UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MAÍRA DE ANDRADE PASCOAL
EFEITO DO TEMPO DE ACOMPANHAMENTO, TIPO DE MUTAÇÃO DE CFTR E FREQUÊNCIA DE CULTURAS COM Staphylococcus aureus E Pseudomonas aeruginosa NA FUNÇÃO PULMONAR DE PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA
CAMPINAS 2018
MAÍRA DE ANDRADE PASCOAL
EFEITO DO TEMPO DE ACOMPANHAMENTO, TIPO DE MUTAÇÃO DE CFTR E FREQUÊNCIA DE CULTURAS COM Staphylococcus aureus E Pseudomonas aeruginosa NA FUNÇÃO PULMONAR DE PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de concentração em Saúde da Criança e do Adolescente.
ORIENTADOR: CARLOS EMÍLIO LEVY
COORIENTADOR: ILMA APARECIDA PASCHOAL
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
MAÍRA DE ANDRADE PASCOAL, ORIENTADA PELO PROF. DR. CARLOS EMÍLIO LEVY E COORIENTAÇÃO DA PROF. DRA. ILMA APARECIDA PASCHOAL.
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
MAÍRA DE ANDRADE PASCOAL
Orientador (a) PROF(A). DR(A). CARLOS EMILIO LEVY
Coorientador (a) PROF(A). DR(A). ILMA APARECIDA PASCHOAL
MEMBROS:
1. PROF(A). DR(A). CARLOS EMILIO LEVY
2. PROF(A). DR(A). ADYLÉIA APARECIDA DALBO CONTRERA TORO
3. PROF(A). DR(A). NILTON ERBET LINCOPAN HUENUMAN
Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Aos meus filhos Lucca e Lara, toda minha gratidão por saberem dividir a mãe com a pesquisa e profissão que tanto amo. Sigam o exemplo do estudo e dedicação, que sempre nos levam a inteligência e sucesso.
Ao meu querido e amado marido agradeço por ter acreditado e me apoiado em cada escolha, por ter estado do meu lado sempre.
Aos meus amados pais Alvaro e Márcia, obrigado por terem me ensinado sobre, honestidade, perseverança e amor.
À minha tia e madrinha, que sempre foi meu exemplo de inteligência e perseverança, toda minha gratidão.
Ao meu padrinho Tixa, que sempre me incentivou e me apoiou e auxiliou em todas as escolhas.
Ao meu irmão Vitor, muito obrigada pelo apoio e incentivo.
Aos colegas e amigos da pós-graduação: Fernando Marson, Maíra Assumpção, Raquel Sakae, Renata Guirau, Talita, Renan Mauch, Carla Gomes, Marina, Adriana Vinagre e Mauro pelos momentos de descontração e pelas trocas de conhecimento;
À minhas amigas irmãs Luciana, Karina e Isabella obrigada pela amizade, apoio, incentivo e compreensão.
À CAPES pela concessão de bolsa.
Ao meu orientador Prof. Dr. Carlos Emílio Levy, obrigada por ter acreditado em mim, pela paciência e incentivo. Minha gratidão, respeito e admiração.
À minha co-orientadora Ilma Paschoal, toda minha gratidão por seu carinho, paciência e confiança. Obrigada por ser meu exemplo de amor a profissão e perseverança.
Ao Dr. Fernando Marson, agradeço pela análise estatística, pela paciência, por toda contribuição ao trabalho e amizade.
Ao Prof. Dr. José Dirceu Ribeiro muito obrigada pelo incentivo e apoio. Ao Prof. Dr. Fernando Ribeiro muito obrigada por todo apoio e amizade.
À Dra Maria Angela Ribeiro obrigada por todo auxílio e contribuição ao trabalho.
À Profa. Dra. Carmen Bertuzzo, muito obrigada pela amizade e por contribuirem com o estudo genético dos pacientes com FC.
Aos queridos pacientes do ambulatório de fibrose cística da pediatria e seus responsáveis, que apesar de uma rotina intensa de exames, consultas e internações aceitaram participar desse estudo. MUITO OBRIGADA.
Ao Serviço de Odontologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP, muito obrigada pela acolhida e colaboração constantes.
Aos funcionários da pós graduação, em especial por todo auxílio da Márcia.
Aos funcionários da patologia clínica do Hospital de Clínicas da UNICAMP, em especial por todo auxílio da Denise, que contribui ao trabalho, minha gratidão.
Agradeço a todos os funcionários da FCM e do HC da UNICAMP que de alguma forma contribuíram com a realização desse estudo.
RESUMO
Introdução: A fibrose cística (FC) apresenta deterioração progressiva e crônica da função pulmonar decorrente da inflamação e colonização/infeção pulmonar, principalmente por bactérias. Nesse contexto, foi avaliado um período de 24 meses de acompanhamento pela espirometria e colonização/infecção por Staphylococcus aureus e/ou Pseudomonas aeruginosa.
Método: Incluídos 52 pacientes com FC. Na espirometria foram avaliados: CVF (L e % do previsto), VEF1 (L e % do previsto), VEF1/CVF e FEF25-75%. A colonização/infecção foi
avaliada por: (i) predominantemente S. aureus; (ii) predominantemente P. aeruginosa; (iii) concomitância entre microrganismos.
Resultados: Na FC, houve maior frequência de p.Phe508del/p.Phe508del [16/52 – 30,8%] e sexo feminino [33/52 – 63,5%]. O sexo feminino apresentou maior frequência de P. aeruginosa (OR=6,262; 95%IC=1,132-62,69) e menor variação dos marcadores VEF1(%)
(p=0,013) e FEF25-75%(%) (p=0,033) quando comparado ao masculino. Na análise pareada, a
espirometria (% do previsto), no período de 24 meses, piorou para os grupos e marcadores (p<0,05): (i) sexo masculino – CVF%; VEF1; VEF1/CVF; FEF25-75%; (ii) sexo feminino –
CVF%; VEF1; (iii) desconsiderando colonização/infecção por S. aureus e P. aeruginosa e
predominantemente S. aureus – CVF%; VEF1; VEF1/CVF; FEF25-75%; (iv)
predominantemente P. aeruginosa – VEF1/CVF; (v) concomitante para S. aureus e P.
aeruginosa – CVF%; VEF1. A idade apresentou correlação com a redução da CVF (L)
(Rho=-0,498) e VEF1 (L) (Rho=-0,459), não invalidando o estudo de associação. A interação
entre os marcadores da espirometria não mostrou associação com os grupos de bactérias (p>0,05). Adicionalmente, a insuficiência pancreática e mutações de CFTR foram avaliadas e foi observada associação com os dados da espirometria (p<0,05).
Conclusão: Neste estudo, a deterioração da função pulmonar avaliada pela espirometria é continua e apresentou diferença de acordo com o sexo, insuficiência pancreática e mutações
de CFTR. Não foram observadas diferenças entre os grupos estabelecidos por tipo predominante de bactéria, porém, para dentro dos grupos predominantemente S. aureus e concomitante, a redução foi estatisticamente positiva.
ABSTRACT Background:
Introduction: Cystic fibrosis (CF) presents progressive and chronic deterioration of lung function due to inflammation and colonization / lung infection, mainly by bacteria. In this context, a period of 24 months of follow-up was evaluated by spirometry and colonization / infection by Staphylococcus aureus and / or Pseudomonas aeruginosa.
Method: Including 52 CF patients. In spirometry, FVC (L and% predicted), FEV1 (L and % of
predicted), FEV1 / FVC and FEF25-75% were evaluated. The colonization / infection was
evaluated by: (i) predominantly S. aureus; (ii) predominantly P. aeruginosa; (iii) concomitance between microorganisms.
Results: In HR, there was a higher frequency of p.Phe508del / p.Phe508del [16/52 - 30.8%] and female [33/52 - 63.5%]. The female sex presented a higher frequency of P. aeruginosa (OR = 6.262, 95% CI = 1.132-62.69) and lower markers of FEV1 (%) (p = 0.013) and FEV 25-75% (p = 0.033) when compared to the male. In the paired analysis, spirometry (% predicted) in
the 24-month period worsened for the groups and markers (p <0.05): (i) male sex - FVC%; FEV1; FEV1 / FVC; FEF25-75%; (ii) female sex - FVC%; FEV1; (iii) disregarding colonization /
infection by S. aureus and P.aeruginosa and predominantly S. aureus - FVC%; FEV1; FEV1 / FVC; FEF25-75%; (iv) predominantly P. aeruginosa - FEV1 / FVC; (v) concomitant for S.
aureus and P. aeruginosa - FVC%; FEV1. Age correlated with the reduction of FVC (L) (Rho = -0.498) and FEV1 (L) (Rho = -0,459), not invalidating the association study. The interaction
between the markers of spirometry showed no association with the groups of bacteria (p> 0.05). In addition, pancreatic insufficiency and CFTR mutations were evaluated and association with spirometry data was observed (p <0.05).
