UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE OFTALMOLOGIA,
OTORRINOLARINGOLOGIA E CIRURGIA DE CABEÇA E PESCOÇO
Neuroproteção da retina dos olhos de coelhos albinos
(raça Nova Zelândia) submetidos à vitrectomia com
substituição do vítreo por óleo de silicone
MILA WIERMANN PAQUES
Ribeirão Preto
2006
Livros Grátis
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MILA WIERMANN PAQUES
Neuroproteção da retina dos olhos de coelhos albinos
(raça Nova Zelândia) submetidos à vitrectomia com
substituição do vítreo por óleo de silicone
Tese apresentada ao programa de
pós-graduação de Oftalmologia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Doutor
em Oftalmologia.
Área de Concentração: Mecanismos
Fisiopatológicos nos Sistemas
Visu-al e Áudio-Vestibular
Orientador: Prof. Dr. Wagner Ferreira dos Santos
Ribeirão Preto
2006
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU
PAR-CIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO
CONVENCIO-NAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,
DESDE QUE CITADA A FONTE.
Paques, Mila Wiermann
Neuroproteção da retina dos olhos de coelhos albinos (raça Nova Zelândia) sub-metidos à vitrectomia com substituição do vítreo por óleo de silicone.
Ribeirão Preto, 2006. 168 p.: il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP – Programa: Oftalmologia; Área: Mecanismos Fisiopatológicos nos Sistemas Vi-sual e Áudio-Vestibular – Depto. de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço.
Orientador: dos Santos, Wagner Ferreira.
1. neuroproteção, 2. retina, 3. coelho, 4. vitrectomia via pars plana, 5. óleo de sili-cone, 6. cetamina, 7. lamotrigina, 8. cetoprofeno, 9. necrose, 10. apoptose.
iii
DEDICATÓRIA
A meus pais, Antonio e Otilia, com muito amor e gratidão, por acreditarem em mim e me incentivarem a trabalhar pelos meus ideais de vida. Esta tese com
certeza só foi possível devido ao apoio incondicional dado por eles.
A meu noivo, Luciano, com muito amor e carinho por seu apoio, compreensão e presença, durante todo o período desde a elaboração, realização e finalização
desta tese, sempre me incentivando na busca do melhor resultado.
A meus irmãos, Henrique e Fernanda, com muito carinho, pelo apoio constante.
Às minhas avós, Cléria e Benedita, que com certeza estariam comemorando comigo mais esta conquista.
Aos meus colegas da pós-graduação, Marcelo e Rafael, pela amizade e
com-preensão, por estarem sempre comigo lutando por nossos trabalhos.
A todos os oftalmologistas que buscam em sua prática diária o melhor trata-mento aos seus pacientes com doenças da retina.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Wagner Ferreira dos Santos por sua orientação e seus ensinamen-tos que contribuíram para meu crescimento científico e intelectual.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Jorge pelos ensinamentos na área que escolhi para exer-cer minha medicina e viabilizar a elaboração e realização de minha tese.
Ao Dr. Rubens Camargo Siqueira, pela amizade e importante ajuda nas cirurgi-as experimentais.
Ao Dr. Renato Guizzo e ao estudante José Luiz Liberato, pela amizade e
gran-de ajuda na parte biológica presente nesta tese.
Ao pessoal da cirurgia experimental do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo - Campus Ribeirão Preto, responsáveis por grande parte de meu
sucesso nas cirurgias experimentais.
Ao Professor Doutor Cláudio R. Simon e ao senhor Lucas Anhenzini pela cola-boração na realização do método de TUNEL.
v
Ao Prof. Dr. Amilton Barreira e ao técnico Sr. Antônio Renato M. e Silva, que gentilmente cederam o laboratório de Neurologia Experimental e Aplicada (HCUSP - Ribeirão Preto), assim como forneceram toda a ajuda necessária ao manuseio do microscópio e à utilização de software.
Ao Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e pescoço, pela oportunidade de realizar minha tese de doutorado.
RESUMO
PAQUES, M. W. Neuroproteção da retina dos olhos de coelhos albinos (ra-ça Nova Zelândia) submetidos à vitrectomia com substituição do vítreo por óleo de silicone. 2006. 168f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Neuroproteção consiste na estratégia de se tratar uma doença pela pre-venção da morte neuronial. O objetivo deste estudo, utilizando-se um modelo experimental de lesão crônica da retina, que envolve a realização de vitrectomia via pars plana (VVPP) e injeção de óleo de silicone (IOS), na câmara vítrea de coelhos albinos (Nova Zelândia), é testar os efeitos neuroprotetores de: cetami-na (i.m.; 50 mg/kg), lamotrigicetami-na (v. o.; 25 mg/kg), cetoprofeno (i. m.; 10 mg/kg) e suas associações. Quarenta coelhos (de 2,0 a 2,5 Kg) foram submetidos à VVPP e IOS em um de seus olhos. Após a cirurgia, os coelhos foram divididos aleatoriamente em 8 grupos. Os coelhos do Grupo I receberam injeção intra-muscular diária de solução salina tamponada (operados-salina). As retinas dos olhos contralaterais dos coelhos do Grupo I foram utilizadas como controle, formando mais um grupo (Grupo II, controles-salina). Os coelhos do Grupo III receberam injeção intramuscular diária de cetamina, enquanto que os do Grupo IV receberam lamotrigina por via oral; os do Grupo V, cetoprofeno por via intra-muscular; os do Grupo VI cetamina + lamotrigina por via oral; os do Grupo VII receberam cetamina + cetoprofeno por via intramuscular; os do Grupo VIII la-motrigina + cetoprofeno por via oral; e os coelhos do Grupo IX cetamina + lamo-trigina + cetoprofeno por via oral. Todos os coelhos foram tratados por 4 sema-nas, quando então foram sacrificados. Foram feitas análises qualitativas e quantitativas das retinas coradas com H.E. (hematoxilina-eosina) usando mi-croscópio Zeiss Axiophot e o programa KS 400. As mesmas retinas foram pre-paradas para o método de TUNEL e analisadas em microscópio de fluorescên-cia, utilizando filtro para FITC (fluoresceína isotiocianato), a fim de detectar a presença de apoptose. A análise qualitativa demonstrou edema mais extenso e desorganização celular nas retinas dos coelhos do Grupo I, quando compara-das com os demais grupos. O mesmo ocorreu, de forma menos expressiva, nas retinas dos coelhos dos Grupos IV lamotrigina), V (operados-cetoprofeno) e VIII (operados-lamotrigina+(operados-cetoprofeno). O método de TUNEL mostrou apoptose nas camadas da retina dos coelhos do Grupo V. As densida-des celulares (células/mm2) na camada nuclear externa (CNE), camada nuclear
vii
interna (CNI) e camada de células ganglionares (CCG) da retina de coelhos do Grupo I foram significativamente menores (p<0,05) quando comparadas com as retinas dos coelhos do Grupo II. Houve uma gradação, dentre os agentes neu-roprotetores, na proteção da retina. Na CNE, a ordem da maior para menor pro-teção foi a seguinte: cetamina (96%), cetoprofeno (82%), cetamina + lamotrigi-na + cetoprofeno (80%), cetamilamotrigi-na + lamotrigilamotrigi-na (74%), lamotrigilamotrigi-na + cetoprofe-no (69%), cetamina + cetoprofecetoprofe-no (67%) e lamotrigina (56%). A CNI mostrou esta ordem: cetamina (100%), cetamina + lamotrigina + cetoprofeno (99%), la-motrigina + cetoprofeno (91%), cetoprofeno (90%), cetamina + lala-motrigina (89%), cetamina + cetoprofeno (67%) e lamotrigina (52%). Na CCG: cetamina + lamotrigina (96%), lamotrigina + cetoprofeno (87%), cetamina (72%), cetoprofe-no (49%), cetamina + lamotrigina + cetoprofecetoprofe-no (48%), lamotrigina (41%), ce-tamina + cetoprofeno (37%). Pode-se concluir que a VVPP e IOS foi associada à morte e desorganização de células da retina de coelhos albinos. A presença de núcleo picnótico, edema intracelular, desorganização celular, menor número de células da CNE, CNI e CCG, edema extracelular e desorganização da matriz nas CPE e CPI além de vacuolização do citoplasma nas células ganglionares evidenciaram a necrose e outras lesões celulares nos Grupos I, IV, V e VIII en-quanto que o Grupo V não mostrou proteção contra apoptose, sugerindo que a morte celular após VVPP e IOS envolve mecanismos apoptóticos e de necrose. Após todas as análises, verificou-se que a cetamina, lamotrigina, cetoprofeno e suas associações, foram capazes de proteger a retina contra esses efeitos. Palavras-chave: neuroproteção, retina, coelho, vitrectomia via pars plana, óleo de silicone, cetamina, lamotrigina, cetoprofeno, necrose, apoptose.
