UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE ESCOLA DE ENGENHARIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA E DE PETRÓLEO
TAYNA FERREIRA DA CUNHA
OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE
ÓXIDO DE FERRO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DOS
NANOMATERIAIS COMO SUPORTES ENZIMÁTICOS NA
IMOBILIZAÇÃO DE LIPASE
Niterói 1/2019
TAYNA FERREIRA DA CUNHA
OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE
ÓXIDO DE FERRO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DOS
NANOMATERIAIS COMO SUPORTES ENZIMÁTICOS NA
IMOBILIZAÇÃO DE LIPASE
Projeto Final apresentado ao Curso de Graduação em Engenharia Química, oferecido pelo departamento de Engenharia Química e de Petróleo da Escola de Engenharia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Bacharel em Engenheira Química.
ORIENTADORES
Profa. Dra. Ana Carla da Silveira Lomba Sant´Ana Coutinho
Mestre Marcel Guimarães Martins
Niterói 1/2019
Ficha catalográfica automática - SDC/BEE Gerada com informações fornecidas pelo autor
Bibliotecária responsável: Fabiana Menezes Santos da Silva - CRB7/5274
C972o Cunha, Tayna Ferreira da
Obtenção de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro e avaliação do potencial dos nanomateriais como suportes enzimáticos na imobilização de lipase / Tayna Ferreira da Cunha ; Ana Carla da Silveira Lomba Sant'Ana Coutinho, orientadora ; Marcel Guimarães Martins, coorientador. Niterói, 2019.
78 f. : il.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia Química)-Universidade Federal Fluminense, Escola de Engenharia, Niterói, 2019.
1. Nanopartículas magnéticas de óxido de ferro. 2. Alginato de cálcio. 3. Imobilização enzimática. 4. Biocatálise enzimática. 5. Produção intelectual. I.
Coutinho, Ana Carla da Silveira Lomba Sant'Ana, orientadora. II. Martins, Marcel Guimarães, coorientador. III.
Universidade Federal Fluminense. Escola de Engenharia. IV. Título.
-DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho, primeiramente, a Deus, que é a principal motivação do meu interesse pela ciência. Cada experiência durante a elaboração deste trabalho tornou mais real pra mim Sua existência, Graça e Misericórdia. Cada aprendizado e descoberta foi uma ponte que me conectou ao Criador, que Se revelou a mim por meio das coisas criadas. A despeito das minhas limitações, minha fé e conhecimento a Seu respeito aumentaram, de modo que não há mais compartimentação de áreas da minha vida. Hoje, pra mim, a ciência e a fé não são esferas isoladas, mas ambas interagem fortemente à medida que são bem compreendidas.
Dedico aos meus pais, Ricardo e Magda, que foram verdadeiramente um oásis enviado por Deus, trazendo refrigério em momentos difíceis e ensinamentos imperecíveis. Ao meu irmão Yuri, que, com a própria vida, forneceu o referencial de persistência e equilíbrio que eu precisava. À minha amiga Kássia Chebli por todo amor, auxílio e companheirismo, sempre se doando sem preocupações. À minha família, que sempre investiu na minha vida e contribuiu para o meu crescimento. Aos meus amigos do movimento M8:32, que foram um instrumento de Deus, encorajando e alegrando a minha caminhada. Em especial, dedico ao meu avô Anemyr (in memoriam), que, mesmo com pouca escolaridade, demonstrou ser um dos maiores engenheiros que já conheci.
Dedico aos meus orientadores, Ana e Marcel, pelo incentivo e doação de conhecimentos fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho; pelos incansáveis esforços; pelos dias e noites de envolvimento com as atividades; pela humildade, paciência e interesse sinceros.
Finalmente, dedico aos meus irmãos em Cristo, que por motivos de perseguição religiosa, não têm liberdade para professar a fé do mesmo modo que eu. Contudo, mesmo diante da morte, não negam a razão da própria esperança (Deus).
―Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima‖. Louis Pasteur
“O temor do Senhor é o princípio do conhecimento.”
RESUMO
O presente trabalho descreveu a síntese de nanopartículas superparamagnéticas à base de ferro e a utilização dos nanomateriais como suportes na imobilização de extrato bruto de lipase de Yarrowia Lipolytica. As nanopartículas de magnetita (Fe3O4) foram
obtidas pelo método de coprecipitação e posteriormente submetidas à oxidação termoquímica para formação de maghemita (γ-Fe2O3) e à redução em atmosfera de H2
para formação de nanopartículas de Fe0. Os nanomateriais obtidos foram caracterizados quanto à dimensão, forma, estrutura, magnetização, perfil de liberação de calor e perfil de redução. As nanopartículas de Fe3O4, γ-Fe2O3 e Fe0 apresentaram respectivos
diâmetros de 14,8 nm, 9,8 nm e 30 nm; formato esférico e estruturas condizentes com os padrões obtidos em banco de dados. As medidas de magnetização obtidas para magnetita e maghemita foram de 70 emu.g-1 e 60 emu.g-1 e as medidas de hipertermia de 35,14 W/g e 14,47 W/g, nessa ordem. A análise de redução à temperatura
programada da amostra de magnetita apresentou picos de redução na faixa de 400 a 850°C, coerentes aos reportados na literatura. O extrato bruto de lipase foi imobilizado por adsorção nos suportes magnéticos, não demonstrando resultados satisfatórios devido à dessorção total das enzimas após algumas lavagens. Como alternativa, foi feita a encapsulação das enzimas em micropartículas de alginato de cálcio. Além disso, foi feita a quantificação das enzimas presentes no extrato e adsorvidas nos suportes, utilizando o método espectrofotométrico. Finalmente, foi determinada a atividade lipolítica do extrato contendo a enzima livre e do extrato imobilizado nas duas metodologias, sendo possível avaliar a aplicação dos catalisadores enzimáticos heterogêneos (suporte/enzima) na reação de hidrólise do azeite de oliva. Os resultados demonstraram que os biocatalisadores imobilizados apresentam grande potencial de aplicação, uma vez que podem ser recuperados e reutilizados no processo, reduzindo os custos relacionados à produção do catalisador.
Palavras-chave: nanopartículas magnéticas de óxido de ferro, alginato de cálcio, imobilização enzimática, biocatálise enzimática.
Summary
The present work describes the synthesis of iron-based superparamagnetic nanoparticles and the use of these nanomaterials as supports to immobilize crude enzymatic extract of Yarrowia Lipolytica. The magnetite nanoparticles (Fe3O4) were
obtained by coprecipitation method and later submitted to thermochemical oxidation to form maghemite (γ-Fe2O3) and to reduction in H2 atmosphere to form Fe0 nanoparticles.
The nanomaterials obtained were characterized by size, shape, structure, magnetization, heat release and reduction profile. Fe3O4, -Fe2O3 and Fe0 nanoparticles presented
diameters of 14.8 nm, 9.8 nm and 30 nm; spherical shape and structures conforming to the standards obtained in database. The magnetization measurements obtained for magnetite and maghemite were 70 emu.g-1 and 60 emu.g-1 and the hyperthermia measurements were 35.14 W/g and 14.47 W/g, in that order. The programmed temperature reduction analysis (TPR) of magnetite sample presented reduction peaks in the range of 400 to 850 ° C, consistent with those reported in the literature. The crude lipase extract was immobilized by adsorption on the magnetic supports, not showing satisfactory results due to the total desorption of the enzymes after some washes. Alternatively, the enzymes were encapsulated in calcium alginate microparticles. . In addition, the enzymes present in the extract and adsorbed on the supports were quantified, using the spectrophotometric method. Finally, the lipolytic activity of the extract containing the free enzyme and of the immobilized extract was determined in these two methodologies. It was possible to evaluate the potential heterogeneous enzymatic catalysts (support/enzyme) in the hydrolysis reaction of olive oil. The results showed that the immobilized biocatalysts have great potential of application, since they can be recovered and reused in the process, reducing the costs associated to the production of the catalyst.
