2011).
Atualmente o cultivo autotrófico é a estratégia mais comum para o cultivo de microalgas, no entanto, esse modo de cultivo vem limitando severamente o aumento na produção de biomassa celular, principalmente pelo problema do auto sombreamento que impossibilita o aumento na disponibilidade de luz, além dos outros problemas já discutidos anteriormente (Tse-Shih Lin e Wu, 2015). Assim, o crescimento heterotrófico pode ser uma alternativa viável para o crescimento fotoautotrófico (Perez-Garcia et al., 2011).
Algumas espécies podem crescer heterotroficamente (Chen e Johns, 1994; Xu et al., 2006), assimilando uma grande variedade de fontes de carbono orgânico, evitando assim os problemas de limitação de luz (Huang et al., 2010).
Na heterotrofia, as microalgas crescem no escuro, suportados por uma fonte exógena de carbono orgânico, substituindo o tradicional aporte de dióxido de carbono e energia luminosa em condições fotossintéticas. Tecnologicamente, o emprego deste tipo de rota metabólica supera algumas limitações de engenharia relacionadas ao fornecimento de energia luminosa, que complica significativamente a configuração do biorreator (Suali e Sarbatly, 2012).
Eliminando a necessidade de luz, esta modalidade de cultivo pode aumentar significativamente a densidade celular e a produtividade da cultura (Chen e Johns, 1994). A configuração heterotrófica ainda pode: permitir a utilização de fermentadores de configuração mais simples, como os biorreatores já utilizados para a produção industrial de medicamentos, bebidas, aditivos alimentares etc., e permitir a utilização de efluentes ou fontes de carbono industriais residuais (Chiu et al., 2015; Malcata, 2011; Gladue e Maxey, 1994).
Embora o crescimento heterotrófico tenha muitas vantagens sobre o crescimento autotrófico, o conteúdo de metabólitos de interesse (ex., pigmentos) pode ser diminuído pela ausência de luz (Cheirsilp e Torpee, 2012). Uma estratégia baseada na utilização simultânea de luz e um nutriente orgânico pode superar esta desvantagem ao mesmo tempo aumentando a concentração de biomassa e produtividade, isto é, a concentração da biomassa pode ser semelhante a de culturas
heterotróficas, enquanto também mantém um alto teor de compostos derivados da fotossíntese (Sevilla et al., 2004).
Estas características, observadas no regime de cultivo mixotrófico, vem sendo consideradas uma variação do cultivo heterotrófico (Tse-Shih Lin e Wu, 2015). Não todas, mas algumas microalgas são capazes de crescer em mixotrofia, ou seja, elas têm a capacidade de crescer usando uma combinação de processos metabólicos que são necessários para a autotrofia e para a heterotrofia, realizando, por exemplo, a fotossíntese com aquisição simultânea de nutrientes orgânicos exógenos. Em cultivos mixotróficos, a presença de um substrato orgânico significa que o crescimento celular não é estritamente dependente da fotossíntese e, portanto, a luz não é um fator de crescimento indispensável.
Embora já existam diversos estudos sobre os diferentes modos de crescimento abordados (Kong et al., 2011; Liang et al., 2009), a complexa gama de alterações moleculares e metabólicas que propiciam o crescimento das microalgas nas variadas condições de cultivo ainda não foi totalmente elucidada, principalmente a mixotrofia.
Por exemplo, foi observado que a assimilação de glicose em certas linhagens de Chlorella é suprimida pela luz, mesmo que esta esteja em baixa intensidade (kamiya e Kowallik, 1987), e é também conhecido que, para algumas microalgas, a total ausência de luz estagna o crescimento e captação de nutrientes se uma fonte de carbono orgânico estiver presente (Sevilla et al., 2004).
Para algumas cepas ainda foi encontrado que condições mixotróficas reduzem a fotoinibição, como se a glicose tivesse uma influência protetora do aparato fotosintético (Chojnacka e Noworyta, 2004). Já outros autores relatam que fontes de carbono orgânico podem reduzir a eficiência fotossintética (Liu et al., 2009; Yang et al., (2000).
