Daniel de Azevedo Teixeira
INFLUÊNCIA DA ATIVIDADE NTPDÁSICA SOBRE A INFECTIVIDADE DE ISOLADOS DE Leishmania Chagasi PROVENIENTES DE CÃES INFECTADOS.
Governador Valadares 2008
DANIEL DE AZEVEDO TEIXEIRA
INFLUÊNCIA DA ATIVIDADE NTPDÁSICA SOBRE A INFECTIVIDADE DE
ISOLADOS DE LEISHMANIA CHAGASI PROVENIENTES DE CÃES
INFECTADOS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências da Saúde da Univale, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Área de Concentração:
Imunopatologia das doenças
infectocontagiosas. Linha de Pesquisa: Protozoologia de Parasitos.
Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso Co-orientador: Prof. Dr.Luiz Cosme Cotta Malaquias
Governador Valadares 2008
Teixeira, Daniel de Azevedo
Influência da atividade NTPDásica sobre a infectividade de isolados de Leishmania chagasi provenientes de cães infectados. / Daniel de Azevedo Teixeira. -- 2008.
78 f.
Dissertação (mestrado) – Universidade Vale do Rio Doce, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Biológicas, Governador Valadares, MG, 2008.
Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso.
1. Parasitologia. 2. Leishmaniose. 3. Cão - Doenças. I. Afonso, Luís Carlos Crocco. II. Universidade Vale do Rio Doce. III. Título
DANIEL DE AZEVEDO TEIXEIRA
INFLUÊNCIA DA ATIVIDADE NTPDÁSICA SOBRE A INFECTIVIDADE DE ISOLADOS DE LEISHMANIA CHAGASI PROVENIENTES DE CÃES INFECTADOS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências da Saúde da Univale,como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Área de Concentração: Imunopatologia das doenças infecto-contagiosas. Linha de Pesquisa: Protozoologia de Parasitos.
Governador Valadares, _______ de _____________________________ de ______________
Banca examinadora:
___________________________________________________________________________ (Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso)
___________________________________________________________________________ (Profa. Dra. Alda Maria Soares Silveira)
___________________________________________________________________________ (Profa. Dra. Juliana Lopes Rangel Fietto)
Dedico primeiramente a Deus, a maior força dentro de mim.
Ao meu orientador Dr. Luís Carlos Crocco Afonso e ao meu co-orientador Dr. Luiz Cosme Cotta Malaquias que contribuíram intensamente para o desenvolvimento da minha dissertação;
E aos meus pais e irmão que sempre estiveram do meu lado, transmitindo o amor e carinho necessário para fortalecer-me.
AGRADECIMENTO(S)
Agradeço a Deus por me fortalecer a cada dia agindo sobre mim com a luz do Espírito Santo.
Ao meu Pai, minha referência de caráter e inspiração eterna de sabedoria.
A minha mãe, que depositou sobre mim o seu espírito de luta e superação, transmitido através do seu amor incondicional.
Aos meus avós, que se orgulham a cada vitória alcançada ao longo da minha vida e especialmente em memória do “meu Vô” Sebastião Teixeira de Souza, que permanecerá sempre vivo em nossos corações.
Aos meus amigos, que me apoiaram em todos os momentos sendo considerados a minha família.
Ao amigo Maxwell, que foi um grande companheiro de trabalho e um colaborador decisivo para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu orientador Dr. Luís Carlos Crocco Afonso e ao meu co-orientador Dr. Luiz Cosme Cotta Malaquias que não mediram esforços para que esse trabalho fosse concretizado. Agradeço a dedicação e presteza que me foi oferecida e a amizade que se desenvolveu ao longo de nossa convivência.
Aos estagiários e funcionários do Laboratório de Pesquisa em Imunologia da UNIVALE, que ofereceram todo o suporte necessário para a conclusão deste trabalho.
Ao Dr. Eduardo de Almeida Marques da Silva e demais membros do Laboratório de Imunoparasitologia da UFOP, que através de muita dedicação me transmitiram os conhecimentos necessários para o desenvolvimento do trabalho.
Aos meus colegas de mestrado, que nesses anos de convivência demonstraram através de muito companheirismo a certeza de serem realmente meus eternos amigos.
Ao amigo Luciano, que além de companheiro em diversas ocasiões durante o curso de mestrado se tornou um grande amigo.
“Tudo posso naquele que me fortalece.”
(Filipenses 4:13)
RESUMO
As leishmanioses são doenças parasitárias de grande importância para a saúde pública, devido a sua alta incidência no mundo, principalmente em países das regiões tropicais e subtropicais. Eventos iniciais no processo de instalação da infecção parecem ser determinantes para o desenvolvimento da doença. A atividade nucleotidásica, realizada pela expressão das enzimas ecto-nucleotidases já foi descrita em estudos com outros parasitos como fator de virulência, influenciando, por exemplo, a resposta imune no processo de instalação da infecção. É sabido que os parasitos do gênero Leishmania utilizam a via de salvação de purinas para captação de nucleotídeos através da ação das ectonucleotidases, como as apirases e a 5’-nucleotidase. A hidrólise promovida pelas ecto-nucleotidases sobre o ATP, ADP e AMP extracelular, resulta na formação de adenosina necessária à sobrevivência do parasito. Nossa hipótese é que a atividade ecto-nucleotidásica dos parasitos de L. chagasi sobre o ATP extracelular, possa influenciar diretamente na modulação da resposta imune e no estabelecimento da infecção. No presente estudo foi demonstrada a atividade das enzimas ecto-nucleotidásicas pelas cepas M2682, OP e BH da espécie L. chagasi. Foi proposta a alteração dos meios de culturas dos parasitos que resultou no aumento da expressão da enzima 5’-nucleotidase com a adição de molibdato de amônio e a diminuição com adição de adenosina quando comparados ao grupo controle. Diante destes resultados foi realizada a infecção de macrófagos peritoneais obtidos de camundongos C57/BL6 com as formas promastigotas metacíclicas. A infectividade dos parasitos parece estar diretamente influenciada pela atividade ecto-nucleotidásica, pois os resultados obtidos indicaram maior infectividade (% de macrófagos infectados, número de parasitos associados aos macrófagos e índice de infectividade) de cepas tratadas com molibdato de amônio e menor infectividade quando tratadas com adenosina em comparação ao grupo controle, resultados estes observados no período de 72 horas de incubação. Analisando a infectividade foi adicionado no momento da infecção nucleotídeos ATP e AMP, com o objetivo de simular o processo de infecção in vivo em experimentos realizados in vitro. A adição dos nucleotídeos promoveu maior infectividade ao grupo no qual foi adicionado AMP em 2 e 72 horas de incubação. Na tentativa de elucidar o mecanismo de proteção do hospedeiro contra o parasito, foi realizada a dosagem de óxido nítrico nos sobrenadantes das culturas de macrófagos infectados, os resultados apresentados indicaram uma inibição da produção de óxido nítrico nas infecções com tratamento de molibdato de amônio e na presença de AMP.
