UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA
COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA MECÂNICA
Utilização de Membranas de Poli (L-ácido
láctico) em Regeneração Tecidual Guiada para
Periodontia
Autor: Lucas Alves Moura
Orientadora: Eliana Ap. Rezende Duek
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA
COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA MECÂNICA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MATERIAIS
Utilização de Membranas de Poli (L-ácido
láctico) em Regeneração Tecidual Guiada para
Periodontia
Autor: Lucas Alves Moura
Orientadora: Eliana Ap. Rezende Duek
Curso: Engenharia Mecânica
Área de concentração: Engenharia de Materiais e Processos de Fabricação
Dissertação de mestrado acadêmico apresentada à comissão de Pós Graduação da Faculdade de Engenharia Mecânica, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Engenharia Mecânica.
Campinas, 2007 SP – Brasil
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA - BAE - UNICAMP
M865u
Moura, Lucas Alves
Utilização de membranas de poli (L-ácido láctico) em regeneração tecidual guiada para periodontia / Lucas Alves Moura. --Campinas, SP: [s.n.], 2007.
Orientador: Eliana Aparecida de Rezende Duek Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica.
1. Biomateriais. 2. Polímeros na medicina. 3. Ossos - Regeneração. 4. Periodontia. I. Duek, Eliana
Aparecida de Rezende. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Mecânica. III. Título.
Título em Inglês: Use of poly (L-lactic acid) membranes in guided tissue regeneration for periodontology
Palavras-chave em Inglês: Biomaterial, Poly (L-lactic acid), Guided tissue regeneration, Periodontal
Área de concentração: Materiais e Processos de Fabricação Titulação: Mestre em Engenharia Mecânica
Banca examinadora: Célia Marina de Alvarenga Freire e Arnaldo Rodrigues dos Santos Junior
Data da defesa: 10/07/2007
Dedicatória:
Dedico este trabalho a:
Os meus amados pais, Antonio Carlos e Regina Moura, que me forneceram conhecimento, condições e incentivo nesta empreitada longe de casa;
A minha irmã Carolina que sempre torceu por mim;
AGRADECIMENTOS
Este trabalho não poderia ter sido terminado sem a ajuda de certas pessoas a quem presto minha homenagem:
A Deus por me proteger e iluminar;
À Profª Draª Eliana Duek, minha orientadora, que me ajudou e inspirou em todos os momentos desta pesquisa;
Às minhas amigas do laboratório de Campinas que me ensinaram e ajudaram tanto, Márcia Tomaz e Grazielle Baraúna;
Aos meus Amigos do laboratório de Sorocaba: Denis Bastiton, que me auxiliou nas cirurgias dos animais, Carolina Lucchesi, que realizou os testes de DSC de minhas amostras e à Kátia Fernanda;
A Claudinete e ao José Luís que me ajudaram nos MEVs e no ensaio mecânico; À família da Vanessa que tanto me apoiou nestes anos aqui em Campinas.
Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende.
RESUMO
MOURA, Lucas Alves, Utilização de membranas de Poli (L-ácido láctico) em regeneração tecidual guiada para Periodontia, Campinas,: Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, 2007. 67p. Dissertação (Mestrado).
A regeneração tecidual guiada (RTG) é uma técnica utilizada na Periodontia para permitir a neoformação de um novo aparato de inserção periodontal do dente (osso alveolar, ligamento periodontal e cemento). Na Periodontia, a utilização de polímeros biorreabsorvíveis vem ganhando confiabilidade e importância devido a não necessidade de uma segunda intervenção cirúrgica para remover a membrana, porém poucas membranas atendem a todos os critérios da RTG, que são biocompatibilidade, exclusão celular, manutenção do espaço a ser regenerado, integração à atividade tecidual, facilidade de utilização e atividade biológica. Um polímero biorreabsorvível muito estudado é o poli (L-ácido láctico) (PLLA), porém ele é polímero semicristalino muito rígido e com longo período de degradação, contudo ao se adicionar em sua composição um plastificante, o tri-etil-citrato, a membrana resultante seria mais flexível, microporosa e teria seu tempo de degradação reduzido. Esta pesquisa avaliou, através de estudo in vivo, a resposta inflamatória e a manutenção de um espaço vital para a regeneração óssea sob membranas de PLLA/tri-etil-citrato, em três diferentes proporções polímero/plastificante, implantadas na calota craniana de coelhos, analisando, assim, a capacidade destas membranas em se adaptar aos critérios da RTG periodontal. Paralelamente ao estudo in vivo, foram realizados estudos da degradação in vitro, com ensaios mecânicos de tração, de microscopia eletrônica de varredura e de calorimetria diferencial de varredura (DSC). Notou-se que as membranas de concentração PLLA/tri-etil-citrato de 85/15 apresentaram características mais adequadas para a RTG periodontal tanto no estudo in vivo quanto no in vitro.
Palavras-chave:
Abstract
MOURA, Lucas Alves, Use of Poly (L-lactic acid) Membranes in Guided Tissue Regeneration for Periodontology, Campinas,: Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, 2007. 67p. Dissertação (Mestrado)
Guided tissue regeneration (GTR) is a technique used in the periodontal practice to allow the neoformation of a new apparatus of teeth periodontal attachment (alveolar bone, periodontal ligament and cementum). In Periodontology, the use of bioresorbable polymers is gaining trustworthiness and importance due the non required second surgical intervention to remove the membrane, however few membranes fit in all GTR criteria, which are biocompatibility, cellular exclusion, space maintainer, integration to tissue activity, easy usage and biological activity. A bioresorbable polymer very studied is poly(L-lactic acid) (PLLA), however it is a very rigid semicrystalline polymer and with a long degradation period, but by adding in its composition a plasticizer, the tri-ethyl-citrate, the resultant membrane would be more flexible, microporous and would have its degradation time reduced. This research evaluated, through in vivo study, the inflammatory response and the maintenance of a vital space for bone regeneration under PLLA/tri-ethyl-citrate membranes, in three different polymer/plasticizer proportions, implanted in rabbits calvarial bone, analyzing, thus, the capacity of these membranes in adapting to the criteria of periodontal GTR. Simultaneously to this study, it had been carried out studies of in vitro degradation, with mechanical testing, scanning electronic microscopy and differential scanning calorimetry (DSC). It was observed, that the highest concentration membranes PLLA/tri-ethyl-citrate (85/15) showed themselves more adequate characteristics for the periodontal GTR on in vivo study as well on in vitro.
