Caracterização química e morfológica de tecidos moles preservados em ictiólitos da Formação Santana (Bacia do Araripe) : em busca de fósseis cardíacos

LARA MALDANIS CERQUEIRA PERES

“CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E MORFOLÓGICA DE TECIDOS MOLES PRESERVADOS

EM ICTIÓLITOS DA FORMAÇÃO SANTANA (BACIA DO ARARIPE): EM BUSCA DE

FÓSSEIS CARDÍACOS”

CAMPINAS

2015

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Médicas

LARA MALDANIS CERQUEIRA PERES

“

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E MORFOLÓGICA DE TECIDOS

MO-LES PRESERVADOS EM ICTIÓLITOS DA FORMAÇÃO SANTANA (BACIA DO

ARARI-PE): EM BUSCA DE FÓSSEIS CARDÍACOS.

”

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como par-te dos requisitos exigidos para a obpar-tenção de título de Mes-tra em Farmacologia.

ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ XAVIER NETO

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LARA MALDANIS CERQUEIRA PERES E ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ XAVIER NETO.

___________________________

CAMPINAS 2015

vii

RESUMO

No contexto do estudo da evolução do coração dos vertebrados, a análise do registro fóssil se mostra infrutífera, devido à ausência de registros incontestáveis de estruturas cardíacas fossilizadas. En-quanto os cordados invertebrados apresentam rudimentares vasos contráteis, os vertebrados viventes já apresentam um coração com câmaras altamente especializado, existindo uma lacuna no entendimento evolutivo dessa transição morfológica. Esse trabalho objetiva a busca e a caracterização química e morfo-lógica de corações fósseis de vertebrados, através de técnicas físicas espectroscópicas e de imagem. Para tanto, analisamos fósseis do extinto peixe teleósteo basal Rhacolepis buccalis Agassiz 1841, da Formação Santana, Bacia do Araripe, Nordeste do Brasil, devido à sua já documentada preservação de tecidos moles. Realizamos análises destrutivas por meio de digestão com ácido, e não destrutivas por técnicas de Tomo-grafia Computadorizada de Absorção (CT), e também por TomoTomo-grafia Síncrotron de Contraste de Fase (SR-CT), as quais nos forneceram informações sobre a anatomia e morfologia das estruturas internas preservadas nos fósseis. As análises químicas foram realizadas através da espectroscopia Raman, Micro-fluorescência de Raios-X (-XRF), e espectroscopia de absorção de raios-x (XANES). As análises morfológi-cas, em especial por tomografia SR-CT, indicaram a presença, no espécime CNPEM-LNB 3P, de uma estru-tura tridimensional, composta por quatro câmaras dispostas em “S”, identificadas como câmaras cardía-cas, sendo o cone arterioso, ventrículo, átrio e seio venoso. Há também estruturas semelhantes a válvulas conais e vasos identificados como ductos de Cuvier. Essa estrutura possui uma morfologia compatível com a do coração dos peixes e se localiza medialmente à cintura peitoral e posterior às brânquias, posição onde se encontra o coração de todos os vertebrados. As análises químicas sugerem presença de matéria orgâni-ca preservada, obtidas pela espectroscopia Raman, e também forneceram informações sobre a composi-ção química e tafonômica dos espécimes. Nessa estrutura cardíaca fóssil encontrada observamos, através da -XRF, indícios de preservação de tecidos moles por fosfatização e presença de ferro não associado a enxofre. A natureza desse ferro foi analisada por XANES, que indicou uma origem não pirítica, diferente do ferro de sua matriz, com forte influência de compostos com ferro III, semelhante aos espectros de hemo-globina, hematita, magnetita e goetita. Esses resultados fortalecem e corroboram nossa hipótese, e, asso-ciados aos dados morfológicos, são grandes indicadores da descoberta de uma estrutura cardíaca fossiliza-da em um fóssil de R. buccalis. A descrição de um fóssil cardíaco abre perspectivas para um ainfossiliza-da inexplo-rado campo de estudo da evolução do coração em vertebinexplo-rados, através da aplicação de técnicas de ima-gem e espectroscopia para a análise do registro fóssil.

ix

ABSTRACT

In the context of cardiac evolution, the fossil record does not provide uncontestable evidence of a cardiac preservation. While invertebrate chordates display rudimentary contractile veins, extant verte-brates already display a chambered heart. The present work aims to characterize fossil cardiac structures chemical and morphologically through spectroscopic and imaging techniques. We analyzed two specimens of the extinct primitive teleostean fish Rhacolepis buccalis Agassiz 1841, from the Cretaceous Santana Formation of North-East Brazil, because of its known soft-tissues preservation. We performed destructive acid digestion analysis and non-destructive analyses with Absorption Computerized Tomography (CT) and with Phase-Contrast Synchrotron Tomography (SR-CT), which provided morphological and anatomical information about the fossils preserved structures. Chemical analyses were performed by Raman spectros-copy, X-Ray Microfluorescence (-XRF) and x-ray absorption spectroscopy (XANES). Morphological anal-yses, particularly with SR-CT, showed, in the specimen CNPEM-LNB 3P, one tridimensional structure, with four chambers displayed in a “S” shape, identified as cardiac chambers, which are conus arteriosus, ventri-cle, atrium and sinus venosus. There are also structures similar to conal valves and vessels identified as Cuvier ducts. This structure has the same morphology as fishes hearts and lies between the pectoral girdle and behind the gills, the position of all vertebrates hearts. Chemical analyses suggested the presence of organic matter preserved, obtained with Raman spectroscopy, and gave us information about chemical and tafonomical composition of the specimens. In the identified cardiac structure, we observed, through

-XRF, evidence of soft-tissues preservation by phosphatization and the presence of non-sulfur associated iron. The nature of this iron was analyzed with XANES, which showed a non-pyritic origin, different from the matrix iron, with strong contribution of iron III compounds, as well as does hemoglobin, hematite, magnetite and goethite spectra. These results strongly support our hypothesis, and, associated with mor-phological data are great indicators of the finding of a fossilized cardiac structure in R. buccalis. The de-scription of a fossil heart shows that it is possible to scrutinize the fossil record with imaging and spectro-scopic techniques for unexplored evidences of vertebrates cardiac evolution.

xi

Sumário

Agradecimentos ... xv

Lista de Figuras ...xvii

Lista de Abreviaturas e Siglas ... xxi

1

Introdução ...

1

1.1 Contexto ... 1

1.2 Objetivos ... 1

1.3 Evolução cardíaca ... 2

1.4 O coração dos cordados ... 4

1.5 O coração em peixes... 5

2

Estudo paleontológico ...

7

2.1 Modelo de estudo ... 7

2.2 A Bacia do Araripe ... 8

2.3 Formação Santana ... 9

10

11

11

2.4 A preservação de tecidos moles ... 13

4

Descrição das Técnicas Experimentais ...

15

4.1 Tratamento com ácido acético ... 16

4.2 Técnicas de Imagem ... 16

4.2.1 Tomografia Computadorizada ...

16

4.2.2 Microtomografia Síncrotron de Contraste de Fase ...

17

4.3 Análises químicas espectroscópicas ... 18

4.3.1 Espectroscopia Raman ...

19

4.3.2 Microfluorescência de Raios-X ...

20

4.3.3 Espectroscopia XANES ...

21

xii

5.1 Preparação de fósseis com ácido acético ... 23

5.2 Tomografia Computadorizada ... 24

5.3 Microtomografia Síncrotron de Contraste de Fase ... 24

5.4 Segmentação e modelagem tridimensional ... 25

5.5 Secção transversal de CNPEM-LNB 23P ... 26

5.6 Espectroscopia Raman ... 26

5.7 Microfluorescência de Raios-X ... 27

5.8 XANES ... 28

6

Resultados e Discussão ...

29

6.1 Tomografia Computadorizada ... 30

6.2 Microtomografia Síncrotron de Contraste de Fase ... 32

6.3 Secção de CNPEM-LNB 23P ... 38

6.4 Espectroscopia Raman ... 39

6.5 Fluorescência de Raios-X ... 40

6.6 XANES ... 46

7 Conclusões ...

51

8

Referências bibliográficas ...

55

9

Anexos ...

62

xiii

Sem saber que era impossível, foi lá e fez.

xv

Agradecimentos

Agradeço à CAPES pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento desse trabalho.

Ao meu orientador, José Xavier Neto, pela oportunidade de participar desse projeto, e por todo o aprendi-zado proporcionado, contribuindo de forma inestimável em minha formação.

Aos meus colaboradores e também amigos do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, doutores Carlos Alberto Perez, Frederico Alves Lima, Douglas Galante, Fábio Rodrigues e Raul de Oliveira Freitas, por terem contribuído com todo seus conhecimentos e experiência, enriquecendo imensamente e permi-tindo a exploração de novos rumos no projeto. Obrigada também por todos os ensinamentos e paci-ência ao me ajudarem a entender cada passo dado em uma área totalmente nova para mim.

Ao Prof. Dr. Ronei de Jesus Poppi e Mariana Ramos de Almeida, do Laboratório de Quimiometria em Quí-mica Analítica do IQ-UNICAMP, pela contribuição nas medidas de RAMAN.

Ao Dr. Carlos Eduardo Rochitte e Júlio Soares do InCor pela disponibilização e realização das medidas de tomografia computadorizada.

Ao Dr. Vincent Fernandez e Dr. Paul Tafforeau do European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), pelas incríveis tomografias realizadas em nossos fósseis.

Ao Prof. Dr. Ismar de Souza Caralho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela contribuição nas áreas de paleontologia e geologia.

Ao Departamento Nacional de Produção Mineral do Crato, Ceará (DNPM) pelos fósseis disponibilizados para nosso estudo.