Conclusion: In CF, the deterioration of pulmonary function evaluated by spirometry is continuous and presented difference according to sex, pancreatic insufficiency and CFTR mutations. No differences were observed between the groups established by predominant type of bacteria, but, within the predominantly S. aureus and concomitant groups, the reduction was statistically positive
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Legenda das figuras:
Figura 1. Associação do sexo com a variação dos marcadores da espirometria em pacientes com fibrose cística.
Figura 2. Associação do sexo com os valores dos marcadores da espirometria em pacientes com fibrose cística em dois períodos
Figura 3. Associação dos valores dos marcadores da espirometria em pacientes com fibrose cística em dois períodos, independentemente da colonização/infecção por bactérias.
Figura 4. Associação dos valores dos marcadores da espirometria em pacientes com fibrose cística em dois períodos), considerando os pacientes predominantemente com colonização/infecção pelo Staphylococcus aureus.
Figura 5. Associação dos valores do índice VEF1/CVF (volume expiratório forçado no
primeiro segundo pela capacidade vital forçada) da espirometria em pacientes com fibrose cística em dois períodos, predominantemente com colonização/infecção pela Pseudomonas aeruginosa (mucoide ou não mucoide) no grupo 1.
Figura 6. Associação dos valores dos marcadores da espirometria em pacientes com fibrose cística em dois períodos, considerando pacientes com colonização/infecção concomitante para Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (mucoide e não mucóide).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Dados epidemiológicos e laboratoriais dos pacientes com fibrose cística incluídos no estudo.
Tabela 2. Comparação entre os grupos de colonização/infecção (predominantemente
Staphylococcus aureus, predominantemente Pseudomonas aeruginosa, ou concomitante para ambas as bactérias) e sexo dos pacientes com fibrose cística.
Tabela 3. Genótipo de CFTR dos pacientes com fibrose cística incluídos no estudo. Tabela 4. Valores de p para a comparação entre os grupos de colonização/infecção
(predominantemente Staphylococcus aureus, predominantemente Pseudomonas aeruginosa, ou concomitante para ambas as bactérias) e sexo com os valores de espirometria, no momento inicial, e após 24 meses de acompanhamento, bem como diferença entre o valor final e inicial da avaliação da função pulmonar dos pacientes com fibrose cística.
Tabela 5. Valores de p para a comparação entre o momento inicial e final da espirometria (período ajustado de 24 meses) considerando os grupos de colonização/infecção
(predominantemente Staphylococcus aureus, predominantemente Pseudomonas aeruginosa, ou concomitante para ambas as bactérias) e sexo dos pacientes com fibrose cística.
Tabela 6. Correlação entre a idade dos pacientes com fibrose cística (em anos) com os valores de redução dos marcadores da espirometria durante os 24 meses avaliados no estudo. Tabela 7. Interação entre o sexo e redução dos valores dos marcadores de espirometria em pacientes com fibrose cística de acordo com os grupos de bactérias isoladas durante o período do estudo.
Tabela 8. Associação do genótipo de CFTR para a mutação p.Phe508del com a presença de insuficiência pancreática nos pacientes com fibrose cística.
Tabela 9. Associação entre o genótipo de CFTR com a presença de insuficiência pancreática nos pacientes com fibrose cística.
Tabela 10. Comparação dos pacientes com fibrose cística para o status da insuficiência pancreática com os valores de espirometria, no momento inicial, e após 24 meses de
acompanhamento, bem como, a diferença entre o valor final e inicial da avaliação da função pulmonar.
Tabela 11. Associação do genótipo de CFTR para a mutação p.Phe508del com o sexo dos pacientes com fibrose cística.
Tabela 12. Comparação dos pacientes com fibrose cística de acordo com a mutação p.Phe508del com os valores de espirometria, no momento inicial, e após 24 meses de acompanhamento, bem como, a diferença entre o valor final e inicial da avaliação da função pulmonar.
Tabela 13. Comparação dos pacientes com fibrose cística de acordo com a mutação de CFTR com os valores de espirometria, no momento inicial, bem como, a diferença entre o valor final e inicial da avaliação da função pulmonar.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Cl- Cloreto
CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator CIPED Centro de Investigação em Pediatria
CV Coeficiente de variação
ENAc Canal de sódio FC Fibrose cística
FCM Faculdade de Ciências Médicas HC Hospital de Clínicas
IC Intervalo de confiança
LAFIP Laboratório de Fisiologia Pulmonar Na+ Sódio
Unicamp Universidade Estadual de Campinas
VEF1 Volume expiratório forçado no primeiro segundo
CVF FEF25-75%
Capacidade vital forçada
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1. Fibrose cística ... 16
1.2. Doença pulmonar na fibrose cística ... 16
1.3. Fisiologia pulmonar...17
1.4. Genética, CFTR, níveis de cloreto e gravidade da Fibrose cística...18
1.5. Colonização e infecção...19
1.6. Microbiologia e microbioma das vias aeríferas...19
2. OBJETIVO ... 21 3. CASUÍSTICA E MÉTODO ...22 3.1. Desenho do estudo ... 22 3.2. População do estudo ... 22 3.3. Aspectos éticos...23 3.4. Teste do suor...23 3.5. Mutações de CFTR...23
3.6. Função pulmonar- espirometria...23
3.7. Análise microbiológica ... 24
3.8. Classificação do agente predominante colonização/infecção ... 24
3.9. Análise estatística...25 4. RESULTADOS...55 5. DISCUSSÃO...58 7. REFERENCIAS...59 8. ANEXOS...64 Anexo I...64 Anexo II...65 Anexo III...66 Anexo IV...67
1. INTRODUÇÃO
1.1- Fibrose cística
A fibrose cística (FC) é uma doença genética com variado espectro de manifestações clínicas, podendo apresentar quadros evolutivos graves de comprometimento pulmonar e pancreático, comum entre indivíduos brancos. No Brasil, dependendo da região, sua prevalência varia de 1 a cada 3.500 nascidos vivos até 1 a cada 10.000 nascidos vivos 1. A
diferença provavelmente pode ser explicada pelo grau variado de miscigenação das populações avaliadas. Mesmo a menor frequência observada faz desta afecção uma condição comum o suficiente para justificar a preocupação com o diagnóstico correto e com a condução terapêutica adequada de todas as suas manifestações.
1.2- Doença pulmonar na fibrose cística
A doença pulmonar é a principal causa de morbidade e mortalidade em pacientes com FC. Depois de um pulmão totalmente preenchido por líquido na vida intrauterina, a partir da primeira respiração deve persistir uma pequena camada de água, eletrólitos e mucinas na superfície das vias aéreas, denominada líquido superficial das vias aéreas (LSVA).
No epitélio respiratório de pacientes com fibrose cística, o mau funcionamento do CFTR faz com que o cloreto não seja secretado adequadamente em resposta aos estímulos habituais. Além disso, há diminuição da ação inibidora que o CFTR tem sobre o canal do sódio (ENac) naquela região. Como resultado, ocorre absorção exagerada de sódio e água, o que resulta em diminuição de volume do LSVA e predominância de cargas negativas na luz das vias aéreas (em razão da absorção exagerada de cargas positivas). Os pacientes têm um declínio progressivo na função pulmonar atribuído principalmente a ciclos recidivantes de infecção pulmonar, inflamação e obstrução. Manter a saúde pulmonar e reduzir a progressão da doença pulmonar são os principais objetivos no manejo da FC, o que é guiado pelas pesquisas. Apesar dos avanços com as terapias antimicrobianas, a perda da função pulmonar
continua a ser a causa de 90% da mortalidade nos pacientes com FC, e pode ser consequência dos danos causados por intensas respostas inflamatórias do hospedeiro a bactérias que colonizam o pulmão desses pacientes.
1.3- Fisiologia pulmonar
O oxigênio do ar precisa entrar em contato com a membrana de troca gasosa, constituída, na maior parte de sua superfície, pelos pneumócitos tipo I. No espaço delimitado por dois pneumócitos tipo I de alvéolos adjacentes encontram-se os capilares pulmonares e seus elementos de sustentação (fibras colágenas, elásticas e substância fundamental do tecido conjuntivo). Nas porções mais finas, a membrana alvéolo- capilar tem 0,5m de espessura e nenhuma proteção contra dessecação e variações de temperatura. O ar inspirado precisa ser umidificado e aquecido e as impurezas do ar, muitas delas micro-organismos, precisam ser retiradas por um sistema de limpeza muito eficiente. A estrutura das vias aéreas provê esse aparelho de condicionamento de ar do necessário para proteger a membrana alvéolo-capilar de agressões físicas, químicas e biológicas. Entre a traqueia e os alvéolos, as vias aéreas dividem-se, por dicotomia assimétrica, de 23 a 26 vezes. Tal estruturação ramificante faz com que sua superfície se expanda grandemente, das vias proximais para as distais (de uma área de 50 cm², na terceira geração de brônquios, para 2 m², na vigésima geração, o que explica a representação das vias aéreas como um funil invertido) 2.