PAQUES, M. W. Neuroprotection of albino rabbit (New Zealand) retina eyes
submitted to pars plana vitrectomy and vitreous substitution with silicone oil as vitreous substitute. 2006. 168p. Thesis (Doctoral) - Faculdade de
Medi-cina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Neuroprotection is a strategy of treating a disease through neuronal death pre-vention. The purpose of this study, using a retina chronic lesion from an experi-mental model which involves a pars plana vitrectomy (PPV) and silicone oil in-jection (SOI), in vitreous camara from the albino rabbit (New Zealand), is to test the neuroprotection effects of: ketamine (i.m.; 50 mg/kg), lamotrigine (v.o.; 25 mg/kg), ketoprofen (i.m.; 10mg/kg) and associations. Forty rabbits (2.0 to 2.5 kg) underwent PPV with SOI aleatory in one of their eyes. Postoperatively, rabbits were divided into eight groups. The rabbits from Group I received a daily dose of intramuscular injection of tamponade saline solution (saline-operated). The reti-nas from the contralateral eyes of rabbits from Group I served as control retireti-nas, forming a new group (Group II, saline-controls). The rabbits from Group III re-ceived a daily intramuscular injection of ketamine, while those from Group IV received oral lamotrigine; those from Group V intramuscular ketoprofen; from Group VI oral ketamine + lamotrigine; the rabbits from Group VII received intra-muscular ketamine + ketoprofen; those from Group VIII oral lamotrigine + keto-profen; and the rabbits from Grpup IX, oral ketamine + lamotrigine + ketoprofen. All rabbits were treated for 4 weeks. The animals were euthanized at 4 weeks following the surgery. Qualitative and quantitative analyses were performed from collored retinas with H. E. (hematoxilin-eosine), using the Zeiss Axiophot micro-scope and KS 400 software. The same retinas were prepared to apoptosis (TUNEL methods) and analised in a fluorescence microscope using a FITC fil-ter. The qualitative analysis demonstrated more extensive edema and cell disor-ganization in rabbit retinas from Group I compared to other groups. The same ocurred, in a less expressive way, in rabbit retinas from Groups IV (lamotrigine-operated), V (ketoprofen-operated) and VIII (lamotrigine+ketoprofen-operated). The TUNEL methods showed apoptosis in the retina layers from Group V rab-bits. The cell densities (cell/mm2) in the outer nuclear layer (ONL), inner nuclear layer (INL) and ganglion cell layer (GCL) of rabbit retinas from Group I were sig-nificantly (p<0.05) lower compared to these layers in rabbit retinas from Group II. There was a retina protective gradation, between the neuroprotective agents. In ONL the order from the higher to lower protection was the following: ketamine
ix
(96%), ketoprofen (82%), ketamine + lamotrigine + ketoprofen (80%), ketamine + lamotrigine (74%), lamotrigine + ketoprofen (69%), ketamine + ketoprofen (67%) and lamotrigine (56%). The INL showed this order: ketamine (100%), ketamine + lamotrigine + ketoprofen (99%), lamotrigine + ketoprofen (91%), ke-toprofen (90%), ketamine + lamotrigine (89%), ketamine + keke-toprofen (67%) and lamotrigine (52%). In the GCL: ketamine + lamotrigine (96%), lamotrigine + ke-toprofen (87%), ketamine (72%), keke-toprofen (49%), ketamine + lamotrigine + ketoprofen (48%), lamotrigine (41%) and ketamine + ketoprofen (37%). It is conclusively that PPV with SOI was associated with retinal cell death and disor-ganization in albino rabbit eye retinas. The presence of pyknotic nuclei, intracel-lular swelling, cell disorganization, reduced number of cells in ONL, INL and GCL, matrix extracellular swelling in OPL and IPL besides cytoplasm vacuoliza-tion in GCL cells demonstrated the presence of necrosis and other cell lesions in Groupus I, IV, V and VIII, while Group V didn’t show protection against apop-tosis, what suggests that the cell death after retina ischemia involves apoptotic and necrosis mechanisms. The ketamine, lamotrigine, ketoprofen and associa-tions, after all analysis, were capable to provide protection against these effects. Keywords: neuroprotection, retina, rabbit, pars plana vitrectomy, silicone oil, ketamine, lamotrigine, ketoprofen, necrosis, apoptosis.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Camadas da retina...27 Figura 2- Diagrama da isquemia... 37 Figura 3- Imagens histológicas das retinas dos coelhos não submetidos à VVPP
+ IOS e dos coelhos submetidos à VVPP + IOS sem injeção de drogas neuro-protetoras... 57 Figura 4- Imagens histológicas das retinas dos coelhos não submetidos à VVPP + IOS, dos coelhos submetidos à VVPP + IOS sem injeção de drogas e dos
co-elhos submetidos à VVPP + IOS e à injeção de cetamina... 60 Figura 5- Imagens histológicas das retinas dos coelhos não submetidos à VVPP + IOS, dos coelhos submetidos à VVPP + IOS sem injeção de drogas e dos co-elhos submetidos à VVPP + IOS e à injeção de lamotrigina ...63
Figura 6- Imagens histológicas das retinas dos coelhos não submetidos à VVPP + IOS, dos coelhos submetidos à VVPP + IOS sem injeção de drogas e dos co-elhos submetidos à VVPP + IOS e à injeção de cetoprofeno ...66
Figura 7- Imagens histológicas das retinas dos coelhos não submetidos à VVPP + IOS, dos coelhos submetidos à VVPP + IOS sem injeção de drogas e dos co-elhos submetidos à VVPP + IOS e à injeção de cetamina+lamotrigina ...69 Figura 8- Imagens histológicas das retinas dos coelhos não submetidos à VVPP
+ IOS, dos coelhos submetidos à VVPP + IOS sem injeção de drogas e dos co-elhos submetidos à VVPP + IOS e à injeção de cetamina+cetoprofeno ...72
xi
Figura 9- Imagens histológicas das retinas dos coelhos não submetidos à VVPP + IOS, dos coelhos submetidos à VVPP + IOS sem injeção de drogas e dos co-elhos submetidos à VVPP + IOS e à injeção de lamotrigina+cetoprofeno...75 Figura 10- Imagens histológicas das retinas dos coelhos não submetidos à
VVPP + IOS, dos coelhos submetidos à VVPP + IOS sem injeção de drogas e dos coelhos submetidos à VVPP + IOS e à injeção de cetami-na+lamotrigina+cetoprofeno...78
Figura 11- Imagens histológicas das retinas preparadas para apoptose de con-trole positivo para a técnica, coelhos não submetidos à VVPP + IOS, coelhos submetidos à VVPP + IOS sem injeção de drogas e coelhos submetidos à VVPP + IOS e à injeção de cetamina... 81
Figura 12- Imagens histológicas das retinas preparadas para apoptose de coe-lhos submetidos à VVPP + IOS e à injeção de lamotrigina, VVPP + IOS e à inje-ção de cetoprofeno, VVPP + IOS e à injeinje-ção de cetamina+lamotrigina, VVPP + IOS e à injeção de cetamina+cetoprofeno, VVPP + IOS e à injeção de
lamotrigi-na+cetoprofeno, VVPP + IOS e à injeção de cetami-na+lamotrigina+cetoprofeno...82
LISTA DE TABELAS
Tabela I- Grupos de coelhos albinos da raça Nova Zelândia submetidos à VVPP
e IOS...49 Tabela II- Efeitos na retina da vitrectomia e substituição do vítreo por óleo de silicone dos coelhos controles-salina comparados às retinas dos coelhos opera-dos-salina... ... 58
Tabela III- Efeitos na retina da vitrectomia e substituição do vítreo por óleo de silicone dos coelhos operados-cetamina comparados às retinas dos coelhos controles-salina e operados-salina... ...61 Tabela IV- Efeitos na retina da vitrectomia e substituição do vítreo por óleo de
silicone dos coelhos operados-lamotrigina comparados às retinas dos coelhos controles-salina e operados-salina... ...64 Tabela V- Efeitos na retina da vitrectomia e substituição do vítreo por óleo de silicone dos coelhos operados-cetoprofeno comparados às retinas dos coelhos
controles-salina e operados-salina... ... 67 Tabela VI- Efeitos na retina da vitrectomia e substituição do vítreo por óleo de silicone dos coelhos operados-cetamina+lamotrigina comparados às retinas dos