Palavras-chave: Leishmania chagasi, Apirases, Ecto-nucleotidase, Infectividade
ABSTRACT
Leishmaniose is a parasitic illness of great importance for the public health cause of its high incidence in the world, mainly in countries of tropical and subtropical regions. Firts events in the process of installation of the infection seem to be determinative for the development of the illness. The nucleotidásica activity, happened for the expression of enzymes ecto-nucleotidases was already described in studies with other parasites as virulence factor, evaluating the influence of the degradation of nucleotídeos with the regulation of the immune reply in the process of installation of the infection. Through literature, it is known that the parasites of the Leishmania sort use the way of salvation of purinas for captation of nucleotídeos through the enzyme action, as apirases and the 5 ' - nucleotidase (enzymes ecto-nucleotidases). The hydrolysis promoted by the ecto-nucleotidases on the extracellular ATP, an inflammatory agent, results in the necessary adenosine formation to the survival of the parasite. Our hypothesis is based on the ecto-nucleotidásica activity promoted by the parasites of L. chagasi on the extracellular ATP, what it can influence directly in the modulation of the immune reply and in the establishment of the infection for the parasite. In the present study it was demonstrated the expression of ecto-nucleotidásicas enzymes for cepas M2682, OP and BH of species L. chagasi. The alteration of the ways of cultures was proposal parasitic them that it resulted in the increase of the expression of enzyme 5 ' - nucleotidase with the addition of molibdato of ammonium and the reduction with adenosine addition when compared with the group it has controlled. With these results the infection of peritoneais macrophages gotten of mice C57/BL6 with the promastigotas metacíclicas forms. The infectivity of the parasites seems to be directly influenced for the ecto-nucleotidásica activity, therefore the results gotten showed a bigger number of infectivity (% of macrophagesinfected, number of parasites associated with M and index of infectividade) of strains treated with molibdato of ammonium and smaller infectivity when treated with adenosine in comparison to the group it has controlled, these results were observed in a period of 72 hours of incubation. Analyzing the infectivity, at the moment of infection nucleotídeos ATP and AMP were added, with the objective of simulating the infection process in alive being on experiments in vitro. The nucleotídeos addition promoted greater infectivity to the group in which AMP in 2 and 72 hours of incubation was added. In the attemptp of elucidating the mechanism of protection of the host against the parasite, the dosage of nitric oxide in the sobrenadant of the cultures of macrophages infected the results had indicated a inhibition of the nitric oxide expression in
cepas that they had been beter treated for the infection process (treated with molibdato to ammonium and in the presence of AMP). Therefore, the infectivity of cepas of species L. chagasi seems to be directly related with the expression of ecto-nucleotidásicas enzymes, mainly the enzyme 5' - nucleotidase acting in the process of inhibition of the nitric oxide expression.
KeyWords: Leishmania chagasi, Apirases, Ecto-nucleotidase, Infectivity
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Curva de crescimento das cepas de L. chagasi.
Figura 2 - Separação de promastigotas metacíclicas das cepas L. chagasi.
Figura 3 - Medida da atividade nucleotidásica das cepas M2682, OP e BH realizada com promastigotas totais e promastigotas metacíclicas.
Figura 4 - Medida da atividade nucleotidásica das cepas de L. chagasi realizada com promastigotas metacíclicas obtidas de culturas tratadas com molibdato de amônio e não tratadas.
Figura 5 - Medida da atividade nucleotidásica das cepas de L. chagasi realizada com promastigotas metacíclicas obtidas de culturas tratadas com adenosina e não tratadas.
Figura 6 - Porcentagem de macrófagos na presença de parasitos aderidos às cepas M2682, OP e BH tratadas e não tratadas com molibdato de amônio, após incubação de 2 e 72 horas.
Figura 7 - Número de parasitos por macrófagos infectados. Figura 8 - Índice de infectividade das cepas de L. chagasi.
Figura 9 - Porcentagem de macrófagos na presença de parasitos aderidos em 2 horas e amastigotas em 72 horas das cepas M2682, OP e BH tratadas e não tratadas com adenosina.
Figura 10 - Número de parasitos por macrófagos infectados.
Figura 11 - Índice de infectividade das cepas de L. chagasi.
Figura 12 - Porcentagem de macrófagos na presença de parasitos em 2 e 72 horas das cepas M2682, OP e BH tratadas e não tratadas com molibdato de amônio na presença de ATP.
Figura 13 - Número de parasitos por macrófagos infectados na presença de ATP em 2 e 72 horas.
Figura 14 - Índice de infectividade de parasitos na presença de ATP em 2 e 72 horas.
Figura 15 - Porcentagem de macrófagos na presença d eparasitos em 2 e 72 horas das cepas M2682, OP e BH tratadas e não tratadas com molibdato de amônio na presença de AMP.
Figura 16 - Número de parasitos por macrófagos infectados na presença de AMP em 2 e 72 horas.
Figura 17 - Índice de infectividade de parasitos na presença de AMP em 2 e 72 horas.
Figura 18 - Dosagem de óxido nítrico nos sobrenadantes de cultura de macrófagos infectados em 72 horas na presença de ATP.
Figura 19 - Dosagem de óxido nítrico nos sobrenadantes de cultura de macrófagos infectados em 72 horas na presença de AMP.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADP: Adenosina difosfato. AMP: Adenosina monofosfato.
AMPc: AMP cíclico. ATP: Adenosina trifosfato.
BOD: Demanda bioquímica do oxigênio. Ca2+: Cálcio.
DNA: Ácido desoxirribonucléico. ELISA: Ensaio imunoenzimático.
E-NTPDase: Ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase. FAD: Flavina Adenina dinucleotídeo.
gp: Glicoproteína. IFN-γ: Interferon gama. IL: Interleucina.
iNOS: óxido nítrico sintase induzível. K+: Postássio.
kDNA: Ácido desoxirribonucléico do cinetoplasto.
LACK: Receptores homólogos de leishmania ativadores de kinase C LPG: Lipofosfoglicano.
Mg2+:Magnésio.
MAPK: Proteína Quinase Associada aos Microtúbulos Na+: Sódio.
NO: Óxido nítrico. NO2:Nitrito.
NTPDase: Nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase P: Significância estatística.
PBS: Solução salina tamponada com fosfato. rpm: Rotações por minuto.
RPMI: Meio de cultura desenvolvido no Roswell Park Memorial Institute. SFB: Soro fetal bovino.
Th: Linfócito T “helper”.
TNF-α: Fator de necrose tumoral. TCR: Receptor de células T. Treg: Células T regulatórias.
SUMÁRIO 1 Introdução...18 1.1 Epidemiologia ...18 1.2 Formas Clínicas ...18 1.3 Ciclo de Vida ...19 1.4 Resposta Imunológica ...20
1.5 Resposta imunológica na Leishmaniose Visceral ...22
1.6 Fatores de Virulência...23
1.7As apirases como fator de virulência ...24
2 Justificativa...28
3 Objetivo Geral...29
3.1 Objetivos específicos ...29
4 Metodologia ...30
4.1 Parasitos ...30
4.2 Estabelecimento da curva de crescimento ...30
4.3 Medida da hidrólise de ATP, ADP e AMP ...30
4.4 Alteração do meio de cultura ...31
4.5 Infecção de macrófagos ...31
4.6 Adição de nucleotídeos (ATP e AMP) ao processo de infecção de macrófagos...32
4.7 Avaliação da produção de óxido nítrico no sobrenadante de culturas de macrófagos infectados...32
4.8 Análise estatística ...33
5 Resultados e Discussão...34
5.1 Objetivo I - Curva de crescimento das cepas de L. chagasi ...34
5.2 Objetivo II - Avaliação da atividade ATPásica e 5’- Nucleotidásica de promastigotas totais e promastigotas metacíclicas de isolados de L. chagasi de culturas recentes ...37
5.3 Objetivo III – Verificar o efeito da adição de molibdato de amônio ou adenosina no meio de cultura sobre a expressão das enzimas ectonucleotidásica ...39
5.4 Objetivo IV - Associção da atividade ecto-nucleotidásica de diferentes cepas de L. chagasi com a infectividade em macrófagos peritoneais ...43
5.5 Objetivo V - Avaliação da infectividade de promastigotas metacíclicas em macrófagos na presença de nucleotídeos (ATP e AMP) ...52
5.6 Objetivo VI – Avaliação da produção de óxido nítrico no sobrenadante de cultura de macrófagos infectados com promastigotas metacíclicas tratadas e não tratadas com molibdato de amônio na presença de ATP e AMP ...61
6 Considerações finais ...64
7 Conclusão ...66
1 Introdução
1.1 Epidemiologia
As leishmanioses são doenças que acompanham a humanidade desde a antiguidade, fato comprovado através da descrição da Leishmaniose Tegumentar Americana encontrada na literatura desde o século I d.C. Estudos recentes indicam que as leishmanioses afetam cerca de 12 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo 2 milhões de novos casos a cada ano, afetando cerca de 88 países, dos quais 72 são classificados como em desenvolvimento e 13 países classificados como subdesenvolvidos. Somente na América tropical e subtropical, as leishmanioses afetam cerca de 24 países, mas a distribuição da doença pode afetar outros países como Afeganistão, Argélia, Arábia Saudita, Bangladesh, Sudão, Iran e Nepal, sendo assim uma doença de grande relevância para a saúde pública (WHO, 2004). No Brasil, as leishmanioses são causadas por 6 espécies de Leishmania que podem causar doenças humanas, existindo aproximadamente cerca de 200 flebotomíneos responsáveis pela sua transmissão. A leishmaniose visceral está expandindo acentuadamente em todo mundo, principalmente no Brasil, onde áreas tipicamente rurais passaram recentemente para um perfil urbano através do constante desmatamento, do processo migratório da população humana e canina originárias de áreas rurais onde a doença é endêmica. Dados alarmantes indicam que a incidência da Leishmaniose visceral no mundo é de aproximadamente 500.000 casos anuais e que 90% dos casos estão concentrados em apenas 5 países, dentre eles o Brasil. Distribuída em pelo menos 19 estados da federação brasileira e apresentando mais de 60.000 casos notificados entre o período de 1984 a 2000, a Leishmaniose visceral pode ser considerada como uma grande ameaça à saúde pública. (FUNASA, 2000)
1.2 Formas Clínicas
As leishmanioses são doenças que afetam animais e seres humanos causadas por parasitos protozoários do gênero Leishmania, Trypanosomatidae e ordem Kinetoplastida (Laison & Shaw, 1987). Na natureza, as espécies de Leishmania que podem infectar humanos são transmitidas pela picada de fêmeas de Flebotomíneos infectados (Diptera:Psychodidae). A
doença no Novo Mundo é causada por diferentes espécies do parasito, que são capazes de produzir uma larga variedade de manifestações clínicas (Grimaldi Jr & Tesh, 1993). Estas manifestações podem variar de uma simples lesão cutânea, que pode ou não ter cura espontânea, às formas viscerais que, se não tratadas, levam ao óbito. Portanto, algumas espécies podem ocasionar manifestações bastante distintas, como as formas tegumentares caracterizadas por lesões cutâneas (disseminada e difusa) e lesões mucosas e mucocutâneas, tendo como agente etiológico as espécies L. major no Velho Mundo e L. braziliensis, L.
