A secção de CNPEM-LNB 23P permitiu a observação de algumas estruturas do interior do espéci- me. É possível identificar, além da estrutura de interesse vista na tomografia, uma vértebra, espinhos, estômago com vestígios da carapaça de crustáceos e a musculatura axial, visivelmente degradada, com presença de cristais de quartzo originados durante a necrólise gasosa. Esse processo é bem documentado para os fósseis da região (Maisey, 1991), e o extravasamento do gás gerado leva a rupturas que permitem o influxo de água introduzindo minerais exógenos.
A estrutura observada na tomografia, com formato semelhante ao lúmen de um coração, apre- sentou uma textura e cor muito semelhantes às já observadas em tratos intestinais de outros espécimes de Rhacolepis buccalis tratados com ácido (Figura 28B). Tais características, juntamente com sua posição deslocada posteriormente à esperada para um coração, sem presença de outras estruturas também en- contradas ectopicamente, nos levaram a descartar a hipótese de que essa estrutura se trata de vestígios cardíacos, e nos fazem crer que essa estrutura é, na realidade, parte do trato gastrointestinal do peixe.
Figura 27. Porção anterior do corte obtido.
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Figura 28. A) Detalhe da estrutura analisada no CNPEM-LNB 23P, e B) trato intestinal observado em outro espécime após digestões com ácido. O formato sinusóide, a cor e a textura granulosa sugerem se tratar do mesmo tipo de estrutura.
6.4 Espectroscopia Raman
CNPEM-LNB 23P:Foi observado, no espectro da estrutura analisada, um pico em 1190 cm-1, atribuído a vibrações de estiramento C-C e C=C de estruturas tipo polieno (Dippel, 1999), um tipo de composto associado a ácidos graxos e betacaroteno (Marshall & Marshall, 2010). Também foram observados picos em 1250 e em torno de 1600 cm-1, espectros também encontrados e melhor elucidados no CNPEM-LNB 3P a seguir.
CNPEM-LNB 3P:
Foram observados, nos espectros Raman, picos intensos em 1250 e 1650 cm-1. Tais picos podem ser associados aos modos vibracionais de estiramento de ligações C=O (região 1650 cm-1), do estiramento de C-N, e das deformações de ligações N-H (ambos na região de 1200 cm-1). Esses modos vibracionais são chamados Amida I e Amida III, e a posição e intensidade das bandas Amida são sensíveis a mudanças estruturais da conformação de moléculas de proteínas, refletindo, portanto, sua estrutura secundária (Pelton et al. 2000). Esses resultados indicam a presença de matéria orgânica, mais especificamente tra- ços de remanescentes de proteínas.
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Figura 29. Espectros Raman obtidos para o CNPEM-LNB 23P (A) com picos em 1190, indicador de estruturas tipo polieno, e 1250 e 1550 cm-1. regiões de Amida I e Amida II. O espécime CNPEM-LNB 3P (B), também apresenta picos na região de Amida I e III (1250, 1650cm-1), regiões indicativas da presença de vestígios proteicos. Esses resultados indicam que a estruturas analisadas não se tratam de artefatos diagenéticos, tendo origem biogênica.
A possível presença de vestígios proteicos indica que a estrutura analisada tem origem orgânica e não se trata de um artefato diagenético.
6.5 Fluorescência de Raios-X
Zebrafish:O mapeamento químico do zebrafish permitiu a identificação de elementos que podem ser en- contrados associados a estruturas específicas. No corte sagital, o ferro foi observado em maiores concen- trações na região do coração, embora também tenha aparecido no trato gastrointestinal. O cálcio apare- ceu associado aos elementos ósseos e o zinco é observado em grandes concentrações nos ossos, escamas e intestino (Figura 31). No corte transversal observou-se o ferro apenas na região do coração e onde era possível ver acúmulo de sangue (prováveis vasos). O zinco foi encontrado na parte superior do coração
B
A
41 (átrio/seio venoso) e também nas escamas, vértebra e nadadeiras peitorais. O cálcio foi visto em toda a região óssea, também marcada pelo zinco (Figura 33).
Figura 30. Corte sagital do Zebrafish e estruturas observadas.
Figura 31. Mapeamento do Zebrafish em corte sagital. Observa-se o ferro (vermelho), em maiores concentrações na região do coração e intestino. O cálcio (azul) é visto nos ossos e o zinco (verde) é encontrado em grandes concentra- ções no esqueleto, escamas e intestino.
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Figura 32. Corte transversal do Zebrafish e estruturas observadas.
