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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
Bibliotecária: Elis Regina Alves dos Santos – CRB-8a. / 8099
551c
Venâncio, Paulo César.
Composição química e atividade antimicrobiana de extratos à base de alho (Allium sativum e Allium tuberosum) sobre a infecção estafilocócica: estudo in vitro e in vivo, em ratos / Paulo César Venâncio. -- Piracicaba, SP: [s.n.], 2010.
Orientador: Francisco Carlos Groppo.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
1. Staphylococcus aureus. 2. Amoxicilina. I. Groppo, Francisco Carlos. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título. (eras/fop)
Título em Inglês: Chemical composition and antimicrobial activity of extracts of garlic (Allium sativum and Allium tuberosum) on staphylococcal infection: study in vitro and in vivo in rats
Palavras-chave em Inglês (Keywords): 1. Staphylococcus aureus. 2. Amoxicillin Área de Concentração: Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica
Titulação: Doutor em Odontologia
Banca Examinadora: Francisco Carlos Groppo, Fernando de Sá Del Fiol, Yoko Oshima Franco, Pedro Luiz Rosalen, Rogério Heládio Lopes Motta
Data da Defesa: 17-12-2010
iv
Dedico este trabalho
A Deus, pelo dom da vida, inspiração, força e presença constante, guiando meus caminhos e colocando nele pessoas muito especiais.
À minha mãe Doraci Venâncio, por ter me dado a vida, pela sua importância, por tudo que representa na minha vida, pelo carinho a mim dado, pela paciência, pela educação a nós ensinada, por me guiar no caminho de Deus, por ser minha mãe.
Ao meu pai Antonio Venâncio, que já habita a morada eterna na presença de Deus, de quem tenho muito orgulho pelo amor ensinado, respeito, dignidade, quem me incentivou com suas demonstrações de ânsia ao saber.
A todos os meus queridos irmãos, Maria Aparecida, Inês, Lúcia, José, Carlos, Sônia, Elisabete, Fernando, Mauricio, Fabio e Mauro, pelo incentivo e apoio constante em todos os momentos.
A todos os meus lindos sobrinhos, os quais amo muito, e que são a razão da minha busca constante por coisas novas.
Aos meus familiares e amigos, por fazerem parte da minha vida em todas as situações.
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Agradecimentos
Em especial à minha família, pais, irmãos, aos amigos, obrigado por fazerem parte da minha vida, por todo o apoio, incentivo, toda a torcida, confiança e carinho que me deram.
À Universidade Estadual de Campinas, por meio do Reitor, Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP – UNICAMP), por meio do diretor, Prof. Dr. Jacks Jorge Júnior.
Ao departamento de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica, por meio do chefe de departamento, Prof. Dr. Francisco Carlos Groppo.
À Profa. Dra. Renata C. Matheus R. Garcia, coordenadora dos cursos de Pós-Graduação da FOP/UNICAMP e à Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Aos professores e amigos da Área de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica, Profa. Dra. Maria Cristina Volpato, Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen, Prof. Dr. Eduardo Dias de Andrade, Prof. Dr. José Ranali, Prof. Dr. Thales Rocha de Matos Filho, e a todos os docentes do Programa de Pós-Graduação em Odontologia de Piracicaba.
À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo incentivo concedido, processo n° 2007/08076-5.
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Ao meu orientador Prof. Dr. Francisco Carlos Groppo, minha gratidão pela orientação, pelos exemplos de seriedade, honestidade e esforço, pela disposição em sempre me ajudar, pelo incentivo, pela amizade, um grande irmão.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Eduardo Dias de Andrade, pelas contribuições para a realização do meu trabalho, pelos conselhos, pela amizade.
Às Professoras Dra. Maria Cristina Volpato, Dra. Karina Cogo e Dra. Cristiane Bergamaschi, membros da banca de qualificação, pelas sugestões para a realização e finalização deste projeto.
Ao meu grande amigo Sidney Figueroba, pelos momentos agradáveis e difíceis passados juntos, trabalhos e estudos compartilhados, pela força na execução dos trabalhos, pela sua bela família.
Aos amigos da farmacologia, com carinho, Márcia, Myrella, Cristiane, Luciana Lóci, Luciana Berto, Karina, Michelle, Vanessa, Bruno, Júlio, Patrícia, Leila, Gilson, Giovana e Leandro, por todos os momentos que passamos juntos, pela ajuda nos seminários, pela amizade e companheirismo.
À Eliane Melo Franco, excelente técnica de laboratório, grande amiga, sempre pronta a ajudar em todos os momentos.
À Maria Elisa dos Santos, secretária eficiente, sempre prestativa, por sempre nos ajudar nas questões burocráticas.
Ao Bruno Nani, pelo trabalho efetuado em conjunto como projeto de iniciação científica.
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Ao José Carlos Gregório, funcionário da Farmacologia, grande parceiro nos experimentos, pela grande ajuda prestada.
Ao Edmilson José Onório, funcionário do COTIL, pela ajuda nos experimentos, grande parceiro e amigo.
Ao Dr. Adilson Sartoratto, do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da UNICAMP, pelas análises realizadas.
Aos meus amigos professores do COTIL e a Direção pelo apoio dado.
Aos amigos e pessoas que embora não citadas colaboraram e incentivaram, para que este trabalho fosse realizado.
viii RESUMO
Este estudo teve por objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de soluções de alho (Allium tuberosum e Allium sativum) sobre a infecção estafilocócica em ratos e observar suas respectivas composições químicas. A atividade antimicrobiana in vitro das soluções foi analisada pelos testes de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM), contra a mesma cepa utilizada in vivo, e a análise da composição química dos extratos foi feita por cromatografia gasosa. Esponjas de policlorovinil (PVC) foram implantadas no dorso de 95 ratos. Após 14 dias, os granulomas formados foram infectados com Staphylococcus aureus ATCC 25923. Após 24h da infecção, os animais foram divididos aleatoriamente nos seguintes grupos: Grupo 1 – Controle A (soro fisiológico); Grupo 2 – A. sativum 100mg/kg; Grupo 3 – A. sativum 400mg/kg; Grupo 4 – A. tuberosum 100mg/kg; Grupo 5 – A. tuberosum 400mg/kg; e Grupo 6 – Amoxicilina 50mg/kg. Os animais receberam os tratamentos por via oral a cada 6 horas. Cada grupo foi dividido em três subgrupos de cinco animais cada, os quais foram mortos após 6, 12 e 24 horas, respectivamente. No Grupo 1, também foi utilizado um grupo que foi morto no tempo “zero”, isto é, logo após a primeira administração do soro fisiológico. Os granulomas retirados foram acondicionados em tubos de ensaio, recebendo agitação em vórtex e a suspensão resultante foi cultivada em meio de cultura agar sal e manitol (SMA). Após 18 horas, os microrganismos foram contados manualmente. Os resultados foram comparados através do teste de Kruskal-Wallis, com nível de significância de 5%. A análise cromatográfica mostrou que a composição química foi diferente nos dois extratos, e apresentou compostos orgânicos e organossulfurados, provavelmente resultantes da degradação da alicina. Os testes de sensibilidade CIM e CBM revelaram que a solução de A. tuberosum não mostrou capacidade de inibir ou matar a cepa de S. aureus em nenhuma das concentrações utilizadas. Entretanto, o A. sativum mostrou CIM de 2mg/mL e CBM de 4mg/mL. De uma maneira geral, o peso dos granulomas no
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grupo controle foi menor (Kruskal-Wallis, p<0,05) do que nos demais grupos, considerando-se cada tempo separadamente, sendo que nos tempos 12h e 24h, o
A. tuberosum mostrou maior peso do que os demais grupos. Foi possível observar que houve diminuição da concentração de UFC/mL após 24 horas para todos os grupos. Nos grupos amoxicilina e A. sativum 400mg/kg, esta redução ocorreu a partir de 12 horas. De uma maneira geral, todos os tratamentos causaram redução significativa quando comparados ao grupo controle em todos os períodos de tempo. Além disso, não houve diferenças estatisticamente significantes entre a quantidade de bactérias recuperadas do grupo amoxicilina e os demais tratamentos no período de 24 horas. Concluímos que os extratos foram capazes de inibir a infecção estafilocócica nos animais de maneira similar à amoxicilina.