amazonensis e L. guyanensis na América do Sul. As formas viscerais causadas,
predominantemente, pelas espécies L. donovani, L. chagasi/ L. infantum (Reithinger & Dujardin, 2007; Murray et al, 2005) cujas apresentações clínicas variam de formas assintomáticas até o quadro clássico da doença que, no período estado, é caracterizado pela presença de hepatoesplenomegalia, linfodenopatia, lesões cutâneas, anorexia, alopecia, córneas opacas, perda de peso, febre (Bettini & Gradoni, 1986) e hipergamaglobulinemia, um clássico sinal clínico que progride juntamente com a doença e está acompanhado pela supressão da resposta imune celular, pelo acometimento do sistema linfomonocitário de forma sistêmica, muitas vezes apresentando evolução fatal. (Pinelli et al, 1994; Cabral et al, 1998).
1.3 Ciclo de Vida
O protozoário causador da leishmaniose visceral nas Américas é um parasita intracelular obrigatório da família Tryponosomatidae, gênero e subgênero Leishmania e espécie chagasi-L. (L.) chagasi (Lainson & Shaw, 1987). Estes parasitos têm duas formas distintas em sua vida, uma fase móvel e flagelada que vive extracelularmente no trato digestivo do hospedeiro invertebrado, estas são as formas promastigotas (Walters et al, 1987; Walters, 1993) que se diferenciam em promastigotas procíclicas e promastigotas metacíclicas, sendo estas, as formas infectantes para hospedeiro vertebrado ou liberada na corrente sanguínea. A forma amastigota é imóvel e reside dentro dos macrófagos do hospedeiro vertebrado (Chang et al, 1985). Estas formas sobrevivem e multiplicam-se no compartimento fagolisossomal dos macrófagos, após o processo de crescimento e multiplicação dos parasitos os macrófagos infectados se rompem e liberam as amastigotas que infectam macrófagos vizinhos, progredindo assim a infecção (Chang et al, 1976; Alexander & Vickerman 1975; Sacks & Kamhawi, 2001). A fagocitose de leishmanias por macrófagos envolve receptores de membrana específicos como CR1 e CR3 (Chang, 1981; Klempner et al, 1983) a medida
que estes receptores se diferem na capacidade para estimular respostas celulares específicas, como ligação, internalização e na liberação de enzimas lisossomais estes fenômenos irão desempenhar um papel fundamental para a instalação da infecção pelo parasito (Bryant et al, 1986; Janusz et al, 1987), outros fatores como as moléculas de superfície dos parasitos que contém lipofosfoglicano (LPG) e a gp63 (glicoproteína de 63 KDa) atuam na proteção dos parasitos contra a lise fagolisossomal, através da inibição de mecanismos oxidativos e enzimas lisossômicas, permitindo assim condições favoráveis a multiplicação destas formas (Duarte Corbertt, 1994). Portanto, o estabelecimento da infecção é influenciado diretamente pela interação entre os mecanismos de infecção do parasito, a partir da picada das fêmeas do flebotomíneo Lutzomya longiplapis (vetor da L. chagasi) e a resposta imune do hospedeiro.
1.4 Resposta Imunológica
O resultado da infecção causada por parasitos do gênero Leishmania é influenciado, geralmente, pela resposta imune do hospedeiro e pela virulência do parasito (Grimaldi Jr & Tesh, 1993). O perfil da resposta imunológica desenvolvida pelo hospedeiro poder ser crucial para o desenvolvimento da leishmaniose. Assim, vários estudos (Pearson et al, 1983; Howard et al, 1980; Liew et al, 1982) foram realizados com o objetivo de elucidar os mecanismos de regulação das respostas Th1/Th2 na infecção por Leishmania. Um fator importante é que a modulação da resposta Th1 e Th2 na leishmaniose em camundongos têm influência fundamental na característica da resposta mediada pelas células T CD4+, podendo separar-se em subgrupos com base no perfil de citocinas. Experimentos realizados com L. major utilizando camundongos (BALB/c) susceptíveis à infecção, demonstraram que IL-4 possui um papel importante no desenvolvimento da resposta imune contra um antígeno específico da
Leishmania denominado LACK (Leishmania homolog of receptors for activated C Kinase)
(Launois et al., 1997), regulando negativamente a expressão da subunidade β2 do receptor de IL-12 nas células Th1 que possui potencial protetor. Assim, a célula não reconhece IL-12 e a produção de IFN-γ e a produção de NO (óxido nítrico) pelos macrófagos é inibida, impedindo a destruição dos parasitos pelos mesmos. A IL-4 também, promove a diferenciação das células Th2 induzindo uma maior secreção de IL-4, IL-5 e IL-10, entre outras citocinas, bem como a produção de anticorpos específicos contra o parasito (Locksley et al, 1991; Scott et al, 1991; Heinzel et al, 1989; Heinzel et al, 1991; Rogers et al, 2002). Estudos realizados tanto
em L. major (Kopf et al, 1996) e principalmente em L. amazonensis (Afonso & Scott, 1993; Soong et al, 1997; Jones et al, 2000; Jones et al, 2002), indicaram que utilizando o mesmo hospedeiro e diferente cepas ou espécies do parasito, a resposta protetora era sempre dependente da produção de IFN-γ, mas a susceptibilidade à infecção nem sempre dependia da produção de IL-4.
Estudos em modelos experimentais refletem o que já se havia observado há muito tempo na doença em seres humanos, ou seja, que o parasito tem uma participação importante no estabelecimento da infecção e na determinação de sua forma clínica. Entretanto, independentemente da necessidade ou não do desenvolvimento de uma resposta Th2 para o estabelecimento da infecção por Leishmania, um ponto em que vários dos estudos acima citados concordam é que os momentos iniciais da infecção são cruciais no estabelecimento da resposta imune e costumam determinar sua capacidade de controlar ou não a infecção por estes parasitos (Jones et al, 2002; Vester et al, 1999).
