Orientador: Profa. Dra. Andréa Regina Baptista Rossit
HELOISA DA SILVEIRA PARO PEDRO
Pesquisa do Mycobacterium sp. em uma população soropositiva
para o HIV-1 do Noroeste Paulista
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, para obtenção do título de Mestre em Microbiologia, sob orientação da Profª Drª Andréa Regina Baptista Rossit.
Pedro, Heloisa S. Paro.
Pesquisa do Mycobacterium sp.em uma população soropositiva para o HIV-1 do Noroeste Paulista / Heloisa S. Paro Pedro. – São José do Rio Preto : [s.n.], 2008.
80f. ; il. ; 30 cm.
Orientador: Andréa Regina Baptista Rossit
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Microbiologia. 2. Mycobacterium tuberculosis. 3. Tuberculose. 4. Co-infecção TB/HIV. 5. MNT. I. Rossitt, Andréa Regina Baptista. II.
Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título.
Pesquisa do Mycobacterium sp. em uma população soropositiva
para o HIV-1 do Noroeste Paulista
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, para obtenção do título de Mestre em Microbiologia, sob orientação da Profª Drª Andréa Regina Baptista Rossit.
APROVADO EM: ____/____/____
COMISSÃO EXAMINADORA
_____________________________________ Profª. Drª. Andréa Regina Baptista Rossit
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP
_____________________________________ Profª. Drª. Daisy Nakamura Sato
Instituto Adolfo Lutz – Laboratório Regional de Ribeirão Preto
___________________________________ Profª. Drª. Silvia Helena Vendramine
O presente estudo foi desenvolvido no Instituto Adolfo Lutz/Laboratório Regional de São José do Rio Preto (SP) e no Centro de Investigação de Microrganismos do Departamento de Doenças Dermatológicas, Infecciosas e Parasitárias, da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (SP), sob a orientação da Profa. Dra. Andréa Regina Baptista Rossit.
Dedico este trabalho ao meu marido Carlos, pelo amor, carinho e compreensão, e aos meus filhos Murilo e Isabella, luz e inspiração em minha vida.
Aos meus pais Armando e Mariana e aos meus irmãos Lígia, Sandra, Antônio Carlos e Patrícia, que me ensinaram, pelos seus exemplos, os verdadeiros valores da vida.
Agradecimento especial à Prof.a Dra. Andréa Regina Baptista Rossit, por sua valiosa orientação e também pelo carinho e dedicação sempre presentes. Minha gratidão sincera por fazer parte deste estudo.
Agradeço a Deus, por ter me dado coragem e força, para enfrentar o desafio de realizar este trabalho.
Ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto (IBILCE/UNESP), pela estrutura que possibilitou a realização deste estudo.
Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do IBILCE/UNESP, em especial à coordenadora Prof. Dra. Paula Rahal e vice-coordenadora Prof. Dra. Eleni Gomes, pelo apoio e assistência aos alunos.
A todos os docentes do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, pelos ensinamentos valiosos.
A todos os funcionários da Seção de Pós-Graduação, em especial à Supervisora Rosemar Rosa de Carvalho Brena e às Funcionárias Rosana Miguel Gomes Ferro e Silvia Emiko Kazama, pelo atendimento feito com atenção e paciência.
Às funcionárias da Biblioteca, Elaine Colombo e Gislaine Gameiro, pela revisão das Referências Bibliográficas e apoio ao banco de dados.
À Faculdade Regional de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), em especial ao Centro de Investigação de Microrganismos (CIM), que viabilizou este estudo. Agradeço aos professores e funcionários Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado, Prof. Dr. Carlos Cavasini, Luciana Moran e Valéria Fraga, pelo incentivo, apoio, dedicação e amizade, durante a realização deste trabalho. Agradeço ainda a grande contribuição do Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado, por participar de minha Banca no Exame Geral de Qualificação.
orientar-me no Mestrado, e também por sua preciosa participação em minha Banca de Qualificação. Minha gratidão por, mais uma vez, fazer parte de minha formação profissional.
À Dra. Dirce Zanetta, Dra. M. Lúcia Salomão, Dra. Eliana Cabreira, Dr. José Antônio Cordeiro, da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, pelo apoio durante a elaboração deste trabalho.
À aluna de Iniciação Científica Talita Cordeschi e à aluna do curso de graduação em Medicina Juliana Fenley, pela disponibilidade e grande empenho durante a pesquisa de prontuários do Hospital de Base.
Ao Hospital de Base de São José do Rio Preto (SP), em especial à Dra. Célia Franco do Serviço de Doenças Infecto-Parasitárias, pelo apoio e dedicação em todas as etapas da elaboração deste trabalho.
Ao Instituto Adolfo Lutz, meu agradecimento especial à Diretora dos Laboratórios Regionais Dra. Regina Gomes Almeida, e às Diretoras-Técnicas do Laboratório Regional de São José do Rio Preto, Dra. Cecília Cristina Marques dos Santos e Ivete Aparecida Zago Castanheira de Almeida, pelo apoio e colaboração, durante o desenvolvimento deste trabalho.
Às amigas Maria Izabel Ferreira Pereira e Maria do Rosário Assad Goloni, do Laboratório de Micobactérias do Instituto Adolfo Lutz de São José do Rio Preto, pelo incentivo, carinho, suporte técnico e convívio agradável durante a realização deste trabalho e também durante grande parte de minha vida profissional. Minha gratidão sincera.
Às amigas Jaqueline M. Peresi, Fabiana Costa, Elisabete Cardiga, Vanilda M. Borges, Denise Fusco, Rejane Graciani, Tânia Estécio, Juliana Klinder, Fernanda Pires, Fernanda Seixas, Aparecida Klai Ribeiro, Inara Carvalho e Maria Lúcia Campos, pela disponibilidade em ajudar diante das dificuldades, durante o Curso de Mestrado.
À Maria Elena Takemoto Takahashi e Custódia Roman pelo carinho e solicitude de todos os dias.
Ao Flávio T. Menis e Rodrigo F. Povinelli, pelo apoio à informática.
Às Pesquisadoras Maria Alice Telles, Suely Ueki, Lucilaine Ferrazolli, Conceição Martins, Carmen Giampaglia, Rosângela Oliveira e Érica Chimara, do Setor de Micobactérias, do Instituto Adolfo Lutz/Laboratório Central, pelo apoio, atenção e colaboração, durante a elaboração deste trabalho.
Ao Departamento Regional de Saúde (DRS XV) de São José do Rio Preto, pelo apoio durante a realização deste trabalho.
Ao Dr. Eduardo Lázzaro, Dra. Denise Gandolfi, Dra. Maria Rita Cury e Margarida Georgina Bassi da Secretaria Municipal de Saúde e Higiene de São José do Rio Preto, pelo apoio, atenção e colaboração, durante a realização deste trabalho.
Às enfermeiras Marisa Bacani Posso e Maria Aparecida B. da Rocha Silva, do Serviço de Atendimento Especializado de DST/AIDS (SAE), pela disponibilidade, dedicação e atenção, durante a realização da pesquisa de prontuários. Meus sinceros agradecimentos.
oportunidade do convívio renovador e gratificante com vocês, nesta etapa de minha vida.
Meu muito obrigada à Dra. Daisy Nakamura Sato e à Prof. Dra. Silvia Helena Vendramine, pela atenção dispensada na análise da Dissertação e pela disponibilidade em participar da minha banca examinadora.
Ao Dr. Claúdio Penido Júnior, pelo empenho e colaboração junto ao CEP da Faculdade de Medicina de Catanduva (FAMECA).
A todas as pessoas da família pela ajuda incondicional, por estarem ao nosso lado nos momentos alegres e nas horas difíceis: pais, irmãos, sogra, cunhados e sobrinhos. Obrigada a todos.
Enfim, obrigada a todos que, diretamente ou não, contribuíram para a realização deste trabalho. Que cada um saiba que, de alguma forma, foi responsável por esta conquista. Meus sinceros agradecimentos a todos.
Alguma coisa para sempre...
Tudo flui:
Meu/teu corpo
Meus/teus pensamentos
Meus/teus sentimentos
Nossos encontros/desencontros
Nossas construções/implosões
Nossas utopias/desilusões.
Amanhã diferente do hoje que distinto já foi ontem
Para o sabor de nossas vidas
Que o viver engrandece.