Keyword:
Índice
Lista de figuras ... XI
Lista de tabelas ... XII
Nomenclatura ... XIII
Introdução ... 1
Revisão bibliográfica ... 3
2.1 Polímeros biorreabsorvíveis ... 4
2.2. O periodonto ... 10
2.3. Regeneração tecidual guiada (RTG) na periodontia ... 14
Materiais e métodos ... 19
3.1. Preparo e caracterização das membranas de PLLA ... 19
3.1.1. Caracterização das amostras ... 20
3.2. Estudo da degradação hidrolítica ... 20
3.2.1 Análises e ensaios de caracterização das amostras ... 20
3.3. Animais ... 22
3.4. Procedimento cirúrgico ... 22
3.5. Processamento do material ... 24
3.6. Preparação das lâminas ... 25
3.6.2. Parâmetros qualitativos ... 26
3.6.3. Parâmetros quantitativos ... 26
Resultados e Discussão ... 27
4.1 Estudo in vitro ... 27
4.1.1 Avaliação macroscópica ... 27
4.1.2 Avaliação por microscopia eletrônica de varredura ... 28
4.1.3 Ensaio mecânico de tração ... 32
4.1.4 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) ... 37
4.2 Estudo in vivo ... 44
4.2.1 Avaliação macroscópica ... 44
4.2.2 Avaliação microscópica ... 45
Conclusões ... 59
Sugestões para Próximos Trabalhos ... 60
Lista de Figuras
Figura 1. Fórmula estrutural dos poli α-hidróxi ácidos. ... 5
Figura 2. Esquema da polimerização do anel diéster cíclico. ... 6
Figura 3. Esquema simplificado da degradação do Poli (ácido láctico). ... 8
Figura 4. Hidrólise da ligação éster. ... 8
Figura 5. Destruição do osso alveolar. ... 12
Figura 6. Simulação de como age a membrana de RTG. ... 15
Figura 7. (A) Agitação magnética da mistura PLLA, tri-etil-citrato e dicloro-metano; (B) cuba de vidro saturada por solvente. ... 20
Figura 8. Equipamento Material Testing Systems (MTS) modelo 810 ... 21
Figura 9. Seqüência cirúrgica na calvária de coelhos. ... 24
Figura 10. Membranas de PLLA/Tri-etil-citrato degradadas ... 28
Figura 11. Micrografias eletrônicas de varredura da superfície de membranas de PLLA/tri-etil-citrato. ... 29
Figura 12. Micrografias eletrônicas de varredura da fratura de membranas de PLLA/tri-etil-citrato. ... 30
Figura 13. Fotomicrografias eletrônicas de varredura das membranas de PLLA/tri-etil-citrato ... 31
Figura 14 Curvas de Tensão x Deformação. ... 33
Figura 15. Curvas de Tensão x Deformação ... 34
Figura 16. Termogramas a partir de DSC. ... 37
Figura 17 Termogramas a partir de DSC ... 38
Figura 18. Termogramas a partir de DSC ... 38
Figura 19. Observação macroscópica das calotas cranianas de coelho. ... 45
Figura 20. Fotomicrografia da membrana de PLLA/tri-etil-citrato 85/15 ... 46
Figura 21. Fotomicrografia da membrana de PLLA/tri-etil-citrato 80/10 ... 47
Figura 22. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 95/5 ... 48
Figura 23. Fotomicrografa do defeito controle. ... 49
Figura 24. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 85/15. ... 50
Figura 25. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 90/10. ... 51
Figura 26. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 95/5 ... 52
Figura 27. Fotomicrografa do defeito controle ... 53
Figura 28. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 90/10 ... 55
Figura 29. Fotomicrografia do defeito controle. ... 55
Lista de Tabelas
Tabela 1. Ensaio mecânico de tração para as amostras em função do tempo de degradação. ... 36
Tabela 2. Dados do primeiro aquecimento do DSC para as amostras 95/5, 90/10 e 85/15. ... 42
Tabela 3. Dados do segundo aquecimento do DSC para as amostras 95/5, 90/10 e 85/15. ... 43
Nomenclatura
Tg – Temperatura de transição vítrea (ºC)
Tc – Temperatura de cristalização (ºC)
Tm – Temperatura de fusão (ºC)
Mw – Massa molar ponderal média (Daltons)
ΔHM – Entalpia de fusão experimental (J/g)
ΔHC – Entalpia de cristalização experimental (J/g)
ΔH – Variação de entalpia (J/g)
GC – Grau de cristanilidade (%)
Letras gregas
χ - Grau de Cristanilidade (%)
Abreviações
ASTM – American Society of Testing Materials CO2 – Dióxido de carbono (gás carbono)
Da – Daltons
DMC – Diclorometano
DSC – Calorimetria diferencial de varredura H2O – Água
KV – Quilovolts
MEV – Microscopia eletrônica de varredura MO – Microscopia óptica
MPa – Megapascal N – Newton
PBS – Solução tampão fosfato salina PDLA – poli(D-ácido láctico) PLA – poli(ácido láctico) PLLA – Poli(L-ácido láctico) PDLLA – Poli(L-DL-ácido láctico) PGA – poli (ácido glicólico)
PTFE-e – Poli-tetrafluoretileno expandido RTG – Regeneração tecidual guiada
Capítulo 1
Introdução
A regeneração periodontal é definida como regeneração dos tecidos de suporte do dente, incluindo osso alveolar, ligamento periodontal e cemento. A regeneração tecidual guiada (RTG) é uma técnica que envolve a utilização de membranas, para permitir a repopulação do defeito periodontal por células desejáveis, resultando no chamado novo aparato de inserção (Warrengton, 2004). As células que podem repovoar a superfície radicular após uma cirurgia de retalho são as células oriundas do epitélio gengival, do osso alveolar e do ligamento periodontal.
A procura por materiais apropriados para aplicações no periodonto levou pesquisadores a desenvolverem e testar novos materiais que não necessitassem de uma segunda intervenção cirúrgica. Com isso, iniciaram-se estudos de uma família de polímeros muito atrativa e promissora, os α-hidróxi ácidos, pois além de biorreabsorvíveis, eles também são biocompatíveis, podendo ser utilizados em diversas aplicações na área médica. Implantes de polímeros biorreabsorvíveis são utilizados em diversas aplicações, como suporte para cultura de células, órgãos e peles artificiais, suturas cirúrgicas, liberação controlada de drogas e reparos ortopédicos (Davis & Vacanti, 1996; Furukawa, 2000).
O PLA está presente em várias formas estéreo-isométricas e a mais importante sendo o poli (L-ácido-láctico) (PLLA). Este polímero é metabolizado em ácido láctico e excretado no ciclo de Krebs. Dados seus graus de biocompatibilidade e degradação, o PLLA é bem tolerado pelo organismo, podendo ser utilizado não apenas como uma barreira ou substituinte físico, mas também favorecendo a regeneração óssea e tecidual (Lolito et al., 2002).
Estas substâncias são biocompatíveis e quando implantadas no organismo são degradadas primeiramente por hidrólise e finalmente pelo metabolismo do ciclo de Krebs, liberando CO2 e
água (Cordewerner et al., 1995; Pezzin & Duek, 2002), além de apresentar ótimas características físicas, alta resistência mecânica quanto à compressão e tração, comportamento termoplástico e disponibilidade de fonte renovável (Gajaria, 1996).
Para que se possam utilizar esses materiais para implantes em seres humanos, é necessária, primeiramente, uma avaliação precisa do dispositivo, a fim de satisfazer uma série de exigências para suas aplicações como, por exemplo, apresentar biocompatibilidade, não provocando um processo inflamatório agudo ou crônico em tecidos adjacentes (Ambrosio et al., 2003; Rhee, 2004).
A possibilidade de controlar a flexibilidade e o tempo de degradação de membranas para a RTG periodontal é uma das principais vantagens da membrana de PLLA em relação às demais comercialmente utilizadas. O principal problema relacionado com o uso das membranas comerciais é que a precoce reabsorção das mesmas, associada com a falta de rigidez de sua estrutura pode ocasionar o colapso das membranas para o interior dos defeitos ósseos, interferindo, deste modo, no processo regenerativo.
Baseado nessas informações e nos resultados obtidos pelo grupo em estudos com membranas de PLLA com plastificante, no qual se obteve um controle do tamanho dos poros e do tempo de degradação das membranas em função da concentração de plastificante (Scapin et al., 2003), observou-se que o material resultante desse estudo tem apresentado propriedades adequadas para aplicação em RTG periodontal.
O propósito deste trabalho foi avaliar as características de membranas de PLLA com plastificante (tri-etil-citrato), em diferentes proporções in vitro e in vivo, através de estudos em calvária de coelhos.
Capítulo 2
Revisão Bibliográfica
O avanço tecnológico e científico na área da saúde se deu graças ao desenvolvimento de novas técnicas e materiais que melhor atenderam determinadas funções. Como por exemplo, o desenvolvimento de próteses ortopédicas/odontológicas a partir do titânio, materiais para reconstrução crânio-maxilofacial à base de biocerâmicas e a reconstrução de tecidos moles a partir do emprego de biomateriais poliméricos biorreabsorvíveis (Donos et al., 2005).
2.1 Biomateriais
Um material biocompatível pode ser definido como aquele que uma vez implantado no organismo, não provocará uma resposta tecidual exacerbada, tal como uma diferenciação desapropriada dos tecidos circunjacentes ao implante (Schaldach, 2000).
Os requisitos médicos para considerar um material como biomaterial são restritos, pois o material a ser implantado, enquanto restaura a função comprometida, deve também garantir que não haja, a longo ou médio prazo, qualquer distúrbio no organismo do paciente (Schaldach, 2000).
Alguns fatores devem ser levados em consideração para a escolha e utilização do biomaterial como o limite de tolerância que o tecido apresenta no que se refere à remoção dos produtos de degradação, visto que se este for excedido, poderão ocorrer respostas inflamatórias indesejáveis no tecido, diminuição do tempo de vida útil do dispositivo, reabsorção óssea ou
mesmo necrose do tecido. Os biomateriais mais empregados atualmente são os metálicos, cerâmicos e poliméricos (Pistner et al., 1993).