coelhos controles-salina e operados-salina... 70 Tabela VII- Efeitos na retina da vitrectomia e substituição do vítreo por óleo de silicone dos coelhos operados-cetamina+cetoprofeno comparados às retinas dos coelhos controles-salina e operados-salina... 73
xiii
Tabela VIII- Efeitos na retina da vitrectomia e substituição do vítreo por óleo de silicone dos coelhos operados-lamotrigina+cetoprofeno comparados às retinas dos coelhos controles-salina e operados-salina... 76 Tabela IX- Efeitos na retina da vitrectomia e substituição do vítreo por óleo de
silicone dos coelhos operados-cetamina+lamotrigina+cetoprofeno comparados às retinas dos coelhos controles-salina e operados-salina... 79
LISTA DE SIGLAS
ATP Adenosina
trifosfato
AMPA Ácido
α-amino-3-hidróxi-5-metil-4-
propiônico isoxazol
CCG
Camada
de
células
ganglionares
CNE
Camada
nuclear
externa
CNI Camada
nuclear
interna
CPE Camada
plexiforme
externa
CPI
Camada
plexiforme
interna
cSt
Centistokes
EPR
Epitélio pigmentar da retina
ERG Eletrorretinograma
FDA
Food and Drug Administration
FITC
Fluoresceína isotiocianato
GABA
Ácido gama amino butírico
GTP
Guanosina trifosfato
HE
Hematoxilina-eosina
IOS
Injeção
de óleo de silicone
xv
LDH
Desidrogenase
láctica
L-GLU
Aminoácido excitatório L-glutamato
MLE
Membrana
limitante
externa
MLI
Membrana
limitante
interna
NADPH
Fosfato reduzido de nicotinamida adenina
dinucleotídeo
Na,K-ATPase
Bomba de sódio, potássio-ATPase
NMDA N-metil-D-aspartato
NT(s)
Neurotransmissor
(s)
PBS
Phosphate
buffer saline
PG (s)
Prostaglandina (s)
SNC
Sistema nervoso central
TUNEL
terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelingSUMÁRIO
RESUMO vi
ABSTRACT viii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES x
LISTA DE TABELAS xii
LISTA DE SIGLAS xiv
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS 20 1.2 VITRECTOMIA 22 1.3 ÓLEO DE SILICONE 23 1.4 RETINA 26 1.4.1 NEUROTRANSMISSORES 29 1.5 NEUROPROTEÇÃO 34 1.6 APOPTOSE E NECROSE 37 1.7 CETAMINA 39 1.8 LAMOTRIGINA 40 1.9 CETOPROFENO 422 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS 45xvii
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 45
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS 473.2 ANESTESIA 47
3.3 VITRECTOMIA VIA PARS PLANA 47
3.4 NEUROPROTEÇÃO 48 3.5 AVALIAÇÃO OFTALMOLÓGICA 49 3.6 HISTOLOGIA 50 3.6.1HEMATOXILINA-EOSINA 50 3.6.2 MÉTODO DE TUNEL 50 3.7 ANÁLISE QUANTITATIVA 52 3.8 ANÁLISE QUALITATIVA 53
4 RESULTADOS
4.1 ÓLEO DE SILICONE 56 4.2 CETAMINA 58 4.3 LAMOTRIGINA 61 4.4 CETOPROFENO 64 4.5 CETAMINA+LAMOTRIGINA 67 4.6 CETAMINA+CETOPROFENO 70 4.7 LAMOTRIGINA+CETOPROFENO 73 4.8 CETAMINA+LAMOTRIGINA+CETOPROFENO 76 4.9 APOPTOSE 795 DISCUSSÃO
5.1CONSIDERAÇÕES GERAIS 84 5.2 ÓLEO DE SILICONE 87 5.3 L-GLUTAMATO E RETINA 90 5.4 APOPTOSE E NECROSE 92 5.5 CETAMINA 96 5.6 LAMOTRIGINA 98 5.7 CETOPROFENO 1046 CONCLUSÕES
6.1 CONCLUSÕES109
7 PERSPECTIVAS
7.1 PERSPECTIVAS 1118 REFERÊNCIAS
8.1 REFERÊNCIAS 1139 ANEXOS
9.1 ANEXO A 133 9.2 ANEXO B 134 9.3 ANEXO C 1621.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS
STONE, em 1958, foi o primeiro a mostrar que o óleo de silicone (polidimetilsiloxano) era tolerado no olho do coelho, e CIBIS, em 1965,
introduziu esse material como um implante intravítreo na cirurgia de descolamento de retina. Enquanto SCOTT e muitos outros autores relataram a utilidade desse óleo na cirurgia vitreorretiniana, complicações atrasaram sua
aprovação para cirurgia intraocular nos Estados Unidos da América. Contudo, em 1994, após reavaliado extensivamente em estudos colaborativos, o FDA (Food and Drug Administration) aprovou o uso do óleo de silicone nos Estados Unidos da América (GIORDANO; REFOJO, 1998).
Na cirurgia de descolamento de retina, os pacientes são submetidos à vitrectomia via pars plana (VVPP) na qual o vítreo é removido e substituído por óleo de silicone. Enquanto o tamponamento da retina com óleo de silicone está
associado à reaplicação da retina e à preservação da visão em alguns pacientes(AZEN et al., 1998; SCOTT et al., 1999, 2000; CASTELLARIN et al., 2003), complicações associadas a esse óleo ocorrem no segmento anterior do olho, como catarata, opacificação de cápsula posterior, glaucoma, fechamento
da iridectomia inferior, hipotonia ocular, emulsificação na câmara anterior, distrofia corneana, ceratopatia em faixa, ceratite e acúmulo de silicone subconjuntival (BRODRICK, 1978; LEAVER; GREY; GARNER, 1979;
FEDERMAN; SCHUBERT, 1988; BARR et al., 1993; HUTCHINSON; CAPONE; GROSSNIKLAUS, 1993; BISWAS et al., 1999; JONAS; BUDDE; KNORR, 1999; AVITABILE et al., 2002; SRINIVASAN et al., 2003; MIYAMOTO et al., 2004).
21
Também ocorrem complicações no segmento posterior do olho, como retinopatia do silicone e pucker macular (MUKAI et al., 1975; BRODRICK, 1978; GONVERS; HORNUNG; DE COURTEN, 1986; FEDERMAN; SCHUBERT,
1988; BARR et al., 1993; JONAS; BUDDE; KNORR, 1999; PAPP et al., 2004). Várias alterações histológicas retinianas foram descritas após a VVPP e a injeção de óleo de silicone (IOS). Essas alterações incluem: vacúolos nos
segmentos externos dos fotorreceptores (DOI; REFOJO, 1995), afinamento ou desaparecimento subtotal dos processos das células bipolar e horizontal e dos terminais sinápticos dos fotorreceptores – maior proporção de corpos celulares dos fotorreceptores apresentaram citoplasma e nucleoplasma mais escuro,
remanescente de células em degeneração (GONVERS; HORNUNG; DE COURTEN, 1986), afinamento da camada de fotorreceptores (DOI; REFOJO, 1995), edema intercelular da retina externa envolvendo células bipolares e
fotorreceptores (MIYAMOTO et al., 1986), afinamento ou desaparecimento da camada plexiforme externa (DOI; REFOJO, 1994, 1995), vacuolização hidrópica das células ganglionares acompanhada de edema da camada de fibras nervosas (MIYAMOTO et al., 1986) e degeneração de células ganglionares
(MUKAI et al., 1975).
Devido a essas alterações histológicas e sua ligação com achados clínicos que levam à deterioração visual progressiva crônica, após a VVPP e a
IOS (FEDERMAN; SHUBERT, 1988; AGRAWAL et al., 2003), nosso estudo propõe que a VVPP e a IOS podem ser usadas como um modelo experimental de agressão crônica à retina.
A VVPP e IOS é uma cirurgia muito importante e por vezes essencial para aqueles pacientes que apresentam descolamento de retina associado ou não à retinopatia vítreo-proliferativa. Sendo assim, descobrir uma forma de
proteger essas retinas é vital para um melhor prognóstico visual para esses pacientes.
1.2 VITRECTOMIA
A primeira operação eletiva na cavidade vítrea foi atribuída a VON GRAEFE, em 1863 (1994 apud FREITAS; von GRAEFE, 18631), quando foi removido um corpo estranho intra-ocular pela vitrectomia via pars plana e
seccionada uma membrana vítrea. Os principais instrumentos utilizados foram uma pinça e uma agulha de discisão (FREITAS, 1994).
Na tentativa de substituir o vítreo, os pesquisadores usaram as mais
diversas substâncias. MICHELS, em revisão de literatura, relacionou as seguintes: solução salina (ANDREWS, 1900), vítreo de cadáver (DEUTSCHMANN, 1906), ar (OHM, 1911), líquido subretiniano (BIRCH-HIRSCHFELD, 1912), líquido cefalorraquidiano (LCR) (HEHNER, 1928), humor
aquoso (KURACHI, 1951), vítreo liofilizado (PAUFIQUE; MOREAU, 1953), polivinilpirrolidona (SCUDERI, 1954), ácido hialurônico (WIDDER, 1960), colágeno (BALAZS, 1960), óleo + ácido hialurônico (WIDDER, 1960), óleo de
silicone (CIBIS, 1962), poligeline (OOSTERHIUS, 1966), poliacrilamida
1 von GRAEFE, A. Therapeutische miscellen, Albrecht von Graefes. Arch. Klin. Ophthalmol., v.
23
(MUELLER-JENSEN; KOEHLER, 1967), poliglicerilmetacrilato (DANIELE, 1968) (1994 apud FREITAS; MICHELS2).