Também se discute que na cultura mixotrófica, a concentração de componentes fotossintéticos da célula depende do tempo em que as células permanecem em zonas escuras e iluminadas no biorreator, fato que está ligado ao metabolismos autotrófico e heterotrófico (García et al, 2005). Em altas concentrações celulares, a luz passa a ser limitante para o crescimento celular e o intervalo de
crescimento em condições autotróficas é muito menor se comparado com o heterotrófico. Com a maior densidade celular e menor irradiância no interior do biorreator, as células devem sintetizar mais pigmentos de recepção de radiação, de modo a manter o crescimento (García et al, 2005).
Em culturas mixotróficas de várias linhagens de microalgas, pode haver ainda um efeito de sinergia ou de adição das atividades metabólicas conhecidas da autotrofia e heterotrofia, o que leva a um aumento na produtividade celular (Moheimani et al., 2015). Trabalhos na literatura com diferentes cepas encontraram maior produtividade tanto de biomassa, quanto de metabólitos de interesse, em condições mixotróficas quando comparado a condições autotróficas e heterotróficas (Park et al., 2012; García et al. 2005; Kong et al., 2011). Por exemplo, Sevilla e colaboradores (2004) afirmam que é possível que a disponibilidade de nutrientes orgânicos promova uma alteração metabólica que favoreça a síntese de lipídios.
Em alguns casos, a adição de fonte de carbono orgânico ao cultivo fotoautotrófico inibe o crescimento, enquanto em outros casos estimulam o crescimento (Heredya-Arroyo et al., 2011; Villarejo et al., 1995). Além disso, alguns estudos também revelaram que a concentração de células de microalgas do cultivo mixotrófico foi maior do que a soma dos cultivos fotoautotrófico e heterotrófico, o que pode indicar que o crescimento mixotrófico não é uma simples combinação do crescimento heterotrófico e fotoautotrófico (Marquez et al., 1993; Cheirsilp e Torpee, 2012).
2.3.1. Desenvolvimento de cultivos microalgais no laboratório de engenharia bioquímica, biorrefinaria e produtos de origem renováveis – LEBBPOR/UNICAMP
Pesquisa em cultivo de microalgas com foco em autotrofia e heterotrofia vem sendo realizada no laboratório de engenharia bioquímica (LEBBPOR/UNICAMP) a mais de uma década. A primeira tese nesse tema foi defendida em 2007, e deu início ao estudo de cultivos de cianobactérias em condições autotróficas, tendo como
principal objetivo avaliar a conversão fotossintética de dióxido de carbono através do cultivo da Aphanotece microscopica Nageli. Nesse trabalho foram avaliadas diferentes condições de crescimento, como efeitos de temperatura, intensidade luminosa e concentração de CO2, além de diferentes configurações de fotobiorreatores (Lopes,
2007).
Ainda em condições autotróficas, Lacerda (2009) avaliou o uso de modelos cinéticos de crescimento celular e consumo de dióxido de carbono, para representar o crescimento da mesma cianobactéria (Aphanothece microscopica Nägeli) cultivada em fotobiorreatores. No trabalho de Scoparo, o conceito dos fotobiorreatores foi aplicado no tratamento de efluentes da indústria petroquímica, avaliando quanto do CO2
sequestrado é efetivamente fixado na biomassa de microalgas, além de se realizar um estudo acerca da viabilidade energética e ambiental do processo (Scoparo, 2010).
Foi observado o potencial de sequestro de dióxido de carbono da Aphanothece
microscopica Nägeli cultivada em efluente da indústria petroquímica e através de
estudo de viabilidade energética, demonstrou-se que no ciclo de carbono não há emissão líquida de CO2 para a atmosfera, concluindo que o sistema estudado pode ser
utilizado como fonte de energia limpa (Scoparo, 2010).
Os estudos em autotrofia tiveram sequência na dissertação de mestrado de Francisco (2010). Nesta dissertação, algumas espécies de microalgas descritas pela literatura como produtoras de lipídios foram cultivadas em condições fotossintéticas e avaliadas para a produção de biomassa e de biodiesel. Seis espécies foram avaliadas, dentre elas a microalga Chlorella vulgaris (cepa UTCC90), que apresentou os teores máximos de lipídeos na biomassa (27%) e a cianobactéria Aphanothece microscopica
Nägeli que apresentou melhor desempenho na produção de biomassa e sequestro de
dióxido de carbono.