A variabilidade de manifestações clínicas das leishmanioses é causada por estes fatores e pode ser observado em experimentos com camundongos inoculados com L. major ou
L. braziliensis que desenvolvem lesões cutâneas simples e evoluem espontaneamente para
cura (Childs et al, 1984; Sacks & Noben-Trauth, 2002). Entretanto, quando camundongos são inoculados com L. amazonensis, embora não desenvolvam a forma difusa da infecção, não conseguem controlá-la e desenvolvem uma lesão persistente que se torna crônica (Kima et al., 2000). Estudos sobre a imunopatogênese das leishmanioses cutâneas, demonstraram que a resistência de camundongos aos parasitos do gênero L. major está relacionada com a indução e desenvolvimento preferencial das respostas tipo Th-1 (Locksley et al., 1987).
Estas respostas incluem a produção de IL-2 que ativa a proliferação de linfócitos, a produção de IFN-γ e TNF-α que são mediadores da proteção pela ativação de macrófagos para atividade microbicida através da produção de óxido nítrico (NO) (Wei et al., 1995).
Outros fatores podem contribuir para a regulação da resposta imune, células da resposta imune inata, como granulócitos e células “natural killer” (NK), bem como os queratinócitos e células dendríticas que secretam citocinas e quimiocinas responsáveis pela diferenciação das células T CD4+, determinando assim, a prevalência do perfil Th1 protetor ou Th2 susceptível à infecção. As células T regulatórias (Treg) também exercem um papel importante na resposta imune do hospedeiro aos parasitos, as Treg inibem ativamente a resposta imune, desempenhando um papel preventivo na autoimunidade, bem como na regulação geral da resposta imune aos tumores e às doenças infecciosas em geral (Maloy &
Powrie, 2001; Sakaguchi, 2004). Segundo (Jiaxiang et al, 2005) as células T CD4+ e CD25+ representam um subconjunto de células Treg que representam 5 a 10% da população geral de células T CD4+, esta população de linfócitos possui ação moduladora no sistema imunitário, inibindo as células T CD4+ efetoras, diminuindo a produção de IFN-γ e contribuindo para o desenvolvimento da infecção em camundongos.
1.5 Resposta imunológica na Leishmaniose Visceral
A resposta imunológica desencadeada contra a Leishmaniose Visceral apresenta algumas alterações em relação à resposta apresentada pela Leishmaniose Tegumentar. Os fatores de resistência do hospedeiro contra a Leishmaniose Visceral observados em experimentos realizados com L. donovani, baseiam-se na ativação de macrófagos induzida por citocinas como IFN-γ e TNF-α estimulados por IL-2, apresentando uma resposta inflamatória, caracterizada pela liberação de óxido nítrico que se estabelece como uma via efetora (Murray & Nathan, 1999). A atividade leishmanicida do macrófago também está inversamente relacionada com a produção de TGF-β. Essa citocina está relacionada com a desativação de macrófago, inibição da ação do IFN-γ e a redução da expressão das moléculas MHC de classe II (Ding & Nathan, 1990). A IL-10 é uma outra citocina que contribui para a sobrevivência da Leishmania, promovendo inibição da ativação de macrófagos e suprimindo a produção de IFN-γ por células T CD4+, tipo Th1. A IL-12 pode ser diretamente associada com a resistência dos hospedeiros nas fases iniciais da infecção por leishmania. A principal atividade biológica da IL-12 ocorre sobre as células “natural killer” (NK), nas quais ela estimula a produção IFN-γ, proliferação celular e citotoxicidade (Trinchieri & Gerosa, 1996). A principal alteração imunológica é a incapacidade de ativação de macrófagos para a destruição das leishmanias devido à ausência da produção de IFN-γ, como foi observado em experimentos utilizando antígenos de Leishmania em macrófagos “in vitro” (Carvalho et al, 1988). Estudos realizados em pacientes infectados com L. donovani, demonstraram a presença de RNA mensageiro para IL-10 em linfonodos e células mononucleares desses pacientes (Ghalib et al, 1993). Por fim, a principal diferença na resposta imune na leishmaniose visceral está relacionada com a incapacidade de desenvolver uma resposta tipo Th1, devido a ausência de IL-12, a mais importante citocina no desenvolvimento desse tipo de resposta. Experimentos realizados através da infecção “in vitro” de macrófagos com L. donovani
apresentou resultados que indicam a diminuição da produção da IL-12, que bloqueia a produção de IFN-γ, impedindo a ativação de macrófagos nas fases iniciais da infecção (Bacellar et al, 1996; Bacellar et al, 2000; De Almeida et al, 2003). Portanto, os mecanismos para o estabelecimento da leishmaniose visceral parecem estar relacionados com os momentos iniciais do processo de infecção e modulação da resposta imune.
1.6 Fatores de Virulência
O estabelecimento da infecção por parasitos do gênero Leishmania depende da interação entre a resposta imune do hospedeiro e a expressão de algumas moléculas, denominadas fatores de virulência. O lipofosfoglicano LPG, a proteína homóloga de Leishmania de receptores de proteína quinase C ativada (LACK), a glicoproteína gp63 e as cisteíno-peptidases são algumas das moléculas que desempenham um papel fundamental na imunopatogênese das leishmanioses.
O LPG é um glicolipídeo encontrado na superfície celular das formas promastigotas de Leishmania, capaz de inibir a ação de monócitos através do bloqueio da adesão endotelial e da migração transendotelial (Lo et al, 1998).
A gp63 é uma metaloprotease de zinco presente na superfície celular de promatigotas, que juntamente com a LPG, induzem a fagocitose e contribuem para a sobrevivência das formas amastigotas no interior dos macrófagos, através da ligação com receptores de Complemento (Brinttingham & Mosser, 1996; Handman & Bullen; 2002).
A proteína LACK se encontra próxima ao cinetoplasto do citoplasma celular e possui grande homologia entre as diferentes espécies do parasito. A presença de um epitopo imunodominante em sua conformação ativa linfócitos CD4+ com receptor de células T (TCR) Vβ4, Vα8 produtores de IL-4, que aumentam após a infecção por L. major em camundongos BALB/c, contribuindo para a susceptibilidade do hospedeiro à infecção, regulando negativamente a expressão da subunidade β2 do receptor de IL-12 nas células Th1 que possui potencial protetor.
A participação das moléculas citadas anteriormente no mecanismo de infecção por parasitos do gênero Leishmania, pode ser de grande importância para elucidar os processos que envolvem a ação do parasito, e a resposta imune desencadeada pelo hospedeiro nas fases inicias da infecção.
1.7 As apirases como fator de virulência
As E-NTPDases são ecto-nucleotidases com atividade apirase e a presença de íons bivalentes geralmente Ca2+ ou Mg2+ no meio extracelular, contribui para sua capacidade de hidrolisar ATP e ADP, resultando na produção de AMP (Plesner, 1995; Zimmermann, 2000). As funções fisiológicas destas enzimas ainda não foram totalmente elucidadas, mas há hipóteses que sugerem a participação delas em vários processos como: proteção contra efeitos citolíticos promovidos pelo ATP extracelular, terminação da sinalização purinérgica, envolvimento na transdução de sinal e envolvimento na adesão celular. Estudos sobre o papel destas enzimas em parasites foram descritas em espécies como Toxoplasma gondii (Asai et al, 1995), Tritrichomonas foetus (Jesus et al, 2002), Trypanosoma cruzi (Bissagio et al, 2003; Fietto et al, 2004) Leishmania tropica (Meyer-Fernandes et al, 1997), os resultados obtidos com espécies da família Tripanosomatidae, especificadamente as espécies T. gondii e L.
amazonensis demonstraram a participação destas enzimas na captação de adenina para as vias
de salvação de purinas, necessário para a sobrevivência do parasito.