Os dispositivos metálicos apresentam uma grande dureza e resistência quando confrontados às características dos tecidos humanos, são comumente utilizados como dispositivos para fixação interna de fraturas. As vantagens destes implantes são basicamente: um curto período de recuperação e a exata reposição do osso faturado. Entretanto há inúmeras desvantagens como possível estresse do osso e relativa osteoporose, devido a ausência de funcionamento e transmissão de cargas pelo local do implante; reações alérgicas contra diferentes componentes do metal (Steinhauser, 1968; Bradley et al., 1979) problemas de corrosão (Cohen & Wulf, 1972) sensibilização térmica (Weiler et al., 1996) e em caso de dispositivos temporários, existe, muitas vezes, a necessidade de uma segunda cirurgia para a remoção do implante.
Estes problemas praticamente deixam de existir quando se trata de implantes poliméricos biorreabsorvíveis, que vem a ser implantes que cumprem somente uma função temporária no organismo, uma vez que assim que o tecido ou órgão se regeneram eles degradam por ação dos fluidos orgânicos.
2.1 Polímeros biorreabsorvíveis
O critério para seleção de um polímero para uso com biomaterial envolve dois fatores: as propriedades mecânicas e o tempo de degradação em função das necessidades de aplicação (Middleton & Tipton, 2000). Um polímero ideal para uso com biomaterial biorreabsorvível deve apresentar as seguintes características: não provocar respostas inflamatórias acima do normal no tecido implantado; ser metabolizado pelo organismo após ter cumprido sua função; ser processado em um produto final de forma fácil e ser facilmente esterilizável.
Polímeros sintéticos bioabsorvíveis normalmente mimetizam moléculas naturais, como proteínas e celulose, pois esses polímeros contem ligações hidrolisáveis ao longo de sua cadeia susceptíveis a biodegradação por microorganismos ou enzimas hidrolíticas.
Embora muitos grupos de polímeros venham sendo estudados por suas propriedades biodegradacionais, a família dos α-hidróxi ácidos são os mais estudados e com melhores resultados tanto fisiológicos quanto mecânicos.
Dentre os poli α-hidróxi ácidos, o poli (ácido láctico) (PLA) e o poli (ácido glicólico) (PGA) são os mais utilizados. O campo de aplicação destes polímeros é vasto como implantes (Kulkarni et al., 1996); materiais de sutura (Cutright et al., 1971); próteses, materiais de reparação ortopédica (Rozema et al., 1991); pinos intramedulares (Manninen et al., 1992); na área odontológica (Zislis et al., 1989) e em liberação controlada de fármacos (Domb et al., 1994). Estes polímeros biorreabsorvíveis, brevemente, irão substituir implantes metálicos, devido suas várias vantagens sobre estes: não criam pontos de estresse; não há a necessidade de sua remoção após a cirurgia; e não apresentam corrosão metálica (Chen et al., 2003).
Os poli α-hidróxi ácidos possuem a capacidade de degradar em meio aos fluidos corpóreos devido às cisões hidrolíticas de suas ligações ésteres (Dittrich, 1971). A fórmula estrutural dos poli α-hidróxi ácidos é exibida abaixo na Figura 1.
Figura 1. Fórmula estrutural dos poli α-hidróxi ácidos. PLA quando R=CH3 e PGA quando R=H.
No caso do poli (ácido láctico) a quiralidade de carbono α permite a síntese de dois enantiômeros, o poli (D-ácido láctico) (PDLA) e o poli (L-ácido láctico) (PLLA).
Segundo Dittrich (1971), esses materiais têm diferentes propriedades, como, por exemplo, suas velocidades de degradação, pois o grupo metila é responsável por dois efeitos na cinética de biodegradação: o aumento da hidrofilicidade, e o impedimento estérico na reação de hidrólise. A cinética hidrolítica do PDLA tem sido verificada mais rápida do que em seu análogo, o PLLA (Gilding, 1981).
O poli (L-ácido láctico) (PLLA) é um polímero semicristalino com ponto de fusão em torno de 180ºC e uma cristanilidade por volta de 70%, tornando sua degradação mais lenta em relação aos demais poli (lactides). Esses polímeros podem ser sintetizados a partir da abertura do anel de diésteres cíclicos na presença de catalisadores (Figura 2) (An et al., 2000). As
O
H R
O
O
R H
O
O
H
R
O
O
H
R
O
O
propriedades mecânicas apresentadas por este polímero são muito boas, já que apresentam uma boa resistência à tração e um alto módulo de Young (Vert et al., 1994).
Figura 2. Esquema da polimerização do anel diéster cíclico para obtenção do poli α-hidróxi ácido.
Algumas técnicas possibilitam analisar as características do processo de degradação desses polímeros. Com a calorimetria diferencial de varredura (DSC), obtém-se a cristanilidade e a temperatura de transição vítrea do polímero (Göpferich et al., 2000); com a microscopia eletrônica de varredura (MEV), obtém-se a morfologia externa do polímero e do tecido ao redor do implante. Através da microscopia óptica (MO), podem-se observar as células envolvidas na reação ao implante. Os ensaios mecânicos de tração possibilitam avaliar o comportamento mecânico do implante (Jones, 1999; Shalaby, 1998).
De acordo com Vert et al.. (1994) pode-se definir biodegradação como o processo de perda de massa, ou degradação das cadeias macromoleculares sem a eliminação dos produtos e subprodutos pelo organismo. Bioabsorção é o conceito associado aos materiais que são dissolvidos, sem clivagem da cadeia polimérica, em fluidos corpóreos. Por último, polímeros biorreabsorvíveis são aqueles que quando implantados sofrem primeiramente quebra de suas cadeias e posteriormente eliminação de seus subprodutos por vias metabólicas do corpo.
A degradação do polímero é um fator importante, pois determina o tipo e a intensidade da resposta biológica ao implante, já que a ocorrência de partículas poli, oligo e monoméricas liberadas durante a degradação do polímero in vivo está diretamente correlacionada com uma mudança no tipo e intensidade da resposta inflamatória. Isso pode ser causado por produtos tóxicos provenientes da degradação ou pela mudança na rugosidade superficial e forma do implante durante a liberação de fragmentos. Além disso, a própria fagocitose dos fragmentos atua como um importante fator na modificação da resposta inflamatória. A fagocitose modifica o processo funcional do macrófago, que é o pivô na resposta inflamatória no tecido e na reação de
corpo estranho. As células gigantes observadas nesta fase são formadas pela fusão de macrófagos. A fagocitose de fragmentos também pode causar a morte celular e a liberação do conteúdo destas células mortas pode causar uma reação inflamatória aguda. (Hyon, 1985; Lam et al., 1995).
O processo de degradação hidrolítica pode ser caracterizado pela redução da massa molar, perda de tensão e perda de massa, simultaneamente. Primeiro, a água infiltra pelo polímero e ataca suas cadeias poliméricas causando sua cisão por hidrólise. Isso ocorre in vivo, havendo ou não atividade enzimática. Essa degradação ocorre mesmo com a umidade do ar, se o polímero não for armazenado em condições adequadas (Li et al., 1990; Pistner et al., 1993).
Perdas de tensão e de massa vão ocorrendo gradativamente, mas não linearmente, sendo maior no início do processo enquanto ocorre uma invasão de macrófagos e células gigantes que dão início a fagocitose das partículas degradadas. Finalmente, os macrófagos e células gigantes desaparecem, restando possivelmente um remanescente de cápsula fibrosa. A região onde existia o implante fica preenchida temporariamente por tecido conjuntivo (Mikos et al., 1998).
Silva et al. (2002), observaram a presença de células gigantes a partir do sétimo dia de implante. Estas células são originadas a partir da fusão de diversos macrófagos, em um processo induzido por citocinas tais como interleucina 4 e interferon-gama. Estas células agem geralmente em reações contra corpos estranhos no organismo, e apresentam um grande número de mitocôndrias, o que pode estar associado com a degradação do PLLA via ciclo de Krebs.
Com a quebra das cadeias há a formação de partículas menores que poderão ser fagocitadas por macrófagos, a digestão celular é realizada seguindo os caminhos normais estabelecidos pela célula através de suas atividades usuais e os produtos oxidados finais são de semelhantes aos presentes no organismo, tais como água e dióxido de carbono, excretados pelos rins e pelos pulmões (Ali et al., 1993).
Segundo Bostman (1991), há uma excelente biocompatibilidade dos poliésteres, pois os produtos da biodegradação metabólica do poli (ácido láctico) (CO2 e H2O) são reabsorvidos pelo
organismo. Neste caso, a degradação metabólica do PLA segue o processo de oxidação do ácido láctico, que por sua vez é convertido em ácido pirúvico. Na presença da acetil-coenzima A, ocorrerá liberação de CO2 e consequentemente a decomposição em citrato. Este citrato será então
incorporado no ciclo dos ácidos tricarboxílicos, que no final eliminará novamente CO2 e H2O,
Figura 3. Esquema simplificado da degradação do Poli (ácido láctico).