Figura 33. Mapeamento do Zebrafish em corte transversal. Observa-se o ferro (vermelho), em maiores concentra- ções na região do coração, além do cálcio (azul) nas nadadeiras e esqueleto e zinco (verde) nas escamas e esqueleto, e a sobreposição dos elementos.
43 O mapeamento do Zebrafish nos indicou que o ferro é um bom marcador de estruturas cardio- vasculares, mas também ocorre, juntamente com zinco, no trato digestivo.
CNPEM-LNB 23P:
Como o cálcio é encontrado por todo o fóssil devido à natureza calcária das concreções (CaCO3),
optamos por também observar a distribuição de manganês em nossos fósseis. É sabido que as concre- ções da Formação Santana são formadas por calcita, muitas vezes ricas em manganês (Viana & Richter, 1998), portanto esperamos que esse elemento seja indicador do processo diagenético, marcando, ines- pecificamente, estruturas que tiveram aporte de minerais exógenos.
O mapeamento do espécime CNPEM-LNB 23P indicou a presença de ferro em grandes quantida- des na matriz e em uma porção da musculatura axial, e distribuído de forma granular no estômago e na estrutura que acreditávamos ser coração. O zinco se apresentou em um perfil circundante a essas duas últimas estruturas, corroborando a hipótese de que o que se acreditava ser coração provavelmente seja parte do trato gastrointestinal. O manganês foi encontrado em grande quantidade na região da muscula- tura axial, sobrepondo-se ao ferro nessa estrutura, indicando que ambos são provavelmente decorrentes do processo de diagênese. Essa distribuição, associada à grande decomposição dessa estrutura corrobo- ram a hipótese de rompimento causado por produção de gases da decomposição. O manganês também foi visto distribuído inespecificamente, em menores concentrações, por diversas estruturas e também pela matriz, conforme o esperado para um elemento exógeno.
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Figura 34. Mapeamento de ferro (vermelho), zinco (verde) e manganês (azul) do espécime CNPEM-LNB 23P. O man- ganês é encontrado de forma inespecífica e sobrepõe-se ao ferro em parte da musculatura axial, indicando origem diagenética de ambos nessa estrutura. O ferro é também visto na matriz, e distribuído de forma granular na estru- tura de interesse e no estômago. Além do ferro, essas duas estruturas são circundadas por zinco, atestando uma mesma composição química que sugere se tratarem do mesmo tipo de estrutura, provável trato gastrointestinal.
Tal mapeamento nos forneceu mais informações acerca do processo diagenético, e corroborou as análises visuais que indicaram que a estrutura analisada é, de fato, parte do trato gastrointestinal.
CNPEM-LNB 3P:
No mapeamento do putativo coração de CNPEM-LNB 3P analisamos a presença de fósforo, indi- cador do já comentado processo de fosfatização. Este foi encontrado concomitante ao cálcio, indicando poder se tratar de apatita (Ca3(PO4)2), importante para preservação estrutural de tecidos moles (Briggs,
2003).
Observamos alguns pontos ricos em ferro, e analisamos a ocorrência de enxofre, para avaliar se esses elementos seriam concomitantes, indicando a possível presença de pirita (FeS2), que indicaria uma
45 origem diagenética do ferro. O mapeamento demonstrou que a maior parte do ferro não se encontra associado a enxofre, indicando que ele não é oriundo de pirita, podendo ter origem biogênica.
Figura 35. Mapeamento químico da estrutura potencialmente cardíaca de CNPEM-LNB 3P, com foco em sua análise tafonômica. O ferro é encontrado não associado ao enxofre, indicando ausência de influência diagenética por piriti- zação. O fósforo, associado ao cálcio, indica a ocorrência do processo de fosfatização, com possível formação de apatita, importante na preservação de tecidos moles.
Figura 36. Mapeamento químico de ferro (vermelho) zinco (verde) e manganês. O zinco é encontrado em maiores concen- trações à direita na estrutura, região asso- ciada ao trato de influxo do putativo cora- ção, resultado semelhante ao encontrado no zebrafish. O manganês é encontrado sobreposto a ferro, indicando contribuição dos processos diagenéticos nessa região.
46 O mapeamento desse espécime corroborou a hipótese de estrutura cardíaca, indicando a pre- sença de ferro e sugerindo uma origem não-pirítica do mesmo. Os indícios da ocorrência de fosfatização dão suporte às análises de imagem, uma vez que esse processo está associado à uma preservação morfo- lógica refinada das estruturas de tecido mole.