A inalação de micro-organismos potencialmente patogênicos faz surgir a pergunta sobre o modo como as vias aéreas se defendem desse ataque. A explicação mais antiga enfatiza o papel fundamental do transporte mucociliar. A camada de muco, secretada por células epiteliais juntamente com água e sais (integrantes do líquido superficial das vias aéreas), funcionaria com armadilha adesiva para micro-organismos, e o batimento ciliar, ao empurrar o muco em direção às vias aéreas superiores e à boca, completaria a limpeza de brônquios e bronquíolos. Essa harmoniosa interação de fenômenos físicos e físico-químicos construiria o principal sistema mucociliar de defesa dos pulmões 2,3.
Há evidências consistentes de que o líquido superficial das vias aéreas em indivíduos normais é isotônico com relação ao líquido extraceluar, sendo igualmente isotônico em pacientes com FC. Ainda assim, o líquido superficial das vias aéreas (LSVA) teria seu volume muito diminuído nos pacientes com FC, hipótese corroborada por muitos achados experimentais e clínicos.
Quando se fala de transporte mucociliar, tem-se repetido, ao longo dos anos, o conceito de que o batimento ciliar e a secreção de mucinas são os componentes de maior importância. Não se discute a atuação desses fatores como parte fundamental do processo. Uma revisão mais cuidadosa sobre o assunto, porém sugere que a hidratação do LSVA parece ter papel preponderante na eficiência do transporte de muco. O LSVA apresenta duas porções distintas, uma de gel e outra camada sol. A parte voltada para a luz das vias aéreas tem aproximadamente 2% do seu peso constituído por mucinas, glicoproteínas de alto peso molecular, arranjadas em dímeros ou trímeros filamentosos. As mucinas fornecem sítios de ligação para virtualmente todos os agentes biológicos e outras substâncias inaladas que, aderidos à rede de mucinas, são transportadas para fora das vias aéreas quando o muco é movimentado pelo sistema mucociliar. As proteínas da camada mucosa estão mergulhadas em água (97%) e sal (0,9%) e as propriedades viscoelásticas desse gel devem ser otimizadas para facilitar a propagação da energia do batimento ciliar e, desse modo, proporcionar a criação de um movimento vetorial; além disso, estas propriedades são também importantes quando, em situações de doença, o muco deve ser deslocado pela tosse 4. A antiga camada sol recebe
atualmente o nome de líquido periciliar (LPC) e, como o nome indica, é o ambiente aquoso no qual os cílios batem. Tem aproximadamente 7µm de altura sobre as células ciliadas e 3 µm sobre células calciformes ou células com microvilosidades. A adição de água ao LPC faz a camada mucosa inchar e esse aumento de volume impede a perda de contato com o muco, além disso, havendo mais água, ocorre aceleração do transporte mucociliar.
1.4- Genética, CFTR, níveis de cloreto e gravidade da FC
As mutações de CFTR expressam seus defeitos na variedade de mecanismos moleculares, e podem ser agrupadas em seis grandes grupos. (Classe I, Classe II, Classe III, Classe IV, Classe V e classe VI) 5. Dependendo do genótipo dessa mutação, a forma clinica
pode ser oligossintomática, ou atípica, ou cursar com o quadro completo e grave. A intensidade e a variedade de colonização por bactérias oportunistas também varia pode existir maior ou menor comprometimento da função pulmonar.
Na FC a concentração de cloreto tem sido proposta como um parâmetro da função do CFTR para testar drogas sistêmicas destinadas a ativar mutantes CFTR. Essa idéia surgiu da presunção de que quanto maior a função residual do CFTR menor seria a concentração no suor e menos grave a doença pulmonar. Desse modo surge a hipótese que, quanto menor a
concentração de cloreto no suor, menor a gravidade do acometimento pulmonar. Pacientes com alelos associados a suficiência pancreática poderiam ter melhor sobrevida, menor concentração de cloreto no suor e declínio do VEF1 mais lento do que os pacientes
homozigóticos para o alelo p.Phe508del 6.
1.5- Colonização e infecção
Bebês com FC nascem com os pulmões não colonizados. A dificuldade de transporte mucociliar impede a limpeza das vias aéreas a partir da primeira vez que eles inalam e permite a permanência de bactérias na luz dos brônquios e bronquíolos 7,8.
A deficiência do transporte mucociliar causada pela FC permite a colonização bacteriana crônica de bactérias potencialmente patogênicas tais como Haemophilus influenzae e Staphylococcus aureus. À medida que a doença pulmonar progride aparecem com mais frequência os patógenos oportunistas, tais como Pseudomonas aeruginosa, o complexo Burkholderia cepacia, Achromobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia, entre outros 9.
A frequência de colonização crônica com Pseudomonas aeruginosa em adultos com FC no ano de 2.013 no Reino Unido foi de 51,1%. No Brasil, o Registro Brasileiro de Fibrose Cística no relatório de 2.014, mostra que, até os 5 anos de idade, 31,6% dos pacientes com FC já estão colonizados com P. aeruginosa e, na faixa etária dos 30 aos 35 anos, 60,4% estão colonizados cronicamente 1.
1.6- Microbiologia e microbioma das vias aeríferas
Estudos recentes mostraram que o microbioma em pacientes com FC é altamente complexo e rico, e dão indícios que existem outros patógenos além da P. aeruginosa em infecções pulmonares em pacientes com FC. Avanços no conhecimento da natureza no desbalanceamento do microbioma estão modificando a visão do papel das infecções na FC
É de grande importância determinar a natureza das interações entre bactéria e o pulmão para facilitar melhorias nas estratégias terapêuticas. Nos últimos anos o antigo paradigma de que as vias aeríferas abaixo da glote eram estéreis foi radicalmente modificado. O conceito de uma microbiota própria das vias aéreas ganhou evidências sólidas e levantou importantes questões quanto à contribuição desta população de microrganismos à saúde, quando normal, e à doença, em situações de disbiose. Pouco se sabe ainda quanto às relações entre esta microbiota e a resposta inflamatória e imune do hospedeiro 12. O microbioma das vias
aeríferas inferiores é de difícil caracterização tanto pela dificuldade de obtenção de amostras, distribuição irregular no parênquima pulmonar, diversidade bacteriana, como pela baixa quantidade de bactérias. Pequenas mudanças na sua composição podem ter grandes consequências, justamente pelo fato de o número e a diversidade das bactérias ser incomparavelmente menor do que no trato gastrointestinal 13,14. Vias aeríferas superiores e
inferiores, apesar de sua continuidade, representam pontos extremos no que se refere aos respectivos microbiomas: no trato respiratório superior existe uma quantidade e diversidade grande de microrganismos, que se reduz muito em direção aos espaços aéreos distais 15. O
microbioma do trato respiratório só pode ser entendido como a soma das suas partes 16. Nas
vias aeríferas superiores, nariz e seios da face tem microbiomas diferentes daquele encontrado na cavidade oral. Na microbiota do nariz são encontrados com frequência Streptococcus spp, Acinetobacter spp, Lactococcus spp, Staphylococcus spp e Corynebacterium spp. Na cavidade oral são mais frequentes Prevotella spp, Streptococcus spp, Fusobacterium spp, Neisseria spp, Leptotrichia spp e Veillonella spp 17. Nas vias aeríferas inferiores a composição
bacteriana, como já enfatizado anteriormente, a quantidade de bactérias difere bastante (de 100 a 10.000 vezes menos bactérias) 18. A barreira natural que separa vias aeríferas superiores
das inferiores é constituída pelas pregas vocais. Microaspirações ocorrem em indivíduos normais e mais frequentemente em várias situações de doença, tais como asma, DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica), apnéia obstrutiva do sono e fibrose cística 19-21. A
microbiota das vias aeríferas inferiores deve resultar de microaspirações da microbiota das vias aeríferas superiores e certamente também dos microrganismos trazidos para o interior dos pulmões pela ventilação. Os nada desprezíveis volumes de ar movimentados a cada dia por um ser humano (de 7.000 a 20.000 litros por dia) carregam a microbiota do ar, além de poluentes químicos, material particulado, alérgenos 22. No entanto, os microrganismos mais
frequentemente encontrados nas vias aeríferas inferiores são aqueles presentes na cavidade oral tais como Prevotella spp, Veillonella spp, Rothia spp, Streptococcus spp, e Porphyromonas spp 23,24.
Diante desse contexto o objetivo do presente estudo foi verificar o efeito do período de 24 meses na função pulmonar de pacientes portadores com FC considerando o tipo de mutação de CFTR, marcadores de espirometria e a infecção/colonização por S. aureus e P. aeruginosa.
2. OBJETIVOS
2.1- Objetivo GeralAssociar a função pulmonar de pacientes com FC por parâmetros da espirometria [volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1), capacidade vital forçada (CVF), VEF1/CVF
e fluxo expiratório forçado entre 25-75% (FEF25-75%)da CVF] durante o período de 24 meses
de acompanhamento com o tipo de mutação de CFTR, presença de insuficiência pancreática e bactérias (S. aureus e P. aeruginosa).