x ABSTRACT
The aim of this study was to observe the chemical composition and to evaluate the antimicrobial activity of garlic (Allium tuberosum and Allium sativum) extracts against staphylococcal infection induced in rats. The in vitro antimicrobial activity was obtained by the minimum inhibitory (MIC) and bactericidal (MBC) concentrations against the same strain used in the in vivo assay. The chemical composition of the extracts was measured by gas chromatography. Polyclorovinyl (PVC) sponges were implanted on the backs of 95 rats. After 14 days, the resulting granulomas were infected with Staphylococcus aureus ATCC 25923. After 24 hours of infection, the animals were divided randomly into four groups: Group 1 - The Control (saline), Group 2 - A. sativum 100mg/kg/p.o., Group 3 - A. sativum
400mg/kg/p.o., Group 4 - A. tuberosum 100mg/kg/p.o., Group 5 - A. tuberosum
400mg/kg/p.o. and Group 6 - Amoxicillin 50mg/kg/p.o. The animals were treated every 6 hours. Each group was divided into three subgroups of five animals, which were killed after 6, 12 and 24 hours respectively. Five animals of the Group 1 were also killed at zero time, i.e., after the first administration of saline. Granulomas were removed and placed in test tubes, vortexed and the resulting suspension was spread on mannitol salt agar (SMA). After 18 hours, the microorganisms were counted manually. The results were compared by using Kruskal-Wallis test with a significance level of 5%. Chromatographic analysis showed that the two garlic species showed different chemical composition, but both presented organosulfur compounds, probably resulting from the allicin degradation. MIC and MBC of A. tuberosum showed no ability to inhibit or kill the S. aureus strain in any of the concentrations used. However, A. sativum showed MIC = 2mg/mL and MBC = 4mg/mL. The weight of the granulomas in the control group was lower (Kruskal-Wallis, p <0.05) than the other groups, considering each time separately. At times 12h and 24h, A. tuberosum showed bigger granulomatous-tissue weight than the other groups. It was observed that there was a decrease in the concentration of
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CFU/mL after 24 hours for all groups. Amoxicillin and 400mg/kg A. sativum
reduced the S. aureus concentration after 12 hours. In general, all treatments caused significant reduction compared to the control group at all time periods. Furthermore, no statistically significant differences were observed regarding the number of bacteria recovered from the amoxicillin group in comparison to the other treatments at the 24 hours period. We conclude that the extracts were able to inhibit staphylococcal infection similarly to amoxicillin.
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SUMÁRIO
Página 1 INTRODUÇÃO... 1 2 REVISÃO DE LITERATURA... 3 3 PROPOSIÇÃO... 12 4 MATERIAL E MÉTODOS... 13 5 RESULTADOS... 20 6 DISCUSSÃO... 31 7 CONCLUSÃO... 35 REFERÊNCIAS... 36 ANEXOS... 441 1 INTRODUÇÃO
A resistência de cocos gram-positivos a diversos antibacterianos tem se mostrado progressivo. Este aumento tem sido observado principalmente no ambiente hospitalar, sendo que dentre as espécies mais comumente envolvidas estão os Staphylococcus spp. e os Enterococcus spp. Devido a este fato, novos antibacterianos devem ser avaliados para o tratamento de infecções causadas por estas espécies multirresistentes (Mendes et al., 2002).
O grande número de infecções causadas por S. aureus, concomitante ao aumento da sua resistência aos antibacterianos, é um fator de alerta para a saúde pública. Caso a eficácia terapêutica dos antibióticos utilizados para o tratamento das infecções causadas por essas bactérias multirresistentes venha a ser comprometida, certamente a assistência médica oferecida passará a ser mais complexa e dispendiosa.
A alta frequência de bactérias multirresistentes nos hospitais, particularmente nos centros de terapia intensiva, é indicativa da utilização pouco efetiva dos antibióticos e da necessidade de maior prudência visando à redução da pressão seletiva sobre as cepas sensíveis. A mudança contínua nos padrões de resistência antimicrobiana torna obrigatória a avaliação periódica de sensibilidade microbiana nos hospitais (Japoni et al., 2009).
Existem evidências claras de que, sem a introdução de novos agentes antimicrobianos, haverá um retorno dos problemas de saúde pública que ocorriam na era pré-antibióticos (Furtado & Nicolau, 2010). Entretanto, apesar das intensas pesquisas da comunidade científica, nenhuma nova ou significativa classe de antimicrobianos foi descoberta nos últimos anos.
O alto custo do desenvolvimento comercial de antimicrobianos, bem como daqueles já existentes, é outra realidade atual. Além disso, devem ser considerados os efeitos colaterais indesejáveis, principalmente com a utilização dos antimicrobianos tradicionais, tais como diarréias, vômitos, etc.
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As plantas medicinais constituem uma rica fonte de novas moléculas a serem exploradas como fármacos convencionais no futuro ou ainda como ferramentas bioquímicas para a elucidação de aspectos etiológicos de determinadas patologias que ainda permanecem obscuros (Cragg & Newman, 2005).
A atividade antimicrobiana de extratos de diversas plantas vem sendo observada contra cepas de S. aureus em vários estudos (Camporese et al., 2003; Soberón et al., 2007; O'Shea et al., 2009; Mutai et al., 2009; Quave et al., 2010).
As informações a respeito das diversas propriedades terapêuticas do alho, que é um alimento consumido em larga escala, fornecem campo fértil para sua utilização. Foram reportados efeitos hipocolesterolêmico, hiperlipidêmico, anti-hipertensivo, antidiabético, antitrombótico e anti-hiperhomocisteinemia. Além destes, outras atividades biológicas, tais como antimicrobiana, antioxidante, anticarcinogênica, antimutagênica, antiasmática, imunomoduladora e pró-bióticas foram estudadas (Martínez et al., 2007). Extratos de alho mostraram também atividade antimicrobiana contra estreptococos orais em modelos in vivo em seres humanos (Groppo et al., 2007).
Assim, o objetivo do presente estudo foi determinar a constituição química dos extratos de duas espécies de alho (A. sativum e A. tuberosum), sua atividade antimicrobiana contra S. aureus in vitro e contra a infecção estafilocócica pela mesma cepa em ratos.
3 2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Modelo de tecido granulomatoso
Os modelos ex vivo utilizam a reação a algum corpo estranho, geralmente implantado via subcutânea. Os corpos estranhos porosos são encapsulados gerando tecidos granulomatosos ou fibrinosos, sendo que a sua cavidade é preenchida por fluido do tipo exsudato inflamatório, permitindo a difusão de fármacos e fagócitos. Estes modelos podem ser válidos para determinação da capacidade de um antimicrobiano em penetrar em locais específicos de infecção, seu nível bactericida, seu efeito na fisiologia e morfologia da bactéria e a possibilidade da ocorrência de seleção ou resistência (Renneberg, 1993).
Dentre os vários métodos utilizados para indução desta injúria, a implantação de esponjas de policlorovinil (PVC), como agente desencadeador, no dorso de animais, tem sido utilizada (Baglie et al., 2000; Groppo et al., 2000). Esse tecido tem morfologia e sequência de formação bem estudadas. Os fenômenos morfológicos envolvidos com seu desenvolvimento, segundo Andrade (1980) e Mattos-Filho (1990), são:
• Após sete dias do implante observa-se uma cápsula fibrosa envolvente, já delimitada. Uma incipiente proliferação de tecido de granulação é notada, caracterizada pela presença de fibroblastos, células mesenquimais e neoformação de capilares. • Dentro de 14 dias após o implante nota-se um nítido avanço do
fibrosamento, porém ainda existe formação de capilares e apesar da redução do número de células, estas parecem ocupar os espaços mais interiores da esponja.
• Após três semanas de evolução (21 dias), a diferença para com o período anterior constitui-se apenas na quantidade aumentada de fibras colágenas e presença ocasional de algumas células gigantes de corpo estranho e macrófagos.
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• Em 28 dias, após o implante, observa-se um total envolvimento por fibras colágenas, delimitando o tecido externamente e invadindo o seu interior. Existe escassez de células e de vasos sanguíneos. Os autores são concordantes ao afirmar que, neste momento, a lesão atinge o seu ápice.