O mecanismo de degradação do PLA tem sido avaliado nos últimos anos e demonstrou ser heterogêneo. A presença de terminais ácidos catalisa a reação de degradação. Inicialmente, o processo é homogêneo, gerando oligômeros solúveis em água em toda a extensão do material. Os produtos presentes na superfície da matriz são difundidos para o meio, entretanto, a baixa taxa de difusão dos produtos da reação no interior do material gera um acúmulo de ácidos, fazendo com que estruturas densas tenham uma erosão inicial na superfície, mas apresentando uma degradação mais acentuada no centro. É o chamado efeito autocatalítico dos poli α-hidróxi ácidos. A degradação pode prosseguir por um processo biologicamente ativo (por enzimas dos fluidos orgânicos) ou pela simples clivagem hidrolítica passiva (Li, 1999). A Figura 4 exemplifica a cisão hidrolítica.
A autocatálise foi avaliada inicialmente por Li et al. (1990) estudado copolímeros amorfos de PDLLA. Segundo os autores, após 12 semanas de degradação in vitro em tampão fosfato, o interior do material desaparece. Resultados semelhantes também foram obtidos em estudos in vivo.
Pineda et al. (1996), implantaram membranas de PLA com poros de vários tamanhos em 15 coelhos para cobrir um largo defeito ósseo de 10 mm criado propositadamente. Radiografias pós-implante revelaram um hematoma na região do defeito que foi desaparecendo à medida que a formação de um novo tecido ósseo foi ocorrendo, independentemente do tipo de membrana utilizada. O autor concluiu que a função primária das membranas usadas para cobrir defeitos ósseos é a de preservar componentes osteogênicos presentes no espaço sob a membrana e garantir o crescimento das células na cavidade medular.
A taxa de absorção de um polímero bioabsorvível é influenciada por vários fatores, como grupos químicos da cadeia, estrutura, cristanilidade e o método de processamento do implante. O local do implante contribui com a taxa de metabolismo e quanto maior a circulação, maior será essa taxa (Athanasiou et al., 2000).
Lam et al. (1995), avaliaram a influência da morfologia de superfície e hidrofilicidade de membranas absorvíveis (PLLA, porosas e densas) e não absorvíveis Poli-tetrafluoretileno (PTFE) (Teflon) e PTFE expandido em relação à resposta inflamatória após implantá-las sob a derme de ratos. Foi constatado, através de medidas do ângulo de contato, que o PLLA é mais hidrofílico que o PTFE. Muitos estudos têm estabelecido que a adesão e a expansão celular sejam favorecidas em substratos hidrofílicos. Van der Valk et al. (1983), estudaram a interação de fibroblastos em superfícies poliméricas, tentando fornecer uma relação entre energia superficial livre e o espalhamento dos mesmos.
Propriedades como tipo de grupamento químico, relação entre hidrofilicidade/hidrofobicidade, anisotropia físico-química e contractilidade do substrato têm sido propostas como fatores que influenciam o comportamento de uma cultura de células. Lydon et al. (1985), apresentaram uma revisão sobre as relações entre as propriedades físico-químicas de um substrato e o comportamento celular, para uma série de polímeros sintéticos.
Vert et al. (1984), afirmaram que o grau de cristanilidade determina a taxa de absorção de água pelo polímero, o que consequentemente irá influenciar na velocidade de degradação do material.
A membrana produzida apenas com PLLA é densa, sem poros e rígida, por isso faz-se necessária a utilização de plastificante na composição das membranas. A inclusão de um plastificante nas cadeias de polímeros diminui a interação entre eles, mas aumenta a flexibilidade, porosidade e reduz o tempo de degradação do material (Scapin et al., 2003; Chen et al., 2003). Luciano (1997) observou que o plastificante causa uma variação significativa nas propriedades físicas e na interação biológica do implante. Sugeriu, ainda, que pequenas mudanças na concentração do plastificante possibilitariam obterem-se membranas com melhores condições de interação tecido-implante.
Ao adicionar tri-etil-citrato, como plastificante, às membranas obtidas por dissolução em solvente, constatou-se uma resposta biológica bem aceitável, com muito pouca inflamação inicial e uma rápida invasão celular em membranas com plastificante implantadas no subcutâneo de ratos. Ele observou que ao adicionar o plastificante, a membrana, antes densa, tornava-se totalmente porosa e tinha sua velocidade de degradação aumentada, o que favoreceu, muito, a invasão pelas células dos tecidos adjacentes. O autor sugeriu que controlando a quantidade do plastificante e a velocidade de evaporação do solvente poderia se controlar a porosidade do polímero e a velocidade de degradação, além das propriedades mecânicas dos implantes (Luciano, 1997). O plastificante atua nas cadeias poliméricas, diminuindo a interação entre as cadeias, favorecendo a flexibilidade da membrana. Como conseqüência, há a diminuição no valor da temperatura de transição vítrea (Duek, 1996).
Scapin et al. (2003) comprovou por meio de estudo in vivo que a adição do tri-etil-citrato, como plastificante nas membranas, não provocou processos inflamatórios graves, tampouco formação de tecido neoplásico.
A reação aos implantes pode ser estudada tanto in vitro quanto in vivo. A grande desvantagem de se estudar os efeitos in vitro é o fato de analisar-se o processo isoladamente sem a interação com sistemas fisiológicos do tecido hospedeiro, muito relevantes.
2.2. O periodonto
Os dentes são suportados pelo periodonto. O periodonto é um sistema de tecidos conjuntivos, protegidos por epitélio, que prende os dentes aos ossos mandibular e maxilar e proporciona um aparato continuamente adaptável para a mastigação. Há quatro tecidos
componentes de periodonto: a lâmina própria da gengiva, o ligamento periodontal, o cemento, e o osso alveolar. A lâmina própria da gengiva é protegida por epitélio pavimentoso estratificado queratinizado na sua superfície mastigatória e por epitélio não-queratinizado nas suas superfícies sulcular e juncional (Melcher, 1976).
A doença periodontal refere-se a um grupo de problemas que emergem do sulco gengival. Ela geralmente é dividida em dois grupos: Gengivite - que causa lesões aos tecidos periodontais de proteção; e Periodontite - que afeta o osso alveolar e os tecidos conjuntivos que suportam os dentes. A primeira é uma inflamação gengival normalmente crônica, mas pode assumir fases agudas. A segunda, por sua vez, é caracterizada pela inflamação gengival, com bolsas profundas (superiores a 3 mm), aumento na mobilidade dentária, culminando com a perda do elemento dentário (Simon, 2003) (Figura 5).
A doença periodontal é provocada por microorganismos presentes na placa bacteriana e seus produtos, que causam injúrias inflamatórias. Ocorre uma grande proliferação bacteriana e uma persistente resposta imunológica a estas infecções crônicas, as quais assumem um importante papel, não apenas na destruição dos tecidos periodontais, mas também em outras partes do corpo (Matthews, 2000; Durocher, 2003).
O processo se inicia com o ataque de bactérias. Mesmo em bocas saudáveis, o sulco gengival é habitado por uma variedade de bactérias, porém estas são inofensivas. A doença periodontal se desenvolve geralmente devido a dois eventos na cavidade oral: um aumento na quantidade e um desequilíbrio no balanço dos tipos bacterianos, ou seja, um aumento na quantidade de microorganismos nocivos. Estes microorganismos aumentam em massa e espessura até formarem um biofilme e posteriormente a placa (Simon, 2003).
Quando a placa é mantida na região periodontal, ela se transforma em cálculo. Este material tem a consistência sólida e se adere tenazmente à superfície dentária, sendo assim, muito mais difícil a sua remoção (Gibbons & Van Houte, 1980).
Figura 5. Destruição do osso alveolar, causando perda de inserção dentária.
Segundo Izadi (2002), o acúmulo e o metabolismo de bactérias na cavidade oral são considerados como a causa primária da periodontite, mais de quatrocentas espécies já foram isoladas e caracterizadas na placa dental. O acúmulo de bactérias nos dentes induz uma resposta inflamatória reversível no tecido gengival, mas para o local inflamado progredir a uma destruição tecidual permanente, a área tem de ser colonizada por alguns microorganismos potencialmente patogênicos.