Ao Artur Andrade, chefe do escritório regional do 10º Distrito do (DNPM), e Idalécio Freitas, gerente do Geopark Araripe, pelo auxílio na coleta dos espécimes e nas primeiras etapas do trabalho.

A todos os alunos e funcionários (e também agregados) que passaram nesses anos pelo LMG, em especial, Hozana, Murilo, Ângela, Fabio Amaral, Fábio Henrique, Bárbara, Giulia, Luana, Carol e Andrea. Além de serem as pessoas que alegram meu dia-a-dia, são também meus co-orientadores, professores e amigos. Obrigada por tudo.

Gostaria de agradecer a toda a minha família, a minhas irmãs e meus pais, pessoas que me ajudaram a chegar até aqui. Meu pai, que desde pequena me ensinou a ter gosto pelo conhecimento e curiosi-dade pela ciência, me ensinando e lendo para mim, até que eu estivesse tão interessada que não conseguisse mais largar os livros. Minha mãe, que me ensinou o que era um “biólogo”, e me deu a revista sobre tubarões, que eu carregava orgulhosamente para todos os lados, dizendo que quando crescesse, iria ser bióloga. E hoje aqui estou, graças a vocês. Obrigada.

Gostaria também de agradecer à minha família de Campinas, Zé e Elisa, pelo imenso carinho e suporte dados, contribuindo para que meus últimos anos aqui fossem os mais felizes.

xvi E por fim, quero agradecer àquele que segurou todas as pontas em nossa vida, dando todo o suporte que eu pudesse precisar para que me dedicasse ao desenvolvimento desse trabalho. Àquele que está sempre do meu lado, meu companheiro, amigo e amor, Fábio Súnica.

xvii

Lista de Figuras

FIGURA 1.TIPOS DE BOMBAS CARDÍACAS ENCONTRADOS NOS PRINCIPAIS GRUPOS DE ANIMAIS.MODIFICADO DE (XAVIER-NETO ET AL., 2010). ... 3 FIGURA 2. ESQUEMA DOS PRINCIPAIS TIPOS DE BOMBAS CARDÍACAS ENCONTRADOS NOS CORDADOS.MODIFICADO DE (SCHUBERT, ET AL.

2006) ... 4 FIGURA 3.ESQUEMA SIMPLIFICADO DO CORAÇÃO DE UM PEIXE. CA: CONE ARTERIOSO, A: ÁTRIO, V: VENTRÍCULO, SV: SEIO VENOSO. ... 5 FIGURA 4.MAPA DA LOCALIZAÇÃO DA BACIA DO ARARIPE.MODIFICADO DE MAISEY (1991) ... ERRO!INDICADOR NÃO DEFINIDO. FIGURA 5.DIAGRAMA CRONOESTRATIGRÁFICO SIMPLIFICADO DA BACIA DO ARARIPE, DE ACORDO COM A CLASSIFICAÇÃO DE (PONTE,1990).

MODIFICADO DE (FREITAS,2010) ... 9

FIGURA 6.COLUNA ESTRATIGRÁFICA DA BACIA DO ARARIPE COM DESTAQUE PARA O MEMBRO ROMUALDO, MODIFICADO DE (SARAIVA,

2008). ... 13 FIGURA 7.ESQUEMA DE UM ESPECTRO DE ABSORÇÃO EM FUNÇÃO DA ENERGIA, O OBTIDO POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO DE RAIOS-X.

MODIFICADO DE (RODRIGUES,2010). ... 21 FIGURA 8.ESPÉCIME CNPEM-LNB3P ANTES E DEPOIS DO TRATAMENTO COM ÁCIDO ACÉTICO. ... 22 FIGURA 9.ESPÉCIME DE RHACOLEPIS BUCCALIS CNPEM-LNB23P. ... 23 FIGURA 10.REGIÃO ONDE O ESPÉCIME CNPEM-LNB23P FOI SECCIONADO AFIM DE EXPOR AS ESTRUTURAS PARA ANÁLISES QUÍMICAS.26 FIGURA 11.REGIÕES DO CORTE DE CNPEM-LNB23P ONDE FORAM REALIZADAS AS MEDIDAS DE XANES ... 29 FIGURA 12.(A)REGIÃO ANTERO-VENTRAL DE CNPEM-LNB3P APÓS DIGESTÕES E (B) DETALHE DA ESTRUTURA ENCONTRADA COM

LOCALIZAÇÃO E MORFOLOGIA SEMELHANTES ÀS DE UM CORAÇÃO, SENDO CA, CONE ARTERIOSO; A, ÁTRIO; V, VENTRÍCULO; SV, SEIO VENOSO; DC, DUCTOS DE CUVIER. ... 29 FIGURA 13.VISÃO DORSAL DAS ESTRUTURAS SEGMENTADAS NA CT DE CNPEM-LNB23P.É POSSÍVEL OBSERVAR O ROMPIMENTO DA

COLUNA VERTEBRAL, QUE PODERIA ESTAR ASSOCIADO AO DESLOCAMENTO DA ESTRUTURA CASO ELA SE TRATASSE DE UM CORAÇÃO.30 FIGURA 14.VISÃO VENTRAL DE ALGUMAS ESTRUTURAS SEGMENTADAS EM CNPEM-LNB23P.NÃO É POSSÍVEL IDENTIFICAR UMA

CONTINUIDADE ENTRE O TRATO INTESTINAL (ROSA) E A ESTRUTURA DE INTERESSE (VERMELHO). ... 31

FIGURA 15.RADIOGRAFIA DE CNPEM-LNB23P COM DETALHE DA ESTRUTURA EM FORMATO DE “S”, SEMELHANTE AO LÚMEN DE UM CORAÇÃO DE PEIXES. ... 31

FIGURA 16.ESTRUTURAS SEGMENTADAS NA CT DE CNPEM-LNB3P.É POSSÍVEL SE OBSERVAR A LOCALIZAÇÃO ANATÔMICA DO PUTATIVO CORAÇÃO, POSTERIOR ÀS BRÂNQUIAS E MEDIALMENTE À CINTURA PEITORAL (SÓ É POSSÍVEL VER A PORÇÃO ESQUERDA).A COLUNA VERTEBRAL APARECE CURVA E FRATURADA.A REGIÃO EM ROSA CORRESPONDE AO ESPAÇO INTERPRETADO COMO LÚMEN. ... 32 FIGURA 17.(A)DETALHE DO PUTATIVO CORAÇÃO SEGMENTADO COM A IDENTIFICAÇÃO DAS CÂMARAS CONE ARTERIOSO (CA), VENTRÍCULO

(V), ÁTRIO (A), E SEIO VENOSO (SV).A REGIÃO EM ROSA CORRESPONDE AO ESPAÇO INTERPRETADO COMO LÚMEN.(B)ESQUEMA DO CORAÇÃO DE UM PEIXE TELEÓSTEO, COM A IDENTIFICAÇÃO DAS CÂMARAS CARDÍACAS PARA COMPARAÇÃO (BULBO ARTERIOSO = B).32 FIGURA 18.(A)RADIOGRAFIA DE CNPEM-LNB23P.OBSERVA-SE UMA ÓTIMA RESOLUÇÃO E CONTRASTE, SENDO POSSÍVEL OBSERVAR EM DETALHES AS BRÂNQUIAS, AS TRABÉCULAS ÓSSEAS NO INTERIOR DAS VÉRTEBRAS E DIVERSAS OUTRAS ESTRUTURAS PRESERVADAS NO INTERIOR DO PEIXE. ... 33 FIGURA 19.A)DETALHE DA RADIOGRAFIA SÍNCROTRON ONDE É POSSÍVEL SE OBSERVAR OS CONTORNOS DE UM CRUSTÁCEO PRESERVADO.B)

ESPÉCIE FÓSSIL DE BEURLENIA ARARIPENSIS, CAMARÃO CONHECIDO DA DIETA DE RHACOLEPIS BUCCALIS, PARA FINS COMPARATIVOS COM O ENCONTRADO NA TOMOGRAFIA. ... 34 FIGURA 20.(A)DETALHE DA SR-CT INDICANDO A ESTRUTURA VISTA NA CT E IDENTIFICADA COMO POSSÍVEL CORAÇÃO.É POSSÍVEL

OBSERVAR QUE AS VÉRTEBRAS ESTÃO EM SEQUÊNCIA E OS OSSOS DA CINTURA PEITORAL ESTÃO EM SUA LOCALIZAÇÃO ANATÔMICA ESPERADA, OS QUAIS INDICAM NÃO TER HAVIDO ARRASTE DAS ESTRUTURAS INTERNAS EM DECORRÊNCIA DE PROCESSOS TAFONÔMICOS. (B)SEGMENTAÇÃO DESSA ESTRUTURA, MOSTRANDO UMA TEXTURA GRANULOSA, APARENTEMENTE EM FORMATO DE “S”. ... 34

xviii

FIGURA 21.DETALHE DA RADIOGRAFIA DE CNPEM-LNB3P COM FOCO NA ESTRUTURA POSSIVELMENTE CARDÍACA.É POSSÍVEL NOTAR SUA LOCALIZAÇÃO IMEDIATAMENTE POSTERIOR ÀS BRÂNQUIAS, E O CONTRASTE EM SEU INTERIOR INDICANDO PRESERVAÇÃO DE ESTRUTURAS INTERNAS. ... 35 FIGURA 22.RENDERIZAÇÃO DA SUPERFÍCIE DA ESTRUTURA DE INTERESSE DE CNPEM-LNB3P.OBSERVA-SE DELIMITAÇÕES DE ESTRUTURAS

QUE SÃO ASSOCIADAS A PROVÁVEIS CONE ARTERIOSO (CA), VENTRÍCULO (VE) ÁTRIO (AT), SEIO VENOSO (SV) E TAMBÉM ESTRUTURAS EM FORMATO SEMELHANTE A VASOS, QUE PODEM CORRESPONDER AOS DUCTOS DE CUVIER (DC) CIRCUNDADOS EM PONTILHADO.35

FIGURA 23.SEGMENTAÇÃO DO PUTATIVO CORAÇÃO DE CNPEM-LNB3P, E SUA LOCALIZAÇÃO NA RADIOGRAFIA OBTIDA (FIGURA 21).