Outros modelos também têm sido propostos. Renneberg & Walder (1988) utilizaram tiras de algodão implantadas no dorso de camundongos e infectadas com S. aureus. Observaram a redução do número de bactérias viáveis após a administração de antimicrobianos. Ensink et al. (1996) utilizaram câmaras implantadas subcutaneamente em pôneis, infectando o fluido formado com
Streptococcus zooepidemicus. Administravam, a cada grupo de sete animais, antimicrobianos e observavam o impacto sobre a população bacteriana em comparação com um grupo controle. Modelos similares, porém em porquinhos da Índia e ratos, foram utilizados, respectivamente, por Blaser et al. (1995) e Murillo
et al. (2009).
Uma crítica expressiva a este tipo de modelo, que utiliza a infecção no fluido formado, é que existem evidências substanciais de que muitas infecções resultam de organismos que aderem às superfícies. A maior parte das bactérias não produz efeitos patogênicos em fluidos corpóreos. São encontradas neles como resultado da difusão, a partir do local de infecção, da contaminação provinda de instrumentação ou da ruptura tecidual. Portanto, situa-se no tecido o local da verdadeira batalha contra os agentes patogênicos (Lorian, 1989).
2.2 O uso correto de antimicrobianos e a resistência bacteriana
A razão risco-benefício da terapia antibiótica (toxicidade x eficácia) deve ser considerada individualmente para cada paciente. Agentes antibacterianos devem ser prescritos para pacientes apenas se uma infecção bacteriana significante for diagnosticada ou suspeitada ou, ainda, se houver indicação para profilaxia. O uso excessivo de antimicrobianos para infecções menores e doenças
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não-bacterianas, submete o paciente à toxicidade do fármaco e a possibilidade de superinfecção. Além disso, cada vez mais ocorre resistência múltipla de agentes antimicrobianos em diversos tipos de infecção tais como: meningites, infecções por
S. aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae (Jones et al., 2004).
Num estudo feito no Hospital das Clínicas em Barcelona, Cervera et al. (2009) concluíram que os estafilococos e enterococos foram as causas mais comuns de bacteremias gram-positivas, sendo que em muitos casos foram adquiridos em ambulatório. A maioria das cepas de estafilococos coagulase-negativas e causadoras de bacteremia se mostrou resistente à meticillina. Os autores apontaram também que, devido à propriedade de formar biofilmes, a remoção dos dispositivos intravasculares e cardíacos seria essencial para o sucesso do tratamento.
Japoni et al. (2009) examinaram os padrões de resistência bacteriana em amostras isoladas de pacientes de um centro de terapia intensiva (CTI) no Irã. Colheram 812 amostras de sangue, urina e fluído cérebro espinhal de 553 pacientes hospitalizados no CTI. Os estafilococos coagulase-negativos foram isolados em 66,7% das amostras de sangue, em 36,5% das amostras do fluído cérebro-espinhal e a E. coli em 20,9% das amostras de urina. A maior expressão de resistência foi contra a maioria das penicilinas e cefalosporinas.
Poeschl et al. (2009) identificaram os principais patógenos responsáveis pelas infecções no espaço profundo da cabeça e pescoço e sua resistência aos antibióticos comumente usados em um hospital universitário de Viena. Do total de 206 pacientes, as bactérias mais predominantes foram os estreptococos do grupo
viridans, estafilococos, Prevotella, Peptostreptococcus e bacteróides. Cepas aeróbicas mostraram resistência contra clindamicina (18%), macrolídeos (14%) e penicilina G (7%). As cepas anaeróbicas foram resistentes contra clindamicina (11%), metronidazol (6%) e penicilina G (8%). A taxa de resistência contra
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clindamicina e macrolídeos foi especialmente marcante, o que pode exigir adaptação dos regimes antimicrobianos no futuro.
2.3 Staphylococcus aureus
O S. aureus é o mais importante agente causador de patologias infecciosas em humanos dentre os estafilococos. Entretanto, este microrganismo faz parte da microbiota normal humana, podendo causar infecções oportunistas significantes sob condições apropriadas (Waldvogel, 1990). Frequentemente é isolado de infecções em feridas pós-cirúrgicas, as quais podem servir como nicho, possibilitando o desenvolvimento de infecções sistêmicas (Koneman, 1994). Para a amoxicilina, os valores da concentração inibitória mínima de cepas sensíveis foram de 0,06 µg/mL (Phillips et al., 1991), 0,1 µg/mL (Groppo et al., 1996) e 0,25 a 1 µg/mL (Koneman, 1994). Entretanto, o perfil de resistência antimicrobiana deste microrganismo é conhecido.
Os primeiros relatos de isolamento de estafilococos resistentes às penicilinas foram feitos logo após a introdução da penicilina G na clínica em 1941, registrando-se em 1944 e 1945 índices de resistência de 12 a 22%. Em 1950, cerca de cinco anos após a disponibilidade deste antibiótico, a resistência era em torno de 30% das amostras hospitalares norte americanas. Ao final da década de 1950, cerca de 80% dos estafilococos coagulase-positivos isolados em hospitais americanos eram resistentes às penicilinas devido à produção de penicilinases (Tavares, 2000).
Os estafilococos adquiriram importância ainda maior a partir da observação de que a incidência de endocardite estafilocócica tem aumentado drasticamente em comparação à promovida por outros patógenos. Cepas de S. aureus, sensíveis aos beta-lactâmicos, são os agentes etiológicos responsáveis pela moléstia em mais de 70% da doença diagnosticada em pacientes que fazem uso de drogas por via endovenosa. Outra razão é o fato de que os estafilococos são patógenos importantes para as infecções hospitalares (Mccartney, 1992).
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Este tipo de infecção causa mortalidade e morbidade significantes. Cerca de 30% de todas as infecções causadas pelo S. aureus são devidas à microbiota endógena (Perl & Golub, 1998).
No Brasil, os estafilococos resistentes aos glicopeptídeos foram também encontrados, sendo que uma cepa de S. aureus resistente à vancomicina foi isolada no Rio de Janeiro e estafilococos coagulase-negativos resistentes à vancomicina e/ou teicoplanina foram isolados em São Paulo. No ano 2000, mais de 80% dos S. aureus isolados de pacientes hospitalizados e cerca de 70% dos isolados de pacientes ambulatoriais apresentavam resistência às penicilinas naturais e, por extensão, à ampicilina e amoxicilina (Tavares, 2000). Recentemente, esta espécie atingiu praticamente 100% de resistência às penicilinas, sendo que a subespécie preponderante é aquela resistente à meticilina (Gales et al., 2009).
Spiandorello et al. (2000) estudaram 194 pacientes num hospital em Caxias do Sul e cultivaram 214 amostras de S. aureus. Encontraram 32,7% de amostras resistentes à oxacilina, nenhuma à vancomicina e 92,6% à penicilina. Estes dados mostram que o perfil de resistência destes microrganismos já era alarmante no início da década.
Andrade et al. (2006) avaliaram a ocorrência de bactérias multirresistentes em pacientes hospitalizados no CTI do Hospital de Clínicas de Ribeirão Preto. Observaram 68 pacientes portadores de bactérias multirresistentes, sendo as bactérias identificadas em hemoculturas, uroculturas, cateteres, líquor e em feridas operatórias. As bactérias gram-positivas foram as mais frequentes nas culturas, sendo Staphylococcus sp. coagulase-negativo isolado em 36,4% das amostras, seguido do S. aureus com 19%.
Gales et al. (2009) relataram os padrões de susceptibilidade de bactérias gram-positivas mais frequentemente isoladas e observaram que aproximadamente 60% dos casos eram provenientes de infecções da corrente sanguínea. Os organismos gram-positivos mais frequentemente isolados foram o
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S. aureus (20,2%), Staphylococcus coagulase negativa (14,7%) e Enterococcus spp. (5%). A resistência à oxacilina foi observada em 31% dos S. aureus e a grande maioria de cepas S. aureus meticilina resistente (MRSA) foi também resistente a clindamicina, ciprofloxacino e levofloxacino. A resistência à vancomicina aumentou significativamente entre os enterococos durante o período do estudo.