Rápidos avanços na cirurgia do vítreo durante o último quarto de século
passado expandiram a capacidade dos cirurgiões oftalmológicos para estabilizar ou melhorar a função visual dos pacientes em um grande espectro de doenças vítreorretinianas. ROBERT MACHEMER, em 1979 (1999 apud
REGILLO; MACHEMER, 19793), foi o primeiro cirurgião oftalmológico a desenvolver os instrumentos para a cirurgia de vitrectomia fechada, assim como contribuiu, com seus estudos, na fundamentação das alterações vítreas e proliferações fibrovasculares anormais em várias condições vitreorretinianas
(MACHEMER, 19793).
Inicialmente, as indicações de vitrectomia eram limitadas àqueles casos com doença retiniana avançada, como complicações de descolamento de retina
e pobre prognóstico visual. Hoje, após o desenvolvimento do procedimento, aumento da segurança e efetividade, as indicações cirúrgicas aumentaram e passa-se a objetivar, pela cirurgia, uma boa acuidade visual e não apenas a preservação da baixa visão (MACHEMER, 19793).
1.3 ÓLEO DE SILICONE
Os óleos de silicone são polímeros de cadeias longas formados por
moléculas de silicone e oxigênio que se alternam. Em uma partição, cadeias
2 MICHELS, R. Opus. Cit.
hidrocarbonadas de lipídios devem se ancorar em partículas de óleo por ligações hidrofóbicas.
Pode-se observar esse evento na interface entre vítreo e óleo de
silicone, quando as partículas de óleo se ligam aos fosfolipídios das células da membrana limitante interna, camada mais interna da retina, provocando a “retinopatia do silicone” (MUKAI et al., 1975).
HINE et al, em 1969, demonstrou a tendência do óleo de silicone de se ancorar no encéfalo e na medula espinhal após administração intratecal (1975 apud MUKAI; HINE et al., 19694). Uma dispersão líquida permite ao óleo de silicone penetrar no sistema nervoso central (SNC) por intermédio do fluido
cerebroespinhal, pela interface da linha ependimal e da pia-máter (MUKAI et al., 1975).
O grau de lesão da retina está relacionado ao tipo de contato entre óleo
de silicone e retina. Um contato permanente produz maior e constante lesão da retina, enquanto um contato intermitente leva a uma lesão menos marcante, e a ausência de contato deixa a retina intacta. Além disso, quanto mais completa de óleo de silicone estiver a cavidade vítrea, maior será a extensão da lesão da
retina (GONVERS; HORNUNG; DE COURTEN, 1986).
Além do óleo de silicone, existem vários outros substitutos vítreos como o ar, gases e líquidos perfluorocarbonos (GIORDANO; REFOJO, 1998). Há
ainda vários tipos de óleo de silicone: o não fluorado, fluorosilicone e o de alta
4 HINE ,C. H.; ELLIOT, H. W.; WRIGHT, R. R. et al. Evaluation of a silicone lubricant inject
25
tecnologia. Surgiu ainda um novo óleo de silicone, mais pesado que a água: uma solução de polidimetilsiloxano e perfluorohexiloctano, cuja densidade é de 1,06g/cm3 e viscosidade de 1480 centistokes (cSt), responsável por um efetivo
tamponamento no tratamento cirúrgico de descolamento de retina inferior (KIM; GUNTHER; MEINERT, 2005).
O que varia entre os tipos de óleo é a viscosidade, índice refrativo,
densidade, tensão de superfície e tensão de interface na água. As propriedades mais relevantes neste estudo seriam a viscosidade e a densidade. O óleo de silicone não fluorado apresenta viscosidade entre 1000 e 12000 cSt, enquanto o fluorado 1000 a 10000 e o de alta tecnologia 170 a 200. A densidade do
primeiro é de 0,97 g/cm3 enquanto do segundo de 1,29 g/cm3 e o terceiro de 1,16 g/cm3. Devido a sua densidade menor que a água, o primeiro óleo, usado neste estudo, mantém contato apenas com a retina superior, ao contrário dos
outros dois, que mantêm contato não só com a retina superior, mas também com a inferior (GIORDANO; REFOJO, 1998). Nesse estudo utilizamos o óleo não fluorado e, sendo assim, iremos nos referir sempre ao tamponamento da retina superior.
As alterações histopatológicas provocadas pelo óleo de silicone podem ocorrer devido à ação tóxica direta na retina e à injúria mecânica gerada pela pressão do óleo sobre a retina superior (GONVERS; HORNUNG; DE
COURTEN, 1986). O efeito mecânico, considerado mais importante, foi representado por DOI e REFOJO, em 1995. Ao usarem o óleo de alta tecnologia, notaram o desaparecimento da camada plexiforme externa na retina
superior dos olhos de coelhos. Porém, como demonstrado por ZIVIN e CHOI, em 1991, a pressão mecânica na retina superior por tamponamento com óleo de silicone pode, com o tempo, causar isquemia.
O óleo de silicone contém componentes moleculares de baixo peso molecular, cuja difusão para os tecidos oculares está relacionada à toxicidade ocular crônica (NAKAMURA et al., 1991). Sabe-se, ainda, que o alto grau de
purificação do óleo de silicone, relacionado à menor quantidade de componentes moleculares de baixo peso molecular, não é suficiente, contudo, para prevenir lesões da retina (GONVERS; HORNUNG; DE COURTEN, 1986).
1.4 RETINA
A retina (figura 1), tanto do ponto de vista histológico como embriológico, tem características semelhantes às do encéfalo, sendo considerada uma
porção exteriorizada deste e derivada da mesma vesícula primordial da qual se origina o diencéfalo (2001 apud GUIZZO; COHEM, 19805; SHEPERD, 19746).
5 COHEM, A. I.- Retina y nervio optico In: Robert Moses. “Fisiologia del ojo”, aplicación clinica. Viaminte, Buenos Aires: Editora Panamericana, 1980. 2165 p.
6 SHEPERD, G. M.- In: SHEPERD G. M. (Edts.), The synaptics organizator of the brain, Oxford University Press, 1974. 145-178 pp.
27
FIGURA 1. Esquema demonstrando as diversas camadas da retina adaptado de
MILLER, 1996.
É subdividida em dez camadas: epitélio pigmentar da retina (EPR),
camada de fotorreceptores, membrana limitante externa (MLE), camada nuclear externa (CNE), camada plexiforme externa (CPE), camada nuclear interna (CNI), camada plexiforme interna (CPI), camada de células ganglionares
(CCG), camada de fibras do nervo óptico e membrana limitante interna (MLI). As sinapses encontram-se nas camadas plexiformes e os corpos celulares nas camadas nucleares interna, externa e camada de células ganglionares (2001 apud GUIZZO; DANTAS, 19897).
7 DANTAS, A. M. Doenças da retina. Biblioteca Brasileira de oftalmologia, 1989, 1-41 pp.
C A MA DA NU CLE A R EXT ERNA CAM A D A NU CLEAR INT E R N A CPE CPI CCG C A MA DA NU CLE A R EXT ERNA CAM A D A NU CLEAR INT E R N A CPE CPI CCG
Convenciona-se classificar os neurônios da retina nos seguintes grupos funcionais: neurônios de primeira ordem – cones e bastonetes; neurônios de segunda ordem – células horizontais e bipolares; neurônios de terceira ordem –
células amácrinas e ganglionares (SHEPERD, 19746).
Os neurônios de primeira ordem são hiperpolarizados pela luz e os de segunda e terceira ordens são sensíveis a aminoácidos excitatórios diferindo
apenas nos subtipos de receptores. Os neurônios de segunda ordem são mais
sensíveis ao cainato e ácido α-amino-3-hidróxi-5-metil-4-propiônico isoxazol (AMPA) e menos sensíveis ao N-metil-D-aspartato (NMDA). Os neurônios de
terceira ordem, incluindo todas as células amácrinas e a maioria das
ganglionares são igualmente sensíveis a estes três mediadores sendo, por isso, talvez os mais atingidos pela entrada de cálcio extracelular durante a isquemia (DAW; BRUNKEN; PARKINSON, 1989).
A retina é a área do olho responsável por receber luz e converter os padrões de luz e sombra em impulsos neurais para a interpretação do córtex cerebral (REGILLO; BROWN; FLYNN JUNIOR, 1999). Quando ocorre o descolamento de retina, quebra-se o caminho que leva a informação visual ao
cérebro. A cirurgia de VVPP + IOS, por meio do procedimento da vitrectomia propriamente dita e da substituição do vítreo por óleo de silicone, procura reaplicar a retina e, dessa forma, restabelecer o elo entre a retina e o cérebro.
Evidências epidemiológicas mostram, principalmente nos países desenvolvidos, que as doenças envolvendo a retina, como a retinopatia diabética e a degeneração macular relacionada à idade, são as principais
29
causadoras de cegueira tanto na população jovem (retinopatia diabética) quanto na população adulta (retinopatia diabética) incluindo a terceira idade, no caso da degeneração macular relacionada à idade.
Insultos isquêmicos para a retina e para o nervo óptico são freqüentemente observados no glaucoma, na hipertensão ocular aguda, na retinopatia diabética, na hipertensão, na oclusão vascular, na arterite de células
gigantes e podem acarretar sérias perturbações para os elementos gliais da retina e, com isso, levar à cegueira (GROZDANIC et al., 2003).