Keywords: iron oxide magnetic nanoparticles, calcium alginate, enzymatic immobilization, enzymatic biocatalysis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Reação de hidrólise de triglicerídeo...19
Figura 2. Reação de transesterificação de triglicerídeo em presença de catalisador. ...19
Figura 3. Mecanismo de transesterificação enzimática de triglicerídeo com etanol... 23
Figura 4. Métodos de imobilização de enzimas... 25
Figura 5. Estrutura cristalina da magnetita (a) e da maghemita (b)... 29
Figura 6. Esquema dos momentos magnéticos apresentados em cada tipo de material sob influência ou ausência de um campo magnético externo... 30
Figura 7. Alinhamento desordenado dos domínios magnéticos em material desmagnetizado...31
Figura 8. Esquema dos domínios magnéticos: desalinhados (a); se alinhando gradativamente com o campo externo (b) e (c); e atingindo a máxima saturação (d).... 32
Figura 9. Ciclo de histerese característico de materiais ferromagnéticos e ferrimagnéticos...33
Figura 10. Estabilização de nanopartículas por carga (a) e por impedimento estérico (b)... 35
Figura 11. Aparato experimental utilizado na síntese das nanopartículas de magnetita... 39
Figura 12. Unidade experimental de redução à temperatura programada, utilizada para redução da magnetita a Fe0... 43
Figura 13. Mudança de cor do Coomassie em virtude da interação com a proteína... 45
Figura 14. Espectrômetro ThermoScientific modelo Multiskan Go, do Laboratório de Engenharia de Polimerização da COPPE (Engepol)...46
Figura 15. Difratogramas das amostras sintetizadas de magnetita (Fe3O4), magnetita oxidada (γ-Fe2O3) e magnetita reduzida (Fe0), apresentados em confronto com padrões de difração das mesmas...52
Figura 16. MET da magnetita (a) sintetizada, (b) oxidada e (c) reduzida...54
Figura 17. Medidas de magnetização das nanopartículas de magnetita e maghemita a 300 K...55
Figura 18. Perfil de aquecimento das nanopartículas de magnetita e maghemita (H = 200 Gauss, f = 307 KHz, [NPM] = 5 mg/mL)...56
Figura 20. Sistema enzima/magnetita reduzida antes (a) e depois (b) da aplicação do
campo magnético...58
Figura 21. Massa de enzima adsorvida em 20,0 mg de suporte após o procedimento de adsorção e sucessivas lavagens...59
Figura 22. Extrato bruto de lipase encapsulado em micropartículas de alginato...60
Figura 23. Extrato bruto de lipase encapsulado em alginato junto com as nanopartículas magnéticas... 60
Figura 24. Proposta de economia circular para o ciclo produtivo de biodiesel...63
Figura 25. Esquema de diminuição da potência de radiação luminosa quando esta atravessa a solução contendo a espécie em estudo...73
Figura 26. Representação do limite de linearidade acima do qual a Lei de Lambert-Beer não é válida...73
Figura 27. Curva do padrão BSA...74
Figura 28. Difratograma da magnetita (banco de dados)...76
Figura 29. Difratograma da maghemita (banco de dados)...76
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Especificações do óleo diesel e do biodiesel de óleo de frituras... 21
Tabela 2. Publicações de aplicação de enzimas imobilizadas em diferentes suportes... 27
Tabela 3. Classes de enzimas e suas respectivas funções segundo a União Internacional de Bioquímica... 37
Tabela 4. Atividades do extrato bruto livre e imobilizado...62
Tabela 5. Quantificação de proteínas antes e após a adsorção... 75
Tabela 6. Diâmetros médios estimados por DRX (k = 0,94, λ = 0,1542)...78
Tabela 7. Valores de SAR obtidos para magnetita e maghemita (cp = 0,6 cal/g°C; cpH2O = 1 cal/gºC; ρp = 1000 mg/mL)...78
SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS. A BSA Cbase CBPF Ccat Cp
Atividade específica enzimática Albumina de soro bovino
Concentração da solução básica titulante Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas
Concentração da solução ácida contendo as enzimas Calor específico da partícula
DRX Dc DLS EDS Difração de raios X Diâmetro crítico
Espalhamento dinâmico de luz
Espectroscopia por dispersão de energia de raios X Engepol
ES E-Ac E-Ac-A
Laboratório de Engenharia de Polímeros da UFRJ Complexo enzima – substrato
Enzima acetilada
Complexo Enzima acetilada - álcool
F Frequência
fator de correção da base FEG
H
Fonte de emissão de elétrons por campo Hora H Campo magnético Hc HEMA-DMDAAC IUB Campo coercivo
poli(hidroxietil metacrilato-co-dialil dimetil cloreto de amônio)
União Internacional de Bioquímica
K Constante de proporcionalidade
LABNANO Laboratório Multiusuário de Nanociência e Nanotecnologia do CBPF
Lc Comprimento de correlação
Diâmetro médio do cristalito calculado em referência ao pico de maior intensidade
M Magnetização
Ms Magnetização de saturação
Mr Magnetização remanescente
MAG-MATMULT Laboratório de Magnetometria da Infraestrutura de Pesquisa Multiusuária para Materiais Avançados do CBPF
MET Microscopia eletrônica de transmissão NPM ORF PA PBS PEG Nanopartícula magnética Óleo residual de fritura Para Análise
Tampão fosfato salino Poli(etilenoglicol) p/p
pH
peso por peso
Potencial hidrogeniônico
RECAT Laboratório de Reatores, Cinética e Catálise da UFF
Rpm rotações por minuto
SAR Taxa de absorção específica
(specific absorption rate) SPION
STEM
Nanopartícula superparamagnética de óxido de ferro (superparamagnetic iron oxide nanoparticle)
Microscopia eletrônica de transmissão de varredura
T Tempo
T TPR
Temperatura
Redução à temperatura programada
UFF Universidade Federal Fluminense
UFRJ v Va Vb Vcat Vt ΦH
Universidade Federal do Rio de Janeiro Volume de extrato enzimático
Volume de NaOH gasto na titulação da amostra Volume de NaOH gasto na titulação do branco Volume da solução ácida contendo as enzimas
Volume de NaOH gasto na titulação dos ácidos graxos liberados na reação
ρp Concentração mássica das partículas na solução aquosa
λ Comprimento de onda
θ Ângulo de difração
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 16 1.1. Estado da Arte ... 16 1.2. Objetivos ... 18 1.2.1. Objetivo Geral ... 18 1.2.2. Objetivos Específicos ... 18 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 19 2.1. Produção de biodiesel ... 19 2.1.1 Óleos de reuso ... 20 2.1.2 Catálise química ... 21
2.1.3 Catálise enzimática homogênea ... 22
2.1.4 Catalisadores enzimáticos suportados ... 24
2.2. Nanopartículas magnéticas de óxido de ferro ... 28
2.2.1. Tipos de óxidos de ferro ... 29
2.2.2. Propriedades magnéticas clássicas (fase bulk) ... 30
2.2.3. Nanopartículas superparamagnéticas ... 33
2.3. Enzimas ... 36
2.3.1. Lipases ... 37
2.3.2. Lipases obtidas a partir de substratos residuais ... 38
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 39
3.1. Síntese dos suportes magnéticos nanoestruturados ... 39
3.1.1. Síntese da magnetita (Fe3O4)... 39
3.1.1.1. Materiais ... 39
3.1.1.2. Metodologia ... 40
3.1.2.1 Materiais ... 42
3.1.2.2 Metodologia ... 42
3.1.3 Redução da magnetita a ferro metálico (Fe0) ... 42
3.1.3.1 Materiais ... 43
3.1.3.2 Metodologia ... 43
3.2. Adsorção do extrato enzimático ... 44
3.3. Encapsulação do extrato enzimático ... 44
3.4. Quantificação de proteínas ... 45
3.5. Determinação da atividade lipolítica ... 47
3.5.1. Método Titulométrico ... 47
3.5.2. Dedução da Equação de atividade ... 48
3.6. Caracterizações ... 50
3.6.1. Difração de raios X (DRX) ... 50
3.6.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ... 50
3.6.3. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ... 50
3.6.4. Medidas de magnetização ... 50
3.6.5. Medidas de hipertermia ... 51
3.6.6. Redução à temperatura programada (TPR) ... 51
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 52
4.1. Suportes magnéticos ... 52
4.1.1 Estrutura, tamanho e forma das partículas. ... 52
4.1.2 Medidas de Magnetização ... 54
4.1.3 Medidas de hipertermia ... 55
4.1.4 Redução à temperatura programada ... 57
4.2. Extrato enzimático ... 58
4.2.1. Adsorção... 58
4.2.3 Atividade enzimática ... 61
4.3. Avaliação da economia circular do processo ... 63
5. CONCLUSÕES ... 64 6. RECOMENDAÇÕES ... 65 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 66 APÊNDICE ... 72 ANEXO I... 76 ANEXO II ... 78
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Estado da Arte
A crescente demanda de processos envolvendo a catálise de reações químicas ao longo dos anos despertou o interesse pelo desenvolvimento de técnicas sustentáveis e de baixo custo. Dessa forma, a procura por tecnologias limpas e métodos de reaproveitamento é fundamental para tornar mais eficientes os atuais sistemas utilizados na indústria (PRADO, 2003).
