Espectrometria de massas (MS) aplicada à análise proteômica

A espectrometria de massas desempenha um papel central na proteômica. Nos últimos anos com o avanço notável em tecnologias proteômicas, a espectrometria de massas emergiu como o método principal para a caracterização detalhada dos componentes protéicos de sistemas biológicos (Yates et al, 2007). Esta técnica tornou- se dominante por várias razões, principalmente devido à sua capacidade única de

adquirir grande conteúdo de informação quantitativa de amostras biológicas de enorme complexidade.

Em linhas gerais, a espectrometria de massas determina a relação entre massa e carga (m/z) de espécies ionizadas em fase gasosa. Um espectrômetro de massas é constituído por uma fonte de ionização, um analisador de massas (onde os íons formados são separados de acordo com suas relações m/z), um detector (que registra o número de íons a cada valor m/z), e um sistema de aquisição de dados (Aebersold e Mann, 2003).

Até a década de 1980, um dos principais problemas da aplicação de MS em proteínas envolvia a geração de íons na fase gasosa pelos métodos de ionização disponíveis na época (Pilau, 2010). Nesses métodos, as moléculas a serem ionizadas deveriam estar na fase gasosa, sob alto vácuo e as altas temperaturas, condições geralmente incompatíveis com a preservação da composição de biomoléculas (Riveros et al., 2010).

O grande salto na utilização da espectrometria de massas em análises de biomoléculas ocorreu com o desenvolvimento dos métodos de ionização por eletrospray (ESI), desenvolvida por John Bennet Fenn e a ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI) desenvolvida por Michael Karas e Franz Hillenkamp no final da década de 1980. Essas novas técnicas de ionização de macromoléculas, aliadas aos novos analisadores de massas e às ferramentas de bioinformática, tornaram a espectrometria de massas uma das principais técnicas para a análise e identificação de proteínas atualmente (Pilau, 2010; FENN et al., 1989; Yates, 2004)

A ionização por electrospray (Figura 6) envolve a formação de um spray eletrostático. A solução aquosa contendo o analito é forçada a atravessar uma agulha capilar submetida à alta voltagem. A solução é ejetada como um aerossol de gotas altamente carregadas que, após evaporação do solvente por um fluxo de gás inerte aquecido, geram formas ionizadas do analito (Wilm e Mann, 1994).

Tipicamente, esta solução contendo o analito é bombeada através de um capilar com uma vazão inferior a 10 µL/min. No caso, o nanoeletrospray se trata de fluxos

menores que 1 µL/min. Com a miniaturização do emissor ESI, a quantidade de amostra foi bastante reduzida e a sensibilidade aumentada (Moraes e Lago, 2003).

Figura 6. Esquema da ionização por electrospray (ESI).

Disponível em: http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/hplcms.html.

O analisador de massas também é fundamental para a tecnologia de espectrometria de massas. Para a investigação proteômica, quatro tipos de analisadores de massas são comumente utilizados: quadrupolo (Q), ion trap (quadrupolo íon trap, QIT; linear ion trap, LIT ou LTQ), tempo de vôo (TOF), e transformada de Fourier íon ciclotron de ressonância (FTICR). Eles variam em princípios físicos e desempenho analítico. Instrumentos híbridos, que incluem analisadores do tipo Orbitrap e LTQ, foram posteriormente projetados para combinar as capacidades de diferentes analisadores de massas (Xuemei et al., 2008).

As análises do presente trabalho foram realizadas em um espectrômetro de massas modelo LTQ Orbitrap (Thermo Fisher Scientific). No Orbitrap (Figura 7) os íons orbitam em torno do centro de um eletrodo fusiforme onde oscilam harmonicamente ao longo do seu eixo com uma frequência característica dos valores de m/z (Scigelova e Makarov, 2006).

Com base neste desenvolvimento, um novo espectrômetro de massas híbrido foi criado, o LTQ Orbitrap (Figura 8), que é constituído por um LTQ (linear ion trap) acoplado ao C-trap e ao Orbitrap. Dessa forma ele combina a robustez, sensibilidade e capacidade MS/MS do LTQ, com a precisão muito elevada e alta capacidade de resolução do Orbitrap (Xuemei et al., 2008).

Figura 7. Esquema em corte transversal do analisador de massas Orbitrap. a) eletrodo central; b) eletrodo externo; c) anel de isolamento de cerâmica separando o eletrodo externo em duas seções. Íons representados pela trajetória vermelha se movem em espiral, giram ao redor do eletrodo central (Scigelova e Makarov, 2006).

Figura 8. Esquema do LTQ Orbitrap.

A primeira parte é um espectrômetro de massa LTQ ion trap linear. No C-trap, ions são acumulados, em seguida injetados no Orbitrap e o seus sinais detectados (Scigelova e Makarov, 2006).

Atualmente, as informações sobre o proteoma de uma amostra podem derivar da análise de proteínas intactas (proteômica top-down) ou de seus peptídeos, (proteômica bottom-up) como esquematizado na Figura 9 (Chait, 2006).

Na proteômica bottom-up, inicialmente uma amostra proteica complexa é enzimaticamente digerida em peptídeos com o uso de uma enzima protease, normalmente a tripsina. Essa técnica de espectrometria de massas por ESI ou MALDI é realizada em dois estágios, inicialmente as massas dos peptídeos intactos são

determinadas, posteriormente estes íons peptídicos são fragmentados na fase gasosa para produzir informações sobre a sua sequência e modificações (Chait, 2006).

Na proteômica top-down íons de proteínas intactas são introduzidos na fase gasosa por ESI e são subsequentemente fragmentados no espectrômetro de massas, obtendo-se finalmente as massas moleculares de ambos, da proteína e do fragmento de íon (Chait, 2006).

Figura 9. Esquema dos diferentes tipos de proteômica. Chait (2006).

As limitações da proteômica bottom-up podem estar na cobertura incompleta da sequência das proteínas, na perda das modificações pós-traducionais e nas degradações como resultado da digestão proteolítica. Já a análise top-down permite deduzir a estrutura primária da proteína e a maior parte das modificações pós- traducionais. No entanto, essa estratégia é limitada pela energia de colisão necessária na fragmentação da proteína que é, por vezes, insuficiente para o estudo de proteínas maiores que 50 KDa, tendo melhor aplicação à análise de proteínas purificadas (Nesaty e Suter, 2008).

Na proteômica bottom-up o processo que se inicia com a digestão proteolítica da proteína a ser identificada produz uma coleção de peptídeos (Pennington e Dunn, 2001), que são em seguida submetidos a espectrometria de massas para a detecção das

relações massa/carga por analisadores de massa após a ionização desses peptídeos. O processo finaliza com a geração de uma espécie de impressão digital (fingerprinting) da proteína (com as massas obtidas), as quais são então confrontadas a bancos de dados contendo massas teóricas de peptídeos gerados por digestão enzimática teórica que servem para a identificação das proteínas. (De Souza et al., 2003; Aebersold e Mann, 2003; Twyman, 2004).