Desta forma, os estudos que visam o tratamento de doenças infecciosas provocadas por estafilococos, particularmente S. aureus, sensíveis ou não aos beta-lactâmicos, tendem a se tornar cada vez mais importantes, porque as cepas resistentes são de difícil controle (Andrade et al., 2006).
2.3 Propriedades do alho (gênero Allium)
As plantas medicinais constituem uma rica fonte de novas moléculas a serem exploradas como drogas convencionais no futuro ou ainda como ferramentas bioquímicas para a elucidação de aspectos etiológicos de determinadas patologias (Cragg & Newman, 2005).
O gênero Allium é frequentemente utilizado e estudado em medicina como antimicrobiano, antigripal, hipocolesterolemiante, entre outros. Existem mais de 600 espécies de Allium encontrados pelo mundo, principalmente na Ásia. A maioria das espécies possui aroma e odor característicos, algumas são utilizadas como plantas ornamentais (Pino et al., 2001).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) divulgou em 2010 uma tabela com mais de 60 fitoterápicos e a forma correta de preparar cada uma delas, destacando que a ação terapêutica desses fitoterápicos é totalmente influenciada pela forma de preparo. O alho (A. sativum) aparece com destaque em tratamentos de hipercolesteremia, como expectorante e antisséptico, devendo ser usado o bulbo em maceração na concentração de 0,5 g em 30 mL de água (Brasil, 2010).
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Alguns estudos sobre a determinação da atividade antimicrobiana do A. sativum e a identificação de seus compostos voláteis já foram realizados (Paster et al., 1995; Ankri & Mirelman, 1999; Lemar et al., 2002). A maioria dos seus constituintes é composta de sulfurados, embora a composição química mostre-se variável entre os diferentes estudos (Pino et al., 2001).
A atividade antimicrobiana do Allium spp. já se encontra bem documentada (Mantis et al., 1978; Shelef, 1984; Domingo & Lopes-Brea, 2004). Aplicações práticas do alho, calcadas em sua capacidade de inibição de crescimento e lise bacteriana foram propostas. A alicina e os tiossulfonatos foram apontados como sendo os maiores componentes inibitórios presentes no alho (Sofos et al., 1998).
A alicina, substância encontrada na maioria das espécies de Allium, na sua forma pura demonstrou atividade antimicrobiana em larga escala contra bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e fungos como Candida albicans e não albicans além de Aspergillus spp. (Ankri & Mirelman, 1999; Domingo & Lopes-Brea, 2004).
Além da alicina, o Allium sativum Liliaceae contém vários outros constituintes químicos biologicamente ativos como aliina, alinase, S-alil-cisteína e organossulfetos. A aliina, um dos aminoácidos constituintes do alho, é convertida em alicina pela enzima aliinase quando os bulbos do alho são triturados. A alicina, por sua vez, é um precursor de compostos sulfurados que são responsáveis pelo odor e pelas propriedades farmacológicas. A alicina exposta ao ar é convertida em dialildissulfetos, que têm atividade antimicrobiana. A redução pela cisteína poderá romper as ligações dissulfeto em proteínas microbianas.
A atividade da alicina foi testada isolada e em associação à anfotericina B em infecções causadas por Candida albicans, em ratos. Os resultados mostraram que a alicina melhorou a eficácia da anfotericina B(An et al., 2009).
Sohn et al. (2009) analisaram o efeito da ciplofloxacina, do alho e da associação de ambos em inflamações de próstata induzidas em ratos por E. coli.
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Observaram efeito inibitório significativo no crescimento da bactéria na cultura da urina dos animais após tratamento com o alho, a ciprofloxacina e pela associação de ambos.
O efeito de um extrato de alho a 1,5% em pulmões de ratos infectados com Pseudomonas aeruginosa mostrou que 32% dos animais morreram em contraste com 72% de mortes nos animais do grupo controle, indicando que o tratamento profilático com extrato de alho reduziu significativamente a mortalidade. Um segundo experimento mostrou uma redução significativa (mais de três LOG de UFC) da concentração de P. aeruginosa por pulmão. No 5º dia, 90% dos pulmões dos ratos do grupo tratado com alho estavam estéreis, enquanto que o grupo placebo ainda continha um uma média de 1x105 UFC por pulmão (Bjarnsholt et al., 2005).
Dentre as espécies de Allium spp., o A. tuberosum, também conhecido como “Chinese chive” ou “nirá”, é um importante ingrediente da culinária asiática, sendo utilizado como erva medicinal para muitas disfunções e doenças (Sang et al., 2001). O suco prensado do nirá demonstrou inibição contra uma ampla faixa de microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos, assim como para C. albicans
(Mau et al., 2001).
Segundo Hu (2006), a China é o país de maior produção do nirá, onde é largamente cultivado. Suas sementes foram usadas na medicina tradicional chinesa para tratar impotência e diurese noturna. Segundo o dicionário de medicina chinesa, as folhas têm sido usadas para tratamento de dor abdominal, diarréia, hematêmese, envenenamento por peçonhas de cobras e asma, sendo as sementes usadas como tônico e afrodisíaco. Estas são consumidas como alimento, sendo aceitas como medicamento pelo governo chinês em 2001.
Taminamato (2007) analisou óleos essenciais das folhas e bulbos de A. tuberosum e observou que a maioria dos compostos identificados eram organossulfetos, destacando-se os monossulfetos, dissulfetos, trissulfetos,
11
tetrassulfetos e sulfinatos. Alguns destes compostos mostraram-se ativos contra
Candida albicans.
Lam et al. (2000) isolaram do A. tuberosum, uma proteína sem resíduo de cisteína que não apresenta atividade antibacteriana, mas sim antifúngica.
12 3 PROPOSIÇÃO
Os objetivos deste estudo foram:
1- Determinar por cromatografia gasosa a composição química das soluções aquosas e hidroalcoólicas à base de A. tuberosum e A. sativum;
2- Verificar a sensibilidade, por meio dos testes de concentração inibitória e bactericida mínima, das soluções à base de A. tuberosum e A. sativum;
3- Comparar o efeito de extratos de alho (A. tuberosum e A. sativum) com a amoxicilina, contra a infecção estafilocócica em tecidos granulomatosos em ratos.
13 4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Fármaco e extratos utilizados
Para este estudo foi utilizada uma suspensão de amoxicilina triidratada (Sigma, Chicago, EUA) a 30mg/mL e extratos de alho. Os extratos foram obtidos a partir de amostras de “cebolinha de alho” ou “nirá” (A. tuberosum) e de alho comum (A.sativum), ambos adquiridos no mercado local de Piracicaba, sendo preparados extemporaneamente para cada grupo.
Uma vez separados de suas raízes e casca, 100g de bulbos de alho foram triturados em um liquidificador, por 10 min, com adição de 100mL de água destilada ou solução hidroalcoólica. Após centrifugação a 3.000 r.p.m., por 20 min, o sobrenadante foi submetido à decantação e o extrato aquoso filtrado em um filtro de papel e esterilizado através da passagem por um filtro de membrana de 0,22µm de diâmetro de poro. O rendimento deste processo foi de aproximadamente 75%. Desta forma, a concentração das soluções foi considerada como sendo 75% (p/v), ou seja, 0,75 g/mL.
4.2 Determinação da composição química dos extratos de alho
Parte dos extratos obtidos foi enviada à Divisão Química Orgânica e Farmacêutica do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da UNICAMP, sob a responsabilidade do químico Dr. Adilson Sartoratto para identificação dos principais constituintes dos extratos de alho, através da Cromatografia Gasosa (CG-MS), por meio da metodologia modificada previamente descrita por Taminato (2007). Para a extração hidroalcoólica, foi feita a evaporação do álcool no rotaevaporador, após, foram adicionados 10mL de diclorometano por duas vezes para a extração dos ativos presentes na água. Evaporou-se o diclorometano e adicionou-se acetato de etila 1 ou 2mL para ressuspensão dos ativos e posterior análise em CG-MS.