Em particular, os processos que utilizam enzimas como catalisadores ganharam ênfase e têm sido alvo de estudos. Além do acréscimo em termos de viabilidade ecológica, o emprego da catálise enzimática confere ao processo: aumento da seletividade, especificidade, atividade e eficiência em condições operacionais mais brandas (MONTEIRO; SILVA, 2009).
As dificuldades para manter a configuração estrutural das enzimas e o elevado custo na produção das mesmas, em muitos casos, ainda constituem empecilhos na implementação efetiva desse tipo de processo. A utilização das enzimas na forma solúvel (catálise enzimática homogênea, como é empregada tradicionalmente) inviabiliza a separação do catalisador biológico do meio reacional. Além disso, o emprego de enzimas na forma livre pode comprometer a estabilidade da molécula devido a possíveis interações com solventes e variações operacionais, implicando na perda de atividade catalítica (VOLPATO et al., 2011).
Para solucionar os problemas da catálise enzimática homogênea, foram desenvolvidas técnicas de imobilização das enzimas em suportes sólidos insolúveis. Através desses métodos, a enzima suportada passa a atuar como catalisador heterogêneo e, assim, pode ser separada do meio reacional, de maneira facilitada, e reutilizada no processo sem perdas na estrutura e função originais (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).
Uma vez imobilizado, o catalisador adquire estabilidade e eficiência na aplicação, possibilita maior flexibilidade na escolha do tipo de processo (batelada ou
17 contínuo) e facilita o controle e automação do mesmo, reduzindo as perdas de material nos efluentes e melhorando a qualidade do produto final (ABANG et al., 2008).
As nanopartículas magnéticas de ferro demonstram vantagens na utilização como suportes enzimáticos. Além de oferecerem maior área superficial específica para imobilização das enzimas, as nanopartículas podem ser separadas mais facilmente da mistura reacional por meio da aplicação de um campo magnético externo (GUO; BAI; SUN, 2003).
Dentre os processos otimizados pelo uso de catalisadores enzimáticos suportados, destaca-se o de produção do biodiesel. Tradicionalmente, a catálise básica em meio homogêneo domina a maior parte da produção industrial desse biocombustível. Embora esta catálise homogênea apresente elevado rendimento (acima de 90%), requer condições operacionais mais severas e matérias-primas de maior qualidade; além de produzir resíduos tóxicos e grande quantidade de glicerol impuro de baixo valor comercial (MESSIAS et al., 2011). Em contrapartida, a catálise enzimática gera biodiesel e glicerol mais puros e permite a utilização de substratos de baixa qualidade, como por exemplo, óleos residuais ou de descarte (NIELSEN; BRASK; FJERBAEK, 2008). A aplicação de óleos residuais não se restringe apenas à produção direta de biodiesel, mas agrega valor ao processo, uma vez que os óleos também podem compor o meio nutritivo de cultivo da levedura – microorganismo gerador da enzima utilizada (SILVEIRA; VIEIRA, 2014).
Com essa motivação, o presente trabalho teve como objetivo sintetizar nanopartículas magnéticas à base de ferro, imobilizar o extrato enzimático de Yarrowia
lipolytica nos suportes magnéticos por adsorção e analisar o potencial de aplicação dos
sistemas suporte-catalisador biológico obtidos em reações que mimetizem a produção de biodiesel.
18 1.2. Objetivos
1.2.1. Objetivo Geral
O presente trabalho tem o objetivo de obter nanopartículas de magnetita, maghemita e ferro metálico, bem como avaliar o potencial de aplicação da enzima suportada nestes nanomateriais para produção de biodiesel.
1.2.2. Objetivos Específicos
Os objetivos específicos elencados a seguir estruturam o objetivo principal:
Obtenção de nanopartículas magnéticas (NPM) de magnetita, por coprecipitação;
Obtenção de nanopartículas magnéticas (NPM) de maghemita, por oxidação termoquímica da magnetita;
Obtenção de nanopartículas magnéticas com núcleo de ferro e casca de óxido de ferro, por redução da magnetita em presença de H2;
Caracterização físico-química dos suportes inorgânicos nanoestruturados;
Adsorção do extrato enzimático bruto de lipase no suporte magnético;
Avaliação da atividade da enzima livre e suportada;
Avaliação do potencial do biocatalisador na produção de biodiesel;
Análise de economia circular no processo de produção de biodiesel via catálise enzimática heterogênea.
19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Produção de biodiesel
A intensificação dos impactos ambientais provocados pelo uso indiscriminado de combustíveis fósseis motivou o interesse pelo desenvolvimento de combustíveis alternativos. Nesse contexto, o biodiesel atraiu considerável atenção pela composição natural, renovável, biodegradável e não tóxica (CANACKI; GERPEN, 2001).
Dentre os métodos de obtenção desse biocombustível, um dos mais utilizados é o de transesterificação de triglicerídeos com álcool (principalmente metanol ou etanol) em presença de catalisador, produzindo, além de biodiesel, glicerol como subproduto. A reação de transesterificação, ou alcóolise, é similar à de hidrólise dos triglicerídeos, sendo que esta última forma uma mistura de ácidos graxos (Figura 1), e a primeira forma uma mistura de ésteres alquílicos (Figura 2) (FUKUDA; KONDO; NODA, 2001).
Figura 1. Reação de hidrólise de triglicerídeo.
20 Os triglicerídeos, também conhecidos como triacilglicerois, estão contidos em gorduras animais e óleos de espécies vegetais como: grão de soja, grão de amendoim, semente de girassol, amêndoa de coco de babaçu, polpa de dendê, dentre outros vegetais na forma de sementes, amêndoas ou polpas (SILVEIRA; VIEIRA, 2014).
Entretanto, o uso de óleos ou matérias-primas que também são destinadas à alimentação levanta questões ambientais e sociais a serem analisadas com cautela. De modo que, estudos ainda investigam os possíveis impactos da produção de biodiesel sobre o setor agrícola e, principalmente, se o processo representa uma ameaça à segurança alimentar (LUZ, 2014; SILVEIRA; VIEIRA, 2014; SIMAS, 2010).
Na tentativa de superar as controvérsias que envolvem o uso de matérias-primas alimentícias, novas pesquisas propõem a utilização de subprodutos da alimentação para geração de biodiesel, como os óleos residuais ou de descarte.
2.1.1 Óleos de reuso
O reaproveitamento de óleos residuais apresenta vantagens não apenas econômicas, haja vista a oportunidade de utilizar um insumo de grande oferta e de baixo-custo, mas também reduz os impactos ambientais causados pelo acúmulo desses materiais em esgotos domésticos, aterros e rios (SILVEIRA; VIEIRA, 2014). Alguns problemas ocasionados pelo descarte inadequado são a emissão de metano, principal gás estufa, em decorrência da decomposição do óleo; o comprometimento da vida aquática pela criação de uma barreira de óleo, que impede a oxigenação e a passagem de luz nos rios; além de encarecer o tratamento do resíduo devido à contaminação. Nesse sentido, a reciclagem de óleos utilizados na fritura de alimentos contribui tanto para geração do biocombustível alternativo quando para a retirada do poluente do meio ambiente (FERNANDES et al., 2008).