As 5’-nucleotidases são enzimas encontradas na forma solúvel ou presente nas membranas de parasitos, bactérias, células vegetais e animais (Zimmermann, 1992). Estas enzimas agem sobre mononucleotídeos purínicos e pirimídicos, apresentam atividade sobre 5’-dinucleotídeos, 5’-trinucleotídeos e sobre nucleotídeos complexos como UDP-glicose ou Flavina Adenina dinucleotídeo (FAD) e ainda, são capazes de hidrolisar AMP resultando na formação de adenosina. As atividades dessas enzimas já foram descritas nos músculos esqueléticos e cardíacos e em estudos realizados com L. donovani (Gottlieb e Dwyer et al, 1983) e Trichomonas vaginallis (Tasca et al, 2003). O resultado dessa atividade sobre AMP resultando em adenosina, promove uma ação cardioprotetora em camundongos infectados por
T. cruzi (Fretes et al, 1999) e age também, no controle de derrame vascular ocasionado por
hipóxia em camundongos (Thompson et al, 2004).
Substâncias como o maxadilan, um potente vasodilatador presente na saliva de flebotomíneos como o Lutzomya longipalpis, atuam sobre o sistema imune do hospedeiro facilitando o processo de infecção por Leishmania (Rogers & Titus, 2003). A presença da apirase, 5’-nucleotidase e da adenosina deaminase (ADA) na saliva de insetos transmissores da leishmaniose pode sugerir uma participação efetiva destas enzimas no processo de infecção através da ação vasodilatadora e inibição da agregação plaquetária promovida pela presença
de adenosina (Ribeiro et al, 2003).Portanto, a ação conjunta destas enzimas sobre o ATP e seus metabólitos, pode contribuir para o estabelecimento da infecção por Leishmania, devido a presença de adenosina na fase inicial do processo de infecção, modulando a resposta imune do hospedeiro.
O ATP extracelular é uma molécula que exerce um papel importante na resposta imune de mamíferos (Launois et al, 1997) . Após o processo de injúria são liberadas altas concentrações de ATP extracelular, age como “sinal de perigo” induzindo uma resposta /inflamatória caracterizada pela liberação de citocinas, tais como IFN-γ, IL-12 e TNF (la sala et al, 2003; Langston et al, 2003). Os efeitos podem variar de acordo com a concentração, o tempo de ação e o tipo de célula envolvida (Di Virgilio F., 2007). O controle dessas ações é realizado pelas enzimas com atividade da família apirase e 5’-nucleotidase, que agem sobre o ATP e seus produtos de degradação, reduzindo a sua concentração no meio extracelular resultando na conversão em adenosina. A adenosina através da ativação de receptores purinérgicos da família P1 induz uma resposta antiinflamatória, contrária a resposta promovida pelo ATP. Várias enzimas da família CD 39 foram caracterizadas em mamíferos (Zimmermann, 2000) e de acordo com suas atividades sobre ATP foram sugeridas como capazes de modular diferentes tipos de receptores purinérgicos.
Os receptores purinérgicos estão presentes na superfície de diversas células e exercem a função de reconhecimento do ATP extracelular e seus metabólitos. Estes receptores são divididos em duas famílias: P1 ativados por adenosina e P2 ativados por ATP, ADP, UTP e ADP (Burnstock, 2007).A família P1 composta por 4 subtipos (A1, A2A, A2B e A3), promove
a regulação da reposta imune e inflamatória após o processo de lesão tecidual, desempenhando um papel importante para o controle da resposta imunológica, dessensibilizando e processo inflamatório excessivo (Jackobson & Gao, 2006).
Os receptores A2A possuem alta afinidade por adenosina e apresentam atividade
antiinflamatória por bloqueio da resposta imune, provavelmente por uma via de indução do aumento do AMP cíclico (AMPc) intracelular pela ativação da adenilato ciclase (Raskovalova et al, 2005). Já os receptores A2B, apresentam baixa afinidade por adenosina. A ligação de
adenosina com os receptores A2A e A2B promove a regulação da resposta imune através da
inibição da produção de IFN-γ, IL-12 e TNF-α (Lappas et al, 2005; Hasko et al, 2000; Kreckler et al, 2006) e aumento da IL-10 (Panther et al, 2003). Pode ocorrer também inibição da migração de células dendríticas através da ligação entre adenosina e os receptores A2A e
Os receptores P2 são divididos em duas subfamílias: P2X que possui sete subtipos de receptores (forma homomérica P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X6, P2X7; forma
heteromérica P2X1/P2X5, P2X2/P2X3, P2X4/P2X6) e P2Y que apresentam oito subtipos
(P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13, P2Y14) (North & Suprenant, 2000). A
distribuição dos receptores P2 em diferentes células de mamíferos como plaquetas, neurônios e células musculares demonstram funções fisiológicas importantes como o aumento dos níveis de Ca2+ favorecendo a despolarização de membrana, a ativação dos receptores P2X1,
através da ligação com ATP induzindo a agregação plaquetária(Mahaut-Smith et al, 2000) e a ativação do subtipo P2X7 que está associado a células do sistema imune (mastócitos,
linfócitos e macrófagos) (Burnstock, 2007; Surprenant et al, 1996) promovendo lise celular através da formação de poros na membrana celular e ativando uma resposta inflamatória através da produção de IL1-β (Ferrrari et al, 2006).
Os receptores P2Y estão presentes na superfície de quase todas as células podendo ser divididos em receptores preferenciais para nucleotídeos de adenina, respondendo principalmente a ATP e ADP (P2Y1, P2Y12 e P2Y13 de humanos e ratos P2Y11 de humanos),
receptores preferenciais de nucleotídeos de uracila, respondendo principalmente a UTP e UDP (P2Y4 e P2Y6 em humanos), e receptores P2Y2 de humanos e ratos e P2Y4 de ratos,
classificados como de seletividade mista(Abbracchio et al, 2003; Abbracchio et al, 2006). A A função fisiológica de alguns destes receptores já estão descritos como subtipos P2Y1 e
P2Y12 que promovem agregação plaquetária quando ativados por ADP e P2Y2 que está
envolvido no tratamento de pacientes com fibrose cística. Além disso, a estimulação de ATP sobre os receptores P2Y11 induz a maturação e diferenciação de células dendríticas humanas e
aumenta a produção de IL-12 por células dendríticas estimuladas por TNF-α (Schnurr et al, 2000; Wilkin et al, 2001).
Como já descrito anteriormente, vários estudos demonstraram que os eventos ocorridos nas fases iniciais da infecção por Leishmania, bem como os fatores de virulência, são cruciais para o estabelecimento da infecção. Trabalhos recentes realizados em isolados diferentes de L. amazonensis demonstraram a presença de enzimas envolvidas com o metabolismo de ATP extracelular neste parasito (Berredo-Pinho et al, 2001; Coimbra et al, 2002). Estas enzimas estariam, a princípio, envolvidas com a captação de adenosina pelo parasito, uma vez que os parasitos do gênero Leishmania não possuem as vias de síntese de novo de purinas e pirimidinas, necessitando de utilizar as vias de salvação de purinas no processo de obtenção de nucleotídeos para sua sobrevivência. (Marr et al, 1978). As
ecto-nucleotidases, como são denominadas estas enzimas são responsáveis por degradar ao ATP extracelular que age como um “sinal de perigo” e induz uma resposta inflamatória através da secreção de citocinas, tais como IFN-γ, IL-12 e TNF-α (la sala et al, 2003; Langston et al 2003). A degradação de ATP é mediada pela ação das apirases que agem sobre ATP e ADP resultando em AMP, que posteriormente é degradado pela enzima 5’-nucleotidase resultando na formação de adenosina (Meyer-Fernandes, 2002). Esta, por sua vez, induz uma resposta antiinflamatória através da ativação dos receptores purinérgicos da família P1. Portanto, a presença destas enzimas na superfície de parasitos da espécie L. chagasi pode ser crucial para o desenvolvimento da infecção através da modulação da resposta imune e como a fator de virulência, características que já foram descritas com estudos realizados com L. amazonesis e
L. brazilienses (Marques-de-Almeida et al, 2008).
Neste trabalho investigamos a atividade ecto-nucleotidásica presente nos promastigotas de Leishmania chagasi. Realizamos alterações no meio de cultura de promastigotas com molibdato de amônio e adenosina para avaliar a influência exercida na atividade ecto-nucleotidásica. Associamos a atividade ecto-nucleotidásica a infectividade em macrófagos em culturas tratadas e não tratadas com molibdato de amônio, na ausência e presença de ATP e AMP. Por fim, avaliamos a produção de óxido nítrico em sobrenadantes de cultura de macrófagos infectados na tentativa de elucidar o mecanismo de infecção da espécie Leishmania chagasi.