OBSERVA-SE A PAREDE DO CONE ARTERIOSO(LARANJA), AS APARENTES VÁLVULAS (ROSA) E O LÚMEN DO VENTRÍCULO E ÁTRIO

(VERMELHO), EM UMA TEXTURA GRANULAR QUE SUGERE UM COÁGULO SANGUÍNEO. ... 36 FIGURA 24.PUTATIVO CORAÇÃO VISTO EM PLANO INCLINADO, MOSTRANDO A PROFUNDIDADE DO LÚMEN (VERMELHO) E A CONFORMAÇÃO

TRIDIMENSIONAL CÔNCAVA DA ESTRUTURA IDENTIFICADA COMO CONE ARTERIOSO (LARANJA)... 36 FIGURA 25.PUTATIVO CORAÇÃO DE CNPEM-LNB3P SEGMENTADO, VISTO EM UM PLANO ROSTRAL (A) E PLANO CAUDAL (B) INCLINADOS

PARA MOSTRAR A TRIDIMENSIONALIDADE DA ESTRUTURA.EM VERMELHO O LÚMEN DOS POSSÍVEIS VENTRÍCULO E ÁTRIO, EM LARANJA A PAREDE DO CONE ARTERISO E EM ROSA A APARENTE VÁLVULA DO CONE ARTERIOSO. ... 37 FIGURA 26.DETALHE DAS RADIOGRAFIAS MOSTRANDO A CONFORMAÇÃO DAS APARENTES VÁLVULAS CONAIS (DEMARCADAS EM PONTILHADO)

E SUA LOCALIZAÇÃO. ... 37 FIGURA 27.PORÇÃO ANTERIOR DO CORTE OBTIDO. ... 38 FIGURA 28.A)DETALHE DA ESTRUTURA ANALISADA NO CNPEM-LNB23P, E B) TRATO INTESTINAL OBSERVADO EM OUTRO ESPÉCIME APÓS

DIGESTÕES COM ÁCIDO.O FORMATO SINUSÓIDE, A COR E A TEXTURA GRANULOSA SUGEREM SE TRATAR DO MESMO TIPO DE ESTRUTURA. ... 39 FIGURA 29.ESPECTROS RAMAN OBTIDOS PARA O CNPEM-LNB23P(A) COM PICOS EM 1190, INDICADOR DE ESTRUTURAS TIPO POLIENO, E

1250 E 1550 CM-1.REGIÕES DE AMIDA I E AMIDA II.O ESPÉCIME CNPEM-LNB3P(B), TAMBÉM APRESENTA PICOS NA REGIÃO DE

AMIDA I E III(1250,1650CM-1), REGIÕES INDICATIVAS DA PRESENÇA DE VESTÍGIOS PROTEICOS.ESSES RESULTADOS INDICAM QUE A ESTRUTURAS ANALISADAS NÃO SE TRATAM DE ARTEFATOS DIAGENÉTICOS, TENDO ORIGEM BIOGÊNICA. ... 40 FIGURA 30.CORTE SAGITAL DO ZEBRAFISH E ESTRUTURAS OBSERVADAS. ... 41 FIGURA 31.MAPEAMENTO DO ZEBRAFISH EM CORTE SAGITAL.OBSERVA-SE O FERRO (VERMELHO), EM MAIORES CONCENTRAÇÕES NA REGIÃO

DO CORAÇÃO E INTESTINO.O CÁLCIO (AZUL) É VISTO NOS OSSOS E O ZINCO (VERDE) É ENCONTRADO EM GRANDES CONCENTRAÇÕES NO ESQUELETO, ESCAMAS E INTESTINO. ... 41 FIGURA 32.CORTE TRANSVERSAL DO ZEBRAFISH E ESTRUTURAS OBSERVADAS. ... 42 FIGURA 33.MAPEAMENTO DO ZEBRAFISH EM CORTE TRANSVERSAL.OBSERVA-SE O FERRO (VERMELHO), EM MAIORES CONCENTRAÇÕES NA

REGIÃO DO CORAÇÃO, ALÉM DO CÁLCIO (AZUL) NAS NADADEIRAS E ESQUELETO E ZINCO (VERDE) NAS ESCAMAS E ESQUELETO, E A SOBREPOSIÇÃO DOS ELEMENTOS. ... 42 FIGURA 34.MAPEAMENTO DE FERRO (VERMELHO), ZINCO (VERDE) E MANGANÊS (AZUL) DO ESPÉCIME CNPEM-LNB23P.O MANGANÊS É

ENCONTRADO DE FORMA INESPECÍFICA E SOBREPÕE-SE AO FERRO EM PARTE DA MUSCULATURA AXIAL, INDICANDO ORIGEM DIAGENÉTICA DE AMBOS NESSA ESTRUTURA.O FERRO É TAMBÉM VISTO NA MATRIZ, E DISTRIBUÍDO DE FORMA GRANULAR NA ESTRUTURA DE INTERESSE E NO ESTÔMAGO.ALÉM DO FERRO, ESSAS DUAS ESTRUTURAS SÃO CIRCUNDADAS POR ZINCO, ATESTANDO UMA MESMA COMPOSIÇÃO QUÍMICA QUE SUGERE SE TRATAREM DO MESMO TIPO DE ESTRUTURA, PROVÁVEL TRATO GASTROINTESTINAL... 44 FIGURA 35.MAPEAMENTO QUÍMICO DA ESTRUTURA POTENCIALMENTE CARDÍACA DE CNPEM-LNB3P, COM FOCO EM SUA ANÁLISE

TAFONÔMICA.O FERRO É ENCONTRADO NÃO ASSOCIADO AO ENXOFRE, INDICANDO AUSÊNCIA DE INFLUÊNCIA DIAGENÉTICA POR PIRITIZAÇÃO.O FÓSFORO, ASSOCIADO AO CÁLCIO, INDICA A OCORRÊNCIA DO PROCESSO DE FOSFATIZAÇÃO, COM POSSÍVEL FORMAÇÃO DE APATITA, IMPORTANTE NA PRESERVAÇÃO DE TECIDOS MOLES. ... 45

FIGURA 36.MAPEAMENTO QUÍMICO DE FERRO (VERMELHO) ZINCO (VERDE) E MANGANÊS.O ZINCO É ENCONTRADO EM MAIORES CONCENTRAÇÕES À DIREITA NA ESTRUTURA, REGIÃO ASSOCIADA AO TRATO DE INFLUXO DO PUTATIVO CORAÇÃO, RESULTADO SEMELHANTE AO ENCONTRADO NO ZEBRAFISH.O MANGANÊS É ENCONTRADO SOBREPOSTO A FERRO, INDICANDO CONTRIBUIÇÃO DOS PROCESSOS DIAGENÉTICOS NESSA REGIÃO. ... 45

xix

FIGURA 37.ESPECTRO XANES DO ESTÔMAGO, DA ESTRUTURA DE INTERESSE EM DOIS PONTOS,A E B, E DE OUTRA REGIÃO DO CORPO DO

CNPEM-LNB23P.OS ESPECTROS SÃO UNIFORMES, INDICANDO MESMA NATUREZA QUÍMICA DO FERRO DA ESTRUTURA DE INTERESSE E DOS DEMAIS ENCONTRADOS NO INTERIOR DO PEIXE. ... 47 FIGURA 38.ESPECTRO XANES DE CNPEM-LNB23P, INDICANDO QUE O FERRO ENCONTRADO NA ESTRUTURA DE INTERESSE APRESENTA

CONTRIBUIÇÃO DE MATRIZ, ASSIM COMO O ESPECTRO DO ESTÔMAGO, OBSERVADAS PELO DESLOCAMENTO DA PRÉ-BORDA NA REGIÃO DE 7120 EV.TODOS ESSES ESPECTROS DIFEREM SIGNIFICATIVAMENTE DO ESPETRO DA HEMOGLOBINA. ... 47

FIGURA 39.ESPECTROS XANES DE DIFERENTES REGIÕES DO POSSÍVEL CORAÇÃO DE CNPEM-LNB3P.EMBORA COM DIFERENTES INTENSIDADES, OS ESPECTROS APRESENTAM A MESMA ESTRUTURA, INDICANDO MESMA NATUREZA QUÍMICA NAS TRÊS REGIÕES ANALISADAS DO PUTATIVO CORAÇÃO... 49 FIGURA 40.ESPECTROS XANES DO POSSÍVEL CORAÇÃO, HEMOGLOBINA, PIRITA E MATRIZ DO FÓSSIL.A PIRITA APRESENTA UM ESPECTRO

CARACTERÍSTICO, CUJA CONTRIBUIÇÃO É OBSERVADA NO DESLOCAMENTO DA BORDA DA MATRIZ.TANTO ESSES ESPECTROS QUANTO O DA HEMOGLOBINA SE MOSTRAM BEM DIFERENTES DO ESPECTRO DO POSSÍVEL CORAÇÃO. ... 49 FIGURA 41.GRÁFICO DAS DERIVADAS DOS ESPECTROS DE PIRITA, MATRIZ, PUTATIVO CORAÇÃO DE CNPEM-LNB3P, ESTÔMAGO E