Um estudo relatado por Costa e Rossi(2000) avaliou o potencial do biodiesel gerado a partir de óleos residuais de fritura (ORF), apresentando resultados positivos. Os ésteres obtidos a partir da transesterificação de óleos residuais apresentaram semelhança com os ésteres derivados de óleos novos. Além disso, apresentaram características físico-químicas próximas a do diesel convencional, e a vantagem de não
21 possuírem compostos aromáticos e não emitirem compostos de enxofre na combustão, como demonstrado na Tabela 1.
Tabela 1 Especificações do óleo diesel e do biodiesel de óleo de frituras.
Fonte: Adaptado de COSTA; ROSSI, 2000.
Contudo, em virtude de o óleo residual ser um subproduto do processo de cocção dos alimentos, possui impurezas que devem ser eliminadas antes da transesterificação, sendo necessário acrescentar etapas de pré-purificação e secagem do óleo (COSTA; ROSSI, 2020).
2.1.2 Catálise química
A reação de transesterificação pode ser catalisada por catalisadores homogêneos e heterogêneos, os quais podem ser ácidos ou básicos. Comprovadamente, a catálise homogênea alcalina é a que fornece maiores rendimentos em menor tempo e, portanto, é a mais utilizada na produção de biodiesel (LÔBO; FERREIRA, 2009).
Características Óleo diesel Biodiesel (ORF)
Densidade 15°C (Kg/m3) 0,85 0,89
Ponto inicial de destilação (°C) 189 307
Ponto final de destilação (°C) 349 342
Aromáticos (% v/v) 31,5 0 Carbono (% v/v) 86,0 77,4 Hidrogênio (% v/v) 13,4 12,0 Oxigênio (% v/v) 0 11,2 Enxofre (% v/v) 0,30 0,03 Índice de cetano 46,1 44,6 Valor calórico 42,3 37,5
22 Os catalisadores básicos são menos corrosivos e de manipulação mais fácil quando comparados aos ácidos, sendo geralmente empregados NaOH e KOH, em virtude do menor custo destes e rendimento final satisfatório (LÔBO; FERREIRA, 2009). Por outro lado, a principal desvantagem da catálise alcalina é a produção indesejada de sabão, que cria uma emulsão – ainda mais estável quando se utiliza etanol-, dificultando a remoção dos subprodutos e encarecendo o processo pela necessidade da etapa extra de separação (SILVA, 2008). A qualidade da matéria-prima também influencia no rendimento reacional, uma vez que a presença de ácidos graxos livres nos triglicerídeos consome o catalisador básico e contribui para a formação de emulsão. Desse modo, o emprego de etanol ou álcoois de menor custo (maior peso molecular) e a utilização de triglicerídeos com grande quantidade de ácidos graxos livres inviabilizam ou tornam inativo esse tipo de sistema catalítico. A catálise ácida, por outro lado, não exige matéria-prima de elevada qualidade. Contudo, apresenta taxa de reação mais baixa, sendo desqualificada para produção de biodiesel. (AL-ZUHAIR, 2007).
2.1.3 Catálise enzimática homogênea
A catálise enzimática da reação de transesterificação baseia-se na utilização de importantes grupos funcionais presentes nos sítios ativos das enzimas, onde acontece a transferência de prótons do substrato para a enzima e vice-versa. Dois principais grupos que participam da catálise são a hidroxila, que age como nucleófilo, e o grupo amino, cujo nitrogênio recebe e doa prótons ao longo da reação (AL-ZUHAIR, 2007). A Figura 3 detalha o mecanismo de catálise enzimática do triglicerídeo.
23
Fonte: Adaptado de COSTA FILHO, 2008.
Figura 3. Mecanismo de transesterificação enzimática de triglicerídeo com etanol.
Na primeira etapa do mecanismo ocorre o ataque do grupo nucleófilo presente na enzima ao carbono da carbonila do triglicerídeo e a captura do próton da hidroxila pelo nitrogênio do grupo amino, formando um complexo enzima substrato (ES). Na sequência, o átomo de oxigênio do complexo ES captura o próton do grupamento amino, gerando a espécie intermediária (E-Ac) e liberando diglicerídeo. Posteriormente,
24 o oxigênio da molécula de etanol é adicionado à carbonila da enzima acetilada e o próton é capturado pelo nitrogênio do grupo amino, levando à formação do complexo enzima acetilada álcool (E-AcA). Por fim, ocorre a transferência do próton do ácido conjugado do grupamento amino para o oxigênio do complexo E-AcA, produzindo o éster etílico e a enzima na forma original (AL-ZUHAIR, 2007).
A catálise enzimática homogênea configura um sistema vantajoso frente às dificuldades encontradas na catálise química. A utilização dos biocatalisadores possibilita a síntese específica do biodiesel, que, nesse caso, pode ser produzido a partir de fontes de triglicerídeos (substrato) com alto teor de ácidos graxos livres; torna a recuperação do glicerol muito mais fácil (SHA; SHARMA; GUPTA, 2003) e garante eficiência catalítica superior a de catalisadores sintéticos, haja vista a elevada especificidade. Acrescenta-se ainda a versatilidade do catalisador biológico, que pode ser usado tanto em soluções aquosas quanto em solvente orgânicos, atuando em condições brandas de temperatura e pH (GAMBA, 2009).
Entretanto, o alto custo de produção do biocatalisador e o descarte após a utilização, a possiblidade de inativação das enzimas por fatores biológicos, físicos ou químicos, durante a reação ou até mesmo no armazenamento, acrescentam desvantagens que podem inviabilizar o emprego desse tipo de sistema (COSTA FILHO, 2008).
2.1.4 Catalisadores enzimáticos suportados
A imobilização do biocatalisador em suportes sólidos é uma estratégia desenvolvida para contornar os problemas enfrentados na catálise enzimática homogênea. O catalisador suportado passa a atuar como catalisador heterogêneo, que pode ser facilmente separado do meio reacional, recuperado e reutilizado (CRUZ JÚNIOR, 2007). Ao serem dispersas na superfície do material suporte, as enzimas podem ter sua atividade aumentada, à medida que os grupos funcionais de interesse, presentes nos sítios ativos, são protegidos da interação com o solvente da reação, sendo expostos ao substrato de modo eficiente. Em contraste à utilização do catalisador na forma livre, o processo de imobilização demonstra aumento de estabilidade enzimática, uma vez que são reduzidas as possibilidades de alteração na estrutura da enzima e modificações nos sítios ativos durante o processo.
25 Contudo, não existem ainda métodos que auxiliem na previsão da manutenção desses parâmetros (atividade e estabilidade) após a imobilização, o que justifica a ocorrência de casos tanto de aumento quanto de inibição da atividade enzimática. (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).
Os principais métodos de imobilização ocorrem por meio de adsorção ou ligação da enzima em suporte insolúvel; retenção física via confinamento da enzima em uma matriz polimérica ou encapsulação em membrana polimérica e por meio de ligações cruzadas promovidas por um reagente multifuncional. A Figura 4 representa a classificação dos métodos de imobilização.
Fonte: Adaptado de COSTA, 2002 apud CRUZ JÚNIOR, 2007.
Figura 4. Métodos de imobilização de enzimas.
O método físico de imobilização por retenção pode ser feito pelo confinamento das enzimas em suportes formados por matriz polimérica ou pela encapsulação do biocatalisador em micropartículas poliméricas. A principal vantagem deste método é a manutenção da estrutura dos sítios ativos, uma vez que não há ligação direta destes com o suporte. Em contrapartida, devido ao tamanho pequeno do sistema suporte/enzima, podem ocorrer problemas difusionais com o substrato e o produto, comprometendo a catálise e o rendimento da reação. Dessa forma, recomenda-se a utilização de substratos
26 em grande concentração e formados por moléculas pequenas (HOMAEI et al., 2013; VILLENEUVE et al., 2000).
A imobilização da enzima no suporte via adsorção ocorre por meio de interações fracas, como as de Van Der Waals, ligações iônicas, ligações de hidrogênio ou interações hidrofóbicas entre a enzima e o suporte. Este tipo de imobilização é o mais recomendado, pois a enzima não sofre modificações na estrutura original, preservando os sítios ativos e, consequentemente, mantendo a atividade catalítica. Outra vantagem é a possibilidade do suporte ser recuperado e reutilizado após a dessorção de enzimas que perderam a atividade. (JESIONOWSKI; ZDARTA; KRAJEWSKA, 2014). Contudo, em virtude das interações fracas, as enzimas podem não permanecer fixadas no suporte se submetidas a condições reacionais mais intensas (BRENA; GONZÁLEZ-POMBO; BATISTA-VIEIRA, 2013).