2.2- Objetivos Específicos
(i) Associar os dados de espirometria com o genótipo para a mutação p.Phe508del; (ii) Associar os dados de espirometria com o genótipo de acordo com a presença de mutações de CFTR de classes I, II e/ou III;
(iii) Associar os dados de espirometria com o sexo dos pacientes com FC;
(iv) Associar os dados de espirometria com a presença de insuficiência pancreática nos pacientes com FC;
(v) Associar os dados de espirometria com o agrupamento para predominância de acordo com S. aureus e P. aeruginosa;
(vi) Associar sexo com a genética, idade e insuficiência pancreática. (vii) Associar os grupos de bactérias com os dados de espirometria.
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1. Desenho do estudo
Foi realizado um estudo retrospectivo de coorte dos pacientes em acompanhamento no Centro Especializado de Referência em Fibrose Cística da Unicamp.
3.2. População do estudo
Fizeram parte do estudo indivíduos com diagnóstico de FC confirmado em acompanhamento no Centro Especializado de Referência em Fibrose Cística da Unicamp com diagnóstico por dois testes do suor alterados (cloreto ≥ 60 mEq/L) e/ou identificação de duas mutações no gene CFTR. Os pacientes com FC foram acompanhados em um mesmo centro de referência tendo o mesmo acesso ao tratamento e acompanhamento.
3.2.1- Critérios de inclusão dos pacientes com FC
(i) Diagnóstico confirmado de FC com pelo menos dois testes de cloro no suor e/ou estudo genético do gene CFTR.
(ii) Seguimento clínico maior que 5 anos e intervalo entre a primeira e a última espirometria mínimo de 2 anos.
(iii) Espirometrias feitas no CIPED ou na Função Pulmonar da Unicamp
(iv) Resultados disponíveis de exames de dosagem de cloreto no suor, provas de função pulmonar, estudo genético do gene CFTR e exames microbiológicos.
3.2.2- Critérios de exclusão
(i) Pacientes cujos dados estavam incompletos ou não tinham seguimento clínico, laboratorial e de provas de função pulmonar considerados mínimos.
3.3. Aspectos Éticos
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp, registrado sob o número 157/2010. Foram respeitadas as condições éticas pertinentes ao protocolo e seguidos rigorosamente os princípios enunciados na Declaração de Helsink II de 20/08/1947 e da Resolução 196/96 do Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP)
3.4- Teste do suor
O teste do suor é realizado na rotina de diagnóstico dos pacientes com FC. O método clássico de Gibson e Cooke 25 foi usado para o teste do suor, contemplando a dosagem do
cloreto por titulometria e de sódio por fotometria de chama. No teste do suor temos três possibilidades de acordo com nível de cloreto: (i) FC (≥ 60 mEq/L); (ii) limítrofe (≥ 30 mEq/L a < 60 mEq/L); (iii) sem FC (< 30 mEq/L) 25-27 .
3.5- Mutações de CFTR
A identificação de mutações de CFTR é realizada na rotina de diagnóstico pelo Laboratório de Genética Molecular em nosso centro de referência. A identificação da mutação p.Phe508del foi feita, como primeiro passo, de acordo com a PCR em tempo real por protocolo padrão. Para as demais mutações, o sequenciamento dos exóns foi realizado, juntamente com a técnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) 28,29.
3.6- Função pulmonar – espirometria
A espirometria foi realizada nos indivíduos com idade superior a seis anos. No estudo, os seguintes parâmetros foram considerados: (i) capacidade vital forçada (CVF) (L e % do previsto); (ii) volume expiratório forçado no primeiro segundo da CVF (VEF1) (L e % do
previsto); (iii) índice VEF1/CVF; (iv) fluxo expiratório forçado entre 25% e 75% da CVF (%
do previsto). Os pacientes tiveram os dados tabulados considerando o acompanhamento e houve variabilidade no tempo e número de exames. Dessa forma, considerando que o menor
período de resultados de espirometria foi de 24 meses, fizemos o ajuste matemático dos dados da seguinte maneira:
Valor para marcadores da espirometria (após 24 meses) = {Valor inicial (primeiro resultado) + [(Valor final (independentemente do tempo de acompanhamento)) - Valor inicial)/tempo de
acompanhamento (em meses)]*24}
A espirometria foi realizada no Laboratório de Fisiologia Pulmonar do Centro de Investigação em Pediatria e no Serviço de Função Pulmonar do Hospital de Clínicas de acordo com as diretrizes da American Thoracic Society com valores de referência para a população brasileira
30,31.
3.7- Análise microbiológica
O resultado da cultura de rotina diagnóstica foi obtido pelo Serviço de Informática do Hospital de Clínicas. No Laboratório de Microbiologia, as amostras de escarro ou swab dos pacientes com FC foram semeadas em meio de cultura ágar sangue, ágar chocolate, ágar McConkey, ágar Manitol sal (seletivo para S. aureus) e BCSA (seletivo para B. cepacia). Após o crescimento, a identificação dos microrganismos foi realizada por testes bioquímicos convencionais e automatizados [Vitek®2 (bioMeriéux, Jacarepaguá, Rio de Janeiro, Brasil) e
Phoenix™ (Becton, Dickinson and Company, Loverson Circle, Sparks, USA) de acordo com as recomendações dos fabricantes].
3.8- Classificação do agente predominante da colonização/infecção
Foram adotados dois critérios para classificar o agente predominante da colonização/infecção:
(critério 1) foi avaliada a proporção entre o número de culturas positivas para S. aureus e P. aeruginosa, pela seguinte formula, proporção relativa de S. aureus = [n. de culturas positivas para S. aureus / (n. de culturas positivas para S. aureus + n. de culturas positivas para P. aeruginosa)]*100. Com os resultados, os pacientes foram reagrupados em: (i) predominantemente S. aureus (proporção superior a 66,66%); (ii) predominantemente P. aeruginosa (proporção inferior a 33,33%); (iii) concomitantes para S. aureus e P. aeruginosa (proporção entre 33,33% a 66,66%).
(critério 2) critério de Lee e colaboradores que considera as 12 últimas culturas microbiológicas ou todas as culturas realizadas, nos casos de acompanhamento com tempo
inferior a 12 meses. Inicialmente, o critério foi utilizado para classificar o status de colonização/infecção por P. aeruginosa, mas ampliamos a classificação para outros agentes, incluindo o S. aureus, isoladamente ou simultaneamente. Os pacientes, dessa forma, foram classificados como: (i) nunca colonizados, quando nunca a P. aeruginosa e/ou outro agente foi isolado; (ii) livres de infecção, quando a P. aeruginosa e/ou outro agente foi isolado, apenas, previamente às últimas 12 culturas; (iii) colonização intermitente, quando a P. aeruginosa e/ou outro agente foi isolado em menos de 50% das culturas realizadas; (iv) infecção crônica, quando a P. aeruginosa e/ou outro agente foi isolado em 50% ou mais das amostras de culturas microbiológicas 32. Com os resultados, os pacientes foram reagrupados
em: (i) predominantemente S. aureus; (ii) predominantemente P. aeruginosa; (iii) concomitantes para S. aureus e P. aeruginosa.
3.9- Análise estatística
Na análise estatística o software Statistical Package for the Social Sciences versão 24 (IBM®, Armonk, New York) foi utilizado. O alpha de 0,05 foi adotado em todas as análises.
Na análise descritiva, os dados com distribuição categórica estão apresentados pela frequência absoluta e frequência relativa, e os dados com distribuição numérica pelo N, média, desvio padrão, mediana, mínimo e máximo. Na comparação entre grupos, com amostras independentes, foram utilizados os testes não paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis. Na análise dos dados de evolução da função pulmonar pela espirometria, com os dados pareados, foi utilizado o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon de amostras relacionadas. Na comparação entre dados categóricos foram utilizados os testes χ2 e o exato
de Fisher. A correlação entre a variabilidade da função pulmonar e a idade foi avaliada pelo teste de correlação de Spearman.
Finalmente, a interação entre os marcadores de espirometria com os diferentes grupos de microrganismos foi avaliada pelas ferramentas Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) e MDRPT. A análise pelo MDR é uma análise de dados não paramétrica para identificar a interação não linear entre fatores ambientais e/ou genéticos. Para ajustar os resultados para comparações múltiplas, foi realizado o MDR permutation test em nossa amostra, totalizando 100.000 permutaçõe
4. RESULTADOS
No estudo foram incluídos 52 pacientes com FC. Na tabela 1 está descrita as frequências para o sexo e grupos de bactérias (1 e 2), bem como, a distribuição dos dados para idade, tempo de acompanhamento para a obtenção dos dados da espirometria e cultura de rotina diagnóstica, e valores de sódio e cloreto no teste do suor. Em nossa amostra, houve predomínio de pacientes com FC do sexo feminino [33/52 (63,5%)] e foi observada ampla variabilidade na distribuição dos pacientes pela idade. Além disso, o menor tempo de acompanhamento para a função pulmonar foi de 24 meses, dessa forma, todos os pacientes tiveram seus dados ajustados para essa faixa de tempo (em meses). Considerando o teste do suor, conforme descrito na tabela 1, um paciente teve o valor boderline e quatro não tinham o valor numérico descrito no prontuário, porém todos tinham o diagnóstico molecular com a presença de duas mutações de CFTR. Considerando o sexo, não houve associação com: valores de sódio no suor (p = 0,991), valores de cloreto no suor (p = 0,418). Porém, o sexo feminino, foi associado a predominância de P. aeruginosa na amostra avaliada (OR = 6,262; 95%IC = 1,132 a 62,69) (Tabela 2).