Na tese de doutorado de Piovanni (2012), os possíveis bioprodutos gerados durante o cultivo autotrófico nas fases sólida, líquida e gasosa da microalga C. vulgaris foram estudados. Os principais resultados desse trabalho evidenciaram a formação de compostos orgânicos extracelulares além da identificação preliminar dos compostos orgânicos voláteis produzidos durante o cultivo, que indicaram a formação de
hidrocarbonetos, aldeídos e cetonas, compostos com interesse comercial, que após sua separação podem intensificar o uso da biorrefinaria de microalgas.
Estudos em condições heterotróficas tiveram o seu início com a dissertação de mestrado de Vidotti (2012). Nesse trabalho foram determinadas as primeiras condições de cultivo heterotrófico axênico no laboratório. Sendo inicialmente utilizados como fonte de carbono orgânico a glicose e o acetato de sódio no crescimento da C. vulgaris. Foram avaliados os efeitos de inibição por substrato, e realizados cultivos em biorreator, em regime de batelada alimentada, visando minimizar os efeitos da inibição, objetivando o aumento da produtividade de biomassa heterotrófica.
Avaliando o comportamento da mesma cepa em heterotrofia, Acosta (2012) avaliou outras fontes de carbono orgânico, sendo elas, glicerol, sacarose, frutose e melaço de cana. O uso do melaço de cana hidrolisado como substrato promoveu os maiores valores de concentração celular final e produtividade em biomassa, quando comparada com as demais fontes de carbono orgânico. Glicerol e frutose não foram consumidos pela C. vulgaris, e a sacarose foi utilizada pela microalga apenas quando hidrolisada.
Embora tenham se iniciado cultivos em condições heterotróficas, parte do grupo ainda dedicou esforços no desenvolvimento de tecnologias de cultivo autotrófico. Exemplo disso foi o trabalho de Lacerda (2013), que testou diferentes temperaturas, concentrações de carbono (CO2), de nitrogênio e intensidades de luz.
Ainda estudou a recuperação da biomassa a partir de floculação, avaliando tipo e concentração de floculante, pH e concentração celular. Por fim, foi feita uma predição da qualidade do biodiesel produzido a partir do óleo de microalga autotrófica.
No mesmo trabalho ainda foi realizado um estudo de viabilidade econômica da produção de biodiesel a partir de microalgas em regime autotrófico. A conclusão foi a não viabilidade econômica desse processo, e diante disso o autor evidenciou os principais pontos do processo que ainda necessitam de estudos e melhorias (Lacerda, 2013).
Em condições heterotróficas, Francisco (2014) avaliou a produção de biomassa e o acúmulo lipídico da cianobactéria Phormidium sp., buscando diferentes estratégias de cultivo empregando a manipueira como substrato (água residual do processo para obtenção da farinha de mandioca).
Além disso, ao longo desses anos, realizou-se em nosso laboratório estudos envolvendo outras cepas, como por exemplo a Scenedesmus bijugus, outros substratos foram testados para crescimento heterotrófico, como a xilose, além de outros modos de cultivo, como o cultivo miniaturizado em microplacas. Também estudou-se a influência da salinidade, diferentes relações carbono/nitrogênio no meio de cultivo, diferentes processos em batelada, em modo contínuo, efeito da limitação de nitrogênio, efeito de lise celular por cisalhamento em biorreator, entre outros estudos.
O método mais comum para o cultivo de microalgas é o fotoautotrófico, no entanto, com base nas tecnologias atuais, esse processo ainda não é economicamente viável para a produção da maioria dos seus potenciais produtos, ficando a exploração de microalgas restrita a um pequeno volume de produtos de alto valor.
Com cultivos em heterotrofia, eliminando a necessidade de luz, eleva-se significativamente a densidade celular e a produtividade da cultura, além de resolver outros problemas inerentes ao cultivo autotrófico de microalgas. Diante disso, nosso laboratório focou nos últimos anos em estudos de microalgas em regime heterotrófico.
Embora todos os trabalhos tenham trazido resultados importantes e significativos no que se refere ao desenvolvimento de tecnologias de cultivo de microalgas, especialmente em condições auto e heterotróficas, muitos desafios ainda precisam ser superados.