As seguintes condições cromatográficas, adaptadas de Taminato (2007), foram utilizadas:
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1) Cromatógrafo a gás HP-6890 acoplado a detector seletivo de massas HP-5975; 2) Coluna capilar: HP-5 (30m x 0,25mm x 0,25μm);
3) Temperaturas: injetor = 220°C; coluna = 60°C, 3°C/min até 240°C; detector= 250°C;
4) Volume injetado: 1,0µL;
5) Vazão do gás de arraste (He): 1,0mL/min; 6) Split: 30mL/min;
7) Biblioteca do equipamento.
4.3 Determinações da Concentração Inibitória Mínima - CIM e da Concentração Bactericida Mínima - CBM
4.3.1 Microrganismo
O microrganismo utilizado foi o S. aureus ATCC 25923 que é comprovadamente sensível às penicilinas. A cepa foi reativada e sua viabilidade foi constatada através de cultivo em ágar tripticaseína soja (TSA) e análise da pureza pelo método de Gram (Koneman, 1994).
4.3.2 Prova de sensibilidade por diluição em caldo para determinação da CIM
A cepa S. aureus ATCC 25923 foi mantida em meio de infuso de cérebro-coração (BHI), em uma estufa a 37° C de temperatura.
Para a obtenção da CIM, foram utilizados 13 tubos de ensaio com 5mL de caldo Mueller-Hinton (MHB), sendo que em 10 tubos foram acrescidas concentrações progressivas dos alhos. O 11° tubo foi usado como controle positivo de crescimento, isto é, sem a solução de alho, porém com o inóculo. As concentrações utilizadas foram: 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 e 512mg/mL.
Após a adição dessas concentrações de alho, cada grupo de 11 tubos (inclusive o controle positivo) recebeu 250 μL de uma suspensão ajustada para 106 UFC de S. aureus/mL por espectrofotometria.
15
Após o preparo, os tubos foram acondicionados em estufa de aerobiose (37°C, durante 24 horas). Decorrido este período, os tubos foram examinados visualmente para comprovar a presença de turvação. O tubo com concentração imediatamente superior aquele que apresentou turvação, foi considerado como sendo a concentração inibitória mínima (CIM).
4.3.3 Prova de sensibilidade em ágar para determinação da CBM
Dos tubos de ensaio que não se mostraram turvos, foram retiradas alíquotas de 5μL, as quais foram depositadas em placas de Petri contendo BHI agar. A menor concentração de alho dos tubos que não proporcionou o crescimento bacteriano foi considerada como sendo a concentração bactericida mínima (CBM).
4.4 Avaliação da atividade antimicrobiana “In Vivo” – Modelo do tecido granulomatoso
A avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos foi realizada no modelo de tecido granulomatoso, descrito a seguir.
4.4.1 Discos
Discos de esponjas de policlorovinil (PVC) com 12mm de diâmetro por 5mm de altura (densidade de 35kg/m3, PRO301 – Proespuma Com. e Ind. Ltda) foram obtidos por meio da utilização de um perfurador. Estes foram esterilizados em autoclave, a 120°C por 15 min.
4.4.2 Animais
Foram utilizados 95 ratos (Rattus norvegicus albinus, Wistar), adultos jovens (60 dias), machos, pesando entre 150 e 200g, S.P.F.1, que foram fornecidos pelo Centro de Bioterismo da UNICAMP.
16
Após a chegada dos animais à Faculdade de Odontologia de Piracicaba, os animais permaneceram cerca de uma semana, para adaptação, nas dependências do biotério de experimentação da Área de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica e receberam na fase de adaptação e na fase experimental, ração balanceada comercial e água ad libitum.
4.4.3 Meios de cultura
Para a manutenção da cepa foram utilizados tubos de ensaio esterilizados com TSB (caldo de tripticaseina) 24 horas antes de sua utilização. Para a obtenção do inóculo padrão contendo 108 UFC/mL, o microrganismo foi inoculado em infuso de cérebro e coração (BHI) e mantido a 37°C em estufa de incubação durante 4 a 6 horas (Koneman, 1994), sendo o mesmo submetido à espectrofotometria para padronização do tamanho do inóculo.
Para o teste de contagem de S. aureus foi utilizado um meio específico para o mesmo, o Salt Manitol Agar (ágar sal manitol - SMA) que foi distribuído em placas de Petri de 50 x 20mm, contendo 5mL do meio.
4.4.4 Obtenção do tecido granulomatoso
O tecido granulomatoso foi obtido por meio do implante de quatro discos de esponja de PVC no tecido subcutâneo no dorso dos animais, de acordo com a técnica descrita a seguir:
1 - Anestesia dos animais via intramuscular com xilazina (10mg/kg) e quetamina (90mg/kg);
2 - Tricotomia da região dorsal mediana e antissepsia com solução de álcool iodado a 2%;
3 - Incisão de aproximadamente 1cm, perpendicularmente à coluna vertebral, na derme, sem invasão de tecido muscular, com tesoura de ponta reta fina;
17
5 - Introdução das esponjas, o mais distante possível da incisão, em posições laterais, uma à esquerda e outra à direita, duas em direção à cabeça e outras duas em direção à cauda;
6 - Sutura com dois pontos simples, com fio de algodão número zero. 4.4.5 Infecção dos tecidos granulomatosos
Decorridos 14 dias da implantação, foi introduzido, por meio de uma seringa de 3mL com agulha 27x5, ambas estéreis, 0,5mL de uma suspensão bacteriana de 1x108 S. aureus ATCC 25923 em solução de cloreto de sódio a 0,9%, em cada um dos quatro tecidos granulomatosos. Este procedimento foi realizado em todos os animais e este dia foi anotado como dia zero da infecção. 4.4.6 Administração dos fármacos
Decorridos 24h da infecção, os animais foram separados em quatro grupos distintos.
A) Grupo Controle (GC): foram utilizados 20 animais, os quais foram divididos em 4 subgrupos (GC1, GC2, GC3 e GC4) de 5 animais cada. Estes animais receberam 0,5mL de solução de cloreto de sódio a 0,9%. Os animais do GC1 foram anestesiados como descrito anteriormente, exanguinados e mortos por aprofundamento da anestesia, imediatamente após a administração do soro fisiológico (tempo 0h). No grupo GC2, foi administrado o soro no tempo 0h e, após 6 horas (tempo 6), os animais receberam nova administração de soro, sendo então mortos. Os animais do GC3 receberam soro fisiológico nos tempos 0h, 6h e 12 horas e foram mortos no tempo 12h e, finalmente, no GC4, os animais receberam o soro fisiológico nos tempos 0h, 6h, 12h, 18h e 24h, sendo mortos em seguida.
B) Grupo A. tuberosum (GAT): foram utilizados 30 animais, que foram divididos em 6 subgrupos, com 5 animais cada: GAT100-1, GAT100-2 e GAT100-3, os quais receberam doses de 100mg/kg de solução de A. tuberosum e GAT400-1, GAT400-2 e GAT400-3 que receberam doses de 400mg/kg de A.
18
tuberosum. No subgrupo GAT100-1 foi administrado solução de A. tuberosum na dose de 100mg/kg no tempo 0h e, após 6h (tempo 6), o animal recebeu nova administração da solução e imediatamente anestesiado, exanguinado e morto pelo aprofundamento da anestesia. Da mesma forma, os animais do GAT100-2 receberam solução de A. tuberosum na dose de 100mg/kg, nos tempos 0h, 6h e 12h e mortos no tempo 12h, como descrito anteriormente. Os animais do GAT100-3 receberam a solução nos tempos 0h, 6h, 12h, 18h e 24h e mortos no tempo 24h, como descrito anteriormente. O mesmo procedimento foi realizado com os subgrupos GAT400-1, GAT400-2 e GAT400-3, porém a solução administrada foi de 400mg/kg.
C) Grupo A. sativum (GAS) – Os mesmos procedimentos descritos acima, entretanto, utilizando a solução de A. sativum.
D) Grupo Amoxicilina (AMO): Foram utilizados 15 animais, sendo que os mesmos procedimentos descritos acima foram realizados, entretanto, utilizando uma solução de amoxicilina na dose de 50mg/kg.
Todos os fármacos foram administrados por via intragástrica, com agulha curva, 70x15, acoplada a uma seringa hipodérmica.