ESTRUTURA ANALISADA DO CNPEM-LNB23P(AGORA JÁ DESCARTADA A CLASSIFICAÇÃO COMO CORAÇÃO), NO QUAL É POSSÍVEL ANALISAR MAIS CLARAMENTE AS REGIÕES DE PRÉ-BORDA E INICIO DA BORDA DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO.NA PRÉ-BORDA É POSSÍVEL OBSERVAR QUE O ESTÔMAGO DE CNPEM-LNB23P E O PUTATIVO CORAÇÃO DE CNPEM-LNB3P APRESENTAM DOIS OMBROS,

EMBORA EM REGIÕES DIFERENTES, ENQUANTO OS DEMAIS APRESENTAM APENAS UM, NA MESMA REGIÃO DE ENERGIA DO OMBRO DA PIRITA, INDICANDO CONTRIBUIÇÃO DA MESMA.COM EXCEÇÃO DO PUTATIVO CORAÇÃO DE CNPEM-LNB3P, TODOS OS ESPECTROS APRESENTAM PICO NA FAIXA DE 7118 EV, REGIÃO DA DERIVADA MÁXIMA DA PIRITA, INDICANDO FORTEMENTE CONTRIBUIÇÃO DESSE MINERAL NA PRÉ-BORDA DO ESPECTRO DESSAS ESTRUTURAS. ... 50 FIGURA 42.ESPECTRO DOS MINERAIS DE FERRO COMPARADOS AOS DO POSSÍVEL CORAÇÃO.OBSERVA-SE MAIOR CONTRIBUIÇÃO DOS

ESPECTROS DE HEMATITA E MAGNETITA, EM RELAÇÃO À GOETITA, AO ESPECTRO DO FÓSSIL. ... 50

FIGURA 43.GRÁFICO DAS DERIVADAS DOS ESPECTROS DO PUTATIVO CORAÇÃO DE CNPEM-LNB3P,MAGNETITA,HEMATITA E GOETITA.A PRÉ-BORDA DE CNPEM-LNB3P APRESENTA DOIS OMBROS EM ENERGIAS MAIS BAIXAS QUE OS OMBROS DAS DEMAIS AMOSTRAS.A

REGIÃO DA BORDA, OBSERVADA PELAS DERIVADAS MÁXIMAS INDICADAS PELAS LINHAS, MOSTRA QUE A ENERGIA DOS PICOS DE MAGNETITA E HEMATITA É SEMELHANTE AO DO FÓSSIL, ENQUANTO O PICO DA GOETITA APRESENTA CONFORMAÇÃO DIFERENTE. 51

xxi

Lista de Abreviaturas e Siglas

CT = Computed Tomography (Tomografia Computadorizada)

DNPM = Departamento Nacional de Produção Mineral, Crato, Ceará

EDS = Energy Dispersive Spectroscopy (Espectroscopia por Dispersão de Energia)

LNLS = Laboratório Nacional de Luz Síncrotron

SEM = Scanning Electron Microscopy (Microscopia Eletrônica de Varredura)

XAS = X-Ray Absorption Spectroscopy (Espectroscopia de Absorção de Raio-X)

XANES = X-Ray Absorption Near Edge Structure (Espectroscopia de absorção de Raio-X na região próxima à borda)

XRF = Micro X-Ray Fluorescence (Microfluorescência de Raios-X)

1

1 Introdução

1.1 Contexto

O contexto no qual o presente trabalho se insere é o estudo da evolução cardíaca em vertebra-dos. Ao estudar a evolução de um determinado caráter, as metodologias mais utilizadas são as aborda-gens ontogenéticas, analisando seu curso de desenvolvimento embrionário, ou as análises de grupo-externo, estudando de forma comparativa a estrutura em outras espécies, acessando também o registro fóssil (Weston, 1988; Carvalho, 2010). No âmbito do estudo da evolução do coração, a análise do registro fóssil se mostra infrutífera, devido à ausência de estruturas cardíacas descritas e acertadamente aceitas como vestígios fossilizados de corações. Em alguns fósseis é atribuída a classificação de coração a impres-sões encontradas na posição anatômica esperada para o mesmo (Shu, et al., 2003; Holland & Chen, 2001; Carvalho & Maisey, 1996), porém nenhum estudo confirmativo sobre a natureza dessas estruturas foi até hoje realizado. O tipo de tecido do qual o coração é formado é chamado na paleontologia de “tecido mo-le”, termo que designa as estruturas histológicas não biomineralizadas, com a matriz extracelular rica em fibras de colágeno e elastina, às quais raramente se preservam nos processos de fossilização (Gobbo, 2013). Nesse contexto, uma inédita descrição de fósseis cardíacos é de extrema importância pois pode, além de abrir novas perspectivas no estudo dos processos anatômicos e embrionários que deram origem ao coração com câmaras dos vertebrados, contribuir também para o estabelecimento de metodologias que possam ser aplicadas no estudo de tecidos moles em um amplo registro fóssil, ainda inexplorado.

1.2 Objetivos

O principal objetivo deste trabalho é a descrição de um fóssil cardíaco, bem como sua caracteri-zação química e morfológica.

2 Os objetivos específicos são:

- Analisar, através de técnicas de imagem não destrutivas, a anatomia interna e morfologia das estruturas preservadas em peixes fósseis com foco na busca de estruturas cardíacas.

- Analisar quimicamente as estruturas preservadas nos fósseis, a fim de verificar se sua compo-sição química corrobora a identificação como estrutura cardíaca.

1.3 Evolução cardíaca

“Coração” é o nome tradicionalmente dado à estrutura muscular bombeadora do sistema circu-latório dos cordados. Bomba cardíaca é o termo técnico que define os órgãos musculares bombeadores, os quais consistem de vários tipos de células trabalhando juntas para propelir o fluido pelos ductos ou vasos de um sistema circulatório. Estas estruturas foram classificadas em corações com câmaras, cora-ções tubulares, veias pulsáteis e coracora-ções acessórios (Simões-Costa et al., 2005).

Os corações com câmaras, presentes em vertebrados e alguns moluscos (Figura 1), são bombas multi-compartimentalizadas com circuitos simples ou duplos, que incluem cerca de um a quatro reserva-tórios, os átrios, e um a dois compartimentos contráteis, os ventrículos. Os invertebrados possuem cora-ções tubulares, ampulares acessórios1 ou veias pulsáteis. Dentre esses tipos de bombas cardíacas, os vasos pulsáteis são o tipo encontrado nos cordados invertebrados, os cefalocordados e tunicados. São estruturas tubulares que propelem fluido por constrição lenta e peristáltica (Farrel, 1997; Xavier-Neto et al., 2010).

1

Corações ampulares acessórios são definidos como bombas acessórias que impulsionam a circulação em locais críticos de alta resistência, de difícil acesso ou onde a energia do fluido é baixa. São as bombas acessórias de crustáceos e insetos, os corações branquiais dos cefalocordados e o coração linfático de peixes, anfíbios e répteis (Farrel, 1997; Maynard, 1960).

3

Figura 1. Tipos de bombas cardíacas encontrados nos principais grupos de animais. Modificado de (Xavier-Neto et al., 2010).

A circulação dos vertebrados se desenvolveu em um modelo unidirecional e à prova de regurgi-tação. Neste modelo, o volume vascular é minimizado, mas recirculado de forma vigorosa através de uma rede bem definida de vasos desenvolvidos com a finalidade de aperfeiçoar o transporte global e garantir uma troca eficiente entre o sangue e os tecidos (LaBarbera, 1990; Xavier-Neto et al., 2010). De uma ma-neira geral, os vertebrados seguiram uma tendência que é comum em filos que apresentam espécies de grande porte e/ou comportamentos sofisticados, uma propensão a concentrar o trabalho circulatório em uma bomba circulatória principal, ou em segmentos específicos de uma bomba cardíaca já dominante (e.g. crustáceos decápodes e insetos) (Xavier-Neto et al., 2010).

O aumento na sofisticação tridimensional e na eficiência de bombeamento de um coração com câmaras foi um fator chave na evolução de vertebrados. A circulação no peixe-bruxa, considerado um vertebrado primitivo, é dotada de múltiplas e engenhosas bombas circulatórias acessórias impulsionadas por músculos esqueléticos (Simões-Costa et al., 2005). Em contraste, os vertebrados modernos reduziram a sua dependência de bombas acessórias (Janvier, 1996) e consolidaram o coração “branquial” como sua bomba principal (descrito como o coração branquial em virtude de sua posição à montante do circuito branquial) (Satchell, 1991; Kardong, 2006).

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1.4 O coração dos cordados

A circulação de tunicados e de cefalocordados compartilha algumas características com o siste-ma circulatório de vertebrados. Todos os cordados posicionam suas bombas circulatórias principais à montante dos vasos faríngeos/branquiais, (Brusca, 2003), e o sistema circulatório centralizado dos tuni-cados lembra o de vertebrados que, gradualmente, consolidaram o coração como sua bomba circulatória principal. (Kardong, 2006; Satchell, 1991). Em contraponto, essas bombas circulatórias diferem significati-vamente em termos de morfologia e eficiência na propulsão de fluidos. A circulação dos cefalocordados é impulsionada por quatro vasos peristálticos formados por músculo liso, enquanto os tunicados apresen-tam uma única bomba circulatória composta por musculatura esquelética, envolvida por pericárdio (Schubert, et al. 2006).