Conforme discutido no tópico anterior, diante de discussões controversas acerca do modo de crescimento em mixotrofia e de seu interessante potencial de poder agregar as vantagens advindas tanto da condição fotoautrófica quanto da heterotrófica, como por exemplo, aproveitamento do CO2, produção de compostos de
alto valor derivados da fotossíntese e alta produtividade de biomassa, o presente trabalho se propôs estudar as alterações no crescimento e composição celular, além dos proteomas, nas três condiçoes de crescimento possíveis para C. vulgaris, com o
objetivo de compreender os mecanismos moleculares utilizados pelas microalgas para se adaptarem, não apenas ao regime mixotrófico, mas também aos regimes de crescimento autotrófico e heterotrófico.
A maior contribuição do presente trabalho foi, portanto, aprofundar o conhecimento sobre o regime de crescimento de mixotrofia, que consiste num modo de cultivo a ser explorado pelo seu potencial biotecnológico e que ainda permanece muito pouco elucidado.
2.4. Fatores que influenciam o crescimento de microalgas
Seja em tanques abertos ou em fotobiorreatores fechados, uma cultura de microalgas exige a consideração de alguns fatores, tais como: temperatura, intensidade de luz, pH, níveis de CO2, salinidade e nutrientes, os quais coletivamente
não só afetam a taxa de crescimento das microalgas, mas também influenciam na atividade do metabolismo e composição celular, por sua vez, a composição macromolecular da célula determina a sua utilidade (Mata et al., 2010). Nos tópicos a seguir são discutidos os principais fatores que afetam o crescimento das microalgas dentro do tema abordado no presente trabalho:
2.4.1. Luz
A luz é a fonte de energia no crescimento autotrófico, sendo que a intensidade luminosa exerce grande influência sobre o crescimento das microalgas pois apresenta impacto direto sobre a fotossíntese (Stockenreiter et al., 2013).
Embora a taxa de crescimento das microalgas em condições de luminosidade crescente seja definida em conjunto com outros fatores, existe um ponto máximo de saturação luminosa, para o qual é observado diminuição das taxas de crescimento, seja para condições de luminosidade superiores ou inferiores ao ponto ótimo. Fábregas et al. (2004) avaliaram esse tipo de comportamento para o cultivo da microalga Nannochloropsis sp., sendo observadas redução do crescimento e redução na produção do ácido eicosapentanóico (EPA) para condições de luminosidade superiores ou inferiores a esse ponto.
O processo de fotoadaptação das microalgas resulta em alterações das propriedades celulares de acordo com a disponibilidade de luz e com o aumento da eficiência fotossintética. Esse processo de adaptação pode ocorrer através de diferentes mecanismos, tais como alterações qualitativas e quantitativas da biossíntese de pigmentos e ácidos graxos e modulação da taxa de crescimento (Dubinsky et al., 1995; Fábregas et al., 2004).
Também é relatado que a luminosidade afeta a composição celular das microalgas. Cuhel et al. (1984) avaliaram o crescimento da microalga Dunaliela
tertiolecta sob diferentes condições de luminosidade e observaram que esta apresentou
redução no conteúdo protéico e aumento na fração de lipídeos em resposta a elevação da intensidade luminosa até o seu ponto de saturação.
Altas intensidades luminosas estão normalmente associadas com danos oxidativos nos ácidos graxos polinsaturados. Alguns estudos sugerem que o conteúdo lipídico e de ácidos graxos polinsaturados diminuem com o aumento da intensidade luminosa. Também foi observado que não apenas a intensidade luminosa total, mas também os ciclos luminosos e a composição do espectro de luz incidente influenciam o comportamento e composição macromolecular das microalgas (Renaud et al., 1991).
2.4.2. Nutrientes
Nitrogênio e fosfato são dois macronutrientes importantes para o crescimento e o metabolismo das células de microalgas. Nitrogênio é um elemento fundamental para a formação de ácidos nucléicos e proteínas, sendo responsável por 7 a 20% do peso seco da célula. O fosfato é outro nutriente essencial, sendo por exemplo, parte integrante de moléculas fundamentais tais como ATP. O fosfato faz parte também das moléculas de DNA e RNA, que são moléculas essenciais para as células. Fósforo também aparece como um nutriente importante na síntese dos fosfolipídios (Sun et al., 2012).