2 Justificativa
A determinação de fatores associados à virulência de agentes infecciosos é um dos principais objetivos da ciência biológica e da saúde. Especificamente no caso das infecções causadas por parasitos do gênero Leishmania, a diversidade de formas clínicas da doença, torna bastante relevante a abordagem do assunto. Vários grupos têm tentado, com maior ou menor sucesso, identificar marcadores de virulência nos parasitos do gênero Leishmania. Dentre estes fatores, a ação das ecto-nucleotidases foi descrita recentemente como um fator determinante para o estabelecimento da infecção por parasitos das espécies L. amazonensis e
L. braziliensis (Marques-de-Almeida et al, 2008). Portanto, o presente estudo se baseia na
hipótese que ocorra expressão a destas enzimas pela espécie L. chagasi. E que da mesma forma observadas nas outras espécies em L. chagasi, estas enzimas sejam responsáveis pela formação de adenosina, capaz de modular a resposta imune contribuindo para o estabelecimento da infecção.
3 Objetivo Geral
Avaliar a atividade de ecto-nucleotidases presente em promastigotas de L. chagasi provenientes de isolados obtidos de cães infectados e associar esta atividade com a infectividade em macrófagos.
3.1 Objetivos específicos
I.Estabelecer a curva de crescimento das cepas para a determinação do pico máximo de concentração dos parasitos.
II.Avaliar a atividade ecto ATPásica, ecto-ADPásica e ecto-5’-Nucleotidásica de promastigotas totais e promastigotas metacíclicas de isolados de L. chagasi de culturas recentes.
III.Verificar o efeito da adição de molibdato de amônio ou adenosina ao meio de cultura sobre a atividade ectonucleotidásica.
IV.Associação da atividade ecto-nucleotidásica de diferentes cepas de L. chagasi com a infectividade em macrófagos peritoneais.
V.Avaliação da infectividade de promastigotas metacíclicas em macrófagos na presença de nucleotídeos (ATP e AMP).
VI.Avaliação da produção de óxido nítrico no sobrenadante de cultura de macrófagos infectados com promastigotas metacíclicas tratadas e não tratadas com molibdato de amônio na presença de ATP e AMP.
4 Metodologia
4.1 Parasitos
Neste trabalhos foram utilizadas a cepa referência de L. chagasi M2682 e isolados BH e OP obtidos de cães infectados. Os promastigotas foram mantidos em meio Grace em estufa BOD a 25°C. (Afonso & Scott, 1993). Foram realizados experimentos com promastigotas totais (procíclicas e metacíclicas) e com formas promastigotas metacíclicas purificadas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll 400® (Sigma Aldrich), na concentração de 10% em PBS (salina tamponada por fosfato).
Foi depositada a solução de Ficoll em um tubo cônico de 15 ml, em seguida foi sobreposto a esta solução 2 mL de meio RPMI 1640 com a concentração máxima de 109 promastigotas totais. As soluções foram centrifugadas a 2600 rpm por 10 minutos a 4 ºC, os parasitos foram recuperados da parte superior da interface da solução de RPMI com uma pipeta Pasteur estéril (Späth & Beverkley, 2001; Bertholet et al, 2005).
4.2 Estabelecimento da curva de crescimento
As cepas foram mantidas em meio Grace, contendo 2 mM de L-glutamina, 100 U de penicilina-G-potássica, enriquecido com 15 e 20% de soro fetal bovino (SFB) (CRIPION) previamente inativado a 56ºC/30 minutos e mantidas em estufa BOD a 25°C (Afonso & Scott, 1993). O inóculo inicial foi de 1 x 105 promastigotas/mL. A contagem foi realizada através de diluição com Formol 4% para imobilizar os parasitos, diariamente, no mesmo horário, por microscopia ótica em câmara de Neubauer, com 3 amostras de cada cepa durante o período de sete dias.
4.3 Medida da hidrólise de ATP, ADP e AMP
A medida da atividade enzimática em promastigotas de Leishmania foi realizada em 25 µl de tampão Tris-Cl 50 mM, pH8.0; NaCl 0,1 M, CaCl2 5 mM, 5.5mM glicose. Foram
incubados 3,75 x 106 parasitos por poço na presença de ATP, ADP e AMP (na concentração de 5 mM) por 1 h a 37 °C, e os resultados foram expressos na concentração de 1 x 108
parasitos/ nmolPi/ hora. Para preparação dos parasitos, foram realizadas 2 lavagens com NaCl 0,8% (após a formação do pellet previamente centrifugado em meio Grace) por centrifugação a 2600 rpm, durante 20 minutos a 4ºC. A reação enzimática foi interrompida pela adição HCl 0,2N (Fietto et al, 2004).A reação foi novamente centrifugada a 2600 rpm e posteriormente adicionada em placas de 96 poços Foi utilizado um reagente colorimétrico: sulfato ferroso 8,8%, ácido sulfúrico 163 mM e 53,0% de uma solução molibdato de amônio 2% e ácido sulfúrico 5,55% (adicionado imediatamente antes do uso) para revelar a reação. Após incubação por 10 minutos ao abrigo da luz foi medida a concentração do fosfato liberado em leitor de ELISA em 650 nm (Taussky & Schorr, 1953).
4.4 Alteração do meio de cultura
No dia de repique das cepas de L. chagasi foi adicionado a solução de molibdato de amônio ou adenosina (5 mM) ao meio de cultura com o intuito de alterar a condição do meio de cultivo dos parasitos.
Os parasitos foram incubados por 5 dias em estufa BOD a 25 ºC (Almeida-Amaral et al, 2006).
4.5 Infecção de macrófagos
Camundongos machos C57BL/6 foram inoculados intra-peritonealmente com 2 mL de meio tioglicolato 3% por 5 dias para obtenção de macrófagos. Estes foram obtidos por meio de lavagem peritoneal com meio RPMI 1640 suplementado com 2mM L-glutamina, 100 U de penicilina-G-potássica por mL e 10% de soro fetal bovino inativado. Os macrófagos foram adicionados em placas de 24 poços, com lamínulas 13 mm de diâmetro na concentração de 1 x 106 por mL, e infectados com promastigotas metacíclicas obtidos na fase estacionária na proporção de 3promastigotas por macrófago por um período de 2 horas de incubação à 37º C em 5% de CO2. Os parasitos extracelulares foram removidos por lavagens com PBS e as
células aderidas foram incubadas por 72 horas nas mesmas condições anteriores. As lamínulas foram fixadas com metanol 100% por 3 minutos e coradas com corante panótico 1, 2 e 3 (Newprov ®). A porcentagem de macrófagos associados aos parasitos em 2 e 72 horas, o número de promastigotas e o número de amastigotas associados por 100 macrófagos
infectados foram determinados por microscopia ótica (Barral et al, 1993; Valdinerez et al, 2000). Foram realizadas 5 repetições experimentais.
4.6 Adição de nucleotídeos (ATP e AMP) ao processo de infecção de macrófagos
No momento da infecção dos macrófagos peritoneais previamente plaqueados com promastigotas metacíclicas tratadas e não tratadas com molibdato de amônio, foi adicionado adenosina 5’- trifosfato (ATP) Aldrich®) e adenosina monofosfato (AMP) (Sigma-Aldrich®) na concentração 100 µM por poço, com o intuito de verificar a influência da presença de nucleotídeos no meio extracelular no processo de infectividade. A técnica para infecção dos macrófagos foi a mesma descrita anteriormente, estabelecendo 3 grupos distintos: 1) sem a adição de ATP ou AMP; 2) com adição de ATP ou AMP apenas nas 2 primeiras horas de incubação; 3) com adição de ATP ou AMP nas 2 primeiras horas e nas 72 horas de incubação.