4.4.7 Obtenção das amostras de granulomas infectados
As amostras dos tecidos granulomatosos infectados foram removidas após anestesia e a secção do plexo carotídeo visando a exanguinação. Esta foi realizada para evitar a possível atividade antimicrobiana do sangue do animal sobre o crescimento bacteriano do tecido. Após a remoção do sangue, os tecidos granulomatosos foram, então, cuidadosamente retirados, mediante técnica cirúrgica. Cada uma das amostras foi colocada em um tubo de ensaio, contendo 10mL de solução de cloreto de sódio esterilizada, previamente pesado.
Após nova pesagem para determinar o peso do granuloma, as amostras foram submetidas à agitação em vórtex por 30 segundos para total homogeneização. Após este período, foram colhidas alíquotas de 10µL e duas
19
destas amostras foram espalhadas, através de uma alça de vidro em L, em placas de Petri de 5cm de diâmetro contendo 5mL de SMA. Outras quatro foram diluídas 10 e 100 vezes, sendo também espalhadas em placas de Petri de 5cm de diâmetro contendo 5mL de SMA. Desta forma, o número de UFC/mL foi obtido dividindo-se o número total obtido nas placas por 10mL e por 0,010 mL (10 µL).
Todas as placas foram levadas à estufa a 37oC, durante 18 horas, para incubação. Decorrido este período, foram submetidas ao procedimento de contagem manual.
4.4.8 Forma de análise dos dados
Os resultados das contagens de colônias obtidos em cada grupo de estudo foram comparados através do teste de Kruskal-Wallis, com nível de significância de 5%, com auxílio do pacote estatístico BioEstat 5.0.
4.4.9 Considerações éticas
Este estudo foi encaminhado ao Comitê de Ética de Experimentação Animal (CEEA) do Instituto de Biologia/UNICAMP e aprovado em 31 de março de 2008, sob número 1457-1 (anexo 1).
20 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 110000 Time--> Abundance
TIC: A-tub-1.D\ data.ms
3.123 3.216 3.249 3.293 3.526 3.661 3.792 4.220 4.275 5.739 5.973 6.607 6.734 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 Time--> Abundance
TIC: A-sat-1.D\ data.ms
3.222 3.255 3.606 3.667 3.797 4.226 4.281 6.610 6.739 9.365 10.004 10.135 5 RESULTADOS
5.1 Perfil cromatográfico das soluções de alho
As Figuras 1 e 2 mostram o perfil cromatográfico das soluções aquosas de A. tuberosum e sativum, respectivamente. As Figuras 3 e 4 mostram, respectivamente, o perfil cromatográfico das soluções hidroalcoólicas de A. tuberosum e A. sativum. As Figuras 5 e 6 mostram as prováveis constituições e concentrações dos constituintes encontrados nas soluções aquosas e hidroalcoólicas, respectivamente.
Figura 1 – Cromatograma expandido do extrato aquoso de A. tuberosum
21 42.00 44.00 46.00 48.00 50.00 52.00 54.00 56.00 58.00 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 Time--> Abundance
TIC: Nira-EtOH-H2O.D\ data.ms
43.275 45.518 46.960 48.276 48.493 52.669 56.65656.930 57.797 58.648 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000 Time--> Abundance
TIC: Fruto-EtOH-H2O.D\ data.ms
3.254 5.403 5.485 9.049 11.189 13.083 14.113 14.755 17.758 20.94221.235 27.303 Figura 3 – Cromatograma expandido do extrato hidroalcoólico de A. tuberosum.
22
Allium Tempo de
retenção (min) Identificação provável % relativa
Tuberosum 3,22 2,5-dimetil-heptano 1,00 3,25 etilciclohexano 0,68 3,61 1-propeno-3,3'-tiobis (Anexo 2) 0,56 3,79 para-xileno 2,32 4,23 orto-xileno 0,80 4,28 nonano 0,95 6,61 1,2,4-trimetilbenzeno 0,80 6,74 decano 1,02 Sativum 3,21 2,5-dimetil-heptano 1,00 3,67 não identificado 1,33 3,77 para-xileno 2,32 4,26 nonano 0,95 6,61 1,2,4-trimetilbenzeno 0,80 9,36 não identificado 4,03 10,01 não identificado 1,54 10,14 não identificado 2,95 13,45 3-vinil-1,2-ditiociclohex-4-eno 21,68 14,50 3-vinil-1,2-ditiociclohex-5-eno 57,33 18,12 di-2-propenil-trissulfeto (Anexo 2) 3,01
Figura 5. Concentração dos prováveis constituintes das soluções aquosas analisadas.
Conforme apresentado na Figura 5, os compostos 2,5-dimetil-heptano, para-xileno, nonano e 1,2,4-trimetilbenzeno aparecem nas análises de ambos os extratos de alho, sendo que para o A. sativum, 36% dos compostos não foram identificados.
23
Allium
Tempo de retenção
(min)
Identificação provável % relativa
Tuberosum
5,73 trissulfeto de dimetila (Anexo 2) 0,45
5,90 não identificado 6,46
8,55 S-metil metanotiossulfonato (Anexo 2) 1,29
14,75 não identificado 1,11
43,28 éster etílico do ácido palmítico
(ou éster etílico do ácido hexadecanóico) 5,20
45,52 não identificado 0,58
46,96 fitol 48,43
48,27 éster etílico do ácido linoléico
(ou éster etílico do ácido 9,12-octadecadienóico) 3,74 48,50 éster etílico do ácido linolênico
(ou éster etílico do ácido 9,12,15-octadecatrienóico) 13,00 52,67 éster etílico do ácido 3-(4-metoxifenil)-2-propenóico 1,41
56,66 não identificado 0,54
56,93 não identificado 1,45
57,80 não identificado 15,47
58,65 não identificado 0,88
Figura 6. Concentração dos prováveis constituintes das soluções hidroalcoólicas analisadas.
24 Sativum 3,25 não identificado 1,21 5,40 não identificado 1,80 5,49 não identificado 1,18 9,05 não identificado 1,60 11,19 não identificado 5,57 13,08 3-vinil-1,2-ditiociclohexeno-4 (Anexo 2) 3,49 14,11 3-vinil-1,2-ditiociclohexeno-5 (Anexo 2) 13,90 14,76 não identificado 1,02
17,76 di-2-propenil trissulfeto (Anexo 2) 31,23
20,94 não identificado 1,70
21,24 não identificado 3,32
27,30 di-2-propenil tetrassulfeto (Anexo 2) 5,13
35,42 não identificado 1,43 35,94 não identificado 1,02 37,43 não identificado 1,97 39,95 não identificado 2,64 42,20 dibutilftalato 2,17 43,15 não identificado 1,72 45,02 não identificado 6,28
48,26 éster etílico do ácido linoléico
(ou éster etílico do ácido 9,12-octadecadienóico) 1,79
52,42 não identificado 1,73
56,66 não identificado 1,17
56,92 não identificado 1,46
57,73 não identificado 4,17
58,65 não identificado 1,33
Figura 6. Concentração dos prováveis constituintes das soluções hidroalcoólicas analisadas.
Conforme apresentado na Figura 6, o composto éster etílico do ácido linoléico (ou éster etílico do ácido 9,12-octadecadienóico) aparece na análise hidroalcoólica de ambos os extratos hidroalcólicos dos alhos. Considerando o A. tuberosum, 50% dos compostos não foram identificados e 76% daqueles do A.
25 0 6 12 24 6 12 24 6 12 24 6 12 24 6 12 24 6 12 24 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Controle Amox. tuberosum
400mg tuberosum 100mg sativum 400mg sativum 100mg
Pe
so
d
os
gran
ulo
m
as
(e
m
g
ram
as
)
sativum. As estruturas químicas dos compostos identificados nas análises podem ser observados no Anexo 2.
5.2 Testes de sensibilidade – Determinação da CIM e CBM
Os testes de sensibilidade CIM e CBM revelaram que a solução de A. tuberosum não mostrou capacidade de inibir ou matar a cepa de S. aureus em nenhuma das concentrações utilizadas. Entretanto, a solução de A. sativum inibiu a cepa (CIM) na concentração de 2mg/mL e produziu morte (CBM) na concentração de 4mg/mL.
5.3 Atividade antimicrobiana In vivo – Tecido granulomatoso
Figura 7. Peso dos granulomas (em gramas) de acordo com os grupos em estudo.