Quando submetidas a restrição de algum desses nutrientes, microalgas alteram suas rotas metabólicas de forma a se adaptarem. Os maiores efeitos da deficiência de
nitrogênio e fósforo no meio de cultura incluem a elevação da biossíntese e acúmulo de lipídeos, com uma redução simultânea do conteúdo protéico celular (Wang et al., 2009; Stephenson et al., 2010).
Carbono, hidrogênio e oxigênio são três nutrientes essenciais não minerais. A abundância de hidrogênio e de oxigênio no meio de cultura das microalgas significa que a sua disponibilidade não representa um impedimento ao crescimento celular. Carbono é um dos nutrientes mais importantes que precisa ser fornecido, pois ele apresenta importância fundamental na fotossíntese, no crescimento e reprodução celular.
A redução na taxa de fixação de carbono em autotrofia implica em redução na taxa de crescimento das microalgas. As microalgas precisam de uma fonte de carbono inorgânico para realizar a fotossíntese. O carbono pode ser utilizado na forma de CO2,
carbonatos, ou bicarbonato para a forma de crescimento autotrófica. Já para o crescimento heterotrófico as microalgas utilizam carbono orgânico, como glicose e frutose (Vidotti et al., 2014b).
Metais traços, embora presentes em pequenas quantidades (inferiores a 4 ppm) nas células das microalgas, são componentes essenciais para o metabolismo desses microrganismos. Ferro, manganês, cobalto, zinco, cobre e níquel são seis dos mais importantes metais traços necessários para as microalgas em diferentes metabolismos (Bruland et al., 1991).
Deficiências nesses metais traços podem limitar o crescimento microalgal. Entretanto, quantidades excessivas desses metais também podem ocasionar a inibição do crescimento, prejudicar a fotossíntese, depreciar antioxidantes e danificar a membrana celular (Campanella et al., 2001). O ferro possui maior importância dentre os metais traços, tanto para o crescimento celular normal, quanto para o funcionamento fotossintético das células e para a respiração microalgal.
2.4.3. pH
O pH apresenta influência significativa sobre o crescimento de microalgas, influenciando diretamente a disponibilidade de CO2 e nutrientes essenciais
(Goldman, 1973). Devido a absorção de carbono inorgânico por microalgas, o pH pode aumentar significativamente nessas culturas (Hansen, 2002).
Crescimento máximo é observado em pH neutro (Goldman et al., 1982). Notavelmente pH elevados limitam a disponibilidade de carbono proveniente do CO2, o que pode vir a ocasionar a supressão do crescimento das microalgas. pH
elevados também são reportados por diminuir a afinidade da alga por CO2 livre
(Rotatore e Colman, 1991).
2.5. Microalgas do gênero Chlorella
As microalgas verdes do gênero Chlorella são um grande grupo de microrganismos eucarióticos, unicelulares e fotossintéticos amplamente distribuídos em ambientes de água doce.
Uma característica especial que distingue a C. vulgaris de muitas outras microalgas é a sua capacidade de viver não somente em autotrofia através da fotossíntese, mas também heterotroficamente e mixotroficamente, o que sugere ser dotada de flexibilidade metabólica em resposta a perturbações ambientais.
Devido a essa e outras vantagens, como possuir altas taxas de crescimento, a C.
vulgaris tem despertado interesse e vem sendo extensivamente estudada como uma
microalga com grande potencial para a produção industrial de biomassa (Lee, 2001) e bioprodutos de alto valor agregado (Pulz e Gross, 2004).
2.6. Análise proteômica
Proteínas podem ser definidas como polímeros de aminoácidos resultantes da tradução das informações genéticas contidas no DNA das células. As proteínas desempenham uma série de funções essenciais, e justamente devido a sua diversidade
funcional, elas desempenham papéis essenciais em praticamente todos os fenômenos biológicos, sendo a análise da sua regulação e função molecular fundamental para a compreensão de sistemas biológicos (Mueller et al., 2008).
O termo proteoma foi proposto por Wilkins e Willians em 1994, como sendo todo o conteúdo de proteínas expressas por um genoma (Wilkins et al., 1996b). Devido à natureza dinâmica do proteoma (ele se altera frente a diferentes condições e estímulos), a proteômica é definida como estudo e caracterização (quali e quantitativamente) do conjunto completo de proteínas presentes numa amostra biológica complexa em um determinado momento (Wilkins et al., 1996a).