Certas espécies subgengivais, na maioria bactérias Gram-negativas, têm sido relacionadas à etiologia das doenças periodontais destrutivas: Actinobacillus actinomycetemcomittans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermédia e Bacterioides sp. Estas espécies podem liberar produtos tóxicos na placa dental tal como endotoxinas (Mergenhagen et al., 1961), nucleotídeos de parede celular, ácidos orgânicos, aminas, e leucotoxinas (Socransky et al., 1998). Estes produtos ativam seqüências de eventos imunológicos que têm um impacto na iniciação e progressão da doença periodontal.
Em síntese, pode-se dizer que os processos inflamatórios e imunológicos nos tecidos periodontais são uma resposta, não simplesmente a uma espécie microbiana, mas à várias espécies e a seus produtos, agindo sobre um longo período de tempo (Izadi, 2002).
Sabe-se que frente à lesões, o tecido gengival tem uma ótima capacidade de se regenerar, porém o mesmo não ocorre quando a injúria atinge o aparato de sustentação periodontal –
ligamento periodontal e osso alveolar. Desta forma, ocorre a destruição das fibras do ligamento periodontal assim como do osso alveolar ligado a estas (Carranza & Newman, 1996).
Há diversas terapias para o tratamento da doença periodontal. A primeira é a remoção mecânica e química do acúmulo bacteriano da superfície corono-radicular dos dentes, com o auxílio de instrumentos raspadores. Este tratamento é eficaz nos casos mais simples e iniciais da doença. Conforme a doença progride, as alternativas de tratamento tornam-se mais complexas, por exemplo, quando há perdas ósseas em virtude de grande acúmulo de cálculo sobre os dentes, faz-se necessário empregar técnicas cirúrgicas a retalho, as quais expõem a raiz dos dentes facilitando sua descontaminação (Lindhe et al., 1999).
Entretanto, após a cirurgia periodontal a retalho, durante a cicatrização, ocorre uma rápida migração de células epiteliais para a superfície radicular, formando uma junção epitelial longa. Esta nova junção epitelial é capaz de bloquear parcialmente a invasão de microorganismos para dentro do sulco, porém não restabelece uma nova inserção dente-osso alveolar (Needleman et al., 2005). A RTG pode oferecer benefícios para esse tipo de cirurgia, como um aumento no nível de inserção gengival clínico, possibilidade de fechamento de defeitos periodontais (Cury et al., 2003).
Por estas razões, em casos em que há extensa perda óssea, culminando em mobilidade dental moderada, apenas a remoção dos depósitos de cálculo não sanará a doença. Foi a partir desta situação que Melcher (1976) propôs os princípios da regeneração tecidual guiada na periodontia.
A exclusão eficaz de células epiteliais ocorre quando um perfeito selamento é estabelecido entre a membrana e os bordos ósseos do defeito ou da raiz do dente. Se não, as células epiteliais podem migrar com a abertura da interface membrana-osso e comprometer o resultado clínico. Igualmente importante, a superfície da membrana voltada para o defeito deve permitir a formação do coágulo sangüíneo que irá maturar e possibilitar a diferenciação das células que regenerarão o periodonto (Takeishi et al., 2001).
2.3. Regeneração tecidual guiada (RTG) na periodontia
A técnica de RTG tem como princípio biológico a exclusão celular seletiva e pressupõe a utilização de uma barreira física interposta entre o retalho periodontal e a superfície radicular já tratada. Com o objetivo de defletir ou excluir o tecido conjuntivo, além de desviar a proliferação epitelial da superfície radicular, criando um espaço protegido que poderá ser repovoado por células originárias do ligamento periodontal e do periósteo remanescentes, condunzindo assim a regeneração do periodonto (Gottlow et al., 1986).
Laurell et al. (2006) investigaram a estrutura dos tecidos periodontais formados após a terapia de regeneração tecidual guiada (RTG) em bolsas (defeitos) intra-ósseos em macacos. Eles observaram que a dimensão e a composição do novo ligamento periodontal se reestabilizavam completamente após seis meses da cirurgia. Quando comparados os ligamentos periodontais regenerados e intactos a proporção de fibroblastos, vasos sanguíneos e fibras colágenas era similar aos ligamentos periodontais intactos.
Varios fatores devem ser levados em consideração quando se utiliza membranas. Dentre eles estão os relacionados ao paciente, ao procedimento e período de cura, e os relacionados ao defeito (Kornman & Robertson, 2000). Dentre os relacionados ao paciente, a importância do controle do biofilme bacteriano e da recolonização após a cirurgia é primordial. Mesmo avaliando-se criteriosamente o tipo de defeito e executando-se um controle adequado de placa, um fato indesejável, porém relativamete frequente com o uso da RTG, é a exposição das membranas atualmente comercializadas. Sugere-se que a exposição prematura permita a colonização bacteriana, o que pode levar a um comprometimento do resultado da terapia (Selvig et al., 1992; Chen et al., 1997).
As membranas para RTG têm o objetivo de proporcionar a regeneração dos tecidos periodontais através do bloqueio físico à migração das células epiteliais para a região a ser regenerada (Figura 6). Desta forma, a concepção de uma membrana cuja topografia superficial fosse capaz de repelir células epiteliais, de um lado, e guiar ou estimular o crescimento de células ósseas do outro, seria o modelo de membrana ideal. O desenvolvimento de tal membrana para a RTG periodontal poderia ser benéfica na aceleração da cicatrização e regeneração óssea, levando a resultados clínicos mais previsíveis (Owen et al., 2005).
Figura 6. Simulação de como age a membrana de RTG após a cirurgia, fornecendo espaço para a regeneração do tecido do ligamento periodontal, do cemento e osso alveolar.
As membranas não-reabsorvíveis apresentam uma maior capacidade de manter o espaço destinado à regeneração porém, o seu uso requer um segundo ato cirúrgico para sua remoção e usualmente ocorrem exposições das membranas, devido à reações de corpo estranho. Tal fato leva a um maior desconforto ao paciente e a possibilidade de perturbar o tecido neoformado sob a membrana. Por outro lado as membranas reabsorvíveis não necessitam de um segundo procedimento cirúrgico e apresentam poucas complicações (Sanz & Giovannoli, 2000).
A utilização de outros materiais que substituam as membranas para RTG não-reabsorvíveis de PTFE-e tem sido bastante estudada. Como pode-se citar o emprego de membranas à base de quitosana, um polímero natural, que foram implantadas em defeitos críticos em calvária de ratos. Estas membranas apresentaram boa atividade defletora de células epiteliais, porém as membranas de quitosana pura, não mantiveram suas características mecânicas, apenas as membranas reforçadas com estrutura de titânio mantiveram suas características por seis semanas após a cirurgia (Kuo et al., 2005).
Eickholz et al. (2006), em um estudo de longo prazo, observaram que, após 10 anos, não há diferenças entre os tratamentos de RTG com membranas reabsorvíveis e não-reabsorvíveis. Principalmente no que diz respeito ao ganho de inserção clínica horizontal.
Em um estudo comparativo de cinco tipos de membranas para RTG, Takata et al. (2001) analisaram a biocompatibilidade e afinidade celular de membranas de diferentes composições.
Foi observado que as membranas biorreabsorvíveis de PLA (Epi-Guide) e de copolímero PLA/PGA (Resolute) apresentaram maior afinidade por fibroblastos após seis dias de teste.
Inicialmente, as membranas servem como protetoras do coágulo sanguíneo que se forma em meio ao defeito, sendo este importante uma vez que atua como matriz, onde os osteoblastos se depositarão e promoverão a neoformação óssea e a proliferação de fibroblastos e cementoblastos (Spiekermann, 1995). Para que seja possível a regeneração dos tecidos periodontais, é necessário que exista uma barreira que impeça a migração do tecido epitelial para a região de defeito preservando componentes osteogênicos presentes no espaço sob a membrana e garantir o crescimento das células na região de defeito (Pineda et al., 1996).