Barra central: mediana; caixa: 1º e 3º quartis; suíças: máximo e mínimo.
A análise dos dados (Kruskal-Wallis) revelou que houve diferenças estatisticamente significantes (p<0,05) entre os períodos considerando somente o grupo controle, sendo que o tempo “0” apresentou maior peso que os demais tempos, os quais não diferiram entre si. Não houve diferenças entre os tempos considerando os demais grupos separadamente.
26
A Tabela 1 mostra a comparação estatística entre pesos dos granulomas em função dos grupos considerando um mesmo tempo. De uma maneira geral, os valores de peso dos granulomas do grupo controle foram menores (p<0,05) do que aqueles promovidos pelos tratamentos. Houve diferenças estatisticamente significantes (Kruskal-Wallis, p>0,05) entre os grupos amoxicilina/A. sativum e o A. tuberosum (100 e 400mg/kg), sendo que os pesos deste último grupo foram maiores que os demais tratamentos a partir de 12 horas.
Tabela 1. Comparação entre os pesos dos granulomas em função dos grupos e tempos em estudo.
Tempo em horas (Mediana [1º e 3º quartis]) Grupos 0 6 12 24 Controle 0,38 [0,3 - 0,44] 0,23 a* [0,17 - 0,34] 0,19 a [0,16 - 0,26] 0,2 a [0,13 - 0,26] Amoxicilina - 0,39 b [0,32 - 0,5] 0,4 b [0,31 - 0,47] 0,36 b [0,32 - 0,46] A. tuberosum 400mg/kg - 0,54 b [0,48 - 0,76] 0,61 c [0,52 - 0,68] 0,61 c [0,52 - 0,70] A. tuberosum 100mg/kg - 0,51 b [0,42 - 0,56] 0,61 c [0,58 - 0,70] 0,63 c [0,56 - 0,71] A. sativum 400mg/kg - 0,41 b [0,33 – 0,47] 0,31 b [0,28 – 0,41] 0,36 b [0,29 – 0,43] A. sativum 100mg/kg - 0,36 b [0,30 – 0,64] 0,43 b [0,36 – 0,48] 0,30 b [0,27 – 0,37]
* - Letras diferentes significam diferenças estatisticamente significantes entre os grupos, considerando cada tempo separadamente.
27
0
6
12
24
1
×10
0 01
×10
0 11
×10
0 21
×10
0 31
×10
0 41
×10
0 51
×10
0 61
×10
0 7a
b
ab
c
Controle
Tempo (em horas)
log
(
U
FC
/m
L)
5.4 Quantificação da infecção nos grupos
As Figuras 8, 9, 10 e 11 mostram os valores da concentração das unidades formadoras de colônia (UFC/mL) de S. aureus ATCC 25923 obtidas para os grupos controle, amoxicilina, A. tuberosum (100 e 400mg/kg) e A. sativum (100 e 400mg/kg), respectivamente. Foi possível observar que houve diminuição significativa (Kruskal-Wallis, p<0,05) da quantidade de UFC/mL somente no período de 24 horas para o grupo controle. A análise dos dados revelou que a amoxicilina, bem como os extratos dos alhos causaram redução significativa da concentração de UFC/mL entre os períodos de 12 e 24 horas.
Figuras 8. Mediana (± desvio interquartílico) da contaminação dos granulomas (em UFC/mL) para o grupo controle.
28
Amoxicilina
6
12
24
1×100 0 1×100 1 1×100 2 1×100 3 1×100 4 1×100 5 1×100 6 1×100 7b
b
a
Tempo (em horas)
log (
U
FC/m
L)
6
12
24
6
12
24
1×100 0 1×100 1 1×100 2 1×100 3 1×100 4 1×100 5 1×100 6 1×100 7 A. tuberosum 100mg/kg A. tuberosum 400mg/kga
b
a
a
b
a
Tempo (em horas)
lo
g (
U
FC/m
L)
Figura 9. Mediana (± desvio interquartílico) da contaminação dos granulomas (em UFC/mL) para o grupo amoxicilina.
Letras diferentes significam diferenças estatisticamente significantes, entre os períodos de tempo.
Figura 10. Mediana (± desvio interquartílico) da contaminação dos granulomas (em UFC/mL) para os grupos A. tuberosum 100 e 400mg/kg.
29
6
12
24
6
12
24
1×100 0 1×100 1 1×100 2 1×100 3 1×100 4 1×100 5 1×100 6 1×100 7 A. sativum 100mg/kg A. sativum 400mg/kgb
b
a
a
b
a
Tempo (horas)
log (
U
FC/
m
L)
Figura 11. Mediana (± desvio interquartílico) da contaminação dos granulomas (em UFC/mL) para os grupos A. sativum 100 e 400mg/kg.
Letras diferentes significam diferenças estatisticamente significantes, entre os períodos de tempo.
A Tabela 2 mostra a comparação estatística entre os grupos considerando cada tempo separadamente.
A análise dos dados (Kruskal-Wallis) revelou que houve diferenças estatisticamente significantes (p<0,05) entre o grupo controle e os demais (exceto com o A. tuberosum 400mg/kg no período 12 horas e A. sativum 100mg/kg no período 24 horas), indicando que, mesmo após 6 horas da administração dos tratamentos, o efeito destes já era visível. Além disso, foi possível observar que, à exceção do A. sativum 100mg/kg e do grupo controle, os demais grupos mostraram-se tão eficazes quanto à amoxicilina no período de 24 horas. Embora com menor concentração em praticamente todos os períodos de tempo em relação ao grupo controle, os tratamentos também ocasionaram redução mais significativa
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somente no período de 24 horas. À exceção foi a amoxicilina que apresentou diminuição significativa da concentração de UFC já no período de 12 horas.
Tabela 2. Comparação entre os grupos em estudo, considerando cada tempo separadamente. Tempo em horas Mediana [1º e 3º quartis] Grupos 0 6 12 24 Controle 5,3.105 [1,1.105 – 9,2.105] A* 1,5.106 [7,9.105 – 2,7.106] a** B 2,2.105 [1,1.105 – 1,6.106] a AB 1,0.104 [2,4.103 – 3,5.104] a C Amoxicilina 7,8.103 [2,0.103 – 1,1.104] b A 4,0.102 [0 – 4,0.103] b B 8,0.102 [0 – 3,9.103] b B A. tuberosum 100mg/kg 4,6.104 [8,5.103 – 1,1.105] bc A 1,3.104 [1,0.104 – 1,5.104] c A 3,4.103 [1,4.103 – 5,8.103] b B A. tuberosum 400mg/kg 1,5.105 [4,0.104 – 2,3.105] c A 2,7.105 [4,5.104 – 5,5.105] a A 5,5.103 [0 – 9,3.103] b B A. sativum 100mg/kg 1,8.105 [1,2.105 – 2,9.105] c A 2,9.104 [1,9.104 – 5,4.104] c B 2,3.104 [9,0.103 – 5,7.104] a B A. sativum 400mg/kg 9,5.103 [5,9.103 – 1,8.104] b A 3,4.103 [2,7.103 – 5,9.103] b A 1,5.102 [1,0.103 – 2,3.103] b B
* - Letras maiúsculas diferentes significam diferenças estatisticamente significantes entre os tempos, considerando cada grupo separadamente.
** - Letras minúsculas diferentes significam diferenças estatisticamente significantes entre os grupos, considerando cada tempo separadamente.
31 6 DISCUSSÃO
A composição química mostrou-se diferente nos dois extratos de alho. A constituição do extrato de A. sativum foi comparável àquela descrita previamente por Lemar et al. (2002). Embora não tenham sido observadas quantidades significativas dos principais constituintes do A. sativum, muitos dos compostos isolados se assemelham quimicamente a tais constituintes. Entre os principais constituintes do A. tuberosum estão os tiossulfinatos (Seo et al., 2001), além de várias saponinas esteroidais (Zou et al., 2001), sendo que compostos destes grupos também foram isolados no presente estudo.
A composição do A. tuberosum descrita por Taminato (2007) mostrou que a composição do extrato bruto deste vegetal apresenta compostos similares aos encontrados na análise cromatográfica realizada no presente estudo, como o trissulfeto de dimetila e o S-metil metanotiossulfonato (ANEXO 2).