A proteômica surgiu no final de 1970 quando pesquisadores começaram a criar as bases de dados de proteínas usando naquela época a técnica de eletroforese bidimensional (O'Farrel, 1975). Esta tecnologia, acoplada ao avanço e uso da espectrometria de massas, modificou fundamentalmente o modo como os sistemas biológicos são estudados e compreendidos (Mueller et al., 2008).
Após o sequenciamento do genoma de vários organismos a comunidade cientifica notou que, para se compreender a função gênica em toda sua plenitude, era necessário um estudo em larga escala das proteínas expressas (Riveros et al., 2010).
Constatou-se que o genoma de um organismo representa um primeiro passo para a compreensão dos complexos sistemas biológicos, enquanto o genoma de um organismo permanece relativamente estável ao longo da vida, o proteoma é extremamente dinâmico e variável. As funções biológicas não são executadas por um genoma estático, mas sim pelo conjunto de proteínas sintetizadas em resposta a influências extracelulares, influências essas que determinam a regulação da expressão dos genes e das proteínas (De Keersmaecker et al., 2006; Riveros et al., 2010).
Nesse sentido, a proteômica surge como mais uma ramificação entre as tecnologias ditas “ômicas” para complementar os estudos sobre a biologia molecular das células (Wilkins et al., 1996b). Em suma, enquanto a genômica visa estabelecer quais genes estão presentes no repertório de recursos que o organismo possui, a transcriptômica estuda a abundância dos transcritos gênicos em determinado tempo, local ou condição ambiental. A proteômica, por sua vez, avalia a presença e
abundância das proteínas traduzidas, consequentemente resultantes da expressão gênica (Amaral et al., 2006).
Tais estudos podem contribuir para a compreensão dos mecanismos moleculares que as microalgas utilizam para se adaptarem as mudanças ambientais, como também auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias biotecnológicas para a geração de produtos de interesse.
Atualmente, apesar da relativa riqueza de dados genômicos e transcriptômicos disponíveis de uma diversificada gama de espécies de microalgas, dados de proteômica ainda são relativamente escassos, sendo que a grande maioria das análises proteômicas foram feitas principalmente para o organismo modelo Chlamydomonas
reinhardtii (Guarnieri, 2015). Vale ressaltar ainda que com o recente interesse nos
biocombustíveis de microalgas, uma série de análises proteômicas têm focado apenas nos processos relacionados ao acúmulo de lipídios em microalgas (Yang et al., 2014; Li et al., 2015b; Nojima et al., 2013).
A compreensão de como os regimes de crescimento influenciam os processos biológicos, crescimento e funções metabólicas mais amplas (não apenas indução lipídica) é fundamental para que o aumento de escala de processos seja bem sucedido para as culturas de microalgas em sistemas comerciais e industriais. Também se faz necessário mais estudos proteômicos em diferentes espécies de microalgas para o entendimento mais completo principalmente dos processos que levam ao acúmulo de biomassa e alterações em sua composição.
2.6.1. Espectrometria de massas (MS) aplicada à análise proteômica
A espectrometria de massas desempenha um papel central na proteômica. Nos últimos anos com o avanço notável em tecnologias proteômicas, a espectrometria de massas emergiu como o método principal para a caracterização detalhada dos componentes protéicos de sistemas biológicos (Yates et al, 2007). Esta técnica tornou-se dominante por várias razões, principalmente devido à sua capacidade única de
adquirir grande conteúdo de informação quantitativa de amostras biológicas de enorme complexidade.
Em linhas gerais, a espectrometria de massas determina a relação entre massa e carga (m/z) de espécies ionizadas em fase gasosa. Um espectrômetro de massas é constituído por uma fonte de ionização, um analisador de massas (onde os íons formados são separados de acordo com suas relações m/z), um detector (que registra o número de íons a cada valor m/z), e um sistema de aquisição de dados (Aebersold e Mann, 2003).
Até a década de 1980, um dos principais problemas da aplicação de MS em proteínas envolvia a geração de íons na fase gasosa pelos métodos de ionização disponíveis na época (Pilau, 2010). Nesses métodos, as moléculas a serem ionizadas deveriam estar na fase gasosa, sob alto vácuo e as altas temperaturas, condições geralmente incompatíveis com a preservação da composição de biomoléculas (Riveros et al., 2010).