Figura 2. Esquema dos principais tipos de bombas cardíacas encontrados nos cordados. Modificado de (Schubert, et al. 2006)

5 Apesar de apresentarem algumas semelhanças, entre a bomba peristáltica primitiva dos corda-dos invertebracorda-dos e os corações com câmaras corda-dos vertebracorda-dos existe uma significativa diferença morfo-lógica, uma vez que os mais primitivos vertebrados viventes, as lampréias e peixes-bruxa já apresentam um coração com 3 ou 4 câmaras (Fange, R., 1972; Simões-Costa et al., 2005).

1.5 O coração em peixes

A evolução das câmaras cardíacas pode ser vista como um componente extremamente impor-tante das diversas mudanças circulatórias que se processaram em vertebrados e que os dotou da versati-lidade necessária para ocupar diferentes nichos ecológicos (Gans & Northcutt, 1983). Uma vez que os vertebrados surgiram em um ambiente marinho, as câmaras cardíacas originais foram definidas no con-texto da anatomia dos peixes (Randall, 1970; Fange, 1972; Bourne, 1980; Kardong, 2006). Portanto, nos peixes há quatro tipos de compartimentos cardíacos classificados como câmaras: o seio venoso, o átrio, o ventrículo e o cone arterioso (Figura 3), o qual nos teleósteos2 mais derivados (e.g Clupeocephala) está reduzido em detrimento do desenvolvimento de um bulbo arterioso. Em peixes, e na maioria dos verte-brados, estes segmentos cardíacos estão localizados dentro da cavidade pericárdica, são flanqueados por válvulas de influxo e efluxo e operados por musculatura estriada contrátil (Simões-Costa et al., 2005).

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Grupo mais diverso de peixes ósseos de nadadeiras raiadas viventes.

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Peixes que possuem um esqueleto majoritariamente cartilaginoso, e.g tubarões, as raias e as quimeras.

Figura 3. Esquema simplificado do coração de um peixe. ca: cone arterioso, a: átrio, v: ventrículo, sv: seio venoso.

6 O bulbo arterioso é um segmento cardíaco de problemática classificação nos peixes. É a estru-tura dominante no trato de saída dos teleósteos, localizada dentro da cavidade pericárdica, e atua como um reservatório elástico, protegendo os vasos branquiais da pressão sanguínea imposta pelo ventrículo (Icardo, 2006). Contrasta com o cone arterioso, pois este é maciçamente dotado de musculatura cardíaca e flanqueado por válvulas, que atuam como um amortecedor das pulsações produzidas pelo ventrículo (Farrell, 1992). Uma vez que o bulbo arterioso contém músculo liso, tem sido sugerido que ele é, na reali-dade, uma extensão do tronco da aorta (Lawson, 1979), hipótese corroborada por Grimes et al. (2006), que observou, através de marcadores cardíacos, não haver, na formação dessa estrutura, uma transição fenotípica de musculatura estriada cardíaca, conforme sugerido por alguns autores (Guerrero et al., 2004; Hu, et al, 2000). Tais estudos indicam que o bulbo não se trata de uma câmara verdadeira, sendo apenas o seio venoso, átrio, ventrículo e cone arterioso as quatro câmaras do coração dos peixes.

O cone arterioso é a estrutura do trato de saída do coração dominante em condrictes3 e em ac-tinopterígeos4 basais. Ele é caracterizado pela presença de três ou mais séries de válvulas, responsáveis pela função de amortecimento do fluxo sanguíneo. Nos teleósteos, o cone é encontrado reduzido, na porção proximal ao ventrículo, em geral contendo uma única válvula (com exceção de alguns Elopomor-pha que apresentam duas), enquanto o bulbo arterioso se desenvolveu em tamanho e função, se tornan-do a estrutura tornan-dominante tornan-do trato de saída desses animais (Icartornan-do, 2006; Parsons, 1866).

3

Peixes que possuem um esqueleto majoritariamente cartilaginoso, e.g tubarões, as raias e as quimeras.

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2 Estudos paleontológicos

2.1 Modelo de estudo

Para a realização do presente trabalho, escolhemos uma espécie de peixe na qual procuramos por vestígios cardíacos fósseis. Era interessante que o animal escolhido se tratasse de um espécime que fosse encontrado fossilizado tridimensionalmente, o que favoreceria a preservação da morfologia original das estruturas moles, e por esse motivo focamos em espécimes das concreções do membro Romualdo da Formação Santana. Foi dado maior foco a espécies com prévias descrições de preservação de tecidos moles, pois estas apresentariam maior chance de terem preservado estruturas cardíacas. Além disso, a espécie escolhida precisaria ser abundante e de fácil acessibilidade, a fim de viabilizar estudos invasivos ou destrutivos durante sua caracterização.

Uma espécie de peixe que satisfaz nossas condições é o extinto Rhacolepis buccalis Agassiz 1841, peixe teleósteo membro da família Pachyrhizodontidae. Essa espécie viveu há cerca de 110 milhões de anos, e sua posição filogenética ainda é incerta, embora seja aceito que se trata de um teleósteo ba-sal, possivelmente mais relacionado ao grupo Elopomorpha. É um fóssil muito comum nas concreções do Membro Romualdo, sendo identificados externamente por apresentarem escamas imbricadas pequenas, com padrão losangular, maiores na região dorsal e menores na parte abdominal (Forey, 1977).

Sua posição filogenética, na base dos teleósteos, coloca-o em uma posição central no estudo do cone arterioso, pois levanta questionamentos sobre se sua morfologia conal é próxima daquela encon-trada na maioria dos teleósteos viventes, com uma estrutura reduzida em tamanho e número de válvu-las, ou se é mais semelhante à encontrada nos peixes não-teleósteos, com um cone bem desenvolvido apresentando três ou mais séries de válvulas.

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2.2 A Bacia do Araripe

Dentre os sítios paleontológicos brasileiros que pudessem apresentar fósseis com possível pre-servação cardíaca, a Formação Santana, na Bacia Sedimentar do Araripe foi escolhida por sua surpreen-dente quantidade de fósseis em excepcional estado de preservação. A Bacia do Araripe é a mais extensa das bacias interiores do Nordeste do Brasil. Sua área de ocorrência estende-se da Chapada do Araripe ao Vale do Cariri, com cerca de 9.000 km2. Localiza-se nas divisas dos estados do Ceará, Pernambuco e Piauí (Figura 4), e é conhecida mundialmente por seu diversificado conteúdo fossilífero do Eocretáceo (no in-tervalo Aptiano Albiano – 126 - 100 milhões de anos atrás) (Assine, 1992). Nela são encontradas uma grande quantidade de fósseis como insetos, vegetais, moluscos, peixes e pterossauros, encontrados em excelente estado de preservação, principalmente nas camadas da Formação Santana (Maisey, 1991; Martill, 2007). Sua evolução é complexa e está relacionada à fragmentação do paleocontinente Gondwa-na e formação do Oceano Atlântico Sul. O registro cretáceo compreende quatro sequências: pré-rifte5, rifte, e pós-rifte I e pós-rifte II, sendo a sequência pós-rifte I a apresentar formações ricas em fósseis, com um ciclo sedimentar de influência marinha (Brito-Neves, 1990; Ghignone, 1986; Assine, 2007).

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Rifte é o termo utilizado para designar fraturas na crosta terrestre, tendencialmente lineares, formadas por afastamento de porções da crosta. O rifte em questão foi gerado pela migração das placas Sul-Americana e Africana, que culminaram na ruptura do paleocontinente Gondwana(Guerra et al., 1997).

Figura 4. Mapa da localização da Bacia do Araripe. Modificado de Maisey (1991)

9 Small (1913) subdividiu o registro sedimentar da bacia em quatro unidades litoestratigráficas, sendo elas, conglomerado basal, arenito inferior, calcário Santana e arenito superior, que posteriormente foram renomeadas e discutidas por outros autores, que descreveram essa sequência deposicional com critérios estratigráficos mais modernos. Uma das litoestratigrafias mais adotadas, e que será usada de base neste trabalho, é a de Ponte & Appi (1990), que divide a coluna em três seções: a Formação Cariri, que constitui a base da coluna, o Grupo Vale do Cariri, que reúne as formações Brejo Santo, Missão Velha e Abaiara, e o Grupo Araripe, dividido nas formações Batateira, Santana, Arajara e Exu.

2.3 Formação Santana

Dentre as unidades litoestratigráficas da bacia do Araripe, a Formação Santana é estratigrafica-mente a mais complexa e também a mais estudada, principalestratigrafica-mente por se constituir em um Konservatla-gerstätte, um sítio fossilífero de excepcional preservação, sobretudo pela rica paleoictiofauna mesozóica

Figura 5. Diagrama cro-noestratigráfico simplifi-cado da bacia do Araripe, de acordo com a classifi-cação de (Ponte, 1990). Modificado de (Freitas, 2010)

10 preservada em concreções6 calcárias (Maisey, 1991). O termo fossillagerstätte foi cunhado por Seilacher em 1970 para designar um “corpo rochoso que contém, devido à qualidade e à quantidade, um número incomum de informações paleontológicas”. Ele também distinguiu dois tipos de fossillagerstätten, os com uma concentração excepcional de fósseis (konzentratlagerstätten) e os com uma excepcional qualidade de preservação (konservatlagerstätten) (Seilacher, 1970; Seilacher et al., 1985).

A Formação Santana pertence à sequência pós-rifte I da bacia, que se depositou durante o Apti-ano-Albiano (Chagas, 2006). Ela possui aproximada espessura de 220 m, sendo composta por uma suces-são de folhelhos7 papiráceos calcíferos, interestratificados com calcários micríticos8 laminados, formando extensos bancos com espessuras com mais de duas dezenas de metros. Há também folhelhos pirobetu-minosos9, com teores de até 25% de carbono orgânico total, e frequentemente calcíferos, devido à abun-dância de carapaças de ostrácodes. O registro fossilífero é abundante, com uma grande biodiversidade que inclui peixes, vegetais, artrópodes, dinossauros e pterossauros (Assine, 1992; Maisey, 1991). A For-mação é dividida em três membros: Crato, Ipubi e Romualdo (Beurlen, 1971), sobre os quais será dada uma breve introdução.