De acordo com Ruddock et al. (2005), discrepâncias na composição dos extratos, na proporção de aliina/alicina podem ocorrer de acordo com a padronização durante a preparação e controle de qualidade destes extratos e interferir sobre a atividade antimicrobiana. No presente estudo, a metodologia de extração para o extrato de A. sativum foi a mesma utilizada em outros ensaios (Elnima et al., 1983; Shashikanth et al., 1984; Groppo et al., 2007).
A opção de não utilizar os compostos isolados dos alhos é justificada pelas observações de Fujisawa et al. (2009), os quais mostraram que o extrato bruto do A. sativum mostrou atividade antimicrobiana muito mais potente que o seu principal constituinte antimicrobiano isolado, a alicina (alil-2-propenotiossulfinato). Além disso, Gomaa & Hashish (2003) mostraram que concentrações progressivas (entre 100 e 1000µg/mL) do extrato bruto de A. sativum foram capazes de inibir vários microrganismos de forma potente.
A CIM obtida para a solução de A. sativum, de 2mg/mL, foi menor que aquela encontrada por Tessema et al. (2006) que obtiveram 11,25mg/mL do extrato bruto contra a mesma cepa utilizada no presente estudo (S. aureus ATTC
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25923). Esta diferença ocorreu provavelmente devido à diferença entre as metodologias empregadas, sendo que Tessema et al. (2006) utilizaram a técnica de diluição em ágar para obtenção da CIM.
As concentrações inibitórias também podem variar de acordo com o microrganismo testado. Concentrações inibitórias mais baixas também foram relatadas para outros microrganismos, tais como a C. albicans (Taminato, 2007). Este autor observou uma CIM de 250 μg/mL de extrato bruto e 50 a 200 μg/mL para as frações mais ativas de A. tuberosum contra este fungo.
Esponjas de policlorovinil (PVC) ou poliuretana vem sendo utilizadas para desencadear tecido granulomatoso no dorso de ratos, visando o estudo de fármacos anti-inflamatórios e antimicrobianos (Baglie et al., 2000; Groppo et al.,
2004), sendo que a morfologia e sequência de sua formação já foram estudadas previamente (Mattos-Filho, 1990).
O período de 14 dias de maturação do tecido granulomatoso foi determinado pelos resultados encontrados por Groppo (1996), que não encontrou diferenças estatisticamente significantes observando as concentrações de amoxicilina, em tecidos granulomatosos induzidos em ratos, em períodos de 7, 14, 21 e 28 dias de evolução da lesão.
Existem evidências de que a maior parte das infecções resulta da aderência das bactérias a uma superfície, sendo que a primeira linha de defesa do organismo contra a invasão bacteriana também requer uma superfície para exercer sua atividade (Lorian, 1989). Assim, o presente trabalho optou por induzir uma infecção estafilócica no tecido granulomatoso, proporcionando uma superfície adequada aos microrganismos. A reação a estes corpos estranhos é um modelo válido para avaliar o comportamento farmacocinético de antimicrobianos em conjunto com os mecanismos de defesa orgânica (Zak & O'Reilly, 1991). O modelo utilizado no presente estudo permitiu verificar o efeito de um antimicrobiano sobre uma infecção com origem e dimensão conhecidas, mimetizando uma condição real de infecção.
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Como apontado por Amato-Neto (1985) e Montgomery (1991), um dos principais aspectos necessários ao sucesso da terapia antimicrobiana é o conhecimento da sensibilidade do agente etiológico. O microrganismo utilizado teve sua sensibilidade à amoxicilina comprovada pela literatura (Phillips et al.,
1991; Koneman, 1994; Groppo et al., 2000; Baglie et al., 2000). Antes de ser utilizada neste estudo, esta cepa teve sua pureza e sua sensibilidade à amoxicilina novamente avaliadas, confirmando os resultados obtidos anteriores.
Os pesos teciduais obtidos nos diferentes grupos em estudo mostraram variação considerável, sendo que nos grupos que mostraram atividade antimicrobiana significativa, houve tendência de o peso tecidual não ser diferente daqueles valores observados no respectivo controle. Assim, a lise significativa nas células bacterianas observada nos grupos tratados com a amoxicilina e pelo A. tuberosum 400mg/kg não se traduziu em menor peso tecidual. Este fenômeno poderia ser explicado pelo fato dos antimicrobianos não conseguirem erradicar a infecção sem a ajuda das células da inflamação humoral e tecidual (Groppo et al., 2006). Assim, embora os tratamentos tenham causado redução significativa no número de microrganismos viáveis, a remoção das células bacterianas e teciduais mortas depende exclusivamente das células inflamatórias.
A amoxicilina e os extratos de alho, que foram preparados extemporaneamente para cada grupo, mostraram redução do número de bactérias adicional ao sistema imunológico dos animais, sendo que o alho foi equiparável à amoxicilina no período de 24 horas. Assim, embora não tenha mostrado atividade antimicrobiana in vitro, o A. tuberosum mostrou atividade antimicrobiana in vivo.
A determinação in vitro da atividade de inibição e da inativação bacterianas de três tipos de A. tuberosum, originários da região metropolitana de Porto Alegre, mostrou atividade antibacteriana seletiva sobre inóculos gram-negativos, os quais atingiram inibição e inativação máximas e permanentes para
Salmonella enteritidis (ATCC 11076) após 48 horas de exposição e para Escherichia coli (ATCC 11229) após 72 horas de exposição ao extrato etanólico a 50% dos
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alhos. Entretanto, as bactérias gram-positivas, S. aureus (ATCC 25923) e
Enterococcus faecalis (ATCC 19433) apresentaram resistência total frente aos mesmos extratos (Araújo et al., 2009). Estes dados corroboram com os achados do presente estudo, pois de forma similar não houve evidência da atividade in vitro
do A. tuberosum contra o S. aureus.
Além do estudo de Araújo et al. (2009), existem poucos dados na literatura indexada internacional sobre a atividade antimicrobiana do A. tuberosum, embora sua atividade antitumoral (inibição da proliferação celular e indução da apoptose), particularmente de seus tiossulfinatos, já tenha sido demonstrada em células prostáticas (Kim et al., 2008) e em células de câncer de colón (Lee et al.,
2009). Mau et al. (2001) demonstraram que o suco prensado do nirá apresentou inibição contra uma ampla faixa de microrganismos positivos e Gram-negativos, assim como para C. albicans.
O A. sativum, por sua vez, já é um conhecido agente antiestafilocócico. O efeito inibitório da dialil-sulfida e da dialil-dissulfida (obtidos do extrato bruto do
A. sativum) na infecção induzida por MRSA em ratos diabéticos (Tsao et al., 2007) e em camundongos (Tsao et al., 2003) já foi demonstrado. Estes estudos, embora tenham se valido de metodologias diferentes de indução de infecção em animais daqueles empregados neste estudo, revelaram achados muito similares.
É notável o fato de que nem a amoxicilina foi capaz de reduzir totalmente o número de microrganismos, erradicando a infecção, resultado similar ao de Groppo et al. (2004). Este fato ocorreu, provavelmente, porque em áreas onde a infecção está contida pelos mecanismos de defesa do organismo, as bactérias se multiplicam em velocidade muito lenta, o que pode dificultar a ação das penicilinas que necessitam da divisão celular para atuar (Groppo et al., 2006). O alho na sua maior concentração também teve comportamento semelhante.
35 7 CONCLUSÃO
Concluímos que:
1. O resultado da análise dos extratos revelou compostos orgânicos e organossulfurados, os quais são, provavelmente, resultantes da degradação da alicina;
2. A análise da atividade antimicrobiana (CIM e CBM) in vitro para o A. tuberosum, mostrou que este não apresentou dentro das concentrações estudadas a capacidade de inibir ou matar a cepa microbiana;
3. O A. Sativum mostrou atividade antimicrobiana in vitro nos testes de sensibilidade, CIM e CBM contra a cepa estudada;
4. Os extratos de alho em suas diferentes concentrações foram capazes de diminuir, de maneira eficaz e comparável à amoxicilina, a infecção estafilocócica no modelo utilizado neste estudo.
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