Paralelamente a isso, a população, não apenas nos países desenvolvidos mas também nos países em desenvolvimento como o Brasil, tem
apresentado uma longevidade cada vez maior e, dessa forma, cada vez mais nos defrontaremos com problemas a serem resolvidos que antes não existiam. O controle endocrinológico da diabetes mellitus e o avanço nas técnicas
cirúrgicas para melhor resolver os problemas oculares estão sendo – e devem ser – explorados extensivamente.
Assim, descobrir agentes neuroprotetores capazes de proteger a retina de seres humanos que serão submetidos à VVPP e IOS – como os diabéticos
que evoluem para descolamento de retina – e com isso melhorar o prognóstico visual destes pacientes, é um passo na conquista da melhor qualidade de vida da população.
Na retina, a transmissão sináptica é mediada por um rico sistema de neurotransmissores (NTs), onde encontramos acetilcolina, dopamina, ácido gama amino butírico (GABA), glicina, L-glutamato (L-GLU), L-aspartato e
possivelmente noradrenalina e histamina (1999 apud SANTOS; KENNEDY; NEAL; LOLLEY, 19778).
Na retina há neurotransmissores excitatórios, como o L-GLU, e
inibitórios, como o GABA. Fotorreceptores, células bipolares e ganglionares liberam L-GLU como NT para transferir a informação visual da retina para o cérebro. Essas células estão presentes na CNE, CNI e CCG, respectivamente (2001 apud GUIZZO; MASSEY; MILLER, 19909). Por outro lado, o mais
importante NT inibitório da retina e do sistema nervoso de mamíferos (GABA) é encontrado em células horizontais e amácrinas, presentes na CNI (2001 apud GUIZZO; MORAN; MORALES-PASANTES; REDBURN, 198610; SILVILOTTI; NISTRI, 199111).
Os aminoácidos excitatórios (NTs) são importantes mediadores da lesão isquêmica na retina e no sistema nervoso de mamíferos (2001 apud GUIZZO;
8 KENNEDY, A. J.; NEAL, M. J.; LOLLEY, R.N. The distribution of amino acids within rat retina. J. Neurochem., v. 29, p.157-159, 1977.
9MASSEY, S. C.; MILLER, R. F. N-methyl-D-aspartate receptors of ganglion cells in rabbit
retina. J. Neurophysiol., v. 63, p. 16-30, 1990.
10 MORAN, J.; MORALES-PASANTES, H.; REDBURN, D. A. Glutamate receptor agonists
release [3H] preferentially from horizontal cells. Brain Res., v. 398, p. 276-287, 1986.
11 SILVILOTTI, L.; NISTRI, A. GABA receptor mechanism in the central nervous system. Prog. Neurobiol., v. 36, p. 35-92, 1991.
31
ROCHA et al., 199912; WONG et al., 198613). O L-GLU, um NT excitatório, considerado o mais importante, está envolvido na toxicidade neuronial, dentre outros processos (2001 apud GUIZZO; CHOI, 198814; GASIC; HOLLMANN, 199215; NASKAR et al., 200016).
Modelos de isquemia têm mostrado que o aminoácido excitatório L-GLU representa o mais importante agravo na perda da homeostase de íons (1999
apud SANTOS; GRAHAM et al., 199317) durante a encefalopatia hipóxico-isquêmica. A exposição dos neurônios a altas concentrações de glutamato por apenas alguns minutos pode levar à morte da célula neuronial (1996 apud GOODMAN; MELDRUM; GARTHWAITE, 199018; OLNEY, 199019).
Em 1969, OLNEY obteve, após administração subcutânea e oral de glutamato monossódico, degeneração neuronial em locais onde não há barreira hemato-encefálica, como os órgãos circunventriculares (1999 apud SANTOS;
OLNEY, 196920). Com a utilização das técnicas de microdiálise no estudo da
12
ROCHA, M.; MARTINS, R. A. P.; LINDEN, R. Activation of NMDA receptors protects against glutamate neurotoxicity in the retina: evidence for the involvement of neurotrophins. Brain Res., v. 827, p. 79-82, 1999.
13 WONG E. H. F. et al. The anticonvulsant MK-801 is a potent N-methyl-D-aspartate antagonist. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 83, p. 7104-7108, 1986.
14 CHOI, D. W. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture is calcium dependent. Neurosci. Lett., v. 58, p.293-297, 1985.
15 GASIC, G. P.; HOLLMANN, M. Molecular neurobiology of glutamate receptors. Ann. Rev. Physiol., v. 54, p. 507-536, 1992.
16 NASKAR, R.; VORWERK, C. K.; DREYER, E. B. Current dowregulation of a glutamate
transporter and receptor in glaucoma. IOVS, v. 41, p. 1940-1944, 2000.
17 GRAHAM, S. H.; CHEN, J.; SHARP, F. R. et al. Limiting ischemic injury by inhibition of
excitatory amino acid release. J. Cereb. Blood Flow Metab., v. 13, p. 88-97, 1993.
18 MELDRUM, B.; GARTHWAITE, J. Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative
disease. Trends Pharmacol. Sci., v. 11, p. 379-387, 1990.
19 OLNEY, J. W. Excitotoxic amino acids and neuropsychiatric disorders. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., v. 30, p. 47-71, 1990.
20 OLNEY, J. W. Glutamate-induced retinal degeneration in neonatal mice. Electronmicroscopy
isquemia cerebral “in vivo”, BENVENISTE et al., demonstraram um aumento de oito vezes na concentração extracelular de L-GLU no hipocampo, durante os dez primeiros minutos de isquemia (1999 apud SANTOS; BENVENISTE et al.,
198421).
O L-GLU nos neurônios do SNC provém principalmente da glicose, através do ciclo de Krebs, ou da glutamina, que é sintetizada por células gliais e
captada pelos neurônios. De modo semelhante a outros neurotransmissores, o L-GLU é armazenado em vesículas sinápticas e liberado por exocitose cálcio-dependente. Existem proteínas transportadoras específicas responsáveis pelo seu acúmulo nas vesículas sinápticas bem como pela sua captação por
neurônios e por outras células e (RANG; DALE; RITTER, 2001). A ação do L- GLU é interrompida principalmente pela sua recaptação mediada por transportadores nas terminações nervosas e nas glias (2001 apud HONG;
TAKAHASHI et al., 199722).
Os receptores para o L-GLU são funcionalmente classificados como ionotrópicos, cujo mecanismo de comporta é controlado pelo fluxo de íons, ou como receptores metabotrópicos, ligados à proteína G. Os receptores
ionotrópicos são o NMDA, o AMPA e o cainato (RANG; DALE; RITTER, 2001). Os receptores metabotrópicos unem-se, por proteínas ligadas à guanosina trifosfato (GTP), a vários mecanismos efetores, enquanto os canais iônicos
21 BENVENISTE, H.; DREJER, J.; SCHOUSBOUE, A. et al. Elevation of the extracelular
concentration of glutamate in rat hippocampus during transient ischemia monitored by intracerebral microdialysis. J. Neurochem., v. 43, p. 1369-1374, 1984.
22 TAKAHASHI, M. et al. The role of glutamate transporters in glutamate homeostasis in the
33
operados pelos ligantes contêm um canal de cátion integral que regula a entrada de Na+ e, em alguns casos, de Ca2+ (1996 apud GOODMAN; HOLLMANN; HEINEMANN, 199423; NAKANISHI, 199224; SEEBURG, 199325).
A abertura da comporta do NMDA requer glicina, bem como glutamato. O sítio de ligação para a glicina é distinto do sítio de ligação para o glutamato, e ambos precisam estar ocupados para a abertura do canal. O efeito fisiológico
da ação da glicina nos receptores NMDA não está bem definido. A concentração necessária apresenta-se baixa em relação à concentração de glicina normalmente presente no cérebro, sugerindo que pode atuar como fator permissivo constante para os efeitos do glutamato mediados pelos receptores
NMDA, mais do que como mecanismo regulador (RANG; DALE; RITTER, 2001).
Os receptores NMDA e seus canais iônicos associados exercem
atividades em mecanismos fisiopatológicos (RANG; DALE; RITTER, 2001) tais como:
• são altamente permeáveis ao Ca2+, e a outros cátions, de tal forma
que a ativação dos receptores NMDA é particularmente eficaz para promover a entrada de Ca2+;
• são rapidamente bloqueados por Mg2+, exibindo este bloqueio
acentuada dependência da voltagem; esse bloqueio ocorre em
23 HOLLMANN, M.,; HEINEMANN, S. Cloned glutamate receptors. Annu. Rev. Neurosci., v. 17,
p. 31-108, 1994.
24 NAKANISHI, S. Molecular diversity of glutamate receptors and implications for brain function. Science, v. 258, p. 597-603, 1992.