4.7 Avaliação da produção de óxido nítrico no sobrenadante de culturas de macrófagos infectados
O estudo da produção de óxido nítrico (NO) foi realizado por uma análise indireta utilizando a avaliação dos níveis de nitrito, pela reação de Griess (Green et al, 1984, Ding et al, 1988). Para avaliação dos níveis de NO2, 100 µL de cada amostra foi adicionada em
duplicada a placas de 96 poços de fundo plano e posteriormente adicionado 100 µL de reagente de Griess (0.1% naftiletilendiamina didihidrocloreto, 1% sulfanilamida, em 2,5% ácido fosfórico) (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA). Após incubação no escuro por 10 minutos, as amostras foram submetidas ao leitor automático de microplacas e a absorbância foi avaliada no comprimento de onda de 540 nm. A concentração de nitrito das amostras foi determinada por interpolação em curva padrão de diluição da solução de nitrito de sódio (com variação linear de 0,78-100 µmol/L) possibilitando a identificação de valores de cada amostra. Os resultados (em µmol/L) foram expressos como média da concentração de NO2. Foi
4.8 Análise estatística
Os resultados foram analisados estatisticamente através do t-test pareado. Valores de
P< 0,05 foram considerados significativos. As análises foram realizadas no programa
5 Resultados e Discussão
5.1 Curva de crescimento das cepas de L. chagasi
Para estabelecer uma curva de crescimento, as cepas de L. chagasi foram mantidas em meio de Grace enriquecido com 15 ou 20 % de soro fetal bovino a 25 ºC de temperatura em estufa BOD. O inoculo inicial foi de 1x105 parasitos/mL. A contagem foi realizada em triplicata durante o período de sete dias.
Segundo, Silva & Sacks, (1987) a maior quantidade de promastigotas metacíclicas é encontrada na fase estacionária de crescimento de Leishmania, sendo assim, este período é primordial para a infectividade do parasito. Macrófagos infectados com Leishmania tropica indicaram que o maior potencial de infecção é encontrado no início da fase estacionária, e que promastigotas desenvolvem de forma semelhante em cultura in vitro como no flebotomíneo. (Sacks & Perkins, 1984).
Pode-se observar através dos resultados uma curva de crescimento homogênea entre as diferentes cepas. O pico máximo de concentração ocorreu entre o quinto e sexto dias de cultivo (Figura 1) , onde se encontra a maior porcentagem de promastigotas metacíclicas, variando de 9 a 13% do número total de parasitos (Figura 2). Os meios para cultivo de
Leishmania necessitam de suplementação com soro fetal bovino, que possuem ingredientes
fundamentais para o desenvolvimento destes parasitos (Newman; 2003). O enriquecimento do meio de cultivo com 15 e 20% de soro fetal bovino não apresentou diferenças significativas no estabelecimento da curva de crescimento. Foi estabelecido para a medida da atividade enzimática, o quinto dia de cultivo em meio Grace para que fosse obtida maior porcentagem das formas infectantes, e suplementação com 15% de soro fetal bovino, diminuindo assim o custo dos experimentos (Figura 1).
0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 6 7 N ú m e ro d e p a ra s it o s x 1 0 6/m l Dias de cultivo
C urva de crescimento Cepa M2682
M26-20% M26-15% 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 6 7 N ú m e ro d e p a ra s it o s x 1 0 6/m l Dias de cultivo
Curva de crescimento Cepa OP
OP-20% OP-15% 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 6 7 N ú m e ro d e p a ra s it o s x 1 0 6/m l Dias de c ultivo
Curva de crescimento Cepa BH
BH-20% BH-15%
Figura 1 - Curva de crescimento para as cepas de L. chagasi: M2682, BH e OP. As cepas de
L. chagasi foram mantidas em meio Grace enriquecido com 15 ou 20 % de soro fetal bovino a
25 ºC de temperatura em estufa BOD. O inoculo inicial foi de 1x 105 parasitos/mL. A contagem foi realizada em triplicata durante o período de sete dias. Foram realizadas 3 repetições para este experimento.
Separação de Promastigotas 0 5 10 15 M2682 OP BH Parasitos % d e p ro m a s tig o ta s m e ta c íc lic a s CONTROLE MOLIBDATO
Figura 2 – Quantificação de promastigotas metacíclicas das cepas L. chagasi. Foi realizada a separação de promastigotas metacíclicas no quinto dia de cultivo purificadas em gradiente de Ficoll a partir da cultura de promastigotas totais. Foi adicionado à cultura molibdato de amônio (5mM) com o objetivo de alterar as condições de cultivo dos parasitos. A figura apresenta a média da porcentagem de promastigotas metacíclicas obtida em cinco separações.
5.2 Objetivo II - Avaliação da atividade ATPásica e 5’- Nucleotidásica de promastigotas totais e promastigotas metacíclicas de isolados de L. chagasi de culturas recentes
A medida de atividade enzimática (hidrólise de ATP, ADP e AMP) foi realizada em promastigotas totais (procíclicas e metacíclicas) e em metacíclicas purificadas das cepas M2682, OP e BH. A superfície celular dos promastigotas de Leishmania possui enzimas capazes de promover a hidrólise do ATP que ocorre por exemplo ação das ecto-NTPDases que convertem ATP em ADP e ADP em AMP e a 5’-nucleotidase que degrada AMP resultando na formação de adenosina (Meyer-Fernandes, 2002). Esta conversão de ATP em adenosina pode resultar na modulação da resposta inflamatória provocada pelo processo infeccioso desencadeado pelo parasito através de processos inibitórios da inflamação (Maioli
et al, 2004; Marques-da-Silva et al, 2008). O ATP extracelular induz uma reposta
inflamatória, ativando macrófagos, linfócitos T, maturação de células dendríticas e a liberação de citocinas pró-inflamatórias (Humphreys e Dubyak; 1998; Schnurr et al; 2003; Skelton et al; 2003; Somers et al; 1998; Langston et al; 2003). Por outro lado, a hidrólise do ATP, resultando na produção de adenosina, induz uma resposta antiinflamatória, o que nos leva a acreditar que a ação conjunta dessas enzimas pode favorecer a instalação da infecção pelo parasito. Os resultados mostram que as cepas apresentaram atividade ATPásica e 5’- Nucleotidásica, mas os valores desta atividade não diferiram entre elas (Figura 3). A demonstração da atividade ecto-nucleotidásica em experimentos com espécie L. chagasi é descrita pela primeira vez, até o atual momento. De forma interessante, os valores das atividades observadas para a espécie L. chagasi são menores que os obtidos em experimentos realizados com L. amazonensis e L. braziliensis, (Berredo-Pinho et al, 2001, Coimbra et al, 2002; Maioli et al, 2004; Marques-da-Silva et al, 2008).
As formas promastigotas metacíclicas são as formas infectantes da Leishmania. Sabemos, através da literatura, que a maior concentração de metacíclicas é um fator importante para a virulência do parasito (Silva & Sacks; 1987). Entretanto, a degradação de ATP, ADP e AMP foram bastante semelhantes quando comparamos as formas promastigotas totais e promastigotas metacíclicas purificadas em ficoll, indicando que a expressão das enzimas ecto-nucleotidases possui perfil similar quando isolamos as formas infectantes (Figura 2), sugerindo que talvez, a metaciclogênese não influencie diretamente na atividade ecto-nucleotidásica promovida por estes parasitos.