6.6 XANES
As principais regiões analisadas do espectro de absorção do ferro foram: número de ombros na pré-borda (7110 - 7120 ev), que fornece informação sobre as transições eletrônicas; a borda, cuja princi- pal informação é obtida pela derivada máxima da borda, e no caso do ferro, fornece informação sobre seu estado de oxidação (7120 – 7125 ev); e a região imediatamente após a borda (< 7130 ev), que na análise de uma mistura tem sua conformação gerada pela soma dos espectros que a compõe. A região acima de 7130 ev apresenta pouca informação distinguível nos espectros, por serem mais uniformes. A intensidade dos espectros varia conforme a concentração dos compostos, não tendo caráter informativo quanto à estrutura.
CNPEM-LNB 23P:
No CNPEM-LNB 23P foi possível observar que os espectro do ferro da estrutura de interesse são praticamente idênticos ao do espectro obtido no estômago e do corpo do peixe, corroborando os resul- tados de XRF de que a estrutura em questão é parte do trato gastrointestinal (Figura 37). Os espectros do estômago e estrutura analisada A apresentam um deslocamento da pré-borda em 7120 ev que indica contribuição de matriz, como pode ser visto na Figura 38. É também possível notar que todos esses es- pectros diferem consideravelmente dos espectros da hemoglobina, não indicando uma contribuição des- se composto (Figura 38).
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Figura 37. Espectro XANES do estômago, da estrutura de interesse em dois pontos, A e B, e de outra região do corpo do CNPEM-LNB 23P. Os espectros são uniformes, indicando mesma natureza química do ferro da estrutura de inte- resse e dos demais encontrados no interior do peixe.
Figura 38. Espectro XANES de CNPEM-LNB 23P, indicando que o ferro encontrado na estrutura de interesse apre- senta contribuição de matriz, assim como o espectro do estômago, observadas pelo deslocamento da pré-borda na região de 7120 ev. Todos esses espectros diferem significativamente do espetro da hemoglobina.
48 CNPEM-LNB 3P:
Os três espectros de absorção obtidos no putativo coração são uniformes, indicando mesma na- tureza química em toda a extensão da estrutura (Figura 39). A comparação com pirita, matriz e hemoglo- bina indica não haver contribuição direta desses compostos no espectro do possível coração. Não é pos- sível inferir contribuição direta de hemoglobina, pois, devido à limitação dessa técnica, para ser detecta- da ela necessitaria estar em concentrações mais elevadas que os demais minérios de ferro nessa região, o que implicaria na necessidade de uma altíssima preservação e ausência de degradação química, condição difícil de ser mantida no processo de fossildiagênese.
O ferro da matriz apresenta uma clara contribuição de pirita, observado pelo deslocamento da região da borda para regiões de menores energias, diferentemente do ferro do putativo coração. O gráfi- co das derivadas dos espectros permite uma melhor observação dessas informações (Figuras 41 e 43).
Os espectros dos minerais de ferro identificaram uma provável contribuição de magnetita e/ou hematita, e uma não-expressiva contribuição de goetita no espectro putativo coração de CNPEM-LNB 3P. Não foi possível diferenciar as contribuições de magnetita e hematita por apresentarem espectros muito semelhantes (Figura 42).
O espectro da pirita tem uma borda e pré-borda muito características, com ombro na região de 7118 eV (Figuras 40 e 41). Por ser um com Ferro II, sua borda de absorção é deslocada para a esquerda em relação à borda dos compostos de Ferro III, como visto nos espectros da magnetita, hematita, goetita, e do putativo coração, cuja derivada máxima da borda fica em torno de 7125 ev (Figuras 41 e 43).
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Figura 39. Espectros XANES de diferentes regiões do possível coração de CNPEM-LNB 3P. Embora com diferentes intensidades, os espectros apresentam a mesma estrutura, indicando mesma natureza química nas três regiões analisadas do putativo coração.
Figura 40. Espectros XANES do possível coração, hemoglobina, pirita e matriz do fóssil. A pirita apresenta um espec- tro característico, cuja contribuição é observada no deslocamento da borda da matriz. Tanto esses espectros quanto o da hemoglobina se mostram bem diferentes do espectro do possível coração.
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Figura 41. Gráfico das derivadas dos espectros de pirita, matriz, putativo coração de CNPEM-LNB 3P, estômago e estrutura analisada do CNPEM-LNB 23P (agora já descartada a classificação como coração), no qual é possível analisar mais claramente as regiões de pré-borda e inicio da borda do espectro de absorção. Na pré-borda é possível observar que o estômago de CNPEM-LNB 23P e o putativo coração de CNPEM-LNB 3P apresentam dois ombros, embora em regiões diferentes, enquanto os demais apresentam apenas um, na mesma região de energia do ombro da pirita, indicando contribuição da mesma. Com exceção do putativo coração de CNPEM-LNB 3P, todos os espectros apresentam pico na faixa de 7118 ev, região da derivada máxima da pirita, indicando fortemente contribuição desse mineral na pré-borda do espectro dessas estruturas.