A imobilização por ligação covalente acontece entre os grupos ativos do suporte e os grupos nucleófilos presentes na enzima, sendo estes, geralmente, grupos amino (mais reativos) (BUKHARI et al., 2014). Neste método de imobilização, ocorre maior fixação da enzima no suporte, uma vez que a ligação mais forte gera um sistema mais estável. Entretanto, uma desvantagem é a modificação nos sítios ativos da enzima devido à força da ligação envolvida, causando redução na atividade (MENDES, A.; OLIVEIRA, 2011).
Outra técnica de imobilização da enzima no suporte por ligação covalente envolve o emprego de reagentes bifuncionais, como o poli(etilenoglicol) (PEG) e o glutaraldeído. Este método também é utilizado, mesmo na ausência de suportes, para formação de agregados enzimáticos insolúveis, através de ligações cruzadas entre as enzimas (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004; SHELDON, 2007).
A escolha do suporte é de fundamental importância para formação do catalisador heterogêneo. Basicamente, para que haja imobilização efetiva, o suporte precisa apresentar estabilidade térmica, para que não sofra deformações e destrua o sítio ativo da enzima; resistência química e mecânica durante a reação e em meio às operações de centrifugação, agitação, filtração e outros procedimentos de recuperação; baixo custo e não ser reativo (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).
27 Alguns trabalhos na literatura descrevem a imobilização de enzimas em diferentes tipos de suporte, usando as técnicas de imobilização aqui relatadas. A Tabela 2 apresenta alguns projetos desenvolvidos.
Tabela 2. Publicações de aplicação de enzimas imobilizadas em diferentes suportes.
Enzima Suporte Método de
Imobilização Aplicação Separação Referência Lipase de Candida rugosa Fe3O4 /P(HEMA-DMDAAC) Ligação covalente Hidrólise do azeite de oliva Magnética YONG et al., 2008 Lipase de Burkholderia sp. C20 Fe3O4/sílica Adsorção Síntese de Biodiesel Magnética TRAN; CHEN; CHANG, 2012 Lipase de Burkholderia Alginato de cálcio Encapsulação Síntese de ésteres aromáticos Filtração PADILHA; BARROS; ALEGRE, 2015 Lipase de Yarrowia Lipolítica Fe3O4 Adsorção Extração de carotenoides do óleo de palma Magnética SANTOS, 2017
Yong e colaboradores. (2008) produziram microesferas de magnetita recobertas com ácido oleico e encapsuladas em copolímero sintético. As microcápsulas obtidas foram ligadas covalentemente à lipase de Candida rugosa e, posteriormente, aplicadas na hidrólise do azeite de oliva. O biocatalisador manteve 80% de sua atividade catalítica inicial ao fim de dez ciclos reacionais.
Padilha, Barros e Alegre (2012) investigaram a imobilização da Lipase de
Burkholderia em alginato de cálcio por encapsulação. O biocatalisador resultante foi
utilizado na síntese de ésteres aromáticos, revelando rendimentos de até 95,5% e aumento da atividade enzimática ao longo dos ciclos reacionais avaliados.
Tran, Chen e Chang (2012) investigaram o potencial catalítico da lipase de
Burkholderia sp. C20 imobilizada em um suporte de Fe3O4 recoberto por sílica, na
alcoólise do azeite de oliva, apresentando reuso do catalisador imobilizado por dez vezes.
28 O método de adsorção de lipase em nanopartículas de magnetita também foi abordado por SANTOS (2017). O catalisador heterogêneo foi testado na extração de carotenoides do óleo de palma, mostrando que após 30 ciclos reacionais a enzima permanece com atividade relativa de 70%.
A comparação dos resultados obtidos em cada metodologia não permite concluir diretamente a melhor técnica de imobilização, uma vez que são utilizados diferentes tipos de suportes e enzimas para diversas aplicações. Contudo, o critério de recuperação do catalisador coloca em destaque os suportes magnéticos e microcápsulas poliméricas para imobilização enzimática, haja vista a facilidade de separação, que nestes casos pode ocorrer com o auxílio de um campo magnético externo ou por simples filtração, respectivamente. Vale ressaltar que a escolha do método e do suporte também depende da natureza da enzima e a aplicação desejada.
2.2. Nanopartículas magnéticas de óxido de ferro
Nanopartículas magnéticas de óxido de ferro são materiais que se diferenciam por apresentarem alta razão entre área superficial e volume. A distribuição das partículas em escala nanométrica provoca o surgimento de propriedades novas e específicas, resultado de alterações no comportamento óptico, elétrico e magnético do material (KUCHERYAVY et al., 2013).
Dentre as propriedades adquiridas, as mais atrativas são as magnéticas. Nanopartículas de magnetita (Fe3O4) e maghemita (-Fe2O3), por exemplo, com
tamanho menor que 30 nm e 25 nm, respectivamente, não magnetizam de modo permanente, mas desenvolvem resposta quando submetidas a um campo magnético externo. Dessa forma, configuram uma nova classe de materiais, que apresentam comportamento superparamagnético e grande potencial de aplicação tecnológica (MAHMOUDI et al., 2012; ESTELRICH et al., 2015).
Entretanto, a grande área superficial específica proporciona também maior energia superficial e, portanto, maior reatividade para os nanomateriais. Sendo assim, faz-se necessário o ajuste da síntese dos mesmos para que não haja aglomeração e crescimento descontrolado (REBELO, 2009).
29 2.2.1. Tipos de óxidos de ferro
Dentre os tipos de óxido de ferro conhecidos, os mais populares são a magnetita (Fe3O4) e a maghemita (γ-Fe2O3) em virtude de suas propriedades magnéticas
particulares (WU et al., 2015).
A magnetita é uma fonte de óxido misto com FeO e γ-Fe2O3 e contém,
portanto, ferro nos dois estados de oxidação (divalente e trivalente). A estrutura, classificada como cúbica de espinélio invertido, é composta por íons O2- coordenados a íons Fe2+ e Fe3+, em sítios octaédricos, e a íons Fe3+, em sítios tetraédricos (Figura 5 (a)) (KOLHATKAR et al., 2013).
A maghemita possui um arranjo semelhante ao da magnetita, mas apresenta apenas o Fe3+ como cátion na estrutura. Por isso, pode ser considerada como magnetita completamente oxidada. Em média, a célula unitária da maghemita possui 32 íons O2-, 21,33 íons Fe3+ e 2,66 vacâncias (espaços vazios), estando os íons férricos distribuídos em 8 sítios tetraédricos e 16 octaédricos, e as vacâncias localizadas somente em sítios octaédricos (Figura 5 (b)) (WU et al., 2015).
Fonte: Adaptado de Oliveira; Fabris; Pereira, 2013.
Figura 5. Estrutura cristalina da magnetita (a) e da maghemita (b).
30 2.2.2. Propriedades magnéticas clássicas (fase bulk)
As propriedades magnéticas de mais interesse para a caracterização dos óxidos de ferro são o tipo de resposta ao campo magnético e a magnetização. Tais propriedades apresentam correlação com o tamanho e a forma das partículas que, por sua vez, determinam o momento magnético atômico, ou momento de dipolo magnético desenvolvido em cada caso (WU et al., 2015). Os possíveis arranjos magnéticos, na ausência ou presença de campo magnético externo, estão ilustrados na Figura 6.
Fonte: Adaptado de JEONG et al., 2007.
Figura 6. Esquema dos momentos magnéticos apresentados em cada tipo de material sob influência ou ausência de um campo magnético externo.
Materiais diamagnéticos e paramagnéticos são considerados materiais não magnéticos, pois exibem magnetização apenas na presença de campo magnético externo (CALLISTER, 2011). Quando submetidos ao campo, materiais diamagnéticos desenvolvem momentos magnéticos iguais, mas orientados no sentido oposto ao de aplicação do campo, gerando uma força de repulsão. Já os materiais paramagnéticos, apresentam momentos magnéticos iguais e orientados no mesmo sentido do campo aplicado. Na ausência do campo, a energia térmica disponível impede fortes interações entre os momentos magnéticos, fazendo com que estes apresentem uma orientação aleatória (KOLHATKAR et al., 2013).