Nesse cenário de total alteração das coisas
Só uma delas não muda,
Permanece
Mesmo uma única coisa sendo,
inspira confiança
Ela não é um vir-a-ser,
Sempre é...será
A esperança de mudanças.
CAPÍTULO UM:
INTRODUÇÃO GERAL
I. Mycobacterium sp………...…...2
I.1 Investigação laboratorial das doenças micobacterianas……...4
II. A tuberculose e o advento da AIDS………...…...5
III. As micobactérias e o portador do HIV/doente com AIDS………...8
III. 1. Principais indicadores clínicos da Aids e da tuberculose...10
III. 2. A poliquimioterapia e o fenômeno da resistência………...11
IV. Justificativa………...13
V. Objetivos V.1. Objetivo geral………...14
V.2.Objetivos específicos……….………...14
CAPÍTULO DOIS: Higth prevalence of Non-tuberculous mycobacteria in HIV-1 infected population from São Paulo State, Southeastern Brazil. Summary………..…..……….….19
Introduction……….….20
Material and Methods……….…21
Results………..……23
Ethical Approval...33 Funding...33 Conflicts of interest...33 References………..……33 Tables...42 Legends or figures...47 CAPÍTULO TRÊS: CONCLUSÕES………...….49 CAPÍTULO QUATRO: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS………...51
CAPÍTULO CINCO: RESUMO………...64 CAPÍTULO SEIS: ABSTRACT………...66 CAPÍTULO SETE: ANEXOS………...………68
Anexo 3...70 Anexo 3.a...71 Anexo 3.b...72 Anexo 4...73 Anexo 4.b...74 Anexo 4.c...75 Anexo 4.d...76 Anexo 5...77 Anexo 5.a...78 Anexo 6...79 Anexo 7...80
I. Mycobacterium sp.
Único representante da família Mycobacteriaceae, o gênero Mycobacterium sp. é constituído por bacilos extremamente delgados e alongados, sejam eles curvos ou retos. Característica essencial para a identificação desses microrganismos é sua marcante propriedade de álcool-ácido resistência, o que se explica, dada a grande quantidade de lipídios presentes em sua parede celular. Seu metabolismo é aeróbio, e o tempo necessário para a visualização de suas colônias divide-os em dois grandes grupos: um primeiro grupo, formado por colônias de crescimento rápido, que requerem menos de sete dias, para produzirem, em meios sólidos de cultura, colônias visíveis; e um segundo grupo, formado por colônias de crescimento lento (HOLT et al., 1994; MELO et al., 2002; NOLTE; METCHOCK, 1995; SATO, 1998). Das últimas, constam não apenas as espécies do complexo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis-BCG, M. africanum, M. microti), como constam ainda outras espécies, atualmente denominadas micobactérias não-tuberculosas (MNT). Até hoje, mais de cem MNT
foram descritas (AMERICAN THORACIC SOCIETY, 1997; COLLINS; FRANZBLAU,
1997; DAVIDSON, 1989;EUZÉBY, 2004; UEKI et al., 2005).
Com o advento de modernas metodologias moleculares, determinaram-se, até o presente momento, genomas de cinco representantes do gênero Mycobacterium: M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis CDC1551, M. bovis, M. leprae e M. avium ssp. paratuberculosis, ao passo que 14 outros genomas encontram-se em fase final de determinação. Os dados obtidos mostraram que, apesar de um grande número de seqüências gênicas comuns, particularidades metabólicas geneticamente determinadas são espécie-específicas, tendo influência direta na fisiologia desses patógenos e também na interação destes com os diferentes microambientes de seus hospedeiros (MARRI et al., 2006).
Enquanto as características patogênicas clássicas de M. tuberculosis têm sido mais extensivamente descritas, pouco se sabe sobre as MNT, as quais ganharam o “status” de agentes oportunistas, desde que infecções atípicas provocadas por esses agentes foram identificadas em portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), mais conhecida por sua sigla, em inglês, AIDS (CONDE et al., 1999;
MURCIA-ARANGUREN et al., 2001). Classicamente, as MNT estão amplamente distribuídas no ambiente fazendo, algumas delas, parte da microbiota de organismos superiores ou tendo outras sido isoladas como contaminantes de espécimes biológicos não-estéreis (PRIMM et al., 2004). De acordo com seu potencial patogênico, podem as MNT ser potencial ou raramente patogênicas, ou podem, então, ser estritamente ambientais, devendo, portanto, proceder-se com cautela, ao avaliar o significado clínico de seu isolamento, para o que foram estabelecidos critérios, quais sejam: um isolamento a partir de sítio estéril; e/ou um isolamento de dois sítios não-estéreis obtidos a partir de culturas puras e abundantes; além da presença de sinais clínicos compatíveis (AMERICAN THORACIC SOCIETY DOCUMENTS, 2007). As MNT potencialmente patogênicas podem causar diversas formas localizadas de doença nos pulmões, nos gânglios, na pele e nas articulações, bem como podem assumir a forma disseminada dessas doenças, que, quando não tratadas, podem ou revelar-se fatais, ou deixar graves seqüelas (BARRETO et al., 1993; CAMPOS et al., 2000; MARRAS et al., 2007).
Nas últimas décadas, com metodologias de investigação do ácido
desoxirribonucléico (DNA), reconheceram-se muitas novas espécies de MNT, que, não tendo sido fenotipicamente caracterizadas, não puderam, portanto, ser elucidadas pelos métodos convencionais. Em razão dos cada vez mais freqüentes resultados não conclusivos, a validação, em rotina diagnóstica de métodos moleculares, de identificação dessas MNT permitirá a determinação da espécie responsável (UEKI et al., 2005).
Dentro das MNT, ocupam lugar de destaque, como potencialmente patogênicas ao homem, aquelas pertencentes ao complexo Mycobacterium avium (MAC), que compreende as espécies M. avium, M. intracellulare, M. paratuberculosis, M. sylvaticum e M. lepramurium, sendo a primeira a mais freqüentemente relatada (MARTÍNEZ-MORAGÓN et al., 2001; SATO, 1999). Estudos genômicos recentes sobre o M. avium são otimistas em relação ao entendimento funcional mais efetivo desses organismos. Apesar dos avanços a respeito dos estudos moleculares sobre MAC, persistem, contudo, problemas em sua detecção e nomenclatura apropriada, uma vez que as cepas desses microrganismos parecem apresentar, quando comparadas entre si, considerável diversidade genética (TURENNE et al., 2007). Além disso, MAC
compartilha características bioquímicas idênticas com outras espécies, como, por exemplo, o M. lentiflavum (SUFFYS et al., 2006).
Para proceder-se à correta determinação de particularidades biológicas micobacterianas com influência direta na concepção futura seja de fármacos, seja de estratégias específicas (e, portanto, mais efetivas) de tratamento das patologias provocadas por tais agentes, é importante identificarem-se, inequivocamente, as diferentes espécies de micobactérias. Futuramente, tal conhecimento contribuirá para a prevenção e o controle das doenças por elas causadas (SUFFYS et al., 2006; UEKI et al, 2005).
I.1. Investigação laboratorial das doenças micobacterianas
O laboratório de referência é importante ferramenta do Programa Nacional de Controle da Tuberculose, muito útil também no controle das demais micobacterioses, uma vez que, entre seus objetivos, estão, justamente, o isolamento e a identificação de seus agentes, através de técnicas validadas. Por meio da microscopia, da cultura e de provas bioquímicas, faz-se o diagnóstico precoce das micobacterioses, o que contribui para a interrupção do seu ciclo de transmissão e para o controle e ainda para a cura da doença (BRASIL, 1998, 2002b; KENT; KUBICA, 1985).
A baciloscopia direta do escarro é fundamental, para determinar as fontes mais importantes da infecção: os indivíduos bacilíferos (BRASIL, 2002b). É o método preconizado para o diagnóstico da tuberculose pulmonar (TB), por tratar-se de um exame direto, não-invasivo, rápido e econômico. Já a cultura, considerada “gold standard”, ainda é o método bacteriológico mais sensível para o diagnóstico da TB e da tuberculose extrapulmonar (API CONSENSUS EXPERT COMMITTEE, 2006). Enquanto o diagnóstico da forma pulmonar pela baciloscopia requer de 5.000 a 10.000 bacilos por mililitro de escarro, a cultura permite a positividade a partir de 10 bacilos por mililitro (MELO et al., 2002). Devido a essa sensibilidade aumentada, a cultura está indicada para a investigação das formas paucibacilares da tuberculose na população geral e, em especial, para a identificação das micobactérias que acometem os pacientes co-infectados pelo vírus da imunodeficiência humana-HIV (BRASIL, 2005).