Na tabela 3 descrevemos o genótipo de CFTR dos pacientes com FC, sendo que houve maior prevalência do genótipo p.Phe508del/p.Phe508del [16/52 (30,8%)]. Na distribuição alélica, exatamente 50% (52/104) dos alelos corresponderam a mutação p.Phe508del (Tabela 3).
Os valores de p estão, resumidamente, apresentados nas tabelas 4 e 5. Na tabela 4, os marcadores de espirometria foram comparados com a classificação de colonização/infeção para o critério 1 e 2, bem como sexo, considerando os valores de: CVF (L e % do previsto), VEF1 (L e % do previsto), VEF1/CVF e FEF25-75% (% do previsto), antes e após o período de
24 meses, e pela diferença entre ambos os períodos. Na tabela 5 estão descritos os valores de p para os mesmos marcadores da espirometria, anteriormente citados [colonização/infeção (critério 1 e 2) e sexo versus CVF (L e % do previsto), VEF1 (L e % do previsto), VEF1/CVF
e FEF25-75% (% do previsto)], considerando a análise pareada do momento inicial versus final
Pacientes com FC e do sexo feminino apresentaram menor variação dos marcadores VEF1 (% do previsto) (p = 0,013; Tabela 6; Figura 1A) e FEF25-75% (% do previsto) (p =
0,033; Tabela 6; Figura 1B) quando comparado aos pacientes do sexo masculino.
Na análise pareada para a função pulmonar em relação ao período de 24 meses, para todos os grupos analisados (bactérias e sexo), houve redução nos marcadores da espirometria (em % do previsto). Dessa forma, houve:
(i) menores valores, no grupo sexo masculino, para: CVF% (p = 0,001; Tabela 6; Figura 2A); VEF1 (p < 0,001; Tabela 6; Figura 2B); VEF1/CVF (p = 0,004; Tabela 6; Figura 2C);
FEF25-75% (p = 0,001; Tabela 6; Figura 2D);
(ii) menores valores, no grupo sexo feminino, para: CVF% (p = 0,003; Tabela 6; Figura 2E); VEF1 (p = 0,004; Tabela 6; Figura 2F);
(iii) menores valores, desconsiderando os critérios de colonização/infecção por S. aureus e P. aeruginosa, para: CVF% (p < 0,001; Tabela 6; Figura 3A); VEF1 (p < 0,001; Tabela 6;
Figura 3B); VEF1/CVF (p = 0,001; Tabela 6; Figura 3C); FEF25-75% (p = 0,001; Tabela 6;
Figura 3D);
(iv) menores valores, considerando o critério de colonização/infecção 1 – predominantemente S. aureus, para: CVF% (p = 0,003; Tabela 6; Figura 4A); VEF1 (p = 0,002; Tabela 6;
Figura 4B); VEF1/CVF (p = 0,027; Tabela 6; Figura 4C); FEF25-75% (p = 0,010; Tabela 6;
Figura 4D);
(v) menores valores, considerando o critério de colonização/infecção 2 – predominantemente S. aureus, para: CVF% (p = 0,001; Tabela 6; Figura 4E); VEF1 (p = 0,001; Tabela 6;
Figura 4F); FEF25-75% (p = 0,012; Tabela 6; Figura 4G);
(vi) menor valor, considerando o critério de colonização/infecção 1 – predominantemente P. aeruginosa, para: VEF1/CVF (p = 0,004; Tabela 6; Figura 5);
(vii) menores valores, considerando o critério de colonização/infecção 1 – concomitante para S. aureus e P. aeruginosa, para: CVF% (p = 0,003; Tabela 6; Figura 6A); VEF1 (p = 0,002;
Tabela 6; Figura 6B);
(viii) menores valores, considerando o critério de colonização/infecção 1 – concomitante para S. aureus e P. aeruginosa, para: CVF% (p = 0,002; Tabela 6; Figura 6C); VEF1 (p = 0,001;
Tabela 6; Figura 6D); VEF1/CVF (p = 0,015; Tabela 6; Figura 6E); FEF25-75% (p = 0,048;
Tabela 6; Figura 6F);
Por último, a idade apresentou correlação com os valores de queda dos marcadores de espirometria, CVF (L) (p < 0,001; Rho = -0,498) e VEF1 (L) (p = 0,001; Rho = -0,459), não
marcadores da espirometria não mostrou associação com os diferentes grupos de bactérias avaliadas no presente estudo (p > 0,05; Tabela 8).
Adicionalmente foram comparados os marcadores da espirometria e idade com a insuficiência pancreática, genótipo de CFTR e presença da mutação p.Phe508del (Tabela 9). Houve presença de insuficiência pancreática em 32/52 (61,5%) dos pacientes com maior prevalência nos pacientes p.Phe508del/p.Phe508del ou com duas mutações de classe I a III de CFTR (p<0,001). A insuficiência pancreática foi associada com o melhor valor na espirometria (VEF1, VEF1/CVF e FEF25-75%) (p<0,05), no período inicial e final do estudo,
porém não houve associação com a redução dos valores da espirometria ao longo do tempo, exceto para o VEF1 (maior redução no valor nos pacientes com insuficiência pancreática)
(p=0,008) (Tabelas 9 e 10) Pacientes com insuficiência pancreática apresentavam maior valores na espirometria, possivelmente, por terem menor idade (p<0,001). O genótipo p.Phe508del/p.Phe508del foi associado com o maior valor inicial e final do VEF1 (p<0,020),
(Tabela 11), e o genótipo agrupado de CFTR com melhor VEF1 no início da análise
(p=0,031) e na diferença entre o momento zero e depois de 24 meses de acompanhamento (maior redução na presença de duas mutações de CFTR de classes I, II e/ou III) (p=0,023) (Tabela 12). Tanto para o p.Phe508del/p.Phe508del, quanto para a presença de duas mutações de CFTR de classes I, II e/ou III, os pacientes com FC tinham idade inferior aos demais participantes do estudo, o que pode explicar na melhor espirometria. (Tabela 13).
Tabela 1. Dados epidemiológicos e laboratoriais dos pacientes com fibrose cística incluídos no estudo.
Variável epidemiológica Distribuição dos dados
Sexo (feminino) 33/52 (63,5%)
Idade (anos) 52; 29,89 ± 16,88; 22,63 (8,36 a 84,35)
Grupo 1 – Bactérias
Predominantemente Staphylococcus aureus 19/52 (36,5%)
Predominantemente Pseudomonas aeruginosa 16/52 (30,8%)
Concomitante (S. aureus e P. aeruginosa) 17/52 (32,7%)
Grupo 2 – Bactérias
Predominantemente S.s aureus 18/52 (34,6%)
Predominantemente P. aeruginosa 5/52 (9,6%)
Concomitante (S. aureus e P. aeruginosa) 29/52 (55,8%)
Tempo de acompanhamento dos marcadores
Função pulmonar (meses) 52; 90,63 ± 48,60; 86,5 (24 a 243)
Cultura de rotina diagnóstica do escarro (meses) 52; 154,23 ± 70,84; 157,5 (24 a 275) Teste do suor (média entre dois últimos exames)
Sódio (Na+, mEq/L) 46; 95,42 ± 18,81; 92,38 (62,75 a 137)
Cloreto (Cl-, mEq/L) 48; 108,86 ± 20,64; 113,4 (59,4 a 148,89)a,b
Dados com distribuição categórica estão apresentados como: n/N (%); dados com distribuição numérica estão apresentados como: tamanho da amostra (N); média desvio padrão; mediana (mínimo e máximo). a, um paciente apresentou cloreto com valor médio de 59,4 mEq/L tendo
o genótipo p.Phe508del/p.Asp1152His; b, 4 pacientes não tiveram durante o período e/ou
sistema de prontuários os valores de cloreto descritos numericamente, sendo apenas citado que eram superiores a 60 mEq/L, além disso, apresentaram os seguintes genótipos de CFTR: p.Phe508del/p.Gly85Glu, p.Phe508del/c.1717-1G>A, p.Gly542X/p.Arg334Trp, 3849+10 Kb C>T/3849+10 Kb C>T.
Tabela 2. Comparação entre os grupos de colonização/infecção (predominantemente Staphylococcus aureus, predominantemente Pseudomonas aeruginosa, ou concomitante para ambas as bactérias) e sexo dos pacientes com fibrose cística.