25 SEEBURG, P. H. The molecular biology of mammalian glutamate receptor channels. Trends Neurosci., v. 16, p. 359-365, 1993.
concentrações fisiológicas de Mg2+ quando a célula está normalmente polarizada, porém desaparece se a célula for despolarizada;
• operam canais que têm como agentes bloqueadores seletivos determinados anestésicos e agentes psicomiméticos bem conhecidos, como a cetamina e a fenciclidina; um novo composto, a
dizocilpina (MK-801), compartilha esta propriedade.
A inibição da isquemia, induzida pela liberação de L-GLU, pode ser promovida pela potencialização do GABA, pela potencialização dos receptores de adenosina, pelos bloqueadores dos canais de cálcio e por meios não
farmacológicos como hipotermia, hipotireoidismo ou pré-condicionamento. Animais hipotireóideos expostos à isquemia mostram-lhe tolerância (SHUAIB et al., 1995).
1.5 NEUROPROTEÇÃO
A estratégia de tratar uma doença pela prevenção da morte neuronial é chamada de neuroproteção (LEVIN, 1999). A proteção de neurônios é
extremamente importante à medida que os neurônios, nos seres humanos, não se dividem após o nascimento e não são repostos quando perdidos (LEVIN, 1999; GROZDANIC et al., 2003). Isso não acontece em mamíferos homotérmicos como as galinhas, pássaros, peixes e anfíbios, nos quais há
células tronco na margem periférica da retina (zona marginal ciliar), com exceção das galinas, nas quais as células de Müller se diferenciam em células tronco (REH; FISCHER, 2001; MOSHIRI; CLOSE; REH, 2004).
35
Tradicionalmente, a lesão à retina por isquemia tem sido considerada uma condição potencialmente incurável em humanos e animais de experimentação porque o SNC não tem capacidade regenerativa (GROZDANIC et al., 2003).
Várias são as estratégias de neuroproteção como a liberação de neurotrofinas, o bloqueio de receptores mediadores da excitotoxicidade e a redução de espécies de oxigênio reativo (LEVIN, 1999). O termo
excitotoxicidade foi descrito por OLNEY, em 1969, para descrever a lesão neuronial resultante da presença de uma quantidade excessiva de L-GLU no encéfalo (1996 apud GOODMAN; OLNEY, 196926).
Embora o L-GLU seja necessário para a função cerebral normal, sua
presença em quantidades excessivas pode causar morte celular excitotóxica (LIPTON; ROSENBERG, 1994).
A ativação dos receptores NMDA, na presença de L-GLU, promove a
entrada de Ca2+ na célula (OLNEY, 1989). Inicia-se uma cascata de eventos que culminará na morte celular. O Ca2+ dentro da célula leva à entrada de Na+ e Cl-, e, conseqüentemente, de água, pois a célula se torna hipertônica, resultando em um edema neuronial agudo (Figura 2).
Os efeitos destrutivos do L-GLU são mediados por seus receptores, em especial aqueles do tipo NMDA. Ao contrário de outros canais iônicos controlados pelo L-GLU, que regulam principalmente o fluxo de Na+, os canais
ativados pelo receptor do NMDA permitem o influxo de Ca2+. A atividade dos
26 OLNEY, J. W. Brain lesions, obesity, and other disrturbances in mice treated with
canais do receptor de NMDA é regulada não só pela concentração do L-GLU no espaço sináptico, mas também por um bloqueio dependente da voltagem do canal pelo Mg2+. Assim, a entrada de Ca+ nos neurônios através de canais dos receptores de NMDA requer a ligação do L-GLU aos receptores de NMDA, bem como a despolarização do neurônio (GOODMAN, 1996).
Os antagonistas do receptor de NMDA podem atenuar ou bloquear a
morte neuronial induzida pela ativação desses receptores. Existe potencial terapêutico considerável para o uso dos antagonistas de NMDA como neuroprotetores (GOODMAN, 1996).
Durante o processo de morte do neurônio, desencadeado pelo L-GLU,
um mecanismo adicional de lesão, a apoptose, pode ocorrer em paralelo com a necrose excitotóxica. A apoptose apresenta pequena chance de se manifestar sob circunstâncias nas quais a excitotoxicidade predomina fundamentalmente.
Experimentos mostram que a aplicação de uma droga antagonista de NMDA junto com outra droga inibidora da apoptose acarreta maior neuroproteção do que cada droga isoladamente, o que sugere que a apoptose e a necrose podem coexistir (DUGAN; CHOI, 1999).
37
FIGURA 2. Diagrama da isquemia adaptado de OSBORNE et.al, 1999.
1.6 APOPTOSE E NECROSE
A morte celular pode ser dividida em duas classes: apoptose e necrose. Apoptose, ou morte celular programada, é o principal mecanismo pelo
qual as células são fisiologicamente eliminadas nos organismos metazoários (MARTIN et al., 1998; EDINGER; THOMPSON, 2004). Durante a apoptose, células são reduzidas pelas caspases e englobadas em corpos apoptóticos
como um mecanismo para evitar ativação imune (EDINGER; THOMPSON, 2004).
A apoptose é um mecanismo intrínseco ao “suicídio celular” (DANIAL;
KORSMEYER, 2004). As células apresentam condensação e fragmentação
Morte neuronial ↓[ATP]i ↑ [Na+; Cl-; H 2O]i ↑Enzimas destrutivas Produção de radicais livres Ativação de receptores AMPA/Ca Inflamação
↑ [Glutamato]
e ↑ NO sintetase REPERFUSÃO Abertura de canais de Ca2+ ↓ Troca Na+/ Ca2+ ↓ Recaptação de glutamato Falência Ca2+ATPase Despolarização ↑ Radicais livres ISQUEMIA ↓ O2 ↓ Glicose Falência Na+/K+-ATPase↑[Ca
2+]
i Ativação de receptores NMDA Ativação de receptores metabolicotróficos Peroxidação de lipídios Liberação de Glu vesicular Inchaço Morte neuronial ↓[ATP]i ↑ [Na+; Cl-; H 2O]i ↑Enzimas destrutivas Produção de radicais livres Ativação de receptores AMPA/Ca Inflamação↑ [Glutamato]
e ↑ NO sintetase REPERFUSÃO Abertura de canais de Ca2+ ↓ Troca Na+/ Ca2+ ↓ Recaptação de glutamato Falência Ca2+ATPase Despolarização ↑ Radicais livres ISQUEMIA ↓ O2 ↓ Glicose Falência Na+/K+-ATPase↑[Ca
2+]
i Ativação de receptores NMDA Ativação de receptores metabolicotróficos Peroxidação de lipídios Liberação de Glu vesicular Inchaçonuclear, clivagem do ácido desoxirribonucleico (DNA) cromossômico em fragmentos internucleossomais e agrupamento dos constituintes celulares em corpos apoptóticos sem quebra da membrana plasmática. Os corpos
apoptóticos são reconhecidos e removidos por células fagocitárias ou células vizinhas. Portanto, a apoptose é observada pela ausência de inflamação ao redor do foco de células mortas. As alterações morfológicas da apoptose
resultam da ativação de caspases (proteases da cisteína) por ligação ao “receptor da morte” ou liberação de mediadores apoptóticos das mitocôndrias. A morte por apoptose requer ATP (STELLER, 1995; EDINGER; THOMPSON, 2004).
Em contraste à apoptose, a necrose tem sido tradicionalmente considerada como uma forma de morte celular passiva. Necrose é o resultado final de catástrofe bioenergética resultante da depleção de ATP a um nível
incompatível com a sobrevivência celular, causada principalmente por um acidente celular, como insultos tóxicos ou lesão física. É caracterizada morfologicamente por vacuolização do citoplasma, quebra da membrana plasmática e indução de inflamação ao redor da célula em destruição, atribuída
pela liberação de conteúdos celulares e moléculas pró inflamatórias. Células que morrem por necrose freqüentemente exibem alterações na morfologia nuclear, mas não apresentam condensação organizada da cromatina nem
fragmentação do DNA em 200 bp fragmentos, característica da apoptose (EDINGER; THOMPSON, 2004). Importantes evidências sugerem que a morte
39
celular após isquemia retiniana envolve mecanismos de apoptose e de necrose (ZHANG et al., 2002).
1.7 CETAMINA
A cetamina é um antagonista não competitivo do receptor NMDA, e foi aprovado pelo FDA, em 1970, para uso como anestésico (SCALLET et al.,
2004). A cetamina interage com o receptor de NMDA e com vários outros receptores que afetam a analgesia. Inibe a ativação do receptor de NMDA pelo GLU quando se liga ao sítio do magnésio, assim como reduz a liberação do L-GLU na região sináptica e potencializa o efeito do GABA. Atua no receptor
associado aos ionóforos de cálcio, mas não nos canais de cálcio sensíveis a voltagem (O’SHAUGHNESSY; LODGE, 1988).
A cetamina apresenta ainda efeitos antiinflamatórios, como a supressão
da produção de neutrófilos por mediadores inflamatórios, melhora o fluxo sanguíneo, assim como inibe as citocinas no sangue humano (KAPUR; FRIEDMAN, 2002).