A tipificação das espécies do gênero Mycobacterium sp., assim como os testes de sensibilidade aos quimioterápicos utilizados no tratamento, são importantes para a prescrição dos antimicrobianos adequados, segundo os esquemas terapêuticos disponíveis (SATO, 1998). Tal estratégia minimiza o risco de seleção de cepas resistentes ou multirresistentes aos medicamentos antituberculose, medida de especial relevância para o grupo de indivíduos imunossuprimidos. Além disso, reduz a possibilidade de falha terapêutica e, portanto, contribui para a melhora do quadro clínico (AMERICAN THORACIC SOCIETY, 1997; BARRETO; CAMPOS, 2000; KRITSKI, 1993; MARTÍNEZ-MORAGÓN et al., 2001).
II. A tuberculose e o advento da AIDS
Dentre as afecções que têm, como agente causal, as espécies do gênero Mycobacterium sp., a forma pulmonar da tuberculose é a mais extensivamente estudada, por sua relevância nos âmbitos individual e populacional, o que a caracteriza como importante problema de saúde pública (RUFFINO-NETTO, 2002).
As manifestações clínicas da tuberculose são conhecidas há milênios. Os sinais indicativos de lesões no pulmão já foram detectados em múmias egípcias de três mil anos. No ano 400 a.C., Hipócrates (460-370 a.C.) descreveu a forma pulmonar da doença, mas, somente por volta do ano 980 de nossa Era, foi a tuberculose reconhecida, na Europa feudal, como doença infecciosa que é. Posteriormente, no século XVII, com suas cidades populosas, é que essa doença adquiriu caráter epidêmico (ASSIS; TAVARES, 2001; BRASIL, 2000; GONÇALVES, 2000; ROSEMBERG; TARANTINO, 1997;). O grande marco na história da tuberculose ocorreu no ano de 1882, quando o médico alemão Robert Koch anunciou o isolamento de seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis, o que conferiu a essa bactéria o nome usual de bacilo de Koch (ASSIS; TAVARES, 2001; GONÇALVES, 2000; LIMA et al., 1997; MELO et al., 2002). Por muito tempo, a doença permaneceu entre as mais temidas da humanidade (LIMA et al., 1997).
Com os marcantes avanços terapêuticos e profiláticos, o panorama mundial da tuberculose foi sendo gradualmente alterado (SCHOUT, 1994). Primeiramente, com os
tuberculostáticos eficazes da década de 40 e, depois, já na década de 70, com a introdução da vacina intradérmica que utiliza o bacilo Calmette-Guérin (BCG-ID), verificou-se, em todo o mundo, acentuado declínio da morbidade em razão da tuberculose, graças, ainda, à melhora generalizada das condições de vida da população (HIJJAR; OLIVEIRA; TEIXEIRA, 2001; MELO et. al., 2002; ROSEMBERG, 1999; SCHOUT, 1994).
Nos dias atuais, configura-se a tuberculose como doença crônica, em ressurgimento, nos países desenvolvidos e como doença de alta incidência, nos países em desenvolvimento (GOLUB et al., 2005). Somente no ano de 2005, estimou-se em 8,8 milhões o número de casos da doença, sendo 7,4 milhões deles na Ásia e na África Sub-sahariana (WORD HEALTH ORGANIZATION, 2007). Em relação à distribuição mundial da tuberculose, as Américas respondem por 7% das notificações, sendo que o Brasil e o Peru notificaram 67% do total de casos do continente americano (BRASIL, 2002a; ORGANIZACION PANAMERICANA DE SALUD, 2002).
Dados epidemiológicos apontam para uma concentração, em 22 países, de 80% dos casos de tuberculose no mundo, sendo que, no Brasil (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1997), a doença é considerada um problema prioritário de saúde pública (BRASIL, 2002b; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003b). Nesse contexto, estima-se uma incidência de 128 mil casos por ano no país, dos quais cerca de 30% não são notificados. Em sua maioria, tais casos ocorrem nos grandes centros urbanos brasileiros (UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO, 2005) e de forma heterogênea nas diferentes regiões da Federação.
A Organização Mundial de Saúde (OMS) assinala, como principais causas para a gravidade contemporânea global da tuberculose, os seguintes fatores: a desigualdade social e suas implicações, o envelhecimento da população, os grandes movimentos migratórios e a piora na qualidade dos programas de controle da doença, sob a coordenação dos gestores públicos, além do advento da AIDS (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1997, 2003a, 2006). Dentre esses fatores, a OMS destaca a
co-infecção M. tuberculosis/HIV (TB/HIV), como uma calamidade sem precedentes (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003b).
Em razão dos dados epidemiológicos favoráveis, no final dos anos 70, a OMS começava a preparar o programa de erradicação da tuberculose, a ser implementado na década seguinte (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1987). Entretanto, no início da década de 80, a então recém-descrita AIDS modificou a história natural da tuberculose, reconduzindo esta doença ao “status” de ameaça à saúde pública, mesmo em países desenvolvidos (RODRIGUES JR.; RUFFINO-NETTO, 2004; RUFFINO-NETTO, 2002; SÃO PAULO, 1996). Desde então, a AIDS avançou. Somente em 2005, havia, em todo o mundo, 38,6 milhões de pessoas infectadas com o HIV, dos quais 2,8 milhões morreram em decorrência da doença. Aproximadamente 11 mil novos casos de AIDS foram notificados por dia, no ano de 2005, sendo que mais de 95% das notificações ocorreram em países de baixa e de média renda (JOINT UNITED NATIONS PROGRAMME ON HIV/AIDS, 2006).
A tuberculose, por sua vez, constitui a principal causa de óbito por doença infecciosa nos portadores do HIV e doentes com AIDS (BARNES et al., 1993; DAVID et al., 2004, WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2006), tendo sido responsável por 195 mil mortes, considerando-se apenas o ano de 2005 (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2007). Ainda que estejam disponíveis tratamentos efetivos para ambas as condições, não estão claramente definidos regimes de tratamento ideais para a co-infecção TB/HIV (BREEN et al., 2006). Desse modo, a infecção pelo HIV tem grande impacto na distribuição mundial da tuberculose, tanto em países desenvolvidos, como naqueles em desenvolvimento, principalmente nas Américas (CANTWELL et al., 1994; LEITE; TELAROLLI JÚNIOR, 1997; McMACKEN; CASTRO, 1994; DROBNIEWSKI et al., 1996; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2007).
No Brasil, a epidemia da AIDS mostra-se igualmente relevante, produzindo mudanças importantes nos aspectos socioeconômicos, na incidência, nas manifestações clínicas, no tratamento e na cura da tuberculose. O novo desenho epidemiológico da tuberculose, portanto, é um dos grandes desafios para a pesquisa e para a prestação de serviços em saúde no país (LEITE; TELAROLLI JÚNIOR, 1997; MELO et al., 2002; RAVIGLIONE et al., 1997; RUFFINO-NETTO, 2002). Segundo o Ministério da Saúde nacional, a TB é uma das três principais infecções oportunistas no paciente com AIDS (SÃO PAULO, 1996). Na Tabela 1, é possível verificar que, em
prevalência da co-infecção TB/HIV, o Brasil ocupa a décima posição, dentre os 22 países de maior incidência da TB no mundo, somente atrás dos países africanos. Importa ressalvar que os dados nacionais mostram, primeiramente, que a distribuição da co-infecção no país não é uniforme (MELO et al., 2002) e mostram, também, que há subnotificação da TB entre pacientes soropositivos para o HIV (SÃO PAULO, 1996). Ainda é de se notar que estimativas recentes, baseadas nas prevalências isoladas de cada uma dessas doenças, referem que cerca de 20% dos pacientes portadores do HIV são afetados pela TB (BRASIL, 2005; PUBLIC HEALTH WATCH, 2006).