Figura 42. Espectro dos minerais de ferro comparados aos do possível coração. Observa-se maior contribuição dos espectros de hematita e magnetita, em relação à goetita, ao espectro do fóssil.
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Figura 43. Gráfico das derivadas dos espectros do putativo coração de CNPEM-LNB 3P, Magnetita, Hematita e Goeti- ta. A pré-borda de CNPEM-LNB 3P apresenta dois ombros em energias mais baixas que os ombros das demais amos- tras. A região da borda, observada pelas derivadas máximas indicadas pelas linhas, mostra que a energia dos picos de magnetita e hematita é semelhante ao do fóssil, enquanto o pico da goetita apresenta conformação diferente.
7 Conclusões
Nesse trabalho estudamos fósseis do peixe teleósteo basal Rhacolepis buccalis através de uma combinação de técnicas paleontológicas clássicas e recursos físicos ainda pouco utilizados de maneira combinada na área de paleontologia. A utilização de técnicas de imagem, em especial a Tomografia Sín- crotron por Contraste de Fase, forneceu informações sobre a estrutura interna dos fósseis com um alto grau de detalhes, mostrando que é possível se acessar, de forma não destrutiva, muitas informações em resolução micrométrica, o que não seria possível através das técnicas tradicionalmente aplicadas no es- tudo de fósseis. As técnicas de espectroscopia, por sua vez, são uma fonte muito importante de informa- ções químicas, permitindo o entendimento tanto da natureza biológica das estruturas, quanto de seu processo diagenético e do seu estado de preservação.
No espécime CNPEM-LNB 23P foi observada, através da CT uma estrutura que, embora estives- se em uma posição posterior à esperada, uma vez que o coração nos vertebrados localiza-se medialmen-
52 te à cintura peitoral e posterior às brânquias, apresentava um formato muito sugestivo dos contornos internos de um coração, o que nos levou a lançar a hipótese de que ela representaria um coágulo intra- cardíaco fossilizado. Após a realização de secções transversais neste fóssil, análises químicas e visuais indicaram uma composição química e textura muito semelhantes à do conteúdo gastrointestinal fossili- zado, e os dados de SR-CT permitiram a observação das demais estruturas preservadas na região, mos- trando não ter havido arraste de estruturas internas que justificasse sua posição ectópica, em se tratando de um coração. Juntos, esses resultados nos permitiram descartar a hipótese de que a estrutura em ques- tão se tratasse de um coração fóssil.
No CNPEM-LNB 3P, o putativo coração observado após digestões com ácido apresentou uma lo- calização anatômica idêntica à esperada, medialmente à cintura peitoral e posterior às brânquias. Sua morfologia, analisada através dos ensaios de tomografia, é de uma estrutura tridimensional, com conti- nuidade no interior do fóssil. É possível observar uma clara estrutura côncava com aparentes válvulas preservadas em seu interior, que permitem a classificação dessa estrutura como um cone arterioso, uma vez que o bulbo não apresenta válvulas. É possível visualizar também os contornos superficiais de um átrio e ventrículo, cuja conformação interior sugere a preservação de um lúmen com textura de um coá- gulo sanguíneo. As câmaras estão dispostas em formato de “S”, observando-se por fim uma região refe- rente ao seio venoso, portando vasos identificados como Ductos de Cuvier.
Neste espécime, a espectroscopia RAMAN sugere a existência de ligações químicas orgânicas nos modos vibracionais chamados Amida I e Amida III, o que indicaria a preservação de vestígios protei- cos.
As análises de -XRF indicaram a presença de fósforo, indicando a ocorrência do processo de fosfatização, importante para a preservação de tecidos moles. O ferro se mostrou presente, mas não concomitante ao enxofre. Tal indício descarta a possibilidade de que ele seja oriundo do processo de piritização, o que foi confirmado com a espectroscopia XANES. Esta última também indicou que o ferro
53 encontrado no putativo coração é de origem diferente do ferro encontrado na matriz do fóssil. A matriz analisada, contrapondo-se à estrutura cardíaca, apresentou uma clara contribuição de pirita em seu es- pectro, observado pelo deslocamento da borda de absorção de raio-x para regiões de menores energias. Nessa estrutura identificada como coração, os espectros de absorção do ferro são uniformes em todos os pontos avaliados em sua extensão, e também indicam se tratar de ferro tipo III, indicando um ambiente oxidante durante o processo de fossilização. Esse estado de oxidação é também encontrado em hemati- ta, magnetita, goetita, e hemoglobina, entretanto só é possível identificar a contribuição clara dos dois primeiros compostos no espectro do coração fóssil. A baixa concentração de ferro remanescente de na- tureza sanguínea, se comparado à dos minerais formados, é um fator limitante para a identificação de vestígios de hemoglobina através dessa técnica.