31 Materiais ferromagnéticos são conhecidos por possuírem momentos magnéticos permanentese alinhados na mesma direção e sentido, ainda que na ausência de campo aplicado. Isto se deve à capacidade de conservarem a magnetização após a retirada do campo. Em materiais antiferromagnéticos e ferrimagnéticos, os momentos magnéticos demonstram comportamento similar. Contudo, na ausência de campo magnético externo, alguns momentos magnéticos desenvolvem orientação antiparalela aos demais, reduzindo, assim, a intensidade global de magnetização do material. Além disso, nos materiais antiferromagnéticos, os momentos magnéticos possuem mesma intensidade, resultando em magnetismo nulo; nos ferrimagnéticos, os momentos apresentam intensidades distintas, resultando em magnetismo fraco (KOLHATKAR et
al., 2013).
A região do material onde há o alinhamento mútuo dos momentos magnéticos é denominada de domínio magnético (CALLISTER, 2011). Dentro de uma amostra material existem domínios com diferentes alinhamentos de momentos, como demonstrado na Figura 7 (AQUINO; ALCANTARA, 2018). Dessa forma, a magnetização macroscópica exibida pelo material corresponde à média volumétrica do conjunto de regiões ou domínios magnéticos do mesmo (DIAS, 2014).
Fonte: Adaptado de LACAVA, 2009.
Figura 7. Alinhamento desordenado dos domínios magnéticos em material desmagnetizado.
Na ausência de aplicação de um campo magnético externo, a magnitude de campo magnético dentro de cada domínio é intensa, mas o fato de estar orientado de modo aleatório - um domínio em relação ao outro - implica numa resultante nula de magnetização. Neste caso, o material está desmagnetizado (AQUINO; ALCANTARA, 2018).
32 Contudo, à medida que se aplica gradativamente um campo magnético externo, ocorre o crescente alinhamento dos domínios magnéticos do material em relação ao campo aplicado. No início, os domínios são rapidamente alinhados ao campo, mesmo que este seja de baixa intensidade. Entretanto, conforme o campo magnético aumenta, há o aumento da dificuldade de se obter novos alinhamentos, dando origem ao fenômeno de saturação magnética (Ms) (AQUINO; ALCANTARA, 2018). A Figura 8 ilustra o processo de alinhamento dos domínios magnéticos com o campo magnético externo aplicado.
Fonte: Adaptado de AQUINO; ALCANTARA, 2018.
Figura 8. Esquema dos domínios magnéticos: desalinhados (a); se alinhando gradativamente com o campo externo (b) e (c); e atingindo a máxima saturação (d).
Após a saturação, se o campo for retirado, o grau de alinhamento dos domínios se reduz, mas não provoca o retorno dos mesmos à condição inicial de desordem. (GOMES FILHO, 2014). Ao invés disso, devido à resistência de alguns domínios em desalinharem, ocorre uma defasagem de magnetização com relação ao campo, efeito conhecido como histerese. De modo que, mesmo quando o campo é nulo, ainda existe uma magnetização remanescente (Mr) no material, que permanece, então, magnetizado. (CALLISTER, 2011).
Para que a magnetização residual seja anulada, é necessária a aplicação de um campo reverso, denominado campo coercivo (Hc). A Figura 9 demonstra o comportamento magnético de um determinado material com características ferromagnéticas ou ferrimagnética.
33
Fonte: Adaptado de CALLISTER, 2011.
Figura 9. Ciclo de histerese característico de materiais ferromagnéticos e ferrimagnéticos.
Ao se aplicar um campo magnético no material inicialmente desmagnetizado (Estágio 1), este ganhará magnetização até o nível de saturação, quando é atingido o máximo de alinhamento de seus domínios (Estágio 2). Retirando-se o campo magnético, o alinhamento dos domínios se reduz, mas sem provocar a desmagnetização total do material, permanecendo um valor residual de magnetização (Estágio 3). Aplicando o campo no sentido inverso, ocorre o anulamento da magnetização remanescente (Estágio 4). O comportamento se repete, atingindo novamente a magnetização de saturação (Estágio 5) e completando o ciclo (Estágio 6).
Materiais superparamagnéticos não exibem o mesmo comportamento, pois possuem pequenos valores de Mr e Hc. Neste caso, não ocorre o fenômeno de histerese e, portanto, ambas as curvas apresentadas na Figura 9 em sentidos opostos agora coincidem, formando apenas uma linha (HENRIQUES, 2016).
2.2.3. Nanopartículas superparamagnéticas
Materiais ferromagnéticos e ferrimagnéticos com diâmetro extremamente reduzido podem sofrer alterações em suas propriedades físicas. Tal diâmetro, conhecido como diâmetro crítico (Dc), estabelece uma nova condição ou estado magnético para as nanoestuturas. De forma que, quando estas possuem tamanho menor que o Dc, apresentam comportamento superparamagnético (DIAS, 2014). Como consequência
34 disso, a nanopartícula apresentará um único domínio - monodomínio magnético -, permanecendo espontaneamente magnetizada em uma só direção (ESTELRICH et al., 2015).
Como visto anteriormente, no estado superparamagnético, a coercividade* e a magnetização remanescente são insignificantes. Logo, a curva de magnetização do material não apresenta efeito de histerese. Desse modo, quando um campo magnético externo é aplicado, as nanopartículas são magnetizadas e quando o campo é removido, o estado é revertido para não magnético (ESTELRICH et al., 2015). Esta propriedade despertou o interesse nas áreas de materiais, meio ambiente, física, química e medicina devido à ampla variedade de aplicações tecnológicas.
Em particular, as nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro, ou SPIONs (do inglês superparamagnetic iron oxide nanoparticles) apresentam baixo custo de produção, elevada estabilidade físico-química (KIM; GRATE; WANG, 2006), possibilidade de funcionalização da superfície (MATEO et al., 2007), além de facilidade de recuperação e reciclo. Contudo, a dimensão nanométrica das partículas não apenas dificulta a caracterização pelas técnicas mais convencionais, mas requer cuidados na escolha da síntese, haja vista a ocorrência de aglomeração. As nanopartículas possuem alta área superficial específica e, portanto, elevada energia superficial. Dessa forma, a tendência natural é de crescer e aglomerar a fim de diminuir a energia total do sistema (REBELO, 2009).
Para evitar o crescimento descontrolado e aglomeração das nanopartículas, atualmente são utilizados dois métodos de estabilização: um via repulsão por cargas elétricas, no qual as partículas se repelem devido à superfície carregada (Figura 10 (a)); e outro de impedimento estérico por meio da adição de um composto passivante ou estabilizante, como polímeros e surfactantes (Figura 10 (b)) (REBELO, 2009).
* Coercividade é a magnitude do campo coercivo, ou seja, intensidade do campo magnético que deve ser
35
Fonte: Adaptado de REBELO, 2009.
Figura 10. Estabilização de nanopartículas por carga (a) e por impedimento estérico (b).
Outra importante característica que também dita as propriedades físicas é a morfologia das nanopartículas. Por meio de metodologias de síntese alternativas, podem ser obtidas formas distintas da convencional (esférica), e, por sua vez, propriedades magnéticas singulares (ZHAO et al., 2013). Ganham destaque os nanocubos (KIM; GRATE; WANG, 2006), que apresentam comportamento ferrimagnético; os nanooctópodes (ZHAO et al., 2013), que possuem superparamagnetismo, assim como as esferas; e os nanoaneis (JIA et al., 2008), que desenvolvem um estado - particular a estruturas de seção circular e elíptica - conhecido como vórtice magnético.