III. As micobactérias e o portador do HIV/doente com AIDS
Relativamente a contrair tuberculose, um indivíduo infectado pelo HIV é 25 vezes mais susceptível a sofrê-lo do que aqueles não-infectados pelo vírus da AIDS (KERR-PONTES; OLIVEIRA; FREIRE, 1997). Além disso, quanto ao risco de morte em decorrência da associação TB/HIV, este é, por sua vez, duas vezes maior para os indivíduos portadores da co-infecção TB/HIV do que para os pacientes portadores exclusivos do HIV (LAGRANGE et al., 2000; PULIDO et al., 1998). Isso ocorre, devido ao fato de a AIDS, em um primeiro momento, causar importante depleção imune celular e, em seguida, alterar o quadro evolutivo da tuberculose já manifesta (MELO et. al., 2002).
De natureza tipicamente crônica em indivíduos soronegativos para o HIV, a tuberculose manifesta-se mais agressiva em doentes com AIDS, podendo a evolução do quadro levar a óbito o paciente soropositivo para o HIV, em um intervalo entre quatro semanas e seis meses depois do diagnóstico da doença bacteriana, na ausência de tratamento específico para esta moléstia. Adicionalmente, a forma extrapulmonar de tuberculose apresenta-se mais freqüente, com índices de incidência variando de 50 a 76% dos casos verificados na população de soropositivos para o HIV (DALCOMO; KRITSKI, 1993; NAGAI, 2003). Além disso, nesses pacientes, podem advir, simultaneamente, as formas pulmonar e extrapulmonar da doença (LEITE; TELAROLLI
Tabela 1. Estimativa de tuberculose (sob todas as suas formas) quanto à incidência, à
mortalidade e à prevalência da co-infecção TB/HIV, nos países de sua maior incidência, no ano de 2004, ordem decrescente.
PAÍSES POPULAÇÃO (MILHÕES) INCIDÊNCIA (MILHARES) INCIDÊNCIA POR 100 mil HABITANTES MORTALIDADE POR 100 mil HABITANTES PREVALÊNCIA DA CO-INFECÇÃO TB/HIV (%) 1- Índia 1.087.124 1.824 168 30 5,2 2- China 1.307.989 1.325 101 17 0,9 3- Indonésia 220.077 539 245 46 0,9 4- Nigéria 128.709 374 290 82 27,0 5- África do Sul 47.208 339 718 135 60,0 6- Bangladesh 139.215 319 229 51 0,1 7- Paquistão 154.794 281 181 40 0,6 8- Etiópia 75.600 267 353 79 21,0 9- Filipinas 81.617 239 293 48 0,1 10- Quênia 33.467 207 619 133 29,0 11- Congo 55.853 204 366 79 21,0 12- Rússia 143.899 166 115 21 6,8 13- Vietnã 83.123 147 176 22 3,0 14- Tanzânia 37.627 131 347 78 36,0 15- Uganda 27.821 112 402 92 19,0 16- Brasil 183.913 110 60 7,8 17,0 17- Afeganistão 38.574 95 333 92 0,0 18- Tailândia 63.694 91 142 19 8,5 19- Moçambique 19.424 89 460 129 48,0 20- Zimbábue 12.936 87 674 151 68,0 21- Mianmar 50.004 85 171 21 7,1 22- Camboja 13.798 70 510 94 13,0
Fonte: Adaptada de WHO, Global Tuberculosis Control Surveillance, Planning, Financing, (Genebra:
WHO, 2006).
JÚNIOR, 1997), com a freqüência aumentada de MNT como agente etiológico da última forma (SHARMA; MOHAN; KAHIRAVAN, 2005). Sabe-se, ainda, que, para portadores da co-infecção vírus-micobactéria, é condição predisponente à tuberculose extrapulmonar a contagem de linfócitos TCD4+ abaixo de 50 células por mm3 (HADAD et al., 1995, 2003; HONGTHIAMTHONG et al., 1994; KERR-PONTES; OLIVEIRA; FREIRE, 1997; MATTOS, et al., 2006; NAGAI, 2003; SÃO PAULO, 1996). Outra conseqüência do sinergismo HIV-Mycobacterium sp. é a probabilidade aumentada de doença disseminada (HADAD et al., 1995).
É fato conhecido que as doenças causadas pelas MNT aumentaram em todo mundo, no período pós-AIDS, sendo que, nos Estados Unidos e na Europa, constatou-se um percentual entre 25 e 60% de infecções atribuídas a esconstatou-ses microrganismos, entre os portadores de HIV (AMERICAN THORACIC SOCIETY, 1997; FALKINHAM, 1996; HADAD et al., 2003). No Brasil, as doenças causadas por tais agentes não são de notificação obrigatória, o que dificulta a busca por registros oficiais, com vistas à estimativa acurada das respectivas incidências. No entanto, levantamentos realizados nas regiões Sul, Sudeste e Nordeste do país mostraram uma ampla variação entre oito e 59% nas taxas de isolamento dessas bactérias, entre os soropositivos para o HIV-1 (FERREIRA et al., 2002; MATTOS et al., 2006; UEKI et al., 2005).
III. 1. Principais indicadores clínicos da AIDS e da tuberculose
Na infecção pelo HIV, a imunodeficiência progressiva está associada a alterações quantitativas e qualitativas dos linfócitos TCD4+, sendo este um indicador confiável, no acompanhamento de pacientes acometidos por essa síndrome (BOISELLE; AVIRAN; FISHMAN, 2002; SILVA et al., 2006). O teste que avalia a contagem dessas células no sangue periférico é rotineiramente solicitado para avaliação do prognóstico da imunodeficiência e de sua evolução. Portanto, a partir das alterações quantitativas e qualitativas dos linfócitos TCD4+, é possível diferenciar estágios sintomáticos e decidir pelo tratamento antiviral e pela profilaxia de patógenos oportunistas. Para a maioria dos laboratórios, os valores normais dos linfócitos TCD4+ são, em média, de 800 a 1.050
células/mm3, com uma variação de dois desvios-padrão de, aproximadamente, 500 a 1.400 células/mm3 (BARTLETT; GALLANT, 2004; RACHID; SCHECHTER, 2005).
Um outro parâmetro relevante no acompanhamento do portador do HIV é a carga viral, que se refere à quantidade de cópias do HIV-1 circulante por mililitro de sangue periférico. Assim como a contagem de linfócitos TCD4+ é usada para monitorar a progressão da doença e auxiliar o tratamento do paciente imunodeprimido (BARTLETT; GALLANT, 2004; RACHID; SCHECHTER, 2005).
É comum que o adoecimento, por tuberculose, de paciente soropositivo para HIV promova a elevação da carga viral e a concomitante redução da contagem de células TCD4+. Portanto, para o controle da tuberculose, em pacientes co-infectados, são fundamentais a quimioprofilaxia, o diagnóstico e o tratamento precoces (BRASIL, 2004) Outro procedimento bastante usado no diagnóstico e no acompanhamento da evolução da TB é o exame radiológico de tórax (SÃO PAULO, 2002). Esse exame é adotado nos casos de sintomáticos respiratórios negativos à baciloscopia direta; nos comunicantes de todas as idades sem sintomatologia respiratória; no suspeito de tuberculose extra-pulmonar e nos portadores do HIV ou pacientes com AIDS (BRASIL, 2004). Nesses últimos, a interpretação de seus resultados pode ser dificultada pela presença de sinais atípicos ou ainda à ausência de quaisquer indicativos radiológicos (SILVA et al., 2006).
III. 2. A poliquimioterapia e o fenômeno da resistência
O tratamento da tuberculose inclui drogas altamente eficazes, como a rifampicina, a isoniazida, a pirazinamida e o etambutol, que, se administrados pelo período previsto de seis meses, fornecem, em situações imunológicas estáveis, bom resultado terapêutico (BRASIL, 2002c).
No Brasil, assim como na maior parte dos países, os esquemas de tratamento da TB são padronizados. Define-se o esquema mais adequado de tratamento com base na forma clínica da doença, na idade de seu portador e no histórico medicamentoso anterior. Independentemente desses fatores, é comum o uso medicamentoso diário, por tempo prolongado (BRASIL, 2002c).