Diante do exposto, a associação das análises químicas e morfológicas nos permite classificar a estrutura encontrada como um coração fóssil. A presença de estruturas semelhantes a duas válvulas na estrutura identificada como cone arterioso corroboram essa classificação, sugerindo que essa espécie pode trazer informações sobre a transição da condição de cone bem desenvolvido e com múltiplas válvu- las dos peixes não-teleósteos, para a condição de cone ausente ou pouco desenvolvido, sem válvulas, encontrada nos teleósteos mais derivados (e.g. Cluepeocephala) (Icardo, 2006; Parsons, 1866). Um estu- do mais aprofundado dessa estrutura em um maior número de espécimes se mostra viável através da utilização da Tomografia Síncrotron de Contraste de Fase.
A descrição de uma estrutura cardíaca fóssil através da combinação de técnicas de imagem e es- pectroscopia abre perspectivas para um campo ainda inexplorado no que tange o estudo de tecidos mo- les, e em especial a evolução do coração dos vertebrados. As técnicas, em especial as não destrutivas, se mostram com um grande potencial de elucidação, passível de ser aplicado em um amplo registro fóssil ainda não examinado, permitindo avanços no entendimento tafonômico, morfológico, evolutivo e ana- tômico de inúmeras estruturas de tecido mole, tais como o sistema cardiovascular.
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Referências bibliográficas
Assine, M. L. (1990). Sedimentação e tectônica da Bacia do Araripe, Nordeste do Brasil. Rio Claro. 124 p. Dissertação (Mestrado em Geociências) − Universidade Estadual Paulista.
Assine, M. L. (1992). Análise estratigráfica da bacia do Araripe, Nordeste do Brasil. Revista Brasileira de
Geociências, 22(3), 289-300.
Assine, M. L. (2007). Bacia do Araripe. Boletim de Geociências da PETROBRAS, 15(2), 371-387.
Assine, M.L. Sedimentação e Tectônica da bacia do Araripe (Nordeste do Brasil). Rio Claro, 1990.
Beurlen, K. (1966). Novos equinóides no Cretáceo do Nordeste do Brasil. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 38(3-4), 455.
Beurlen, K. (1971). As condições ecológicas e faciológicas da Formação Santana na Chapada do Araripe (Nordeste do Brasil). Anais da Academia Brasileira de Ciências, (pp. 43: 411- 415.). Rio de Janeiro. Beurlen, K. 1963. Geologia e Estratigrafia da Chapada do Araripe. In: Congresso Nacional de Geologia, 17,
Recife. Anais..., Recife, p. 1-47.
Bourne, G. (1980). Hearts and Heart-Like Organs. New York: Academic Press.
Briggs, D. E. G. (2003). The role of decay and mineralization in the preservation of soft-bodied fossils. Annual Review of Earth and Planetary Sciences, 31, 275–301.
Brito, P. M., & Yoshitaka, Y. (2011). An updated review of the fish faunas from the Crato and Santana formations in Brazil , a close relationship to the Tethys fauna, 107–136.
Brito-Neves, B. (1990). A Bacia do Araripe no contexto geotectônico regional . In: D. d. Campos, Atas do Simpósio Brasileiro Sobre a Bacia da Araripe e Bacias Interiores do Nordeste (pp. 21-33). Crato. Brusca, R.C., Brusca, G.J., 2003. Invertebrates, segunda edição. Sinauer Associates, Sunderland, MA Buzug, T. M. (2008). Computed Tomography. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg.
Campos, D. de A., & Kellner, A. W. A. (1985). Panorama of the flying reptiles study in Brazil and South America. Anais da Academia Brasiliseira de Ciências, 57 (4), 453–466.
Carvalho, M. (2010). Ontogenia comparada do esplancnocrânio, aparelho de Weber e esqueleto caudal de três espécies de Otophysi, com ênfase em Siluriformes (Pisces, Teleostei). Universidade de São Paulo.
56 Carvalho, M. R. de, and Maisey, J. G. (1996). Phylogenetic relationships of the Late Jurassic shark Proto-
spinax Woodward (1919) (Chondrichthyes: Elasmobranchii). 9–49 in Arratia, G. and ViohL, G., eds.