Diversos estudos em humanos e em animais demonstraram que algumas membranas podem ser aplicadas com sucesso para facilitar a regeneração periodontal em lesões mandibulares de furca classe II e em defeitos intra-ósseos. Assim, começaram estudos utilizando barreiras de poli-tetrafluoretileno expandido (PTFE-e), que era uma membrana não-reabsorvível e foram obtidos ótimos resultados quanto ao ganho de nova inserção periodontal. Em contrapartida, a necessidade de uma nova intervenção cirúrgica para a remoção da membrana inviabilizava, em parte, o uso da mesma por requerer um novo período cirúrgico, assim como cicatricial, além de aumentar custos e riscos para o paciente (Gottlow et al., 1986, Caffesse et al., 1990, Becker & Becker, 1993, Cortellini et al., 1993, Becker et al., 1996, Mattson et al., 1999, Eickholz et al., 2000).
Para as membranas usadas em RTG, é de suma importância um cuidado quanto à sua espessura que possui cerca de 0,2 mm no estado seco e 0,4 no estado úmido. Ela tem que ser semipermeável com tamanho de poros de (0,004 μm) pequenos suficientes para impedir a penetração das células epiteliais, e permitir a passagem de nutrientes, pois isto é essencial para uma neoformação óssea (Wang et al., 1995).
Foi realizado um estudo abrangente e detalhado in vitro e in vivo analisando a degradação de membranas porosas e não porosas de poli (L-ácido lático) (PLLA) que poderiam ser utilizadas tanto em RTG quanto em suporte para cultura de células. Foram analisadas as mudanças na massa molecular, na polidispersividade, na temperatura de fusão, na energia de fusão, na resistência à tração, no módulo de elasticidade, na massa e na área superficial das membranas sob degradação. Estes autores constataram que as membranas porosas apresentam os maiores valores de massa molecular e temperatura de fusão e degradam mais rapidamente em relação às membranas não porosas (Lam et al., 1994).
Sculean et al. (2007) realizaram um estudo controlado avaliando tratamentos de defeitos periodontais intra-ósseos com uma associação de osso mineral natural e membranas de RTG, somente o tratamento de RTG e tratamento somente com osso natural. Foi observado que após cinco anos, o tratamento somente com membrana e o com membrana e osso natural resultaram em um ganho significativo no nível de inserção clínica dos dentes tratados, enquanto que no tratamento somente com osso natural não houve tal resultado positivo.
Stavropoulos et al. (2004) compararam membranas de copolímero PLA/PGA com membranas de colágeno. Observaram que nos sítios operados com membranas de colágeno, estas degradaram muito rapidamente permitindo, assim a proliferação de células epiteliais para a região do defeito, o que retardou o processo de regeneração periodontal. Já nos defeitos com membranas de PLA/PGA, houve a regeneração, mas em ambos os casos estas membranas necessitaram o preenchimento dos defeitos com osso liofilizado a fim de manter o espaço para a regeneração dos tecidos.
A resposta fisiológica ao implante varia em função de sua forma, do tempo de implante, do material implantado e do local do implante (maior ou menor fluxo de fluidos). Geralmente o corpo tende inicialmente a encapsular com uma fina camada de tecido fibroso e tem inicio a degradação do material. Esse encapsulamento vem acompanhado de uma leve reação inflamatória, não muito maior do que a causada por uma incisão. Se essa reação for muito intensa, pode causar a necessidade da retirada do implante (Pennings, 2000).
Foi listada uma série de exigências que uma membrana para RTG necessita apresentar para que ela seja eficiente. Em resumo, ela precisa apresentar biocompatibilidade, exclusão celular, manutenção do espaço, integração à atividade tecidual, facilidade de utilização e atividade biológica. A falha de um dispositivo em um ou em mais destes critérios pode ser a razão para o desempenho insatisfatório na regeneração de defeitos periodontais (Tatakis & Trombelli, 2000). Poucas membranas atualmente têm incorporado todos estes critérios.
Outras técnicas já foram desenvolvidas para substituir ou dispensar a utilização de membranas na RTG. Dentre elas, a utilização de osso particulado autógeno ou alógeno para preencher o defeito periodontal e o emprego de matriz derivada do esmalte. Entretanto, nenhuma destas técnicas promove uma real regeneração dos tecidos periodontais, pois não são capazes de efetuar um bloqueio adequado para a proliferação do tecido gengival para o defeito, portanto a
RTG só terá sucesso com a utilização de barreiras que impeçam a invasão de células epiteliais (Donos et al., 2004; Donos et al., 2005).
O conhecimento da tensão máxima que a membrana pode apresentar sem comprometer sua estrutura e sua utilidade é muito importante durante a síntese de membranas de polímeros biorreabsorvíveis. Quando a membrana é fixada em um tecido do organismo hospedeiro, o polímero começa a degradar e suas propriedades mecânicas são afetadas (Trombelli et al., 2005).
Desta forma a adição de plastificante à composição de membranas de PLLA tornaria a membrana resultante porosa, com menor tempo de degradação sem afetar suas propriedades mecânicas. O que pode torná-las ideais para a RTG periodontal (Luciano et al., 2003).
Capítulo 3
Materiais e Métodos
3.1. Preparo e caracterização das membranas de PLLA
Para o preparo das membranas foi utilizado poli(L-ácido láctico) (PLLA) granulado (PURAC) com massa molecular ponderal média (Mw) em torno de 100.000 Da (segundo informações do fabricante).
As membranas foram sintetizadas em três diferentes concentrações de polímero e de plastificante, a fim de se obter diferentes graus de maleabilidade e de porosidade, assim como para alterar o tempo de degradação das membranas.
As membranas serão sintetizadas nas seguintes proporções: • PLLA a 95% com 5% de plastificante;
• PLLA a 90% com 10% de plastificante; • PLLA a 85% com 15% de plastificante.
A seqüência de preparo foi padronizada para todas as amostras de membranas. As quantidades de PLLA, de solvente (DMC) (Diclorometano, Merck) e de plastificante (tri-etil-citrato de sódio, Aldrich) necessárias para a obtenção das membranas nas proporções acima descritas, foram misturadas e submetidas à agitação magnética por duas horas. Após a agitação, a solução obtida foi colocada em um molde de vidro e posta dentro de uma cuba de vidro com ambiente saturado pelo solvente, por vinte e quatro horas, para obtenção da membrana (Figura 7).
Figura 7. (A) Agitação magnética da mistura PLLA, tri-etil-citrato e dicloro-metano; (B) cuba de vidro saturada por solvente.
3.1.1. Caracterização das amostras
As amostras foram secas em estufa à vácuo por 24 horas e caracterizadas através das técnicas citadas abaixo antes e após sua degradação in vitro.
3.2. Estudo da degradação hidrolítica
As amostras foram colocadas em tubos de ensaios com tampa rosqueada, previamente esterilizados com álcool 70%, contendo solução tampão fosfato (PBS) pH 7,4 a 37 ± 1°C, sendo retiradas após 2, 4, 8, 16 e 18 semanas, lavadas com água, secas à vácuo.
3.2.1 Análises e ensaios de caracterização das amostras
Primeiramente foi feita a avaliação macroscópica da degradação das membranas para se obter uma primeira opinião sobre diferenças de degradação conforme o tempo de imersão entre as diferentes proporções PLLA/tri-etil-citrato.
Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV. Testes realizados em Jeol 300. Pequenas amostras das membranas foram separadas e mantidas em dessecador à vácuo de acordo com os períodos de remoção da degradação in vitro. Teve como objetivo investigar a superfície e superfície de fratura dos dispositivos. As amostras foram introduzidas em nitrogênio líquido para
induzir a fratura dos materiais. As membranas foram fixadas em suporte adequado com o auxílio de cola condutora – cola de prata – e metalizadas com outro a fim de torná-las eletro-condutoras. A tensão utilizada foi de 10KV.
Ensaio mecânico de tração para determinar a máxima resistência das membranas, módulo de elasticidade e a taxa de alongamento das membranas em função do tempo de degradação. As membranas de PLLA/tri-etil-citrato com distância entre as garras de 60 mm de, 15 mm de largura e 0,25 mm de espessura foram submetidas aos ensaios de tração em uma máquina universal de ensaios, MTS (Material Testing Systems), modelo 810 (Figura 8), utilizando célula de carga de 200N e velocidade de 50 mm.min-1 seguindo norma ASTM D882-02. Cada amostra foi submetida a quatro ensaios nas mesmas condições de umidade (50%) e temperatura (22ºC).
Figura 8. Equipamento Material Testing Systems (MTS) modelo 810, utilizado para a realização dos ensaios mecânicos de tração.