Anos de investigação clínica confirmam a importância da terapia com múltiplas drogas, devido à facilidade de seleção de cepas resistentes às drogas antimicobacterianas isoladas (SPTZNAGEL, 2002). De fato, nos últimos anos, apesar do uso de esquemas terapêuticos eficazes, tem-se observado, em nível mundial, o aumento do aparecimento de cepas de M. tuberculosis resistentes às principais drogas, o que constitui uma ameaça para os programas de controle da tuberculose (AZIZ et al., 2006; BARTLETT, 2007; FUJITA, 1998; JARDIM et al., 2001; MURAI, 1999; PALACI et al., 2004; PEREIRA PINTO et al., 2001; SÃO PAULO, 1996; TELLES et al, 2005).
A resistência aos fármacos não constitui fenômeno recente no Brasil, já que, desde o início da década de 1980, observaram-se casos de tuberculose multirresistente (MDR-resistência; pelo menos à isoniazida e à rifampicina) aos esquemas empregados pelos programas oficiais de controle da doença. Nos EUA, a multirresistência é de caráter eminentemente primário, ou seja, em pacientes que não receberam medicamento antituberculose anteriormente, e intimamente associada à AIDS. No Brasil, é, na maior parte, secundária, isto é, em pacientes previamente tratados com drogas antituberculose, pelo período mínimo de um mês. São condições propícias ao aparecimento de formas multirresistentes de M. tuberculosis falhas no tratamento (em especial irregularidade na utilização dos medicamentos), sucessivos abandonos da terapia e mesmo prescrições inadequadas (DAS et al., 2006; HSUEH et al., 2006). A diminuição da imunidade pela infecção do HIV, combinada ao aumento da possibilidade de infecção por cepas resistentes aos fármacos, tornou ainda mais árdua a tarefa de eliminação do M. tuberculosis nos portadores do HIV (SPITZNAGEL, 2002). Nesses pacientes, quanto mais precoce o diagnóstico e o tratamento da TB, minimizam-se os efeitos negativos da afecção no curso do HIV. Ademais, propicia-se a crucial interrupção da cadeia de transmissão, tanto comunitária, quanto hospitalar, sendo essa última particularmente relevante, dado o número maior de internações desses indivíduos e da probabilidade aumentada de isolamento de cepas resistentes, quando comparados aos soronegativos para esse vírus (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 1998).
Quanto as MNT, protocolos oficiais para a notificação e para a conduta terapêutica no Brasil somente agora começam a ser disponibilizados pelo Centro de Vigilância
Epidemiológica do Estado de São Paulo, que também elencou dez Centros de Referência Estaduais, para o tratamento desses agentes (SÃO PAULO, 2005).
IV. Justificativa
A progressão, sem precedentes, da epidemia da tuberculose ligada ao HIV exige ação efetiva e urgente.
Em 1993, a OMS declarou estado de urgência da tuberculose, e o Ministério da Saúde (MS) elaborou o Plano Emergencial para o Controle da Tuberculose, que, efetivamente, foi implantado a partir de 1996. Seu objetivo foi o de aumentar o sucesso das ações de controle da doença, por meio da implementação de atividades específicas, em 230 municípios prioritários, onde se concentravam 75% dos casos estimados para o Brasil. Um dos alvos primários foi a diminuição da transmissão do bacilo até o ano de 1998, meta apenas parcialmente alcançada. A escolha desses municípios baseou-se na magnitude epidemiológica da TB e da AIDS, no tamanho da população, bem como em suas informações operacionais (BRASIL, 1996, 2000; RUFFINO-NETTO, 2002).
O Estado de São Paulo, na Região Sudeste do Brasil, é o responsável, a cada ano, pelo maior número absoluto de casos novos de TB na população brasileira de soropositiva/doentes de AIDS. No Brasil, na década de 90, a freqüência da co-infecção TB/HIV aumentou, até atingir cerca de 20% do total de casos de tuberculose do ano de 1997. Desde então, parece estar lentamente diminuindo. De qualquer forma, os Municípios com altos coeficientes de incidência, como São José do Rio Preto, Ribeirão Preto e Campinas, têm sido objeto de atenção especial do Programa Nacional de Controle da Tuberculose (SÃO PAULO, 1996).
No Município de São José do Rio Preto, no Estado de São Paulo, as proporções de casos dessa co-infecção variaram entre 29 e 37%, no período compreendido entre os anos de 1998 a 2002. Essas taxas são consideradas altas, o que contribuiu para a classificação do Município como prioritário no Programa de Controle da Tuberculose, e direciona o recebimento de incentivos dos governos estadual e federal para o
tratamento de seus doentes (DEPARTAMENTO DE EPIDEMIOLOGIA E SAÚDE COLETIVA, SECRETARIA MUNICIPAL DE SAÚDE E HIGIENE, 2004).
Desconhece-se a freqüência das micobacterioses e das MNT isoladas a partir dos portadores do HIV de São José do Rio Preto e Região, assim como é desconhecido o perfil sócio-demográfico desses doentes. Adicionalmente, não existem publicações quanto ao perfil de sensibilidade antimicrobiana de M. tuberculosis isolada das amostras provenientes do mesmo grupo.
Devido ao impacto, individual e coletivo, da concomitância da infecção pelo HIV e Mycobacterium sp., estudos que considerem a incidência e a prevalência das espécies isoladas contribuirão para o entendimento da dinâmica regional de transmissão e, a médio e longo prazo, para o levantamento de estratégias de prevenção e controle dessas importantes nosologias.
V. Objetivos
V. 1. Objetivo Geral:
Considerado o acima exposto, o presente estudo tem por objetivo avaliar o perfil microbiológico de Mycobacterium sp. em pacientes infectados pelo vírus HIV/ doentes de AIDS, no município de São José do Rio Preto – SP e região.
V. 2. Objetivos Específicos:
São objetivos específicos do presente estudo, tomando por base uma população soropositiva para o HIV/doentes de AIDS do município de São José do Rio Preto e região:
a) Descrever aspectos sócio-demográficos e clínico-epidemiológicos da co-infecção por espécies do gênero Mycobacterium sp.
de risco associados à colonização/infecção pelas mesmas.
c) Verificar o status da resposta antimicrobiana de M. tuberculosis aos fármacos que compõe a poliquimioterapia antituberculose.
Os resultados e a discussão desta dissertação encontram-se apresentados a seguir sob a forma de artigo de publicação, formatado para submissão ao periódico
“Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene”. Os resultados
parciais obtidos durante a execução do projeto de mestrado foram apresentados nos
quatro eventos científicos (Anexo 3, 4, 5, 6) abaixo discriminados:
1- 24º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, realizado em
BRASÍLIA/DF, no período de 3 a 6 de outubro de 2007. Apresentação sob a forma de pôster intitulado “MICOBACTÉRIAS EM PORTADORES DO HIV DE UM MUNICÍPIO PRIORITÁRIO PARA A TUBERCULOSE E PARA A SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA”.
2- XV CONGRESSO BRASILEIRO DE INFECTOLOGIA, realizado em
CURITIBA/PR, no período de 20 a 23 de outubro de 2007. Resumo selecionado para apresentação oral, intitulado "ISOLAMENTO DE ESPÉCIES DO GÊNERO MYCOBACTERIUM SP. ENTRE PACIENTES PORTADORES DE HIV/AIDS EM SÃO JOSÉ DO RIO PRETO, SP”. Pedro et al., 2007. Brazilian Journal of Infectious Diseases, 11: suppl.2, p.S46.
3- XI Encontro Científico da FAMERP & IV Congresso Anual de Iniciação Científica da FAMERP, realizado em São José do Rio Preto, SP, de 23 a 24 de
outubro de 2007. Apresentação sob a forma de resumo intitulado “CO-INFECÇÃO MYCOBACTERIUM/HIV EM UMA POPULAÇÃO DO NOROESTE PAULISTA.”
4- 44º Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, a ser realizado
em PORTO ALEGRE, RS, no período de 4 a 7 de março de 2008. Apresentação em forma de pôster intitulado “PERFIL DE SENSIBILIDADE DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ISOLADO A PARTIR DE 103 PORTADORES DO HIV-1 EM UM CENTRO DE REFERÊNCIA PARA DIAGNÓSTICO DO NOROESTE PAULISTA.”
High prevalence of Non-tuberculous mycobacteria in a HIV-1 infected population from São Paulo State, Southeastern Brazil in the Post HAART era.