Para promover a aplicabilidade das nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro, novas rotas sintéticas foram desenvolvidas. Os avanços nesse aspecto possibilitam a obtenção de materiais com tamanho e forma controlados, sem agregação e com distribuição organizada. Os três métodos de síntese mais utilizados são o de coprecipitação, decomposição térmica e miniemulsão (REBELO, 2009). O mais convencional é o de coprecipitação, que apresenta facilidade na obtenção de nanopartículas em grande quantidade e com altos valores de magnetização de saturação (WU et al., 2015). O método consiste numa mistura estequiométrica (1:2, respectivamente) dos íons Fe2+ e Fe3+ em solução fortemente alcalina sob aquecimento. O controle da forma e do crescimento é dado pela escolha do sal de ferro a ser utilizado na síntese, pela taxa de agitação, velocidade de adição da base, valor de pH do meio e pelo uso de agente estabilizante (WU et al., 2015; WU; HE; JIANG, 2008). Algumas desvantagens do método de coprecipitação são a necessidade de ajuste do pH na etapa de purificação, que dificulta a obtenção de nanopartículas monodispersas, e o tratamento do rejeito gerado, uma vez que este pode ser nocivo ao meio ambiente.
36 Uma vez sintetizadas, as nanopartículas de magnetita podem ser oxidadas completamente à maghemita por meio de solução concentrada de HNO3 e Fe(NO3)3, sob
aquecimento e agitação (BONADIO, 2014); e reduzidas a Fe(0) em atmosfera de H2.
2.3. Enzimas
Os primeiros estudos registrados sobre enzimas ocorreram no final do século XVII, na tentativa de entender os mecanismos de fermentação e digestão em seres humanos. Nesse contexto, Louis Pasteur, observando a fermentação do açúcar em álcool por meio de levedura, concluiu que havia ―fermentos‖ (enzimas) compondo a célula viva do levedo. Mais tarde, em 1878, o fisiologista alemão Wilhelm Kühne cunhou o termo enzima, do grego enyzyme, para descrever este fermento (OLPATO; SADICHHA; SUREKHA, 2013). Em 1926, a primeira enzima, urease, foi isolada e cristalizada por James Sumner’s, desvendando o elemento catalítico da hidrólise da ureia em NH3 e CO2 (VOET, 2000 apud DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI,
2004).
As enzimas podem ser encontradas nas formas mais simples de vida (seres unicelulares) até nas mais complexas, como plantas e animais. Desempenham papel fundamental no metabolismo desses organismos, reduzindo a barreira energética de reações químicas vitais. Podem ser classificadas como proteínas que aumentam a velocidade dessas reações na ordem de 1014 em relação a reações não catalisadas. Possuem estrutura predominantemente proteica, mas geralmente associada a cofatores, ou seja, moléculas de diferente natureza, que, em muitos casos, são responsáveis pela atividade catalítica da enzima. (HARGER; SPRADA; HIRATSUKA, 1982 apud LUZ, 2014). Algumas classes de enzimas e suas correspondentes funções catalíticas estão apresentadas na Tabela 3.
A classe das hidrolases (proteases, celulases, amilases e lipases) é a mais explorada na indústria química. A atratividade dessas enzimas se deve ao baixo custo, ampla disponibilidade, condições brandas de síntese, independência de cofatores e elevada especificidade para substratos (FABER, 1997 apud DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).
37 A utilização dessas enzimas como catalisadores biológicos em processos orgânicos teve início no século 20, mas apenas se difundiu após as publicações de Zacks e Klibanov nos anos 80, quando foi desfeita a ideia de que as enzimas apresentavam atividade catalítica somente em meio aquoso. Desde então, avanços na área de biotecnologia permitiram o aumento da produção desses catalisadores, manipulando-os de forma a exibirem propriedades de interesse para aplicação na indústria alimentícia, por exemplo, para processamento de bebidas e alimentos; na indústria têxtil, para acabamento de produtos; na ambiental para tratamento de efluentes, dentre outras. (KLIBANOV, 2001).
Tabela 3. Classes de enzimas e suas respectivas funções segundo a União Internacional de Bioquímica (IUB).
Classes Funções Catalíticas
Oxirredutases Catalisam reações de oxidação-redução. Transferases
Hidrolases
Mediam a transferência de grupos funcionais. Catalisam reações de hidrólise.
Liases Catalisam reações de quebra de ligações e de adição de grupos.
Isomerases Catalisam reações de mudança intramolecular em que um substrato é transformado em um grupo isômero. Ligases Catalisam a ligação covalente de moléculas. Fonte: Adaptado de LEHNINGER, 1976 apud LUZ, 2014.
2.3.1. Lipases
Lipases são enzimas classificadas como triacilglicerol hidrolases e, como o próprio nome sugere, catalisam a hidrólise de triacilglicerois em glicerol e ácidos graxos livres. Em condições adequadas, também são utilizadas na catálise de reações de síntese, como a de esterificação e transesterificação, permitindo a geração de produtos de elevado interesse comercial, como, por exemplo, o biodiesel obtido por transesterificação enzimática (FUKUDA; KONDO; NODA, 2001).
38 Um dos elementos a serem considerados na aplicação desse biocatalisador é o mecanismo de ação do mesmo, que está relacionado a duas possíveis conformações da enzima: uma quando o sítio ativo está fechado, deixando a enzima inativa e outra quando o sítio está aberto, permitindo a ligação da enzima com o substrato. Dessa forma, qualquer alteração da estrutura enzimática, por menor que seja, pode afetar a atividade e, consequentemente, a formação do produto, sendo necessário o ajuste dos parâmetros da reação que podem influenciar nesse aspecto (VOLPATO et al., 2011).
De modo geral, as lipases atuam em uma ampla faixa de pH, possuem elevada especificidade a uma variedade de substratos e atividade ótima na faixa de 30 a 40 °C, apresentando maior estabilidade térmica e atividade quando obtidas a partir de fontes microbianas (bactérias, leveduras e fungos) (GUPTA, R.; GUPTA, N.; RATHI, 2004).
Um dos métodos de produção de lipases microbianas é o de fermentação submersa, o qual é caracterizado pela fonte e concentração de nitrogênio, pH do meio de cultivo, temperatura de crescimento dos microorganismos, concentração de oxigênio dissolvido e, principalmente, pela fonte de carbono utilizada (GUPTA, R.; GUPTA, N.; RATHI, 2004)
Diversas fontes de carbono foram estudadas por Lin e colaboradores (2006) e Burkert e colaboradores (2004). Dentre elas, os óleos vegetais ganharam destaque pela produção de enzimas de maior atividade, sendo conhecidos como indutores de enzimas.
2.3.2. Lipases obtidas a partir de substratos residuais
Considerando o excesso de subprodutos e resíduos oleosos descartados em diversos processos, estudos investigam a utilização destes compostos sem valor agregado como fonte de carbono na produção de lipase. Nunes e colaboradores (2013) avaliaram o cultivo de lipases de Yarrowia lipolítica em óleo de fritura residual, que apresentou alto potencial de indução na produção da enzima.
Dentre as fontes de carbono estudadas por Lin e colaboradores (2006), o glicerol, subproduto da síntese de biodiesel, foi a melhor fonte para produção de lipase por Bacillus sp e Antrodia cinnamomea. Souza e colaboradores (2006) também demonstraram que o glicerol foi a melhor fonte para produção de transglutaminase
39 Dessa forma, em particular, a produção de lipase a partir do glicerol agrega ainda mais valor ao processo do biodiesel, tornando-o sustentável, à medida que o principal subproduto da síntese passa a ser utilizado no cultivo do catalisador enzimático empregado, fechando o ciclo produtivo.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Síntese dos suportes magnéticos nanoestruturados 3.1.1. Síntese da magnetita (Fe3O4)
As nanopartículas de magnetita (Fe3O4) foram preparadas baseando-se no
método de coprecipitação descrito por Bedê (2010), que será apresentado a seguir.
3.1.1.1. Materiais
Para a síntese das nanopartículas de magnetita foi utilizado o aparato experimental ilustrado na Figura 11.
40 O sistema é composto de um reator de vidro borossilicato encamisado com capacidade de 500 mL e com quatro bocas, sendo a boca central utilizada para inserir o agitador mecânico, uma lateral para inserir os reagentes e outra para fixar o condensador. Além disso, possui um suporte universal com garra, para sustentar e alinhar o sistema reator-agitador; agitador mecânico com haste e impelidor composto por uma pá unificada disposta verticalmente; condensador de refluxo para evitar as perdas de reagente por evaporação e banho termostático que alimenta a camisa para controle da temperatura ao longo da reação.