O grande salto na utilização da espectrometria de massas em análises de biomoléculas ocorreu com o desenvolvimento dos métodos de ionização por eletrospray (ESI), desenvolvida por John Bennet Fenn e a ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI) desenvolvida por Michael Karas e Franz Hillenkamp no final da década de 1980. Essas novas técnicas de ionização de macromoléculas, aliadas aos novos analisadores de massas e às ferramentas de bioinformática, tornaram a espectrometria de massas uma das principais técnicas para a análise e identificação de proteínas atualmente (Pilau, 2010; FENN et al., 1989; Yates, 2004)
A ionização por electrospray (Figura 6) envolve a formação de um spray eletrostático. A solução aquosa contendo o analito é forçada a atravessar uma agulha capilar submetida à alta voltagem. A solução é ejetada como um aerossol de gotas altamente carregadas que, após evaporação do solvente por um fluxo de gás inerte aquecido, geram formas ionizadas do analito (Wilm e Mann, 1994).
Tipicamente, esta solução contendo o analito é bombeada através de um capilar com uma vazão inferior a 10 µL/min. No caso, o nanoeletrospray se trata de fluxos
menores que 1 µL/min. Com a miniaturização do emissor ESI, a quantidade de amostra foi bastante reduzida e a sensibilidade aumentada (Moraes e Lago, 2003).
Figura 6. Esquema da ionização por electrospray (ESI).
Disponível em: http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/hplcms.html.
O analisador de massas também é fundamental para a tecnologia de espectrometria de massas. Para a investigação proteômica, quatro tipos de analisadores de massas são comumente utilizados: quadrupolo (Q), ion trap (quadrupolo íon trap, QIT; linear ion trap, LIT ou LTQ), tempo de vôo (TOF), e transformada de Fourier íon ciclotron de ressonância (FTICR). Eles variam em princípios físicos e desempenho analítico. Instrumentos híbridos, que incluem analisadores do tipo Orbitrap e LTQ, foram posteriormente projetados para combinar as capacidades de diferentes analisadores de massas (Xuemei et al., 2008).
As análises do presente trabalho foram realizadas em um espectrômetro de massas modelo LTQ Orbitrap (Thermo Fisher Scientific). No Orbitrap (Figura 7) os íons orbitam em torno do centro de um eletrodo fusiforme onde oscilam harmonicamente ao longo do seu eixo com uma frequência característica dos valores de m/z (Scigelova e Makarov, 2006).
Com base neste desenvolvimento, um novo espectrômetro de massas híbrido foi criado, o LTQ Orbitrap (Figura 8), que é constituído por um LTQ (linear ion trap) acoplado ao C-trap e ao Orbitrap. Dessa forma ele combina a robustez, sensibilidade e capacidade MS/MS do LTQ, com a precisão muito elevada e alta capacidade de resolução do Orbitrap (Xuemei et al., 2008).
Figura 7. Esquema em corte transversal do analisador de massas Orbitrap. a) eletrodo central; b) eletrodo externo; c) anel de isolamento de cerâmica separando o eletrodo externo em duas seções. Íons representados pela trajetória vermelha se movem em espiral, giram ao redor do eletrodo central (Scigelova e Makarov, 2006).
Figura 8. Esquema do LTQ Orbitrap.
A primeira parte é um espectrômetro de massa LTQ ion trap linear. No C-trap, ions são acumulados, em seguida injetados no Orbitrap e o seus sinais detectados (Scigelova e Makarov, 2006).
Atualmente, as informações sobre o proteoma de uma amostra podem derivar da análise de proteínas intactas (proteômica top-down) ou de seus peptídeos, (proteômica bottom-up) como esquematizado na Figura 9 (Chait, 2006).
Na proteômica bottom-up, inicialmente uma amostra proteica complexa é enzimaticamente digerida em peptídeos com o uso de uma enzima protease, normalmente a tripsina. Essa técnica de espectrometria de massas por ESI ou MALDI é realizada em dois estágios, inicialmente as massas dos peptídeos intactos são
determinadas, posteriormente estes íons peptídicos são fragmentados na fase gasosa para produzir informações sobre a sua sequência e modificações (Chait, 2006).