Heloisa da Silveira Paro Pedro1,5, Maria Izabel Ferreira Pereira1, Maria do Rosário Assad Goloni1, Fernanda Carina Pires1, Rosângela Siqueira Oliveira2, Maria Aparecida Batista da Rocha3, Luciana Moran Conceição4, Valéria Daltibari Fraga4, Juliana Camargo Fenley4, Talita Cordeschi4, Ricardo Luiz Dantas Machado4,Célia Franco5, Andréa Regina Baptista Rossit4*
1
Adolfo Lutz Institute – Regional Laboratory from São José do Rio Preto, São Paulo;
2
Adolfo Lutz Institute – Central Laboratory from São Paulo, SP (IAL-São Paulo);
3DST/AIDS Specialized Attendance Service – SJRPreto, SP; 4Center for
Microorganisms Investigation (CIM), Department of Dermatological, Parasitical and Infectious Diseases from Faculty of Medicine from São José do Rio Preto, SP (CIM-FAMERP); 5Infectious and Parasitical Diseases Service from Hospital de Base (DIP-HB) – Faculty of Medicine from São José do Rio Preto Foundation (Funfarme).
*Corresponding author:
Centro de Investigação de Microrganismos da FAMERP Avenida Brigadeiro Faria Lima, 5416, Vila São Pedro 15090-000 – São José do Rio Preto, São Paulo
FONE/FAX: (017) 32015909 andrea@famerp.br
Summary
São José do Rio Preto city (SJRP), Northwestern São Paulo State, Brazil, is considered “priority” by the National Programs of Tuberculosis and AIDS Control. Our purpose was to retrospectively evaluate Mycobacterium sp. isolated from HIV-infected patients attending the HIV/TB reference health care units from SJRP and region, as well to describe their clinical and socio-demographic aspects. One hundred and ninety-eigth HIV-seropositive individuals provided 287 positives cultures from January 2000 to December 2006. There was positive correlation between tuberculosis and prison record (p=0.021). Tobacco use reduced the mean lifetime from tuberculosis diagnosis to obit (p = 0.05). TCD4+ levels and a diffuse chest X-ray finding were associated to Mycobacterium tuberculosis (MT) isolation (p = 0.014 and 0.000, respectively). Approximately eleven percent of all MT strains showed resistance to at least one drug while 3.1% were multidrug resistant. Non-tuberculous mycobacteria (NTM) totalized 35.19% of all mycobacteria and the most frequently isolated species were Mycobacterium avium complex (MAC; 22.3%), M. fortuitum (5.2%) and M. gordonae (3.1%). We conclude that the HIV-infected population studied has a high prevalence of NTM colonization. In a wide country like Brazil, regional differences must be further evaluated in order to improve control and treatment of these opportunistic infections. Key Words: Mycobacterium; HIV; Tuberculosis; Drug resistance; Non-tuberculous mycobacteria; Co-infection
Introduction
The Southeastern Brazilian region concentrates 79.7% of all notified AIDS cases from 1980 to 2007, and, associated with the Southern region; it shows the highest mortality rates (8.7/100.000 inhabitants) of the country because of this disease (Brasil, 2002). The incidence of tuberculosis (TB) has been increasing worldwide and this fact is strongly related to the infection with the human immunodeficiency virus (HIV). Indeed, both diseases represent major public health failures and depending on geographic area the approximately 40 million people living with HIV infection are 6-50 times more likely to develop active TB than are people living without HIV infection (Bartlett, 2007). Brazil ranks tenth in the prevalence of the total number of co-infected people worldwide and first apart from the African continent countries (WHO, 2006).
Non-tuberculous mycobacteria (NTM) are ubiquitous environmental organisms that have been implicated in progressive pulmonary and non-pulmonary diseases such as skin and soft tissue infections, lymphadenitis, osteoarticular diseases, and disseminated disease (Griffith et al., 2007). In spite of the well know fact that NTM infection prevalence increased as a global phenomenon in the post HIV era much remains to be determined in terms of well-defined diagnosis criteria and thus establishment of “disease” and subsequent treatment (AMERICAN THORACIC SOCIETY, 2007). In addition, it seems clear that the prevalence of pulmonary NTM varies by geographical region, although the majority of epidemiological studies have major limitations. These include the fact that it is not mandatory to report NTM isolation and/or disease in many jurisdictions, the incomplete number of samples (Marras et al., 2007) and erroneous identification by conventional methods, leading to underestimation of the diversity of the Mycobacterium genus (Springer et al., 1996). In Brazil, NTM
isolation rates varied from 5.8-59.6% in HIV-seropositive populations from the Southeast and Northeast regions (Barreto et al., 1993, 2000; Conde et al., 1999; Fandinho et al., 1997; Ferreira et al., 2002; Hadad et al., 2003; Leite et al., 1995; Ueki et al., 2005).
São José do Rio Preto city, located in the Northwestern region of São Paulo State, Brazil, presents a high rate of TB/HIV co-infected individuals (varying from 29 to 37% between 1998 to 2002; DESC - Secretaria Municipal de Saúde e Higiene , 2004), which placed this municipality amongst those with “priority” status by the National Programs of Tuberculosis and AIDS Control. The purpose of the present study was to evaluate the microbiological profile of Mycobacterium species isolated from HIV-infected patients attending the HIV/TB reference health care units from São José do Rio Preto and region, Brazil, as well to describe their clinical and socio-demographic aspects.
Material and Methods
This study contains a retrospective analysis,conducted by the staff of the Adolfo Lutz Institute (IAL-SJRP) and Center for Microorganisms Investigation, Faculty of Medicine from São José do Rio Preto (FAMERP-SJRP), Southeastern Brazil, Northwestern São Paulo State region. We evaluated all HIV-1 positive patients whose IAL-SJRP laboratorial analysis was positive for Mycobacterium sp. after HIV infection diagnosed, from January 2000 to December 2006. The IAL-SJRP represents the regional tuberculosis diagnostic center in the São Paulo State Health Regional Department XV (DRS XV), which includes 101 municipalities. The 198 patients included were at least 18 years old and were attended in the Infectious and Parasitical Diseases Service from Hospital de Base (DIP-HB), Faculty of Medicine from São José do Rio Preto Foundation (n = 85), at the DST/AIDS Specialized Attendance Service (SAE) from the same city (n = 106) and at the Emílio Carlos Hospital from Catanduva, São Paulo (n
= 07). The HB is a tertiary care hospital catering to a large population from the Northwestern region of São Paulo State, Brazil, representing the regional center of AIDS and tuberculosis (TB) treatment. The multidisciplinary assistance to the HIV/AIDS population in SJRP is located on the SAE which includes a prevention and surveillance program for HIV infection and for TB carrier’s contacts. Fifty-one percent of all study group provided two or more samples (up to four), further examined for microbiological characteristics to amount to a total of 287 clinical specimens (225 sputum specimens; 8 bronchoalveolar lavage; 7 gastric lavage; 28 blood cultures; 11 cervical aspirate; 4 pleural fluid; 2 cerebrospinal fluid; 1 ascitic fluid; 1 bone marrow aspirate). Acid-fast stain of each clinical material was performed using the Ziehl-Nielsen method (David, 1989). The remaining amount of sample was used for primary isolation of Mycobacterium sp. by the automated BacT/Alert system (BioMérieux, France) or by the Ogawa-Kudoh culture medium (Susemihl, 1993). The majority of all strains were identified by culture and by biochemical analysis while some of the non-tuberculous mycobacteria required molecular testing (Brunello, 2001; Kent & Kubica, 1985). All M. tuberculosis strains were sent to Adolfo Lutz Institute – Central Laboratory in São Paulo, SP (IAL-São Paulo) to investigate drug susceptibility profile by the Bactec MGIT 960 Becton & Dickinson-BD system (Kruuner, 2006) to four drugs: isoniazid (INH), rifampicin (RMP), streptomycin (SM) and ethambutol (ETH). MDR-TB was defined as MT strains showing simultaneous resistance at least to INH and RMP (WHO, 2004). Records with clinical and epidemiological data such as sex, age, prison record, therapy, immune status, chest X-ray, hospitalization and others were obtained from medical records. Statistical analysis was performed using the Minitab software (version 12.22) and the R-2.41 program. To obtain the independence among proportions, we applied the
chi-square test or the Fisher exact test. The relationship between the clinical characteristics of participant individuals and the presence of MT or NTM as well as for the life expectancy after a positive diagnosis we used the Kaplan-Meier estimates. The adopted significance level for statistical inference was 5%.