Os reagentes utilizados na síntese estão listados a seguir:
1. Cloreto de cálcio dihidratado (CaCl2.2H2O) fornecido pela Vetec Química Fina
(Brasil) com grau PA;
2. Sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4.7H2O) fornecido pela Vetec Química Fina
(Brasil).
3. Cloreto férrico hexahidratado (FeCl3.6H2O) fornecido pela Vetec Química Fina
(Brasil) com grau PA;
4. Solução de amônia (NH4OH) fornecida pela Merck (Brasil) com grau Emsure ACS e
teor de 28-30 % p/v em água.
5. Água ultrapura obtida por sistema de purificação de água Milli-Q®.
3.1.1.2. Metodologia
A metodologia para obtenção nas nanopartículas de magnetita pode ser dividida em três etapas consecutivas: obtenção do cloreto ferroso (FeCl2); preparação da
solução de cloreto férrico (FeCl3) e síntese da magnetita (Fe3O4).
Para obter uma solução de FeCl2 0,5 mol.L-1, de acordo com a Equação 1, foi
preparada uma solução contendo 7,25 g de CaCl2.2H2O dissolvidos em 40 mL de água e
outra solução contendo 19,90 g de FeSO4 em 40 mL de água. As soluções foram
misturadas e homogeneizadas com o auxílio de um bastão de vidro, notando-se, de imediato, a formação de um precipitado esbranquiçado. Fez-se a filtração a vácuo da mistura e foram adicionados 20 mL de água deionizada durante o procedimento,
41 totalizando um volume de 100 mL. O precipitado (CaSO4) foi descartado e o filtrado
(FeCl2 0,5 M) foi recolhido e utilizado na síntese da magnetita.
Equação 1 Optou-se pela obtenção de FeCl2 ao invés de utilizar o composto comercial, pois
este apresenta elevada higroscopicidade, provocando a oxidação dos íons Fe2+ a Fe3+. Para o preparo da solução de FeCl3 0,5 M, foram dissolvidos 13,52 g de
FeCl3.6H2O em 100 mL de água deionizada.
A magnetita foi obtida a partir da reação dos precursores FeCl3 e FeCl2 em meio
básico de acordo com a Equação 2, porém em razões não estequiométricas dos sais de ferro. Estes foram reagidos em proporções equimolares.
Equação 2 Foram adicionados inicialmente 100 mL da solução aquosa de FeCl3 0.5 M ao
reator encamisado aquecido a 60ºC. Após a homogeneização, fez-se a adição de 100 mL da solução aquosa de FeCl2 0,5 M e de 25 mL de uma solução de amônia (NH4OH
28-30% p/v), resultando em um pH do meio entre 9 e 10. Logo depois da adição da base, foi observada a formação do precipitado preto, indicando a formação da magnetita. A mistura reacional obtida foi mantida sob aquecimento e agitação por 30 min.
A suspensão final de magnetita foi resfriada até a temperatura ambiente e a fase sólida sedimentada com o auxílio de um imã. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com água deionizada até que o meio apresentasse pH neutro. Uma parte das nanopartículas de magnetita foi mantida em água e outra parte foi seca ao ar e armazenada.
3.1.2. Oxidação da magnetita à maghemita (γ-Fe2O3)
As nanopartículas de maghemita (γ-Fe2O3) foram obtidas por oxidação
termoquímica da magnetita (Fe3O4), segundo o método descrito por Bonadio (2014),
42 3.1.2.1 Materiais
A unidade experimental utilizada foi a mesma da síntese da magnetita (Figura 11). A seguir estão listados os reagentes empregados:
1. Suspensão de nanopartículas de magnetita, obtida na seção 3.1.1;
2. Solução aquosa de HNO3 2 mol. L-1 fornecido pela Vetec Química Fina (Brasil) com
grau PA;
3. Solução aquosa de Fe(NO3)3 0,35 mol. L-1 fornecido pela Vetec Química Fina
(Brasil) com grau PA;
4. Água ultrapura obtida por sistema de purificação de água Milli-Q®.
3.1.2.2 Metodologia
Para realizar a síntese, inicialmente foram pesados em um bécher 16 g de magnetita. Fez-se a adição de 80 mL de HNO3 2 mol. L-1 ao sólido pesado e a mistura
resultante foi colocada no reator encamisado sob agitação durante 5 min. Logo após, foram adicionados 120 mL de Fe(NO3)3 0,35 mol. L-1 à mistura sob agitação em uma
temperatura de 90ºC por 1 h. Observou-se a mudança de coloração do precipitado de preto para ocre, indicando a conversão de magnetita à maghemita. A suspensão final de maghemita obtida apresentou elevada estabilidade coloidal, dificultando a lavagem e a separação magnética. Após uma considerável separação, o sobrenadante foi recolhido e o sólido foi armazenado em água sob refrigeração.
3.1.3 Redução da magnetita a ferro metálico (Fe0)
As nanopartículas de ferro metálico (Fe0) foram obtidas via redução da magnetita (Fe3O4) em atmosfera de hidrogênio (H2), de acordo com a metodologia
43 3.1.3.1 Materiais
O procedimento de redução das nanopatículas de magnetita a ferro metálico foi feito em uma unidade multipropósito (Figura 12).
Figura 12. Unidade experimental de redução à temperatura programada, utilizada para redução da magnetita a Fe0.
3.1.3.2 Metodologia
Para reduzir as partículas de magnetita a Fe0, inicialmente foi feita a secagem da amostra de magnetita em atmosfera de hélio da temperatura ambiente até 150 °C e taxa de aquecimento de 10°/min durante 15 min. Em seguida, a temperatura foi aumentada para 400 ºC à mesma taxa de aquecimento. A esta temperatura foi feita a redução da amostra com hidrogênio puro, que foi injetado a uma taxa 30 mL/min durante 2 h. Após a redução, foi feito o resfriamento da amostra em banho de gelo e atmosfera de hélio completamente isenta de hidrogênio até à temperatura ambiente.
As nanopartículas de ferro metálico obtidas foram passivadas com uma mistura de oxigênio (5% em He) durante 30 min, garantindo a formação de uma camada de
44 óxido na superfície do metal, aumentando a resistência e estabilidade química do mesmo.
3.2. Adsorção do extrato enzimático
Foi feita a adsorção de extrato enzimático bruto de lipase de Yarrowia
lipolytica cedido pela professora Priscilla Filomena Fonseca Amaral, da Escola de
Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). O extrato foi adsorvido nas nanopartículas de óxido de ferro segundo a metodologia descrita por Carvalho (2017), que será demonstrada a seguir.
Foram adicionados 20,0 mg de nanopartículas a uma solução contendo 4,0 mL de extrato enzimático e 6,0 mL de tampão fosfato salino (PBS). A mistura foi mantida sob agitação constante de 40 rpm por 90 min a 20º C, em Shaker. Ao término, a mistura heterogênea foi deixada em repouso e, com o auxílio de um imã, foi promovida a separação da enzima suportada (nanopartículas + enzima adsorvida).
O sobrenadante foi recolhido para posterior quantificação de proteínas pelo método de Bradford. E as enzimas suportadas foram ressuspendidas em 2,0 mL de tampão PBS para posterior avaliação da atividade enzimática.
3.3. Encapsulação do extrato enzimático
A encapsulação do extrato enzimático bruto de lipase de Yarrowia lipolytica em micropartículas de alginato de cálcio foi feita de acordo com a metodologia de Finotelli (2006).
Para tal, foram adicionados 150 mg de alginato de sódio (3% p/p) a 5,0 g do extrato enzimático. A mistura obtida foi homogeneizada e gotejada, com o auxílio de uma seringa, em uma solução de cloreto de cálcio (2% p/p), formando micropartículas sólidas, que sedimentaram no fundo do recipiente utilizado. Após 10 minutos de sedimentação, as micropartículas foram separadas da solução por filtração, lavadas com água deionizada e armazenadas em tampão PBS sob refrigeração.
O extrato também foi encapsulado junto com as partículas magnéticas nas mesmas condições de antes, acrescentando à mistura 50 mg das nanopartículas.