Calorimetria Diferencial de Varredura – DSC. Foi utilizado para se avaliar variações de cristalinidade através da entalpia de fusão, temperatura de fusão e temperatura de transição vítrea. Estes testes foram realizados utilizando uma porção de 10mg extraídos das membranas de PLLA degradadas in vitro, elas foram colocadas em recipiente especial, lacradas e mantidas em dessecador à vácuo até o momento do ensaio. Duas curvas para cada tipo de membrana foram necessárias para se obter o valor da Tg (temperatura de transição vítrea), que raramente é detectável no primeiro aquecimento. Na primeira, a temperatura foi de 0ºC a 200ºC. A segunda foi de -50ºC a 250ºC. A taxa de aquecimento foi de 20ºC/min.
As curvas obtidas foram analisadas no programa NETZSCH TA ANALYSIS STA 409C V3.3 que acompanha o equipamento. Os valores de Tg e Tf (temperatura de fusão) %Xc (grau de cristanilidade - GC) foram coletados e especificados em gráficos. As curvas também foram sobrepostas a fim de comparação.
3.3. Animais
Neste trabalho foram utilizados coelhos Nova Zelândia de ambos os sexos, com idade aproximada de três meses e pesando de 2,5 a 3,0 Kg. Esses animais foram obtidos do Biotério da Pontifícia Universidade Católica de São Paulo, no Centro de Ciências Médicas e Biológicas de Sorocaba (PUC-SP/CCMB). Eles permaneceram presos individualmente recebendo ração comercial e água “ad libitum” e, mantidos em regime de claro-escuro correspondente a 12 horas e temperatura controlada de cerca de 23 ºC ± 2 ºC.
3.4. Procedimento cirúrgico
Foram utilizados doze (12) coelhos divididos em quatro (04) grupos, equivalentes aos diferentes tempos de implante das membranas: quinze (15), trinta (30), sessenta (60) e noventa (90) dias, sendo utilizados três (03) coelhos para cada tempo. Foram implantadas nestes animais membranas de PLLA com plastificante em diferentes proporções: 95/5 de PLLA/plastificante; 90/10 de PLLA/plastificante e 85/15 de PLLA/plastificante. As membranas apresentando 8 mm de diâmetro foram esterilizadas por imersão em álcool 70º por uma hora e lavadas em solução tampão fosfato pH 7,4 a 37 ± 1 °C, por 1 hora antes da cirurgia.
Os coelhos foram pesados e submetidos à anestesia geral administrada via intramuscular com uma solução de Ketamina 10% (40 mg/Kg) mais Cloridrato de Xylazina 2% (5 mg/Kg) por peso corporal.
Após a anestesia, foi realizada a tricotomia da parte dorsal do crânio do coelho. Uma incisão de aproximadamente 30 mm foi feita no escalpe do animal, seguindo o trajeto da sutura sagital. A musculatura e o periósteo são descolados e rebatidos, expondo os ossos parietais. Quatro defeitos ósseos bilaterais foram preparados, com o auxílio de uma broca trefina com 8 mm de diâmetro, montada em motor odontológico de baixa rotação elétrico (Beltec), sob irrigação constante com solução fisiológica estéril a fim de evitar superaquecimento das bordas do defeito. Três defeitos receberam as membranas em suas diferentes proporções polímero/plastificante e um defeito não foi preenchido para controle. A implantação das membranas obedeceu ao seguinte padrão:
Defeito 1 – localizado no lado anterior direito e preenchido com a membrana 95/5% de PLLA/plastificante;
Defeito 2 – localizado no lado anterior esquerdo e preenchido com a membrana 90/10% de PLLA/plastificante;
Defeito 3 – localizado no lado posterior direito e preenchido com a membrana PLLA 85%/15% de plastificante;
Defeito 4 – localizado no lado posterior esquerdo e não preenchido, servindo como controle.
A pele foi reposicionada e suturada em dois planos, seguida de anti-sepsia com solução de iodo-polvedine na região do ferimento (Figura 9).
Finalizado os períodos de 15, 30, 60 e 90 dias pós-cirúrgicos, os animais foram sacrificados por aprofundamento de anestesia com solução de Hidrato de Cloral 10% na dose 400mg/Kg, seguida por deslocamento cervical. Uma vez sacrificado, a calvária de cada animal foi removida com o auxílio de uma serra cirúrgica. As amostras dissecadas foram analisadas macroscopicamente e as observações registradas e fotografadas. Em seguida, a calvária contendo o segmento de cada membrana implantada e a região controle foram fixados em paraformoldeido 4%, para análise histológica.
Figura 9. Seqüência cirúrgica na calvária de coelhos: (A) preparo dos defeitos ósseos com broca trefina de 8 mm de diâmetro; (B) remoção de parte do osso parietal; (C) exposição da calvária de coelho mostrando os quatro defeitos bilaterais nos ossos parietais para a colocação das membranas; e (D) membranas já colocadas nos defeitos criados.
3.5. Processamento do material
Primeiramente o material foi submetido à descalcificação em solução de ácido nítrico a 5%. Em seguida, os segmentos contendo os defeitos foram separados e os defeitos cortados na região transversal mediana obtendo duas amostras com uma área central e duas periféricas. As amostras foram preparadas para análise histológica de acordo com as técnicas utilizadas para Microscopia de Luz, utilizando-se parafina como meio de inclusão.
O processamento consistiu inicialmente na fixação do material em líquido de paraformoldeído a 4%, por um período de 24 horas à temperatura ambiente. Após a fixação do material, foram realizados os seguintes procedimentos:
1. Desidratação: etanol a 70% (1h), etanol a 80% (2 tempos de 30 min.), etanol a 95% (2 tempos de 30 min.) e etanol a 100% (3 tempos de 30 min.);
2. Diafanização: etanol a 100% + xilol (na proporção de 1:1 durante 30 min.) e xilol puro (durante 60 min.);
3. Embebição: xilol + parafina (na proporção 1:1 durante 30 min. dentro da estufa) e parafina pura (2 tempos de 60 min.);
4. Inclusão: após o processamento o material será incluído em fôrma com parafina. Após gelados e, devidamente identificados, os blocos foram aparados para tirar o excesso de parafina.
3.6. Preparação das lâminas
Os preparados foram seccionados com navalhas descartáveis em micrótomo Leica RM 2245 a uma espessura de 4 μm. Para tanto, os blocos de parafina foram colocados no congelador durante 30 minutos. A seguir os blocos foram colocados um a um no micrótomo e desbastados até que toda a superfície tenha sido atingida. As fitas obtidas foram colocadas no banho histológico, e pescados os cortes com o auxílio de lâminas. Então, as lâminas devidamente identificadas foram colocadas em um suporte de madeira para secar. As lâminas com o material histológico foram levadas para a estufa a 60ºC, onde permanecerão durante 15 minutos para que o excesso de parafina seja eliminado. Finalizando, as lâminas foram coradas usando a técnica Tricômico de Masson:
1. Desparafinizar e hidratar os cortes;
2. Corar com Hematoxilina de Ehrlich por 5 a 15 minutos; 3. Lavar em água de torneira por 10 minutos;
4. Corar com Fucsina Ácida por 1 a 5 minutos; 5. Lavar várias vezes em água destilada;
6. Oxidar pelo Ácido Fosfomolíbdico a 1% por 8 minutos; 7. Escorrer bem e corar pela Azul de Anilina por 5 minutos; 8. Lavar rapidamente em água destilada;
3.6.1. Análise histológica
As lâminas foram analisadas em um microscópio óptico (marca NIKON – E800). Através da analise histológica foram avaliados os seguintes parâmetros:
3.6.2. Parâmetros qualitativos 1. Regeneração óssea;
2. Respostas inflamatórias e coagulatórias;
3. Biocompatibilidade e capacidade de sustentar a adesão e crescimento celular; 4. Propriedades mecânicas condizentes com o tecido a ser reconstruído;
5. Velocidade de degradação compatível com o crescimento do tecido para qual serve o suporte.
3.6.3. Parâmetros quantitativos
Após exame microscópico convencional, a avaliação da resposta cicatricial do osso foi feita obedecendo ao critério preconizado por Donos et al. (2004), no qual se divide a amostra em três grupos:
Grupo 1 – não fechamento – no qual permaneceu aberto o defeito ósseo, com apenas uma cicatrização óssea marginal ao defeito;
Grupo 2 – fechamento parcial – onde houve a formação de novo osso além da cicatrização óssea marginal ao defeito, sem continuidade óssea;
Grupo 3 – fechamento total – defeitos que apresentaram continuidade óssea completa entre as margens.