Results
One hundred and ninety-eight HIV-seropositive individuals ranging from 20 to 70 years (mean age, 35.9 years; SD ± 8.09) were included. We excluded from the initial study group (n= 314) 116 patients since we were unable to locate their medical files and/or to confirm their HIV serological status (Figure 1). The prevalence of Mycobacterium sp. infected and/or colonized patients in the studied period at IAL was 2.9% (total of 6850 individuals) while the prevalence of Mycobacterium sp. positivity among samples obtained from HIV seropositive individuals in all 9785 clinical specimens (HIV seropositive plus seronegative) was 0.03%.
As summarized in Table 1, 74.3% were male of which 60% belonging to the “white” ethnic group. Approximately half of all individuals had TB and/or mycobacteria positive diagnosis between 30 and 39 years old, the majority lived in urban areas and had between four to eight years of formal education. Most of them were employed in positions that do not require specific qualification or schooling, with male mainly in the building construction field and women as domestic servants. The number of patients displaying one or more of the previously recognized risk factors for TB and/or HIV is shown in Table 2. A total of 37.4% of them shared more than one risk factor (data not shown) and the most common association was sexual risk (multiple sexual partners and/or male homosexual relation) and intravenous drug abuse. There was a significant positive correlation between MT isolation and prison record (p = 0.021). By using binary
logistic regression it was not possible to determine that alcohol or tobacco use are risk factors for obit in the studied group. The mean lifetime in-between TB diagnosis to obit was reduced among MT infected patients with a record of tobacco use ( =2.19 years) than among non smoking TB/HIV co-infected individuals ( =3.15 years; p = 0.05).
Table 3 shows clinical characteristics of the participant individuals as for the diagnosis of MT or NTM. Patients infected by MT were more frequently hospitalized (p=0.0000) and treated with antimycobacterial drugs (p=0.000) than those carrying NTM. The majority of MT infected patients were hospitalized at HB/EC whereas NTM was most frequently isolated from the ambulatory assisted individuals from SAE (p=0.000). Additionally, patients with tuberculosis were more frequently immunosupressed (TCD4+ levels below 200 cells/mm3; p = 0.014 and below 350 cells/mm3; p = 0.016) than NTM carriers. The mean TCD4+ cell count in these groups were 177.1 ± 178.5 cells/mm3 and 242.7 ± 260.5 cells/mm3 while the cell counts varied from six to 1145 cells/mm3 and from one to 1413 cells/mm3, respectively. As for the chest X-ray examinations, TB suggestive signs were found in 77.4% of the MT/HIV co-infected patients with the diffuse pattern being more prevalent than localized or normal results (p=0.000). No significant results were obtained when these subgroups were compared regarding the use of HAART or viral load.
Out of all 287 clinical specimens, the great majority (83.6%) was derived from the respiratory tract, 13.9% from sterile sites, such as lymphonodes, cerebrospinal fluid bone marrow and blood, and the remaining (2.5%) from others anatomic sites. Information from acid-fast stain, culture and drug susceptibility tests allowed early diagnosis of mycobacteria in 106 samples (approximately 37%; Table 4), the identification of the majority of the isolated Mycobacterium sp. (95.82%) and the
determination of 11.45% of MT resistant strains, respectively. The resistant strains to at least one drug were: six to streptomycin (54%), two to rifampicin (18.2%), and three to more than one antimycobacterial (27.3%). Overall, a 3.1% prevalence of MDR-TB was detected, as follows: isoniazid/rifampicin, isoniazid/rifampicin/ethambutol and isoniazid/rifampicin/streptomycin. All these strains were isolated in the year of 2000 and represented the patient’s first TB diagnosis. The mean lifetime between diagnosis and death for the patients infected by the resistant strains was reduced in 29 months in comparison to those infected by the susceptible ones, although this difference was not significant (p > 0.05).
The majority (60.6%) of all isolated mycobacteria was M. tuberculosis, 35.2% were classified among one of the NTM species, while 4.2% could not be identified at the species level (Table 4). The most frequently isolated NTM species belonged to the Mycobacterium avium complex (MAC; 22.3%), followed by M. fortuitum (5.2%), M. gordonae (3.1%), M. chelonae (1.4%) and M. kansasii (0.7%; Table 5). One hundred and four patients had 174 single MT infections and 84 patients carried 101 single NTM species. In ten patients (5.5%) more than one Mycobacterium sp. was obtained, as follows: in five of them were isolated MT plus NTM whereas from the other five more than one NTM (two MAC/M.fortuitum; one M.fortuitum/M.gordonae; one MAC/M.gordonae; one M.chelonae/M.abcessus; Figure 1). Twenty-three patients (16.7%) met the American Thoracic Society Documents (ATS) criteria for infection by NTM, the majority of them by MAC (91.3%) and the remaining by M. fortuitum (4.35%) and M. gordonae (4.35%).
Discussion
Undoubtedly, TB/HIV co-infection persists as an important public health problem (Bartlett, 2007; Friedland et al. 2007; Nunn et al. 2007; Perkins & Cunningham 2007) and the numerous reports of increasing NTM infections points to the emergence of an additional concern (Ferreira et al., 2002; Marras et al., 2007; Murcia-Aranguren et al., 2001; Ueki et al., 2005). To our knowledge this is the first report to describe MT and NTM prevalence in a HIV-infected population from São Paulo State other than those from its capital, São Paulo city, Brazil. São José do Rio Preto is a 400.000 inhabitant’s city located on the Northwestern region of São Paulo State, 450 km apart from São Paulo city (IBGE, 2007).The IAL represents the main governmental reference laboratory in São José do Rio Preto and region for infectious and parasitical diseases diagnosis and follow-up, including mycobacteriosis, tuberculosis and AIDS. Therefore, surveys based on Mycobacterium sp. diagnosis among HIV-seropositive individuals performed at IAL, such as the present study, can be considered representative of the Northwestern São Paulo state population. However, one limitation we acknowledge is the fact that Mycobacterium sp. diagnosis in AIDS patients is difficult, as the demonstration and isolation rate of mycobacteria are comparatively low (Bouza et al. 1993). This might explain why the prevalence of Mycobacterium/HIV patients (2.9%) and positive clinical specimens (0.03%) are below our preliminary anticipation at IAL records facing the TB/HIV epidemiological facts for this municipality where 15% of all TB patients were HIV co-infected while the national percentage, in the same year (2000), was 5% (Brasil, 2002).
The socio-demographic profile of the Northwestern São Paulo State Mycobacterium/HIV population is comparable to the other previously published reports
on TB/HIV co-infected populations worldwide in terms of all studied variables (sex distribution, mean age at diagnosis, ethnic group, residence, years of education and employment), as well as to populations from other Brazilian major regions such as the South and the Northeast (Aerts, 2004; Akpaka et al., 2006; Henn et al., 1999; Kerr-Pontes et al., 1997; Matos et al., 2004; Morimoto et al., 2005; Murcia-Aranguren et al., 2001; Silveira et al., 2006; Toledo-Junior et al., 2000). These data also reinforce the previously reported association between TB/HIV co-infection and low socioeconomic levels for the Brazilian population (Kerr-Pontes et al., 1997; Rodrigues-Jr 2006).
Our study corroborates the existence of risk factors that have long been known to ease HIV and/or M. tuberculosis infection, the most frequent being sexual risk, drug abuse and prison record. As for the two first, our data support previous publication on TB/HIV co-infected Brazilian (Atomiya, 2002; Laguardia, 2003; Silveira, 2006) and other countries populations (Erokhin, 2005; Story, 2007). It is of great concern the existence of tuberculosis among institutionalized individuals (Fournet, 2006; Sanchez, 2007). As expected, we were able to verify a positive association between prison record and MT isolation. The percentage of individuals with a prison record in our study (28.3%) was much higher than the 6.3% frequency previously published for a TB/HIV co-infected population from Rio Grande do Sul, Extreme South of Brazil (Mattos et al., 2006), probably because of the differences in population sizes between both studies (198 versus 32 TB/HIV seropositive individuals, respectively). This is not surprising since there are records of high TB positivity rates (around 5%) among prisoners from the São Paulo State Prison System (Oliveira, 2004; Abrahão, 2006) which are even higher in São José do Rio Preto city where culture positivity reached 7.1% (our unpublished data). Recently published meta-analysis, show that there is a strong controversy on the
causality of the association between smoking and TB mortality risk (Bates et al., 2007; Chiang et al., 2007; Slama et al., 2007). Interestingly, in our study the mean lifetime of MT/HIV co-infected patients was significantly reduced when a current or previous history of tobacco consumption was registered. However, we were not able to accurately estimate daily dose or years of tobacco use due to the limits on in the medical files. Future studies with a major focus on tobacco as a candidate risk factor may clarify its role on modifying TB different outcomes on HIV co-infected populations.