Grupoa Feminino Masculino Total p-value Odds ratio IC95%
AS 9 10 19 0,044 0,338 0,104 a 1,101* PA 14 2 16 6,263 1,132 a 62,69** SA+PA 10 7 17 0,745 0,226 a 2,454* Total 33 19 52
Grupob Feminino Masculino Total p-value Odds ratio IC95%
AS 9 9 18 0,114 0,417 0,128 a 1,359* PA 5 0 5 - - SA+PA 19 10 29 1,221 0,393 a 3,799* Total 33 19 52
SA, predominantemente S. aureus; PA, predominantemente P. aeruginosa; SA+PA, concomitantes; IC95%, intervalo de confiança de 95%. *, são apresentados os valores de odds ratio e de intervalo de confiança baseado na série Taylor; **, é apresentado o valor de odds ratio e intervalo de confiança baseado no Teste Exato de Fisher. Critério de colonização/infecção: (a) foi calculada a porcentagem relativas de culturas positivas para S. aureus versus P. aeruginosa pela fórmula = [(n S. aureus) / N (S. aureus + P. aeruginosa não mucoide + P. aeruginosa mucoide)] * 100. Porcentagem maior que 66,66% = predominantemente S. aureus; porcentagem inferior a 33,33% = predominantemente P. aeruginosa (mucoide ou não mucoide); porcentagem entre 33,33% a 66,66% = concomitante para S. aureus e P. aeruginosa. (b) Avaliado pela predominância absoluta de um agente em relação ao outro. Sendo que a concomitância foi avaliada pela observação de aproximadamente 50% de culturas positivas para S. aureus e P. aeruginosa. Dados com valor de p positivos (< 0,05) estão apresentados em negrito. Análise estatística realizada pelo teste χ2. Alpha = 0,05.
Tabela 3. Genótipo de CFTR dos pacientes com fibrose cística incluídos no estudo. Variante de CFTR N % p.Phe508del/p.Phe508del 16 30,8 p.Phe508del/Unknowna 4 7,7 Unknown/Unknownb 4 7,7 p.Phe508del/p.Gly542X 3 5,8 p.Phe508del/p.Arg334Trp 2 3,8 p.Gly542X/p.Arg334Trp 2 3,8 p.Phe508del/2789+5G>A 2 3,8 p.Phe508del/p.Asn1303Lys 2 3,8 3120+1G>A/p.Leu206Trp 1 1,9 3849+10 Kb C>T/3849+10 Kb C>T 1 1,9 622-2A>G/711+1G>T 1 1,9 c.125C>G (p.Ser42Phe)/M470V (polymorphism)c 1 1,9 p.Ala561Glu/p.Ala561Glu 1 1,9 p.Asn1303Lys/2789+5G>A 1 1,9 p.Gly542X/2183AA>G 1 1,9 p.Gly542X/p.Ile618Thr 1 1,9 p.Gly542X/Unknowna 1 1,9 p.Phe508del/c.1717-1G>A 1 1,9 p.Phe508del/2183AA>G 1 1,9 p.Phe508del/p.Arg553X 1 1,9 p.Phe508del/p.Asp1152His 1 1,9 p.Phe508del/p.Gln890X 1 1,9 p.Phe508del/p.Gly85Glu 1 1,9 p.Phe508del/p.Pro205Ser 1 1,9 p.R74W-p.D1270N/Unknowna 1 1,9 Total 52 100,0
a, pacientes com um alelo identificado com mutação de CFTR e outro sem a identificação da
mutação apresentaram pelo menos dois valores de cloro superior a 60 mEq/L; b, paciente sem
identificação de mutações de CFTR, por não inclusão na triagem genética de CFTR, apresentou pelo menos dois valores de cloro superiores a 60 mEq/L; c, paciente com a
identificação de polimorfismos de CFTR apresentou pelo menos dois testes de cloro no suor superiores a 60 mEq/L. Todos os pacientes incluídos na análise tiveram clínica compatível com o diagnóstico de fibrose cística.
Tabela 4. Valores de p para a comparação entre os grupos de colonização/infecção (predominantemente Staphylococcus aureus, predominantemente Pseudomonas aeruginosa, ou concomitante para ambas as bactérias) e sexo com os valores de espirometria, no momento inicial, e após 24 meses de acompanhamento, bem como diferença entre o valor final e inicial da avaliação da função pulmonar dos pacientes com fibrose cística.
Marcador Colonização/infecção – critério 1a Colonização/infecção – critério 2a Sexob CVF (L) – Inicial 0,816 0,564 0,955 CVF (L) (Depois – antes) 0,825 0,346 0,063 CVF (L) – Final 0,780 0,734 0,442 CVF (%) – Inicial 0,121 0,102 0,206 CVF (%) (Depois – antes) 0,358 0,477 0,387 CVF (%) – Final 0,211 0,345 0,196 VEF1 (L) – Inicial 0,926 0,561 0,690
VEF1 (L) (Depois – antes) 0,669 0,504 0,242
VEF1 (L) – Final 0,732 0,663 0,642
VEF1 (%) – Inicial 0,102 0,133 0,100
VEF1 (%) (Depois – antes) 0,229 0,264 0,013
VEF1 (%) – Final 0,130 0,335 0,213
VEF1/CVF – Inicial 0,295 0,491 0,857
VEF1/CVF (Depois – antes) 0,803 0,992 0,075
VEF1/CVF – Final 0,584 0,472 0,562
FEF25-75% (%) – Inicial 0,278 0,266 0,284
FEF25-75% (Depois – antes) 0,616 0,613 0,033
FEF25-75% – Final 0,423 0,257 0,668
CVF, capacidade vital forçada; VEF1, volume expiratório forçado no primeiro segundo da
CVF; FEF25-75%, fluxo expiratório forçado entre 25% e 75% da CVF; %, porcentagem; L,
litros. Critério de colonização/infecção: (1) foi calculada a porcentagem relativas de culturas positivas para S. aureus versus P. aeruginosa pela fórmula = [(n S. aureus) / N (S. aureus + P. aeruginosa não mucoide + P. aeruginosa mucoide)] * 100. Porcentagem maior que 66,66% = predominantemente S. aureus; porcentagem inferior a 33,33% = predominantemente P. aeruginosa (mucoide ou não mucoide); porcentagem entre 33,33% a 66,66% = concomitante para S. aureus e P. aeruginosa. (2) Avaliado pela predominância absoluta de um agente em relação ao outro. Sendo que a concomitância foi avaliada pela observação de aproximadamente 50% de culturas positivas para S. aureus e P. aeruginosa. Dados com valor de p positivos (< 0,05) estão apresentados em negrito. a, análise estatística realizada pelo teste
Tabela 5. Valores de p para a comparação entre o momento inicial e final da espirometria (período ajustado de 24 meses) considerando os grupos de colonização/infecção (predominantemente Staphylococcus aureus, predominantemente Pseudomonas aeruginosa, ou concomitante para ambas as bactérias) e sexo dos pacientes com fibrose cística.
Marcador Amostra completa Predominantemente S. aureus Predominantemente P. aeruginosa Concomitante Masculino Feminino
1 2 1 2 1 2 CVF (L) 0,619 0,398 0,913 0,679 0,500 0,642 0,480 0,059 0,313 CVF (%) < 0,001 0,003 0,001 0,098 0,500 0,003 0,002 0,001 0,003 VEF1 (L) 0,895 0,573 0,879 0,836 0,500 0,435 0,888 0,376 0,317 VEF1 (%) < 0,001 0,002 0,001 0,098 0,893 0,002 0,001 < 0,001 0,004 VEF1/CVF 0,001 0,027 0,053 0,004 0,138 0,287 0,015 0,004 0,051 FEF25-75% (%) 0,001 0,010 0,012 0,112 0,273 0,098 0,048 0,001 0,106
CVF, capacidade vital forçada; VEF1, volume expiratório forçado no primeiro segundo da CVF; FEF25-75%, fluxo expiratório forçado entre 25% e
75% da CVF; %, porcentagem; L, litros. Critério de colonização/infecção: (1) foi calculada a porcentagem relativas de culturas positivas para S. aureus versus P. aeruginosa pela fórmula = [(n S. aureus) / N (S. aureus + P. aeruginosa não mucoide + P. aeruginosa mucoide)] * 100. Porcentagem maior que 66,66% = predominantemente S. aureus; porcentagem inferior a 33,33% = predominantemente P. aeruginosa (mucoide ou não mucoide); porcentagem entre 33,33% a 66,66% = concomitante para S. aureus e P. aeruginosa. (ii) Avaliado pela predominância absoluta de um agente em relação ao outro. Sendo que a concomitância foi avaliada pela observação de aproximadamente 50% de culturas positivas para S. aureus e P. aeruginosa. Dados com valor de p positivos (< 0,05) estão apresentados em negrito. Análise estatística realizada pelo teste dos postos sinalizados de Wilcoxon de amostras relacionadas. Alpha = 0,05.
Tabela 6. Correlação entre a idade dos pacientes com fibrose cística (em anos) com os valores de redução dos marcadores da espirometria durante os 24 meses avaliados no estudo.
Marcador Coeficiente de correlação Rho de Spearman p-value
CVF (L) - 0,498 < 0,001 CVF (%) 0,131 0,354 VEF1 (L) - 0,459 0,001 VEF1 (%) 0,263 0,060 CVF/VEF1 0,030 0,832 FEF25-75% 0,234 0,099
CVF, capacidade vital forçada; VEF1, volume expiratório forçado no primeiro segundo da
CVF; FEF25-75%, fluxo expiratório forçado entre 25% e 75% da CVF; %, porcentagem; L,
litros. Dados com valor de p positivos (< 0,05) estão apresentados em negrito. Análise estatística realizada pelo teste de correlação de Spearman. Alpha = 0,05.