Para cada período avaliado foram empregados estes critérios, e após, estes dados foram cruzados entre si, a fim de determinar qual proporção polímero/plastificante se adequará melhor a determinado período de cicatrização. Teste exato de Fischer foi aplicado para análise estatística, valores de p < 0.05 foram considerados como nível de significância.
Capítulo 4
Resultados e Discussão
4.1 Estudo in vitro
4.1.1 Avaliação macroscópica
Dentre as três proporções polímero/plastificante (95/5; 90/10 e 85/15) pôde-se notar pouca degradação das membranas de 95/5 e 90/10, porém as membranas com maior concentração de plastificante (85/15) tiveram uma maior degradação visível macroscopicamente, conforme aumentava o período de imersão em tampão fosfato (PBS).
Foi possível observar através da análise macroscópica que a partir da 16ª semana de degradação in vitro, ocorreram mudanças na estrutura das membranas e na 18ª semana as membranas, principalmente de proporção PLLA/tri-etil-citrato 85/15 se encontravam muito quebradiças apresentando uma coloração esbranquiçada, dificultando, assim, a execução do ensaio mecânico de tração (Figura 10).
Figura 10. Membranas de PLLA/Tri-etil-citrato degradadas nos tempos de 2, 4, 8, 16 e 18 semanas.
4.1.2 Avaliação por microscopia eletrônica de varredura
Através de MEV, nota-se que as membranas com maior concentração de plastificante são mais globulares e porosas, já as com menor concentração, tendem a ser mais densas.
A partir da análise das fotomicrografias eletrônicas de varredura, podemos comparar a degradação das membranas de PLLA/tri-etil-citrato nos períodos inicial e após 18 semanas, sendo que as membranas de concentração 85/15 foram as que apresentaram maior taxa de degradação. Observou-se, também, que a degradação das membranas se dá a partir do centro para a porção externa das membranas, acontecimento descrito primeiramente por Li et al. (1999), como autocatálise devido ao acúmulo de ácidos fazendo com que a estrutura da membrana tenha uma erosão inicial na superfície, mas apresentando uma degradação mais acentuada no centro (Figura
11 e 12). A morfologia das membranas, particularmente os tamanhos dos poros e sua distribuição são muito importantes para a adesão celular, tornando o material bioativo (Luciano et al., 2003).
Figura 11. Micrografias eletrônicas de varredura da superfície de membranas de PLLA/tri-etil-citrato obtidas no tempo 0 (coluna à esquerda) e após 18 semanas (coluna à direita) de degradação in vitro. Membranas PLLA/tri-etil-citrato 95/5 (A e B), 90/10 (C e D) e 85/15 (E e F). Nota-se a degradação mais acentuada na membrana de proporção 85/15 (E e F).
Figura 12. Micrografias eletrônicas de varredura da fratura de membranas de PLLA/tri-etil-citrato obtidas no tempo 0 (coluna à esquerda) e após 18 semanas (coluna à direita) de degradação in vitro. Membranas PLLA/tri-etil-citrato 95/5 (A e B), 90/10 (C e D) e 85/15 (E e F). Nota-se a degradação mais acentuada na membrana de proporção 85/15 (E e F).
Figura 13. Fotomicrografias eletrônicas de varredura das membranas de PLLA/tri-etil-citrato após 18 semanas de degradação in vitro, em aumentos de 500x (A, C e E) e 2000x (B, D e F). (A e B) representam a membrana 95/5, (C e D) representam a membrana 90/10 e (E e F) representam a membrana 85/15.
De acordo com os resultados obtidos, a adição do plastificante tri-etil-citrato à composição das membranas de PLLA resultou em alterações significativas para a produção de membranas para RTG com diferentes tempos de degradação, pois o plastificante confere às membranas uma porosidade que permite a difusão de nutrientes para a região do defeito sem permitir a sua invasão por células epiteliais, além de fornecer uma maior maleabilidade aos dispositivos sem o comprometimento de sua biocompatibilidade (Nakamura et al., 2000).
Entretanto esta alteração na composição da membrana, só se torna perceptível morfologicamente a partir das membranas de composição PLLA/tri-etil-citrato 90/10 e 85/15. Sendo que a degradação é mais evidente após 18 semanas nas membranas 85/15 provavelmente pela maior quantidade de poros, o que facilita a difusão de aquosa por entre sua estrutura (Figura 13) (Barbanti et al., 2004).
4.1.3 Ensaio mecânico de tração
As amostras 95/5, 90/10 e 85/15 foram submetidas ao ensaio de tração, segundo a norma ASTM D882-02. A Figura 14 mostra o comportamento das curvas tensão x deformação para as amostras de PLLA com diferentes concentrações de plastificante.
Verifica-se nitidamente que a adição do plastificante está diretamente ligada ao alongamento apresentado pelas amostras, ou seja, como era esperado, quanto maior a concentração de plastificante, maior o alongamento.
0 1 2 3 4 5 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 85/15 T0 90/10 T0 95/05 T0 Tensão (MPa) Deformação (%)
Figura 14 Curvas de Tensão x Deformação para as amostras de PLLA com diferentes concentrações de plastificante.
A Tabela 1 refere-se aos dados obtidos das análises do PLLA em função do tempo de degradação em tampão fosfato (PBS). Os resultados analisados foram obtidos até o tempo de 18 semanas.
Verifica-se que o módulo de elasticidade diminui e o alongamento aumenta em função da composição de plastificante. Entretanto, se avaliarmos a variação desses parâmetros em função do tempo de degradação, verifica-se que o módulo aumenta à medida que o processo de degradação ocorre, enquanto o alongamento diminui. No entanto, o aumento do módulo na amostra 85/15 é mais acentuado comparado às amostras 90/10 e 95/5. Esse comportamento pode ser verificado através da Figura 15, que mostra as curvas obtidas para esse ensaio.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Tensão ( M Pa) Deformação (%) 85/15 T5 90/10 T5 95/05 T5
Figura 15. Curvas de Tensão x Deformação para as amostras de PLLA com diferentes concentrações de plastificante, após 18 semanas de degradação.
O aumento dos valores do módulo e a diminuição no alongamento em função do processo de degradação podem estar relacionados à variação do grau de cristalinidade à medida que a degradação ocorre, como verificado nas análises de DSC. Dessa forma, à medida que o material degrada novos arranjos cristalinos são formados, aumentando a resistência e diminuindo o alongamento. Esse efeito é mais acentuado nas amostras 85/15, devido a maior composição do plastificante.
No entanto, acredita-se que existe um efeito competitivo entre a ação do plastificante, levando a uma degradação mais rápida devido aos poros, permitindo uma maior difusão dos fluidos e por isso, variações nas propriedades mecânicas mais acentuadas para as amostras 85/15, embora as análises de DSC mostrassem que nessa amostra a variação do grau de cristalinidade foi menor comparada com as outras amostras.
A comparação entre dados de estudos de degradação in vitro publicados na literatura torna-se difícil, devido a inúmeras diferenças entre os estudos. Esses fatores que podem alterar os resultados incluem a composição do material de estudo, processamento, armazenamento da amostra e tipos de testes mecânicos (Moser et al., 2005).
De qualquer forma, os resultados do estudo in vitro apresentados têm o objetivo de servir somente como um simples modelo do comportamento do estudo in vivo dos implantes biorreabsorvíveis, tendo em vista que quando implantados esses dispositivos podem estar em contato com vários tecidos que podem afetar as características de degradação dos implantes.
Moser et al. (2005), exemplifica as situações que dificultam a predição exata do estudo in vitro para a situação in vivo, dizendo que no caso do dispositivo polimérico in vitro a exposição à solução tampão de PBS é muito grande, enquanto na situação in vivo os implantes podem estar expostos a um volume muito menor de fluídos. Além disso, a carga a que o implante estará sujeito, durante o período de recuperação óssea, pode variar, dependendo do local do implante, tendo essa carga, às vezes, uma magnitude maior do que a suportada pelo dispositivo.
Nesse contexto, as menores variações entre um estudo in vitro e um in vivo serão encontradas quando se sabe previamente que o implante estará numa região onde a exposição a carga é baixa, como no caso de certas aplicações craniofaciais, assim como relatado por Moser et al. (2005).
Um dos copolímeros estudados por Mainil-Varlet et al. (1997), quanto a degradação in vitro e in vivo, foi o poli(L-co-DL ácido lático), na relação 95:5 , sendo constatado uma boa correlação entre esses estudos quando os critérios considerados foram variações na resistência mecânica e massa molar.