Foi observada como um agente neuroprotetor retiniano pela primeira vez
em 1992, em um modelo de isquemia “in vivo” que induzia lesão retiniana em coelhos seguida por glaucoma agudo experimental irreversível. Análises qualitativas demonstraram uma proteção seletiva de neurônios da CCG, quando
administrado na superfície da retina (LOUZADA et al., 1992). Há ainda relato de administração endovenosa, para neuroproteção da retina em modelo de
glaucoma em coelhos (TSUKAHARA; BLAIR, 1992), ocorrendo melhora da função neuronial observada no eletrorretinograma (ERG).
Em outro estudo foi administrada oralmente, em um grupo de pacientes
com lesão neuronial (KAPUR; FRIEDMAN, 2002), resultando em melhora sintomática por seus efeitos antiinflamatórios.
Assim como a cetamina, foi demonstrada a ação neuroprotetora da
lamotrigina (SANTOS, 1995, 1999; GUIZZO et al., 2005;) e do cetoprofeno (SANTOS, 1995, 1999) por mecanismos diferentes.
1.8 LAMOTRIGINA
A lamotrigina (3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-tiazina) é uma droga antiepiléptica, aprovada em 1994 pelo FDA, para o tratamento de indivíduos com idade superior ou igual a 2 anos, na monoterapia de epilepsia parcial e
generalizada (MEYER et al., 1999; TERGAU et al., 2003; LA ROCHE; HELMERS, 2004). Estudos clínicos mostraram que a lamotrigina é bem tolerada por jovens e pacientes adultos com epilepsia (BRODIE et al., 1995; MESSENHEIMER et al., 1998; STEINER; DELLAPORTAS; FINDLEY, 1999;
DEVINSK et al., 2000; BITON et al., 2001). Foi promovida como droga antiepiléptica baseada em seus efeitos na farmacologia dos aminoácidos excitatórios (BRODIE, 1992).
Atua por bloqueio dos canais de sódio voltagem dependente pré e pós sinápticos (CALABRESI et al., 2000; LEE; YOON; ROH, 1999) e, em menor extensão, por bloqueio dos canais de cálcio voltagem dependente pós
41
sinápticos (CALABRESI et al., 2000; LA ROCHE; HELMERS, 2004), estabilizando, dessa forma, membranas neuronais e reduzindo a liberação de neurotransmissores excitatórios, particularmente L-GLU e aspartato (LEACH;
MARDEN; MILLER, 1986; MACDONALD; KELLY, 1993; LEACH; BAXTER; CRITCHLEY, 1991; WIARD et al., 1995; SHUAIB et al., 1995; WALDMEIER et al., 1995, 1996; CALABRESI et al, 1996; CASANOVAS et al., 1996; ZONA;
AVOLI, 1997; CRUMRINE et al., 1997; MESSENHEIMER, 1998; MEYER et al., 1999; PISANI et al., 2001; CAPUTI et al., 2001; REKLING, 2003; FAUGHT; MATSUO; WOMBLE, 2004; LA ROCHE, HELMERS, 2004).
A lamotrigina também inibe o óxido nítrico, o que poderia contribuir para
os efeitos neuroprotetores dessa droga, já que o óxido nítrico produz radicais livres e promove a peroxidação de lipídios, envolvidos no processo de morte celular (PISANI et al., 2001).
A lamotrigina diminui a liberação de desidrogenase láctica (LDH) produzida por NMDA, diminui o edema e o número de células com núcleo necrótico e picnótico na CCG da retina de galinha, em situação de excitotoxicidade induzida por agonistas de L-GLU (PISANI et al., 2001). Na incubação da retina com 100 µM de lamotrigina, observou-se uma preservação parcial da estrutura da retina e uma redução do edema, especialmente da CPI (PISANI et al., 2001).
1.9 CETOPROFENO
O cetoprofeno, (ácido 3-benzoil-2-fenil propiônico) (NETTER et al., 1985), derivado do ácido propiônico (ASANUMA et al., 1997; MEHLISCH; WEAVER;
FLADUNG, 1998) é um potente antiinflamatório não hormonal usado desde 1973 em indivíduos com desordens artríticas (MEHLISCH; WEAVER; FLADUNG, 1998; BARBANOJ; ANTONIJOAN; GICH, 2001). Outras indicações
seriam condições traumáticas agudas, dismenorréia, dores de origem odontológica, cefaléia, entre outros (MEHLISCH; WEAVER; FLADUNG, 1998).
Exerce ação antiinflamatória, analgésica e antipirética (ASANUMA et al., 1997). Ainda não muito bem elucidadas, parece que as ações analgésicas
estão relacionadas com a inibição da síntese de prostaglandinas (PGs) pela inibição da enzima ciclooxigenase (BARBANOJ; ANTONIJOAN; GICH, 2001; STEEN; WEGNER; MELLER, 2001). Esta enzima cataliza a formação de
precursores de prostaglandina a partir do ácido araquidônico (principal substrato no metabolismo da lipooxigenase e ciclooxigenase) (ASANUMA et al., 1997; SIJURDSSON; YOUSSEF; BASIC, 1993).
O cetoprofeno estabiliza membranas lisossômicas, inibe a síntese de
leucotrienos pela inibição da lipooxigenase, assim como inibe a produção de radical de oxigênio em neutrófilos ativados por bloqueio de fosfato reduzido de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADPH) oxidase (SIJURDSSON;
YOUSSEF; BASIC, 1993). Apresenta ainda atividade antibradicinina e promove a liberação de radicais de hidroxila, os quais podem contribuir para os efeitos periféricos de sua analgesia. A atividade do cetoprofeno está relacionada,
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principalmente, às ações nos sítios periféricos da lesão, apesar de existir evidência de um componente central envolvido na ação de analgesia, o que pode ocorrer em altas doses (STEEN; WEGNER; MELLER, 2001).
Pode ser considerado um neuroprotetor por inibição da biossíntese endógena de prostaglandina no tecido cerebral. Apresenta ainda ações inibitórias no aumento da permeabilidade vascular e migração de leucócitos
polimorfonucleares (ASANUMA et al., 1997).
Um estudo verificou os efeitos da isquemia cerebral focal em ratos por meio da dosagem de glutamato e achados morfológicos. Esse estudo avaliou, por meio de achados histopatológicos, um possível efeito protetor do
cetoprofeno, nos neurônios isquêmicos (DIAS, et al., 2000). Outro estudo relata sua ação direta na remoção de radicais de óxido nítrico das células neuronais (ASANUMA et al., 2001). Radicais de óxido nítrico ativam as ciclooxigenases
COX-1 e COX-2 aumentando dessa forma as prostaglandinas e conseqüentemente a inflamação (ASANUMA et al., 2001).
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2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste estudo é investigar o efeito neuroprotetor de várias drogas sabidamente neuroprotetoras em modelos de isquemia-reperfusão no
glaucoma, utilizando a VVPP e IOS como um modelo experimental de agressão crônica à retina de coelhos albinos (raça Nova Zelândia).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1 Comprovar o efeito da VVPP + IOS como um modelo experimental de agressão crônica à retina de coelhos albinos (raça Nova Zelândia).
2.2.2 Investigar o efeito neuroprotetor na retina de coelhos albinos (raça Nova Zelândia) da cetamina, lamotrigina e cetoprofeno, pelas análises quantitativa e
qualitativa das retinas submetidas à VVPP + IOS.
2.2.3 Investigar o efeito neuroprotetor nas retinas de coelhos albinos submetidas à VVPP + IOS, (raça Nova Zelândia) das seguintes associações de
drogas: cetamina + lamotrigina, cetamina + cetoprofeno, lamotrigina + cetoprofeno e cetamina + lamotrigina + cetoprofeno.
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3.1 ANIMAIS
Quarenta coelhos albinos fêmeas, da raça Nova Zelândia, pesando de 2,0 a 2,5 Kg, foram confinados em gaiolas individuais com livre acesso a
comida e água durante o experimento. Dois dias antes do experimento, os coelhos foram expostos a ciclos de 12 h de luz/ 12 h no escuro (luz acesa às 7 horas da manhã) à temperatura de 23 a 25 °C.
3.2 ANESTESIA
Os coelhos foram anestesiados com injeção de 2 mL de thiopental sódico (50 mg/Kg-Thionembutal-Abbott) para todos os procedimentos; doses adicionais foram administradas quando necessário. A dilatação pupilar foi realizada com colírio de tropicamida a 1% (Mydriacyl- Alcon) e cloridrato de fenilefrina 2,5% (Fenilefrina- Allergan-Frumtost). Os experimentos estão de acordo com as normas da Sociedade Brasileira para Neurociências e Comportamento para o Uso de Animais em Pesquisa.
3.3 VITRECTOMIA VIA PARS PLANA
Os coelhos foram submetidos à VVPP convencional, com três acessos, através de esclerotomias localizadas 1 mm posterior ao limbo (MIYAMOTO et al., 2004), em um de seus olhos, usando um aparelho de vitrectomia de alta
fornecida por uma lente de contato (VOLK-XL, Mento, Ohio, USA) e sistema de inversão (OPTO, São Carlos, Brasil).