0 2 00 4 00 6 00 8 00
ATP ADP AMP
n m o lP i/ 1 x 1 0 8p a r a s it o s /h . CEPA M2682 TOTA L METACÍC LIC A 0 200 400 600 800 A TP A D P AM P n m o lP i/ 1 x 1 0 8 p a ra s it o s /h . CEPA OP TOTAL META CÍ CLI CA 0 200 400 600 800
ATP ADP AMP
n m o lP i/ 1 x 1 0 8p a ra s it o s /h . Cepa BH TOTAL ME TACÍCLICA
Figura 3 - Medida da atividade nucleotidásica de diferentes cepas de L. chagasi realizada com promastigotas totais e promastigotas metacíclicas. Os parasitos foram incubados na concentração de 3,75 x 106 parasitos por 1 hora à 37 ºC na presença de ATP, ADP e AMP na concentração de 5 mM. As barras azuis representam os promastigotas totais e as barras amarelas representam as promastigotas metacíclicas. Foram realizadas 5 repetições para cada cepa.
5.3 Objetivo III – Verificar o efeito da adição de molibdato de amônio ou adenosina no meio de cultura sobre a expressão das enzimas ectonucleotidásica
O meio de cultura foi alterado com adição da solução de molibdato de amônio ou adenosina na concentração de 5mM no primeiro dia de repique. Foi realizada a medida de hidrólise de nucleotídeos (ATP, ADP e AMP) na presença das formas promastigotas metacíclicas das cepas de L. chagasi obtidas de culturas tratadas com as determinadas soluções. As funções fisiológicas das ecto-nucleotidases ainda não foram bem elucidadas, supõe-se que haja participação dessas enzimas nos processos de nutrição, proteção contra a resposta imunológicas do hospedeiro (Gottlieb & Dwyer; 1982; Glew et al; 1988) e diferenciação dos parasitos, (Bakalara et al; 1995) podendo exercer um papel fundamental nas fases iniciais de infecção por L. chagasi através da hidrólise de ATP (Coimbra et al; 2002). Foram realizados experimentos modificando os meios de cultura com molibdato de amônio (Marques-da-Silva et al; 2008) ou adenosina (Berredo-Pinho et al; 2001) para caracterizar o papel das ecto-nucleotidases no processo de infectividade e como fator de virulência da
Leishmania. Existem várias substâncias capazes de inibir a ação das ecto-fosfatases, como
ARL 67156 (Lévesque et al; 2007), quercetina (Barganhol et al; 2007), ortovanadato de sódio, tartarato de sódio (Glew et al; 1988) bpV-PHEN (Cool e Blum; 1993; Furuya et al; 1998; Posner et al 1994) e o molibdato de amônio (Dutra et al; 1998; Lemos et al; 2002; Ferraro et al; 2004; Jesus et al; 2002). O molibdato de amônio é um clássico inibidor de fosfatases (Almeida-Amaral et al, 2006) e também é considerado um forte inibidor da atividade da enzima 5’- nucleotidase (Borges et al, 2007). Portanto, as culturas foram alteradas com a adição de molibdato de amônio no intuito de inibir a expressão das enzimas ecto-nucleotidásicas, já que o molibdato de amônio apresenta um papel inibitório da atividade 5’-nucleotidase em parasitos do gênero Leishmania (Marques-da-Silva et al, 2008) e assim avaliar a degradação dos nucleotídeos antes e após a alteração.
Segundo Berredo-Pinho et al; (2001), culturas tratadas com adenosina apresentam maior viabilidade de formas promastigotas em comparação a tratamentos com outros nucleotídeos (ATP, ADP e AMP). O que pode ser justificado pela necessidade da Leishmania em retirar nucleosídeos do seu ambiente (Marr et al; 1978). Entretanto, o mesmo tratamento das culturas, reduz significativamente a atividade ecto-ATPásica das formas promastigotas do parasito, provavelmente pela não necessidade da expressão destas pela presença de adenosina
livre. A adição de adenosina ao meio de cultura foi realizada com o objetivo de avaliar a expressão das ecto-NTPDases e 5’-nucleotidase perante a oferta de adenosina necessária a sobrevivência do parasito. Já no caso do molibdato de amônio o objetivo de sua adição foi inibir a atividade ecto-nucleotidásica.
A figura 4, mostra os valores das atividades das cepas M2682, OP e BH tratadas e não tratadas com o molibdato de amônio. Como pode ser observado, ocorreu um decréscimo nos valores de degradação de ADP e um aumento na degradação de AMP em todas as cepas (p<0,05). A diminuição na degradação de ADP sugere que o tratamento com molibdato de amônio deve ter inibido a expressão e/ou atividade das ecto-NTPDases ou as espécies de L.
chagasi podem expressar de forma mais intensa o grupo de isoenzimas NTPase I (Asai et al;
1995), que possui afinidade pela hidrólise apenas do ATP. Os valores aumentados da degradação de AMP podem estar correlacionados com o aumento da expressão da enzima 5’-nucleotidase em resposta ao bloqueio por molibdato de amônio, uma vez que para sobrevivência dos parasitos eles necessitam adquirir nucleotídeos do meio, resultado semelhante foi descrito em experimentos com L. braziliensis (Marques-da-Silva et al; 2008).
O tratamento da cultura com adenosina resultou em uma menor degradação de AMP quando comparada as cepas não tratadas (Figura 5), o que sugere que a oferta do nucleotídeo necessário para a sobrevivência do parasito possa ter diminuido a expressão da enzima 5’-nucleotidase. Comportamento semelhante foi descrito em experimentos com L. amazonensis na presença de adenosina (Berredo-Pinho et al; 2001). Portanto, a alteração dos meios de cultura parece ter influenciado diretamente na expressão da enzima 5’-nucleotidase, o que sugere um papel crucial exercido por esta enzima na obtenção de nucleosídeos por L. chagasi. Os resultados obtidos em relação à degradação de AMP foram bastante semelhantes entre as cepas utilizadas.
0 200 400 600 800
ATP ADP AMP
n m o lP i/ 1 x 1 0 8p a ra s it o s /h . Cepa M2682 CONT RO LE MOLIBDATO 0 200 400 600 800
ATP ADP AMP
n m o lP i/ 1 x 1 0 8 p a ra s it o s /h . Cepa OP CONTR OL E MOL IBD ATO
0 200 400 600 800
ATP ADP AMP
n m o lP i/ 1 x 1 0 8 p a ra s it o s /h . Cepa BH CONTROLE MOLIBDAT O
Figura 4 - Medida da atividade ecto-nucleotidásica de diferentes cepas de L. chagasi realizada com promastigotas metacíclicas obtidas de culturas tratadas ou não com molibdato de amônio. As culturas foram tratadas com a adição de molibdato de amônio 5mM no primeiro dia de repique das culturas seguido de 5 dias de incubação. Os parasitos foram incubados na concentração de 3,75 x 106 parasitos por 1 hora à 37 ºC na presença de ATP, ADP e AMP na concentração de 5 mM. As barras azuis representam as culturas não tratadas e as barras vermelhas representam as culturas com adição de molibdato. * p< 0,05 na degradação de AMP tratada com molibdato.
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0 200 400 600 800 A TP ADP A MP n m o lP i/ 1 x 1 0 8p a ra s it o s /h . CEPA M2682 CONTROLE ADENOSINA 0 200 400 600 800
ATP ADP AMP n m o lP i/ 1 x 1 0 8p a ra s it o s /h . C EPA OP C ONTRO LE AD ENOSINA 0 200 400 600 800 A TP ADP A MP n m o lP i/ 1 x 1 0 8p a ra s it o s /h . CEPA BH CONTROLE ADENOSINA
Figura 5-Medida da atividade ecto-nucleotidásica de diferentes cepas de L. chagasi realizada com promastigotas metacíclicas obtidas de culturas tratadas ou não com adenosina. As culturas foram tratadas com a adição de adenosina 5 mM no primeiro dia de repique das culturas seguido de 5 dias de incubação. Os parasitos foram incubados na concentração de 3,75 x 106 parasitos por 1 hora à 37 ºC na presença de ATP, ADP e AMP na concentração de 5 mM. As barras azuis representam as culturas não tratadas e as barras verdes representam as culturas com adição de adenosina. Foram realizadas 5 repetições para cada cepa. * p< 0,05 na degradação de AMP tratada com adenosina.
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