Tabela 7. Interação entre o sexo e redução dos valores dos marcadores de espirometria em pacientes com fibrose cística de acordo com os grupos de bactérias isoladas durante o período do estudo.
Grupo 1 Training bal. acc. Testing bal. acc. CV consistency P-value
Sexo 0,6318 0,5515 9/10 0,5910
Sexo*CVF 0,6408 0,5100 6/10 0,7650
Sexo*VEF1* FEF25-75% 0,6697 0,5108 8/10 0,7580
Sexo*VEF1*CVF*FEF25-75% 0,6712 0,3785 10/10 0,9720
Grupo 2 Training bal. acc. Testing bal. acc. CV consistency P-value
Sexo 0,6225 0,6225 10/10 0,3630
Sexo*CVF 0,6300 0,5123 10/10 0,7410
Sexo*CVF*VEF1 0,6521 0,4342 6/10 0,9250
Sexo*CVF*VEF1*FEF25-75% 0,6554 0,4449 10/10 0,9020
Grupo 3 Training bal. acc. Testing bal. acc. CV consistency P-value
Sexo 0,6694 0,6694 10/10 0,1850
Sexo*CVF 0,6802 0,5861 5/10 0,5200
Sexo*VEF1*FEF25-75% 0,6910 0,4694 5/10 0,8380
Sexo*CVF*VEF1*FEF25-75% 0,6994 0,4278 10/10 0,9100
Grupo 4 Training bal. acc. Testing bal. acc. CV consistency P-value
Sexo 0,5735 0,4706 7/10 0,8550
Sexo*CVF 0,6324 0,5000 8/10 0,8000
Sexo*CVF*FEF25-75% 0,6585 0,5147 9/10 0,7620
Sexo*CVF*VEF1*FEF25-75% 0,6634 0,4412 10/10 0,9110
CVF, capacidade vital forçada; VEF1, volume expiratório forçado no primeiro segundo da CVF; FEF25-75%, fluxo expiratório forçado entre 25% e
75% da CVF; %, porcentagem. Grupo, pacientes agrupados em predominantemente Staphylococus aureus versus predominantemente Pseudomonas aeruginosa; Grupo 2, pacientes predominantemente colonizados/infectados por P. aeruginosa versus os demais pacientes segundo o critério 1; Grupo 3, pacientes predominantemente colonizados/infectados por P. aeruginosa e S. aureus, concomitantemente, versus os demais pacientes segundo o critério 1; Grupo 4, , pacientes predominantemente colonizados/infectados por S. aureus versus os demais pacientes segundo o critério Critério de colonização/infecção 1, foi calculada a porcentagem relativas de culturas positivas para S. aureus versus P. aeruginosa pela fórmula = [(n S. aureus) / N (S. aureus + P. aeruginosa não mucoide + P. aeruginosa mucoide)] * 100. Porcentagem maior que 66,66% = predominantemente S. aureus; porcentagem inferior a 33,33% = predominantemente P. aeruginosa (mucoide ou não mucoide); porcentagem entre 33,33% a 66,66% = concomitante para S. aureus e P. aeruginosa. Análise estatística realizada pela ferramenta MDR e MDRPT. Alpha = 0,05.
Tabela 8. Associação do genótipo de CFTR para a mutação p.Phe508del com a presença de insuficiência pancreática nos pacientes com fibrose cística.
Insuficiência pancreática p.Phe508del/p.Phe508del p.Phe508del/- -/- Total
Sim 15a 13b 4c 32 Não 1d 6e 13f 20 Total 16 19 17 52 a. OR=16,01; 95%IC=2,048 a 742** b. OR=1,60; 95%IC=0,49 a 5,24* c. OR=0,08; 95%IC=0,01 a 0,37** d. OR=0,06; 95%IC=0,001 a 0,49** e. OR=0,63; 95%IC=0,19 a 2,06* f. OR=12,18; 95%IC=2,74 a 68,56**
OR, odds ratio; 95%IC, intervalo de confiança de 95%; -, ausência de mutação p.Phe508del. *, valores de OR e 95%IC baseado na série Taylor; **, OR e 95%IC baseado no Teste Exato de Fisher. Dados com valor de p positivos (<0,05) estão apresentados em negrito. Análise estatística realizada pelo χ2 (p<0,001). Alpha=0.05.
Tabela 9. Associação entre o genótipo de CFTR com a presença de insuficiência pancreática nos pacientes com fibrose cística.
Insuficiência pancreática MI/MI MI/Other Other/Other Total
Sim 28a 3b 1c 32 Não 2d 12e 6f 20 Total 30 15 7 52 a. OR=54,48; 95%IC=8,72 a 658,6 b. OR=0,074; 95%IC=0,01 a 0,36 c. OR=0,079; 95%IC=0,003 a 0,60 d. OR=0,018; 95%IC=0,002 a 0,096 e. OR=13,56; 95%IC=2,79 a 93,43 f. OR=12,62; 95%IC=1,34 a 630,2
OR, odds ratio; 95%IC, intervalo de confiança de 95%. O agrupamento para o genótipo de CFTR foi realizado considerando a presença de duas mutações de CFTR de classe I, II e/ou III (MI/MI); ou presença de apenas uma mutação de CFTR de classe I, II e/ou III e outra de classe IV, V e/ou VI ou não identificada (MI/Other); ou presença de duas mutações de CFTR de classe IV, V e/ou VI ou não identificada (Other/Other). Valores de OR e 95%IC baseado no Teste Exato de Fisher. Dados com valor de p positivos (<0,05) estão apresentados em negrito. Análise estatística realizada pelo χ2 (p<0,001). Alpha=0.05.
Tabela 10. Comparação dos pacientes com fibrose cística para o status da insuficiência pancreática com os valores de espirometria, no momento inicial, e após 24 meses de acompanhamento, bem como, a diferença entre o valor final e inicial da avaliação da função pulmonar.
Marcador Insuficiência pancreática Distribuição do dado P-value
CVF (L) – Antes Sim 32; 1,99±0,95; 1,78 (0,85 a 5,05) <0,001
Não 20; 2,56±0,49; 2,6 (1,71 a 3,58)
CVF (L) – (Depois – Antes) Sim 32; 0,54±1,06; 0,69 (-1,47 a 2,71) 0,008
Não 20; -0,24±0,54; -0,32 (-1,38 a 0,82)
CVF (L) – Depois Sim 32; 2,12±0,93; 1,90 (0,85 a 4,90) 0,009
Não 20; 2,48±0,51; 2,44 (1,54 a 3,47)
VEF1 (L) – Antes Sim 32; 1,64±0,80; 1,54 (0,74 a 4,95) 0,013
Não 20; 1,88±0,40; 1,85 (1,17 a 2,96)
VEF1 (%) – Antes Sim 32; 79,84±21,06; 77 (38 a 115) 0,018
Não 20; 65,90±19,46; 66 (31 a 108)
VEF1 (%) – (Depois – Antes) Sim 32; -23,06±19,58; -19,50 (-58 a 6) 0,008
Não 20; -7,95±21,13; -6 (-61 a 27)
VEF1 (%) – Depois Sim 32; 73,21± 19,40; 72,49 (33,85 a 110,28) 0,050
Não 20; 63,01±18,64; 63,02 (26,20 a 100,70)
VEF1/CVF (%) – Antes Sim 32; 0,83±0,10; 0,84 (0,56 a 1,01) 0,003
VEF1/CVF (%) – Depois Sim 32; 0,81±0,09; 0,81 (0,59 a 1) 0,001
Não 20; 0,72±0,08; 0,72 (0,57 a 0,88)
FEF25-75% (%) – Antes Sim 32; 65,93±32,03; 57,50 (20,9 a 145) 0,021
Não 19; 46,74±26,76; 43 (15 a 116)
FEF25-75% (%) – Depois Sim 32; 60,20±28,47; 51,57 (15,54 a 135,23) 0,025
Não 19; 42,23±21,99; 39,22 (11,16 a 96,70)
Idade (anos) Sim 32; 23,52±13,15; 20,26 (10,76 a 84,35) <0,001
Não 20; 40,06±17,48; 41,39 (8,36 a 75,38)
CVF, capacidade vital forçada; VEF1, volume expiratório forçado no primeiro segundo da CVF; FEF25-75%, fluxo expiratório forçado entre 25% e
75% da CVF; %, porcentagem; L, litros. A análise estatística foi realizada pelo teste de Mann-Whitney. Alpha=0,05. Os dados estão apresentados pelo N; média±desvio padrão; mediana (mínimo a máximo).
Tabela 11. Associação do genótipo de CFTR para a mutação p.Phe508del com o sexo dos pacientes com fibrose cística.