2.3.1 Membro Crato

Caracteriza a parte inferior da Formação Santana, sendo composto basicamente por estratos horizontalizados de calcários laminados de natureza micrítica, com espessura de 50 a 70 metros. Indica a deposição em regime de sistemas lacustres, apontando condições de baixa energia no ambiente deposi-cional, com influxo terrígeno e turvação da água paulatinamente decrescentes. (Assine 1992). Há um rico

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Nódulos que se formam graças a uma precipitação de minerais que se processa em torno de núcleos, os quais podem ser de origem mineral, vegetal, animal, ou mesmo se tratar de um organismo (Guerra et al., 1997).

7

Rocha sedimentar finamente laminada, constituída de grãos muito fino.

8

Calcário constituido essencialmente por calcita microcristalina (<4 m) e argila.

9

11 registro fossilífero nos calcários laminados e folhelhos, caracterizado pela ausência de formas marinhas, que corroboram se tratar de um ambiente de sedimentação lacustre (Ponte, 1994; Neumann, 1999).

2.3.2 Membro Ipubi

Sobre os calcários laminados do Membro Crato, em associação com folhelhos pirobetuminosos, encontram-se os evaporitos10 _{do Membro Ipubi. Estes evaporitos exibem pouca variabilidade química,} restringindo-se a sulfatos de cálcio, especialmente sob a forma de gipsita11 laminada primária (Assine, 1990). Há evidências de espécies marinhas nos estratos (Lima, 1978), entretanto a existência de folhe-lhos pirobetuminosos pretos, ricos em fragmentos vegetais carbonificados e ostrácodes não-marinhos, indicam também a ocorrência de lagos que originaram uma bacia evaporítica continental (Chagas, 2006). Esses evaporitos são interpretados como originados em ambientes costeiros, sujeitos a variações relati-vas do nível do mar, em condições de climas árido a semi-árido (Assine, 1992; Assine, 2007).

2.3.3 Membro Romualdo

Sobreposto ao Membro Ipubi está um dos principais sítios paleontológicos do Araripe, por apre-sentar abundantes concreções carbonáticas, com uma grande quantidade de fósseis preservados tridi-mensionalmente em seu interior. Essas concreções ocorrem em meio à fácies de folhelhos calcíferos es-verdeados, ricos em ostrácodes, e grande parte delas encerra peixes em seu interior. Tem sido descritas associadas às concreções um total de 25 espécies (Brito & Yoshitaka, 2011), compondo uma paleoictio-fauna considerada marinha (Silva-Santos & Valença, 1968). Também são encontrados, entre outros ver-tebrados, dinossauros (Leonardi & Borgomanero, 1981), tartarugas marinhas (Price, 1973) e pterossauros

10

Rocha sedimentar formada por cristalização e precipitação dos sais dissolvidos em um meio aquoso, devido a um processo de evaporação, geralmente associado a climas secos e áridos. (Guerra et al., 1997).

11

12 (Price, 1971; Campos & Kellner, 1985). As concreções são constituídas por calcário micrítico argiloso, fi-namente laminado, sendo marcante a presença de ostrácodes articulados. As características de preserva-ção dos peixes nas concreções, com riqueza de detalhes e estruturas articuladas, indicam águas muito calmas. A grande quantidade de espécimes encontrados indica ocorrência de eventos de mortalidade em massa destes organismos nectônicos, estando sua provável causa associada a uma mudança catastrófica na química ou na temperatura nas águas superficiais (Martill, 1988). A presença de moluscos tidos como marinhos (Beurlen, 1963) dinoflagelados e foraminíferos (Lima, 1978, Arai & Coimbra, 1990), e principal-mente equinodermos (Beurlen, 1966) corroboram a hipótese de ingressão marinha na área. Mais no to-po, interdigitados aos sedimentos pelítico-carbonáticos12 portadores de fósseis marinhos, voltam a ocor-rer siltitos13 e arenitos14 com fósseis de águas continentais, como moluscos e conchostráceos (Beurlen, 1971), indicando o retorno de condições de água doce.

12

Pelito é uma rocha formada de materiais muito finos, geralmente argilosas.

13

Rocha sedimentar formada por grãos menores que areia e maiores que argila.

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13

Figura 6. Coluna estratigráfica da Bacia do Araripe com destaque para o Membro Romualdo, modificado de (Saraiva, 2008).

2.4 A preservação de tecidos moles

A pouca quantidade de informações acerca de corações fósseis tem, em grande parte, contri-buição de sua composição histoquímica. Tecidos moles se fossilizam em uma proporção muito inferior à dos tecidos biomineralizados, tais como ossos, dentes ou conchas.

14 A Formação Santana é conhecida por seu histórico de preservação de tecidos moles, que inclu-em músculos, brânquias, ovários, além de conteúdos estomacais e até vasos sanguíneos (Martill, 1988, 1990). Em níveis estruturais, já foram relatados desde os contornos da estrutura de tecidos, morfologias celulares e até detalhes subcelulares (Wilby & Briggs, 1997). Essa excepcional preservação ocorre por um processo de fossilização denominado replicação por minerais autigênicos, ou mineralização autigênica, processo pelo qual minerais se precipitam e substituem a matéria orgânica das células e tecidos, repli-cando sua morfologia (Briggs, 2003). Na Formação Santana, o íon mais frequentemente associado à pre-servação dos tecidos moles é o fosfato, classificando o processo de prepre-servação como fosfatização, um evento que ocorre rapidamente nos momentos iniciais após a morte do espécime (Martill, 1988). Para que tal processo ocorra, o pH da micro-região deve ser ácido e a concentração de fosfatos (Wilby et al., 1996) deve superar a de carbonatos, inibindo momentaneamente a precipitação deste último. O próprio processo de decomposição do organismo pode, além de criar um microambiente acidificado que favoreça a precipitação, liberar o fosfato necessário para que a preservação ocorra em nível local, embora seja insuficiente para garantir a preservação total do espécime (Briggs, 2003; Wilby et al., 1996), como é ob-servado em muitos peixes da formação Santana. Isso levou Martill (2008; 1990) a propor a hipótese de que esses peixes morreram em eventos de mortalidade em massa, causados por prováveis flutuações químicas do meio aquático. Tais eventos levaram a um aumento na disponibilidade de nutrientes na água, como o fosfato, fornecendo matéria prima para a ocorrência do processo de fosfatização.

A qualidade e fidelidade da preservação dos tecidos dependem, principalmente, da quantidade de decomposição que precede a mineralização, e do tamanho unitário dos cristais que precipitam (Briggs, 2003). A preservação de tecidos mais frágeis como músculos, encontrada nos fósseis do Membro Romu-aldo, indica uma rápida mineralização autigênica, usualmente envolvendo apatita (Martill, 1988). A maio-ria dos tecidos moles da formação Santana estão preservados associados a pequenas microesferas de

15 aproximadamente 1 m que são, por sua vez, constituídos por cristalitos15 que atingem dimensões má-ximas de 0,3m, o que permite um fino preenchimento à nível subcelular. Algumas células e tecidos também tem seu contorno preservado pela indução à deposição de carbonatos a partir do metabolismo de filmes bacterianos (Martill, 1988; Wilby & Briggs, 1997).

A pirita é um mineral muito abundante nas concreções da Formação Santana, e costuma ser en-contrada nas trabéculas ósseas dos fósseis. É um mineral também associado à preservação de tecidos, moles, mas principalmente em plantas devido à presença de parede celular, uma vez que sua precipita-ção é mais lenta que a do fosfato, ocorrendo uma maior degradaprecipita-ção dos tecidos, o que compromete a preservação de tecidos animais (Briggs, 2003). A pirita é importante no contexto do nosso estudo pois se trata de um minério de ferro que se forma, na Formação Santana, pela precipitação de ferro na forma de FeS2 por bactérias redutoras. O ferro é um elemento chave nos nossos estudos químicos, uma vez que o

mesmo é encontrado de forma abundante no sangue. Dessa forma, o ferro encontrado nos fósseis pode ser tanto de origem biogênica, quanto diagenético, precipitado na forma de pirita.

3 Descrição das Técnicas Experimentais

Este trabalho utilizou uma série de técnicas de investigação, sendo algumas tradicionalmente utilizadas em estudos paleontológicos, enquanto outras tiveram sua aplicabilidade no estudo de fósseis explorada apenas nas últimas décadas. Tal limitação se deve à necessidade de equipamentos cuja tecno-logia, de última geração, se desenvolveu principalmente visando estudos na área da física, química e de materiais. Em especial, o uso de técnicas que necessitam de uma fonte Síncrotron de raios-x, e que po-dem fornecer uma gama de informações de naturezas químicas e estruturais, são restritas ao público com acesso e conhecimento das possíveis utilizações desse tipo de acelerador de partículas. Será,

15

16 to, dada uma breve introdução aos princípios e funcionalidade das principais técnicas utilizadas nesse trabalho.

3.1 Tratamento com ácido acético

O tratamento com ácido acético é uma técnica tradicional e largamente utilizada no estudo de fósseis de matriz calcárea (White, 1945; Toombs & Rixon, 1959). Baseia-se no princípio de que o ácido acético remove esse tipo de matriz, através da reação do ácido com o carbonato de cálcio (CaCO3 + 2

CH3COOH  2Ca(CH3COO) + CO2 + H2O), porém não reage de forma significativa com tecidos preservados

na forma de fosfatos. Essa técnica consiste em imergir o fóssil na solução ácida e deixá-lo reagindo até que se tenha removido a quantidade de matriz desejada, ou até que a solução se sature. Procede-se com uma imersão em água, para neutralização do ácido e a retirada do sedimento que se solta, repetindo-se o processo sucessivamente até que se tenham expostas as estruturas de interesse.