It is unknown the impact of nosocomial transmission as an important source of infection due to the number of airborne expelled bacilli by TB/HIV co-infected individuals during the period in-between hospital admittance and TB diagnosis (CDC, 2002). More than half of the Mycobacterium/HIV Northwestern São Paulo state population was hospitalized at HB when Mycobacterium sp. diagnosis was established, being the majority of them (68.2%) TB/HIV co-infected. This point to the need of establishing measures of mycobacteria local hospital surveillance since HB represents the regional reference center for HIV/AIDS diagnosis and treatment, therefore concentrating a great number of potentially TB co-infected patients.
TCD4+ lymphocyte count does not always correlate with the chance of
developing tuberculosis, as observed for other infectious diseases (Rozman et al., 2007; Toledo Jr et al., 2000). Our data show that among individuals with a record of at least one Mycobacterium sp. isolation, TCD4+ level can be an important predictor of TB development. Additional studies focusing on patient’s follow-up after initial HIV and/or Mycobacterium diagnosis, in different populations, will be able to confirm such correlation. Even though chest X-ray is the routine method for the diagnosis and follow-up examination of pulmonary TB, when associated to HIV, it can provide a multiple and
even a normal radiological pattern (Silva et al., 2006). In our study more than 70% of all individuals presented chest X-ray findings revealing TB suspicion, as previously reported for another TB/HIV co-infected Brazilian population (Morimoto et al., 2005). In addition, a diffuse radiological pattern was more frequently associated with MT co-infection, as observed for a HIV-infected population from Southern Brazil (Henn et al., 1999). Nevertheless, due to the considerable sum of incomplete medical files concerning thoracic x-ray findings (around 45%), this results should be carefully viewed.
The IAL-SJRPreto mycobacteria positivity rate for the acid-fast stain (approximately 37%) is higher than the reported before in a survey conducted in an AIDS reference center from Rio de Janeiro, Southeast Brazil in the pre-HAART era, where 29.7% of acid-fast stain positivity was detected among MT/NTM positive cultures from respiratory specimens (Conde et al., 1999). An intermediate (11,5%) and a low percentage (3.1%) of resistant and MDR-TB strains, respectively, was detected among the Northwestern São Paulo State HIV-infected patients in comparison to other populations from Southeast Brazil. The first one revealed 5.6% of resistant and 11.84% of MDR-TB strains in the country’s largest urban center, São Paulo city (Pereira Pinto et al., 1996). Rozman et al. (2007) evaluated an HIV + population from five municipalities of the São Paulo state littoral area (Baixada Santista), where HIV prevalence is high, describing 18.5% resistant MT and 10.6% MDR-TB. Similar frequencies, 16% and 8%, respectively, were found in an AIDS reference center from Rio de Janeiro, Rio de Janeiro state, (Fandinho et al., 1997). These numbers are higher than those globally reported for the Brazilian population (1.3% and 9%, respectively) as well as for those from the different regions within São Paulo state, independently of HIV status (CVE, 2006). Previous studies were able to show that resistance can contribute to a shorter
survival among co-infected TB/HIV individuals (Frieden et al., 1993, Perneger et al., 1995, Pereira Pinto et al., 1996), which could not be statistically demonstrated in our study, probably due to the small number of resistant strains. Taken together, these data reinforce the impact of this co-infection on MT drug resistance in the most heavily populated Brazilian region. In a global view, only MDR-TB outbreaks are the major evidence for HIV infection as a specific risk for multidrug resistance among patients with TB since, apart from that, only limited data demonstrate inconsistent association (Wells et al., 2007).
In Brazil, where HIV infection reaches the highest rates in Latin America, MAC was firstly referred in bone marrow and blood clinical specimens from AIDS patients in two Southeastern regions states with frequencies of 18% and 37%, respectively (Barreto et al., 1993, Fandinho et al., 1997). Lately, NTM isolation before introduction of HAART in clinical specimens from seropositive and/or seronegative patients varied from 6.9% to 17.8% in Southeast Brazil (Conde et al., 1999; Ferreira et al., 2002; Leite et al., 1995). In Brazilian Northeast region, at a multiresistant tuberculosis reference center, Matos et al (2004) described an 8.2% frequency of NTM isolation whereas in Northern Brazil this number was higher (25.4%; Salem et al., 1989), both independently of HIV status. In the present study, a high prevalence of NTM was detected (35.2%; Table 4), probably due to the fact that our study considered HIV-infected patients or to the geographical and temporal variation on the distribution of these bacteria in Brazil, (Barreto et al., 2000; Matos et al., 2004). By studying NTM species diversity in São Paulo state, other study found 59.6% HIV seropositive patients among all 1267 NTM infected or colonized individuals (Ueki et al, 2005). As previously described (Conde et al., 1999, Ferreira et al.
2002, Ueki et al., 2005), MAC was the most frequently isolated NTM species (22.3%). However, among HIV seropositive individuals from the same state, Ueki et al. (2005) described a different proportion of the five most frequent NTM with M. kansasii occupying the second most frequently isolated species (10%) as well as a comparatively smaller frequency of mixed infections (0.13% versus 5.5%). However, the recognition of the pathogenicity of those microorganisms is not an easy task because of the difficulty in associating clinical disease to positive cultures (Ueki et al., 2005). Furthermore, contamination can occur in laboratory routine, especially when mycobacteria liquid culture is performed (Perkins & Cunningham, 2007). In spite of the fact that we mainly verified single NTM in pulmonary clinical specimens from HIV seropositive individuals, it is worth to mention that half of the MAC and half of the M. fortuitum colonized patients presented radiological findings compatible with pulmonary disease associated with severe immunosuppression. In addition, approximately one third of them were also hospitalized. Our result suggest that particular attention must be given to NTM single isolation in clinical specimens from HIV/AIDS individuals before concluding for culture contamination and/or colonization by environmental mycobacteria.
A potential limitation of our study lies in the fact that a retrospective analysis may have been influenced by confounding factors. Incomplete patient records might also have affected the data. Nevertheless, we were able to demonstrate that the HIV-infected population from the Northwestern region of São Paulo State, Brazil, has a high prevalence of NTM colonization. Finally, Brazil is a continental dimension country that has a high prevalence of TB and AIDS, differentially distributed within its different regions. Therefore, the variation on NTM isolation frequency among distinct HIV-infected
Brazilian populations can be related to regional differences which must be further evaluated in order to improve control and treatment of these opportunistic infections.
Authors’ contributions
This study was conducted as the Masters Dissertation theme of HSPP under the supervision of ARBR, both principal investigators. ARBR, HSPP, CF, and RLDM designed the study, performed statistical analysis and results discussion. HSPP, TC, JFC, LMC, VDF, MIFP, MRAG, FCP, MABR and RSO performed data collection and database entry plus laboratorial investigation. ARBR and HSPP wrote the draft of the manuscript and RLDM and CF critically revised it. All authors read and approved the final manuscript. ARBR is guarantor of the paper.
Acknowledgments
The authors wish to thank José Antônio Cordeiro from the Department of Epidemiology and Community Health/FAMERP, for his assistance in statistical analysis and to Adolfo Lutz Institute for the laboratory and administrative support.
HSPP is Master student from Microbiology Program of the University of São Paulo State Júlio Mesquita Filho.
Ethical Approval
This study was conducted according to a protocol approved by the Research Board of
the Faculty of Medicine from São José do Rio Preto (CEP-FAMERP no 279/2006) and by
the Ethical Committee of the Faculty of Medicine from Catanduva (no 43/07).
Funding: TC is a medical student granted with the Scientific Initiation Institutional
Scholarship Program from the Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa – PIBIC/CNPq/FAMERP.
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