Genótipo Masculino Feminino Total Odds ratio 95%IC
p.Phe508del/p.Phe508del 10 6 16 5 1,415 a 17,67*
p.Phe508del/- 4 15 19 0,33 0,065 a 1,332**
-/- 5 12 17 0,625 0,180 a 2,167*
Total 19 33 52
95%IC, intervalo de confiança de 95%; -, ausência de mutação p.Phe508del. *, valores de odds ratio e 95%IC baseado na série Taylor; **, odds ratio e 95%IC baseado no Teste Exato de Fisher. Dados com valor de p positivos (<0,05) estão apresentados em negrito. Análise estatística realizada pelo χ2 (p<0,001). Alpha=0.05.
Tabela 12. Comparação dos pacientes com fibrose cística de acordo com a mutação p.Phe508del com os valores de espirometria, no momento inicial, e após 24 meses de acompanhamento, bem como, a diferença entre o valor final e inicial da avaliação da função pulmonar.
Marcador Genótipo p.Phe508del Distribuição do dado P-value
CVF (L) – (Depois – Antes) p.Phe508del/p.Phe508del 16; 0,65±1,16; 0,80 (-1,47 a 2,26) 0,049
p.Phe508del/- 19; 0,34±0,94; 0 (-0,66 a 2,71)
-/- 17; -0,25±0,54; -0,30 (-1,38 a 0,85)
VEF1 (L) – (Depois – Antes) p.Phe508del/p.Phe508del 16; 0,17±1,29; 0,45 (-3,68 a 1,75) 0,039
p.Phe508del/- 19; 0,19±0,73; 0,05 (-1,13 a 2,04)
-/- 17; -0,36±0,53; -0,19 (-1,53 a 0,38)
VEF1 (%) – Antes p.Phe508del/p.Phe508del 16; 83,63±18,61; 82,50 (50 a 110) 0,020a
p.Phe508del/- 19; 76,21±22,09; 71 (38 a 115)
-/- 17; 63,94±19,48; 65 (31 a 108)
VEF1 (%) – Depois p.Phe508del/p.Phe508del 16; 75,06±16,54; 73,07 (44,60 a 101,68) 0,023a
p.Phe508del/- 19; 72,98±21,39; 73,79 (33,85 a 110,28)
-/- 17; 59,73±17,45; 59,71 (26,20 a 100,70)
Idade (Anos) p.Phe508del/p.Phe508del 16; 22,25±9,36; 19,71 (10,76 a 44,14) 0,002
p.Phe508del/- 19; 26,05±13,92; 21,53 (8,36 a 59,21)
CVF, capacidade vital forçada; VEF1, volume expiratório forçado no primeiro segundo da
CVF; %, porcentagem; L, litros; -, ausência de mutação p.Phe508del. A análise estatística foi realizada pelo teste de Kruskal-Wallis. a, p.Phe508del/p.Phe508del é diferente de -/-.
Alpha=0,05. Os dados estão apresentados pelo N; média±desvio padrão; mediana (mínimo a máximo).
CFTR, Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator; CVF, capacidade vital forçada; VEF1, volume expiratório forçado no primeiro segundo da
CVF; %, porcentagem; L, litros. O agrupamento para o genótipo de CFTR foi realizado considerando a presença de duas mutações de CFTR de Tabela 13. Comparação dos pacientes com fibrose cística de acordo com a mutação de CFTR com os valores de
espirometria, no momento inicial, bem como, a diferença entre o valor final e inicial da avaliação da função pulmonar.
Marcador CFTR Distribuição do dado P-value
CVF (L) – Inicial MI/MI 30; 2,04±0,94; 1,86 (0,85 a 5,05) 0,039
MI/Other 15; 2,34±0,71; 2,60 (0,88 a 3,29)
Other/Other 7; 2,62±0,53; 2,43 (2,01 a 3,58)
VEF1 (L) – Inicial MI/MI 30; 1,66±0,80; 1,54 (0,78 a 4,95) 0,034a
MI/Other 15; 1,70±0,46; 1,84 (0,74 a 2,38)
Other/Other 7; 2,07±0,44; 2 (1,58 a 2,96)
VEF1 (%) – Inicial MI/MI 30; 79,97±21,54; 77 (38 a 115) 0,031b
MI/Other 15; 63,20±17,04; 62 (31 a 100)
Other/Other 7; 75,14±22,33; 71 (42 a 108)
VEF1 (%) – (Antes – Depois) MI/MI 30; -23,60±19,31; -19,50 (-58 a 6) 0,026b
MI/Other 15; -6,80±21,06; -5 (-46 a 27)
Other/Other 7; -12,43±22,90; -7 (-61 a 4)
Idade (Anos) MI/MI 30; 23,11±8,76; 20,26 (10,76 a 44,14) 0,006a
MI/Other 15; 34,43±15,20; 35,73 (8,36 a 59,21)
classe I, II e/ou III (MI/MI); ou presença de apenas uma mutação de CFTR de classe I, II e/ou III e outra de classe IV, V e/ou VI ou não identificada (MI/Other); ou presença de duas mutações de CFTR de classe IV, V e/ou VI ou não identificada (Other/Other). A análise estatística foi realizada pelo teste de Kruskal-Wallis. a, MI/MI é diferente de Other/Other; b, MI/MI é diferente de MI/Other. Alpha=0,05. Os dados estão
Figura 1. Associação do sexo com a variação dos marcadores da espirometria em pacientes com fibrose cística. A. Variação dos valores do volume expiratório forçado no primeiro segundo da capacidade vital forçada (VEF1) (% do previsto) no período de 24 meses de
acompanhamento dos pacientes com fibrose cística: (Feminino) - 33; -11,88 ± 20,53; -8 (-58 a 27); (Masculino) - 19; -26,58 ± 19,84; -21 (-61 a 0). (p = 0,013). B. Variação dos valores do fluxo expiratório forçado entre 25 e 75% da capacidade vital forçada (FEF25-75%) (% do
previsto) no período de 24 meses de acompanhamento dos pacientes com fibrose cística: (Feminino) 32; -11,22 ± 28,81; -8,5 (-75 a 36); (masculino) 19; -28,78 ± 28,13; -28 (-103 a 19,1). (p = 0,033). Análise estatística foi realizada pelo teste de Mann-Whitney. Alpha = 0,05. Os dados estão apresentados pelo N; média ± desvio padrão; mediana (mínimo a máximo). Nos gráficos a dispersão representa 95% para o intervalo de confiança da mediana.
Figura 2. Associação do sexo com os valores dos marcadores da espirometria em pacientes com fibrose cística em dois períodos (0, primeira espirometria; 24 meses depois, última espirometria conforme ajuste realizado para o estudo). A. Variação dos valores da capacidade vital forçada (% do previsto) no período de 24 meses de acompanhamento dos pacientes com fibrose cística para o sexo masculino: (0 meses) 19; 88,26 ± 27,60; 92 (40 a 158); (24 meses depois) 19; 82,78 ± 24,68; 86,64 (35,2 a 140,39). (p = 0,001). B. Variação dos valores do volume expiratório forçado no primeiro segundo da CVF (VEF1) (% do previsto) no período
de 24 meses de acompanhamento dos pacientes com fibrose cística para o sexo masculino: (0 meses) 19; 80,42 ± 24,81; 84 (31 a 115); (24 meses depois) 19; 73,29 ± 22,68; 72,50 (26,20 a 103,99). (p < 0,001). C. Variação dos valores do índice VEF1/CVF no período de 24 meses de
acompanhamento dos pacientes com fibrose cística para o sexo masculino: (0 meses) 19; 0,80 ± 0,11; 0,81 (0,56 a 0,98); (24 meses depois) 19; 0,76 ± 0,10; 0,76 (0,59 a 0,94). (p = 0,004). D. Variação dos valores do fluxo expiratório forçado entre 25 e 75% da CVF (FEF25-75%) (%
do previsto) no período de 24 meses de acompanhamento dos pacientes com fibrose cística para o sexo masculino: (0 meses) 19; 65,10 ± 35,04; 60 (15 a 145); (24 meses depois) 19; 56,18 ± 29,21; 47,75 (11,16 a 122,32). (p = 0,001). E. Variação dos valores da CVF (% do previsto) no período de 24 meses de acompanhamento dos pacientes com fibrose cística para o sexo feminino: (0 meses) 33; 80,03 ± 15,44; 77 (46 a 114); (24 meses depois) 33; 76,24 ± 15,37; 75,43 (46,63 a 108,26). (p = 0,003). F. Variação dos valores do VEF1 (% do previsto)
no período de 24 meses de acompanhamento dos pacientes com fibrose cística para o sexo feminino: (0 meses) 33; 71,06 ± 18,70; 68 (38 a 110); (24 meses depois) 33; 66,98 ± 17,52; 65,75 (33,85 a 110,28). (p = 0,004). Análise estatística realizada pelo teste dos postos sinalizados de Wilcoxon de amostras relacionadas. Alpha = 0,05. Os dados estão apresentados pelo N; média ± desvio padrão; mediana (mínimo a máximo). Nos gráficos a dispersão representa 95% para o intervalo de confiança da mediana.