Após a VVPP, 1 mL de óleo de silicone 5000 cSt (Ophthalmos, São
Paulo, Brasil) foi injetado dentro da câmara vítrea do olho operado de cada coelho. Os olhos contralaterais do Grupo I não foram submetidos à cirurgia, sendo categorizados como grupo controle.
Passos da VVPP convencional: confecção de 3 esclerotomias, sendo uma para a infusão de BSS e as outras duas para a entrada da ponteira do vitreófago e da fonte de luz; realização da vitrectomia propriamente dita; troca fluido-gasosa, na qual a cavidade vítrea é toda preenchida por ar; injeção de
óleo de silicone de tal forma que o ar sai à medida que o óleo é injetado; sutura das esclerotomias.
3.4 NEUROPROTEÇÃO
Os quarenta coelhos foram aleatoriamente divididos em 8 grupos conforme a tabela I. Os olhos contralaterais dos coelhos do Grupo I formaram um nono grupo. Todos foram submetidos a tratamento diário com drogas ou
placebo por 4 semanas, iniciando-se o tratamento um dia após a cirurgia. A cetamina foi administrada por via intramuscular (i.m.) e via oral (v.o.), quando associada à lamotrigina, 50 mg/kg (Park-Davis). A lamotrigina foi administrada
por via oral, 25 mg/kg (Glaxo – Wellcome); o cetoprofeno, por via oral quando associado à lamotrigina e, quando isolado, por via intramuscular, 10 mg/kg
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(Allergan- Frumtost). Um dos grupos (Grupo I) recebeu placebo (solução salina, 15 mM) por via intramuscular.
TABELA I- Grupos de coelhos albinos da raça Nova Zelândia
submetidos à VVPP e IOS.
GRUPO
EXPERIMENTO
DROGA E DOSE
I Operados-Salina Solução Salina 15 mM
II Controles-Salina Solução Salina 15 mM
III Operados-Cetamina Cetamina 10 mg/kg
IV Operados-Lamotrigina Lamotrigina 25 mg/kg V Operados-Cetoprofeno Cetoprofeno 10 mg/kg VI Operados-Cetamina+Lamotrigina 10 mg/kg (Cetamina) + 25 mg/kg (Lamotrigina) VII Operados-Cetamina+Cetoprofeno 10 mg/kg (Cetamina) + 10 mg/kg (Cetoprofeno) VIII Operados-Lamotrigina+Cetoprofeno 25 mg/kg (Lamotrigina) + 10 mg/kg (Cetoprofeno) IX Operados-Cetamina+Lamotrigina + Cetoprofeno 10 mg/kg (Cetamina) + 25 mg/kg (Lamotrigina) + 10 mg/kg (Cetoprofeno) 3.5 AVALIAÇÃO OFTALMOLÓGICA
Os coelhos foram avaliados oftalmologicamente no primeiro dia após a cirurgia e semanalmente por 4 semanas, quando então foram sacrificados. A avaliação oftalmológica incluiu inspeção, tonometria com TonoPen (Mentor,
3.6 HISTOLOGIA
3.6.1 HEMATOXILINA-EOSINA
Os coelhos foram sacrificados com overdose de thiopental sódico, seus
olhos retirados com o uso de uma tesoura curva, que permitia a rápida enucleação do órgão e após fixados em ALFAC (álcool a 85%, formalina a 10% e ácido acético a 5%) por 24 horas. Para posterior orientação, uma incisão
escleral linear de espessura parcial foi feita no quadrante superonasal de todos os olhos. Após a fixação, a córnea, o humor aquoso, o cristalino, o humor vítreo que possa ter permanecido, além do óleo de silicone foram removidos e o globo foi cortado em 2 por uma secção abaixo e paralela ao raio medular. A parte
inferior de cada globo não foi usada. A parte superior de cada globo foi desidratada em etanol de 70 a 100% e embebida em parafina. As retinas foram seccionadas transversalmente em 5 µm, coradas com hematoxilina-eosina (H.E.) e examinadas por meio de um microscópio de luz (Axiophot, Zeiss).
3.6.2 MÉTODO DE TUNEL
Os blocos contendo as retinas foram cortados transversalmente a 5 µm e distendidos em lâminas de vidro. Os cortes aderidos nas lâminas foram desparafinizados em xilol, hidratados em concentrações decrescentes de etanol
100 a 50% e depois em uma solução de PBS 0,05 M. Uma fixação adicional dos cortes foi realizada por imersão das lâminas em uma solução de formaldeído em PBS a 4 %, por 15 min. Em seguida os cortes foram lavados
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em PBS. Após este pré-tratamento, as lâminas foram colocadas em uma câmara úmida de superfície plana, e os cortes contidos nas lâminas incubados por uma solução de proteinase K em PBS (20 µg/mL) por 10 min, o que auxilia a permeabilização do tecido pelos outros reagentes nos próximos passos. Os
cortes foram fixados novamente por imersão das lâminas em uma solução de formaldeído em PBS a 4 %, por 5 min. Em seguida, as lâminas contendo os cortes foram lavadas em PBS, colocadas em câmara úmida de superfície plana e incubadas em tampão de equilíbrio, por 5 min. O tampão de equilíbrio foi
retirado e, em seguida, os cortes foram incubados em uma solução combinada contendo: o tampão de equilíbrio, um mix de nucleotídeo (12-dUTP-fluoresceína) e a enzima TdT, em banho de água a 37°C, por 60 min, protegendo as lâminas da exposição direta à luz. A enzima TdT, uma
transferase terminal, catalisa a reação entre o mix de nucleotídeo e o DNA fragmentado de células apoptóticas, formando uma cauda na extremidade 3’, onde as células apoptóticas serão detectadas pela fluorescência (verde). Para
interromper a reação, as lâminas foram lavadas em uma solução contendo cloreto de sódio e citrato de sódio por 30 min, e em seguida as lâminas foram lavadas em PBS. Após a lavagem em PBS o excesso de líquido foi retirado e as lâminas montadas com Fluoromount G. Após a montagem, essas lâminas foram
analisadas imediatamente em microscópio de fluorescência, utilizando filtro para FITC e objetiva de 40x. As imagens foram capturadas através de uma
câmera digital utilizando o software para aquisição de imagens ACT-1 e armazenadas em CD-R.
3.7 ANÁLISE QUANTITATIVA
Obtivemos 5 imagens/retina em cada um dos nove grupos. Foram analisados cinco campos microscópicos (40X) de uma secção transversal na
região superior da retina de cada olho (começando 1 mm acima do nervo óptico) por microscópio de luz (Axiophot, Zeiss) e digitalizados com uma câmara analógica (JVC TK1270) conectada ao microscópio e a um computador. Como havia 5 olhos em cada um dos nove grupos, obtivemos 25 imagens para
cada um dos nove grupos. O programa de análise KS 400 (Carl Zeiss Vision, Germany) foi utilizado para a contagem de células (média do número do núcleo ± erro padrão da média) nas imagens digitais de áreas idênticas em todas as retinas. A área de cada camada de retina analisada foi de 0,032973 mm2 para a
CNE, 0,025106 mm2 para a CNI e 0,02585 mm2 para a CCG.
Os resultados foram expressos em densidades médias (células/mm2 ± S.E.M.). A diferença significativa entre os Grupos I e II foi determinada usando o teste t de Student não pareado e diferenças significativas entre todos os grupos foram determinadas usando a Análise de variância de Uma Via (ANOVA)
seguido pelo método pós-teste, Student-Newman-Keuls (p<0,05 indicou diferença estatisticamente significante).
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3.8 ANÁLISE QUALITATIVA
As secções de tecido usadas para análises qualitativas, coradas com H.E. e preparadas para apoptose, foram obtidas da mesma região da retina
(começando 1 mm acima do nervo óptico) em cada olho e avaliadas quanto à presença de edema intracelular, desorganização celular, menor número de células da CNE, CNI e CCG; edema extracelular e desorganização da matriz
nas CPE e CPI; vacuolização do citoplasma nas células ganglionares e presença de apoptose. As lesões celulares podem ser classificadas em necrose, degeneração, edema e desorganização, além da apoptose.
Necrose significa uma lesão celular irreversível caracterizada por
alterações nucleares do tipo picnose e cariólise. Depois de iniciada a lesão, esta se acha circundada pelo infiltrado inflamatório e o citoplasma apresenta-se intensamente eosinofílico. Na lise, considera-se a fragmentação da célula.
Degeneração é uma lesão celular reversível caracterizada pela integridade dos núcleos e alterações predominantemente citoplasmáticas, tais como vacuolização, tumefação, acidofilia ou hialinização localizada ou difusa no citoplasma.
Edema significa presença anormal de líquido em localização intersticial ou cavidade pré-formada, caracterizada histologicamente pelo afastamento dos componentes ou deposição intersticial de material eosinofílico acelular.
Desorganização expressa a alteração de local dos núcleos, que com o processo de isquemia induzida podem se mover, aumentando a área da camada analisada, provocando o processo que chamamos de inchaço.