3.2 Técnicas de Imagem

As técnicas de imagem utilizadas consistem em tomografias de raios-x, técnicas não destrutivas com poder de fornecer informações do interior dos espécimes analisados.

3.2.1 Tomografia Computadorizada

A palavra “tomografia” é derivada das palavras gregas “tomos”, que significa “fatiar”, e “gra-pho” que por sua vez significa “imagem”. Os raios-x atravessam a matéria e parte deles é absorvida pelos diferentes materiais que a compõe. Materiais de maior densidade absorvem mais que os de menor den-sidade, e essa diferença de absorção produz contraste, sendo este o princípio da radiografia de absorção. A tomografia é a técnica de imagem que utiliza um conjunto de radiografias seriadas para uma represen-tação tridimensional da amostra (Buzug, 2008). Tendo-se as projeções (radiografias) do objeto em

ques-17 tão, realiza-se o procedimento de reconstrução, processo matemático com o qual se obtém informação sobre a estrutura através de uma sondagem do seu contorno. Cada projeção é definida matematicamen-te como a transformada de Radon da amostra (Ludwig, 1966; Vescovi, 2014). O matematicamen-termo Tomografia Com-putadorizada (CT) normalmente refere-se à tomografia de absorção de raios-x, e permite a observação de estruturas de densidades diferentes presentes no interior dos objetos (Buzug, 2008).

Embora os tomógrafos tradicionais tenham evoluído bastante nos últimos anos e hoje possam atingir resoluções nanométricas, os mesmos não podem contribuir para o estudo de um grande número de fósseis. Tais limitações são fruto de sua fonte policromática de raios-x, além da natureza intrínseca dos fósseis, que, sendo altamente mineralizados, apresentam um baixo contraste de absorção. Por esse mo-tivo, a tomografia de absorção ou CT, embora diferencie bem materiais de alta e baixa densidade, se mostra pouco eficiente para produzir contraste no estudo da anatomia interna de materiais paleontológi-cos, de densidade mais uniforme (Sutton, 2008; Tafforeau et al., 2006).

3.2.2 Microtomografia Síncrotron de Contraste de Fase

Uma informação importante que também pode ser obtida por transmissão de raios-x é a fase de sua onda. Ao atravessar uma amostra, o feixe de raios-x passa por diferentes tipos de materiais, com diferentes índices de refração, os quais irão levar a pequenas mudanças em sua fase, que podem ser con-vertidas em contraste na imagem projetada. O índice de refração de raios-X ao atravessarem determina-do material pode ser escrito praticamente como um número inteiro, com uma pequena correção imagi-nária (β), da forma n = 1 − δ + iβ, onde β descreve a absorção dos raios-x (Willmott, 2011). Apesar de pequena, essa correção permite identificar estruturas que dificilmente seriam medidas apenas pela ab-sorção, como bordas de objetos, mesmo que de densidades muito similares. Essa propriedade permite explorar a técnica de tomografia em materiais de baixo contraste por absorção, como os fósseis.

Imagens por contraste de fase podem ser obtidas por diferentes técnicas. Entre os métodos disponíveis, o utilizado nesse trabalho foi o método de propagação, no qual um feixe de raios-X coerente

18 interage com a amostra e é propagado por diferentes distâncias, a fim de se observar a interferência das ondas transmitidas em diferentes regimes16 (Tafforeau et al., 2006; Willmott, 2011).

Tomografias de contraste de fase são em geral aplicadas em fontes de luz Síncrotron17 de ter-ceira geração, especialmente pela alta coerência18 e intensidade do feixe. Além disso, a possível mono-cromatização do feixe de raio-x evita artefatos típicos de amostras paleontológicas (devido à alta absor-ção dos componentes de mais baixa energia pela rocha). A alta intensidade do feixe das fontes síncrotron também permite uma rápida aquisição de dados a uma resolução espacial alta, resultando em um mape-amento preciso das estruturas internas da amostra (Sutton, 2008; Tafforeau et al., 2006).

3.3 Análises químicas espectroscópicas

As análises químicas por meio de técnicas espectroscópicas19, embora de natureza não destruti-va, necessitam da exposição das estruturas de interesse, o que pode, em alguns casos, exigir a manipula-ção do fóssil.

No estudo de fósseis cardíacos, levando-se em conta que a função do coração é bombear san-gue, é razoável esperar que fósseis cardíacos possam apresentar remanescentes de derivados de sansan-gue, tais como hemoglobina, porfirinas ou uma maior concentração de átomos de ferro. Por esse motivos, optamos por técnicas de espectroscopia para buscar vestígios químicos de hemoglobina e seus derivados, seja na forma de vestígios de ligações orgânicas, obtidas por espectroscopia RAMAN, ou pelo mapeamen-to dos elemenmapeamen-tos químicos, através da espectroscopia por XRF. Tais elemenmapeamen-tos químicos, quando encon-trados nos fósseis, podem ser tanto de origem biogênica quanto diagenética20, fruto do processo de

16

Regimes são distâncias nas quais se observa determinados fenômenos físicos, no caso, o de difração do raio-x.

17

Luz Síncrotron é uma radiação eletromagnética que compreendem os comprimentos de onda do infra-vermelho ao raio-x, e possuem alto brilho e intensidade, obtida por aceleradores de partículas chamados Síncrotrons.

18

Coerência é uma propriedade de ondas de mesma frequência e direção que mantêm uma relação de fase constante entre si.

19

Espectroscopia é o estudo da absorção e emissão de luz ou outra radiação pela matéria, quando submetida à irradiação de energia ( Encyclopædia Britannica Online,"spectroscopy").

20

19 ldiagênese21. Para identificar sua natureza química, utilizamos análises de espectroscopia XANES, que fornece informações sobre o estado químico dos elementos, permitindo avaliar a contribuição de possí-veis derivados de hemoglobina e de outros minérios de ferro ao espectro do ferro encontrado no fóssil.

3.3.1 Espectroscopia Raman

Assim denominada em homenagem ao físico indiano e vencedor do prêmio Nobel de Física de 1930, C.V. Raman, descobridor do espalhamento Raman, essa técnica espectroscópica é bastante utiliza-da em estudos de química analítica, e hoje é também aplicautiliza-da em estudos de paleontologia. Ela consiste em incidir um feixe monocromático de fótons na amostra, que, ao interagir com a mesma, é espalhado de forma inelástica, ou seja, com energia diferente da incidente. Essa diferença de energia é decorrente da interação do fóton com as vibrações moleculares, e permite a correlação da energia do fóton espalha-do com a frequência de vibração da molécula, através da fórmula:

Ei = Ef ± hv

Onde:

Ei = Energia do fóton incidente Ef = energia do fóton espalhado

v = frequência de vibração da molécula h = constante de Planck

A radiação espalhada é separada por um monocromador, e sua intensidade é medida por um detector, resultando em um espectro que relaciona a energia à informação vibracional, a qual é específi-ca para específi-cada ligação químiespecífi-ca, funcionando como uma espécie de impressão digital pela qual uma molécu-la pode ser identificada (Rodrigues, 2010; Sousa-Filho, 2011).

21

20 A identificação de ligações químicas pode fornecer informações sobre os compostos orgânicos e inorgânicos encontrados nos fósseis, permitindo, principalmente, a busca de remanescentes orgânicos das estruturas biológicas, tais como proteínas ou vestígios de hemoglobina.

3.3.2 Microfluorescência de Raios-X

Quando o raio-x incide sobre um material, ele pode remover um ou mais elétrons de seus áto-mos, no chamado efeito fotoelétrico. Para que isso ocorra, a energia do raio-x deve ser maior do que o potencial de ionização do átomo em questão. Quando um elétron é removido de seu orbital, o átomo se torna ionizado, sua estrutura fica instável, e elétrons de orbitais de maior energia mudam de camada a fim de ocupar o espaço deixado pelo elétron expelido. Nesse processo, há liberação de energia na forma de um fóton, e essa energia é equivalente à da diferença dos dois orbitais envolvidos. Essa radiação emi-tida é característica para cada átomo presente na amostra, e é denominada fluorescência. Essa proprie-dade permite a realização de análises elementais qualitativas, na técnica chamada Fluorescência de Rai-os-x (XRF) (Willmott, 2011).

A Microfluorescência de Raios-x (-XRF) é uma variante microanalítica da XRF, que, devido à uti-lização de um microfeixe, permite a reauti-lização de uma varredura na amostra, produzindo um mapeamen-to químico da mesma. Ela nos permite identificar os elemenmapeamen-tos químicos in situ nas amostras, sem a ne-cessidade da pulverizá-las. Através desses mapeamentos químicos podemos observar os principais ele-mentos associados às estruturas cardiovasculares em um peixe, e então verificar sua distribuição nos fósseis. Com isso podemos obter informações sobre a natureza química das estruturas observadas e seu processo de fossildiagênese. A profundidade de penetração dos raios-x permite a análise de camadas subjacentes à superfície, propiciando uma gama de resultados maior do que as obtidas, por exemplo, por EDS-SEM (Energy Dispersive Spectroscopy - Scanning Electron Microscopy) que realiza uma análise super-ficial por utilizar feixes de elétrons no lugar de raios-x para excitar os átomos.