Na proteômica top-down íons de proteínas intactas são introduzidos na fase gasosa por ESI e são subsequentemente fragmentados no espectrômetro de massas, obtendo-se finalmente as massas moleculares de ambos, da proteína e do fragmento de íon (Chait, 2006).
Figura 9. Esquema dos diferentes tipos de proteômica. Chait (2006).
As limitações da proteômica bottom-up podem estar na cobertura incompleta da sequência das proteínas, na perda das modificações pós-traducionais e nas degradações como resultado da digestão proteolítica. Já a análise top-down permite deduzir a estrutura primária da proteína e a maior parte das modificações pós-traducionais. No entanto, essa estratégia é limitada pela energia de colisão necessária na fragmentação da proteína que é, por vezes, insuficiente para o estudo de proteínas maiores que 50 KDa, tendo melhor aplicação à análise de proteínas purificadas (Nesaty e Suter, 2008).
Na proteômica bottom-up o processo que se inicia com a digestão proteolítica da proteína a ser identificada produz uma coleção de peptídeos (Pennington e Dunn, 2001), que são em seguida submetidos a espectrometria de massas para a detecção das
relações massa/carga por analisadores de massa após a ionização desses peptídeos. O processo finaliza com a geração de uma espécie de impressão digital (fingerprinting) da proteína (com as massas obtidas), as quais são então confrontadas a bancos de dados contendo massas teóricas de peptídeos gerados por digestão enzimática teórica que servem para a identificação das proteínas. (De Souza et al., 2003; Aebersold e Mann, 2003; Twyman, 2004).
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Meio de cultivo
O meio de cultivo sintético BBM - Bold's Basal Medium modificado (Stein-Taylor, 1973) (Tabela 3) foi utilizado em todos os experimentos, inclusive na manutenção, propagação e preparo do inóculo da microalga utilizada.
Tabela 3. Composição do meio sintético BBM modificado (pH 6.8).
Componente (mg.L-1) Componente (mg.L-1) Na2EDTA 50 Fe2SO4.7H2O 4,98 KOH 3,1 H2SO4 (μL/L) 1 CaCl2.2H2O 25 H3BO3 11,42 MgSO4.7H2O 75 ZnSO4.7H2O 8,82 K2HPO4 75 MnCl2.4H2O 1,44 KH2PO4 175 CuSO4.5H2O 1,57 NaCl 25 Co(NO3)2.6H2O 0,49 MoO3 0,71
Apenas a concentração de nitrato de sódio diferencia da composição do meio de cultivo sintético BBM - Bold's Basal Medium modificado. A concentração de nitrato de sódio utilizada no presente trabalho variou com a concentração de glicose no meio, de acordo com a relação carbono/nitrogênio igual a 20. O valor C/N=20 foi obtido em
estudos anteriores em nosso laboratório, que testou diferentes valores para essa relação no crescimento da C. vulgaris (Vidotti et al., 2011).
O pH dos meios de cultivo foram ajustados inicialmente a 6,8 com HCl 1 M. Os meios de cultivo foram esterilizados em autoclave a 121 °C durante 20 minutos.
3.2. Microalga
A microalga C. vulgaris (CPCC90), obtida do Canadian Phycological Culture
Centre, foi utilizada em todos os ensaios. A cultura estoque foi mantida em ágar
inclinado, na ausência de luz e a temperatura ambiente. O ágar inclinado consistiu de meio de cultivo BBM modificado líquido adicionado de ágar-ágar (15 g.L-1), glicose
(10,0 g.L-1) e nitrato de sódio (1,21 g.L-1, equivalente à uma razão carbono/nitrogênio
de 20).
3.3. Preparo do inóculo
O inóculo foi preparado de acordo com a Figura 10. Cada Erlenmeyer de 250 ml contendo meio sólido (ágar inclinado) com células de C. vulgaris na superfície foi lavado com 3,0 mL de meio BBM modificado líquido. Após homogeneização, 3,0 ml da suspensão foram transferidos para Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 mL de meio BBM modificado líquido adicionado de 10,0 g.L-1 de glicose e 1,21 g.L-1 de nitrato de
sódio (razão C/N=20). Células em meio sólido Células em meio líquido Transferência das
células Frascos incubados em shaker Figura 10. Preparo do inóculo.