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3.3.3 Espectroscopia XANES

Na Espectroscopia de Absorção de Raios-X (XAS), incide-se um feixe de raio-x em uma amostra e mede-se sua absorção em função de cada comprimento de onda incidente. O coeficiente de absorção diminui continuamente com o aumento da energia do fóton, até que ocorrem aumentos bruscos em energias específicas. Estas energias correspondem àquelas necessárias para ionização (retirada de um elétron) de uma camada eletrônica de um átomo, e são características para cada átomo (Rodrigues, 2010).

Figura 7. Esquema de um espectro de absorção em função da energia, o obtido por espectroscopia de absorção de raios-x. Modificado de (Rodrigues, 2010).

XANES, cuja sigla significa X-Ray Absorption Near Edge Structure, é uma técnica complementar de XAS, e trata da análise da região anterior à borda de absorção do espectro, até aproximadamente 50 eV após a mesma. Essa técnica pode fornecer informações sobre estados de oxidação, geometria tridimensi-onal do composto e ambiente químico ao redor do elemento investigado (Willmott, 2011).

Uma vez que um dos objetivos do presente trabalho é investigar a possível preservação de re-manescentes de sangue, XANES pode nos dar informações sobre a natureza do ferro encontrado em di-versas regiões, internas e externas dos fósseis, e permitir comparações com o ferro de minerais que po-dem ter se formado no processo de diagênese.

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4 Parte Experimental

A parte experimental aqui descrita foi desenvolvida em dois espécimes de Rhacolepis buccalis, depositados no Acervo Fóssil do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) e identifi-cados como CNPEM-LNB 3P e CNPEM-LNB 23P. Tais espécimes foram cedidos peloDepartamento Nacio-nal de Produção Mineral (DNPM) de Crato, no Ceará. Vinte dois espécimes foram também aNacio-nalisados previamente, porém não se mostraram relevantes para maiores análises.

O espécime CNPEM-LNB 3P possui 11,2 cm de comprimento, e também não apresenta os ossos da extremidade anterior focinho (e.g pré-maxila) e os raios da nadadeira caudal. Está preservado sem matriz externa e foi selecionado para o estudo após tratamentos com ácido acético para observação das estruturas internas.

O espécime CNPEM-LNB 23P encontra-se imerso em matriz, apenas com sua porção antero-ventral exposta. O nódulo possui 15,6 cm de comprimento e está preservado quase que em sua

23 de, faltando apenas parte dos ossos da extremidade anterior do focinho (e.g pré-maxila) e dos raios da nadadeira caudal.

Figura 9. Espécime de Rhacolepis buccalis CNPEM-LNB 23P.

4.1 Preparação de fósseis com ácido acético

Vinte espécimes de Rhacolepis buccalis foram submetidos a banhos sequenciais de ácido acéti-co para remoção da matriz calcária. A acéti-concentração do ácido utilizado foi entre 1 e 4%, optando-se por um tratamento mais agressivo inicialmente, e passando para tratamentos mais cuidadosos quando se acessava camadas mais internas do espécimes. O fósseis foram deixados submersos na solução overnight e então lavados diversas vezes para retirada do ácido e do sedimento que se soltou. Foram então foto-grafados, e então submetidos aos próximos ciclos de digestão.

CNPEM-LNB 3P:

Dentre os espécimes analisados, o espécime CNPEM-LNB 3P, após os tratamentos, apresentou uma estrutura de morfologia e localização anatômica muito semelhantes às de um coração. Ele foi então selecionado para uma investigação mais detalhada dessa putativa estrutura cardíaca.

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CNPEM-LNB 23P:

O espécime CNPEM-LNB 23P não foi submetido à tratamentos com ácido pois apresentava-se em excepcional estado de preservação, tendo sido dado preferência, inicialmente, às análises não destruti-vas.

4.2 Tomografia Computadorizada

Foram realizados ensaios de CT em diversos espécimes de Rhacolepis buccalis no Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da FMUSP, o InCor, em São Paulo. Utilizamos o tomógrafo Aquilion ONE 320 canais, da Toshiba, com espessura de corte tomográfico de 0,5 mm e intervalo de 0,25 mm. Os scans foram feitos com filtro bone, e em modo de alta qualidade. As imagens foram reconstruídas pelo softwa-re do próprio apasoftwa-relho, e disponibilizadas em formato DICOM.

4.3 Microtomografia Síncrotron de Contraste de Fase

Após os ensaios de CT, o espécime CNPEM-LNB 23P apresentou uma estrutura com formato su-gestivo de coração, o que o levou a ser selecionado, juntamente com o espécime CNPEM-LNB 3P, para serem enviados a Grenoble, na França para a realização dos ensaios de microtomografia síncrotron de contraste de fase (SR-CT) no European Synchortron Radiation Facility (ESRF). Trata-se de um síncrotron de 3ª geração, cuja linha de microtromografia é a ID 19. Essa linha apresenta uma fonte de raios-x alta-mente colimada, com resolução de 30µm x 120µm, e uma faixa de energia que vai de 6 a 100 keV. Tem 100 metros de comprimento, o que permite uma grande variação de distância entre a amostra e a fonte de raios-x, permitindo a realização de contraste de fase por propagação. Nossas amostras fora escanea-das com feixe monocromático rosa, 16 metros de propagação e reconstruíescanea-das pelo algoritmo de Paganin,

25 metodologia esta já otimizada para o estudo de fósseis (Sanchez, et al. 2013; Tafforeau et al., 2006). Os dados reconstruídos nos foram disponibilizadas em formato TIFF.

4.4 Segmentação e modelagem tridimensional

As reconstruções tomográficas foram trabalhadas no software Amira versão 5.5, da FEI

A segmentação foi realizada através da seleção de voxels (pixeis volumétricos) de acordo com sua intensidade, uma vez que essa informação está relacionada à composição química de cada estrutura. Os voxels correspondentes a cada tipo de estrutura foram selecionados em cada projeção, e associados a um material, para o qual pode-se associar uma cor, possibilitando observar cada estrutura com uma cor diferente na renderização final. Os dados da SR-CT, devido à sua alta resolução, forneceu pacotes de cerca de cinco mil até mais de dez mil fotos para cada um dos dois fósseis. Esses arquivos possuíam de dezenas até mais de três centenas de gigabytes de tamanho, portanto, para possibilitar uma análise mais rápida, a estratégia utilizada foi a separação em pequenos blocos de imagens, através da ferramenta chamada “lattice access”, permitindo a segmentação de pequenas partes dos fósseis de cada vez. A partir da superfície “surface” gerada com a renderização desses materiais, foi possível realizar sua modelagem e visualização tridimensional, permitindo análises morfológicas em alta resolução das estruturas encontra-das nos fósseis.

A análise e segmentação das imagens de CT foram importantes para que pudéssemos realizar uma análise prévia da anatomia dos fósseis, identificando as estruturas potencialmente cardíacas, e sele-cionando os espécimes mais promissores para os ensaios de SR-CT e as análises químicas. Já nos dados

26 da SR-CT, a análise e segmentação das imagens permitiu a obtenção de dados com alto contraste e re-solução das diversas estruturas internas preservadas nos fósseis.

4.5 Secção transversal de CNPEM-LNB 23P

Após a identificação de uma estrutura com formato semelhante ao de um coração pelas tomo-grafias, o espécime CNPEM-LNB 23P foi seccionado (Figura 10). A secção foi feita com serra diamantada de 1 mm de espessura, a fim de expor a estrutura de interesse para análises visuais e químicas.

Figura 10. Região onde o espécime CNPEM-LNB 23P foi seccionado afim de expor as estruturas para análises quími-cas.

4.6 Espectroscopia Raman

A espectroscopia Raman foi realizada em dois laboratórios:

- Laboratório de Astrobiologia do IAG-USP. Foi utilizado um equipamento de Micro-Raman Re-nishaw InVia com laser de excitação em 785 nm e detecção com CCD. Os dados foram adquiridos e anali-sados com o software Wire 3.4 da Renishaw, por modo de mapeamento de áreas.

27 - Laboratório de Quimiometria em Química Analítica do IQ-UNICAMP. Foi utilizado um espec-trômetro dispersivo Raman Station 400F da Perkin Elmer equipado com detector CCD e um laser diodo com excitação em 785 nm e potência máxima de 250 mW. Os espectros foram obtidos no software Spec-trum versão 6.3.5, por modo de mapeamento e análise de espectros pontuais.

4.7 Microfluorescência de Raios-X

A fluorescência de raios-x a nível micrométrico foi realizado no Laboratório Nacional de Luz Sín-crotron (LNLS), no campus do CNPEM em Campinas. A técnica foi realizada na linha XRF, que, graças à sua fonte de raios-x síncrotron, consegue obter uma ótica com resolução de feixe de 12x22 m. A técnica foi aplicada na forma de mapeamento elemental, e os resultados foram analisados no software PyMca, com seu aplicativo RGB correlator, onde é possível escolher até três elementos químicos para serem observa-dos simultaneamente na imagem gerada.

Zebrafish:

Realizamos mapeamento químico de dois espécimes de Zebrafish - Danio rerio (Hamilton 1822), previamente fixados em PFA 4%. Os espécimes foram desidratados em soluções crescentes de etanol por 30 minutos em cada concentração, incluídos em uma mistura de historesina e etanol (1:1) durante 3h em geladeira e depois transferido para resina pura overnight. Finalmente, os peixes foram transferidos para um molde de plástico em resina com catalisador (0.8%) para endurecimento e orientados lateralmente. Os blocos foram deixados a 50ºC até solidificação.

Essa espécie de peixe foi escolhida por seu pequeno tamanho e fácil manipulação. O objetivo era analisar quais elementos químicos estão presentes em estruturas específicas, tais como o coração, para posteriormente comparar com a sua distribuição nos peixes fósseis.