PEQUIZEIRO (Caryocar brasiliense Camb.)
1FLÁVIA DE SOUZA LIMA LANDA
2RENATO PAIVA
3PATRÍCIA DUARTE DE OLIVEIRA PAIVA
4JÚLIO SÍLVIO DE SOUSA BUENO FILHO
5RESUMO - Com o objetivo de promover a indução in vitro de calos, segmentos foliares de plantas jovens de pequizeiro (Caryocar brasiliense Camb.) foram subme-tidos a diferentes concentrações de ANA e BAP, em meio WPM suplementado com 3% de sacarose e 0,65% de ágar. Os explantes foram mantidos na presença e au-sência de luz, em sala de crescimento, com temperatura de ± 27o C. A melhor indução de calos foi observada em explantes mantidos na ausência de luz e inoculados em meio contendo a combinação de ANA (10,74µM) e BAP (2,22µM e 4,44µM). Objetivando-se também
promover o subcultivo dos calos produzidos, foram uti-lizadas diferentes concentrações de ANA (5,37µM e 10,74µM), BAP (1,11µM e 2,22µM), acrescentando-se ainda ao meio de cultura água de coco, extrato de malte, extrato de levedura e caseína hidrolizada. Os calos foram mantidos na ausência de luz, em sala de crescimento, com temperatura de ±27oC. Os resulta-dos indicaram que o uso de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 500 mg.l-1 de extrato de malte proporci-onou a maior média de peso de matéria fresca de calos.
TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Pequi, Caryocar brasiliense, calos, cultura de tecidos
IN VITRO CALLUS INDUCTION OF
Caryocar brasiliense Camb. LEAF EXPLANTS
ABSTRACT - With the objective to promote in vitrocallus induction, young leaf segments of Caryocar
bra-siliense Camb. were inoculated in WPM medium
su-pplemented with 3% sucrose, 0.65% agar and different concentrations of NAA and BAP. The explants were maintained in a growth room in the presence or absen-ce of light at a temperature of ±27°C. The best callus induction was observed in explants maintained in the abscence of light and inoculated in medium containing the combination of NAA (10.74 µM) and BAP (2.22 or
4.44 µM). With the objective to promote callus subcul-ture, the WPM medium was supplemented with diffe-rent concentrations of NAA (5.37 and 10.74 µM), BAP (1.11 and 2.22 µM), coconut water, malt extract and hydrolized casein. The callus was maintained in a growth room in the absence of light at a temperature of
±27°C. The results indicated that the use of 5.37 µM NAA + 1.11 µM BAP + 500 mg/L malt extract provi-ded the highest average weight of callus fresh matter. INDEX TERMS: Pequi, Caryocar brasiliense, callus, tissue culture.
INTRODUÇÃO
O cerrado é um bioma típico da zona tropi-cal e ocupa mais de 50% do território do Estado de Minas Gerais (Silveira, 1989). Levantamentos
flo-rísticos realizados em regiões de cerrado mostraram enorme riqueza em espécies, apesar da homogenei-dade fisionômica da vegetação (Silva Júnior, 1984).
1. Parte da Dissertação de Mestrado apresentada à UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS(UFLA), pela primeira autora, para obtenção do grau de Mestre em Agronomia, área de concentração Fisiologia Vegetal.
2. Bióloga
3. Professor Adjunto, Departamento de Biologia/UFLA, Caixa Postal 37, 37.200-000 – Lavras - MG 4. Professor Adjunto, Departamento de Agricultura/UFLA
Dentre as espécies vegetais ocorrentes no cerra-do, pode-se citar o pequi (Caryocar brasiliense), espé-cie arbórea de grande interesse socioeconômico. Além de apresentar um fruto de alto valor nutritivo e madeira de boa qualidade, o pequizeiro é explorado de forma extrativista, para subsistência e para indústrias (Chévez Pozo, 1997). Além disso, essa espécie apresenta difi-culdades no processo de propagação, pois suas semen-tes possuem dormência (Miranda, 1986; Melo e Gon-çalves, 1991).
A cultura de tecidos pode ser considerada uma importante técnica para propagação e vem sen-do utilizada com sucesso em várias espécies. A pro-pagação por meio da cultura de tecidos pode ser feita por via direta ou indireta (via indução e formação de calos), podendo esta última ser considerada como método potencial de propagação, caso as variações genéticas (mutações) não atinjam valores percentu-ais elevados (Pierik, 1985).
Pesquisas com calos formados a partir de frag-mentos de caules, folhas e raízes são realizadas princi-palmente para determinar as condições de cultura que os explantes requerem para sobreviver e crescer (Si-queira e Inoue, 1992), para estudar o desenvolvimento celular, explorar produtos provenientes do metabolismo primário e secundário, obter suspensão celular e propagação, com a formação de gemas ou embriões somáticos.
Com este trabalho objetivou-se promover o esta-belecimento in vitro do pequizeiro (C. brasiliense Camb.), pela indução e formação de calos, utilizando segmentos foliares como explantes, além de identificar o meio mais adequado para o subcultivo de calos for-mados.
MATERIAL E MÉTODOS 1) Indução de calogênese
Foram utilizados como explantes segmentos fo-liares de tamanho aproximado de 1 cm2, provenientes de mudas de pequi com 4 meses de idade, produzidas a partir de sementes coletados no município de Montes Claros (MG).
As folhas permaneceram em água corrente por 16h antes de sofrerem o processo de desinfestação. Esse processo consistiu em lavá-las 2 vezes com água desti-lada com 2-3 gotas de detergente neutro, seguido de imersão rápida em álcool etílico 70% (v/v), imersão em hipoclorito de sódio 30% (v/v) de produto comercial,
por 15 minutos, e 4 lavagens com água destilada auto-clavada. As folhas permaneceram em água destilada até o momento da inoculação.
O meio de cultura utilizado foi o WPM (Lloyd e McCown, 1980), suplementado com 3% de sacarose, 0,65% de ágar, ANA (ácido naftalenoacético) nas con-centrações de 0,0 e 10,74 µM, combinados com 0,0; 2,22 e 4,44µM de BAP (benzilaminopurina), com pH ajustado para 5,8 ± 0,1 antes da autoclavagem. Os ex-plantes foram mantidos na ausência e presença de luz (fotoperíodo de 16h luz), em sala de crescimento com temperatura de 27ºC.
O delineamento experimental utilizado foi o in-teiramente casualizado contendo 12 repetições por tratamento. Ao final de 60 dias, foi realizada avaliação visual, que consistiu em observar a ocor-rência de calos, coloração, grau de oxidação e enrai-zamento, além da obtenção da percentagem de cresci-mento de calos, pela fórmula:
%cresc. = PF - PI x 100 PI em que, PF = peso final PI = peso inicial. 2) Subcultivo de calos I
Os calos formados na ausência de luz em meio contendo 10,74 µM ANA e 2,22µM BAP (experimento anterior) foram divididos em 2 e 4 fragmentos e submetidos aos seguintes tratamentos: 1) meio acrescido de 10,74 µM ANA + 2,22µM BAP (con-trole); 2) meio sem reguladores de crescimento; 3) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP; 4) meio acrescido de 50 ml.l-1 de água de coco; 5) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 500 mg.L-1 de extrato de malte; 6) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 50 ml.L-1 de água de coco; 7) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 250 mg.L-1 de extrato de levedura; 8) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 200 mg.L-1 de caseína hidrolizada.
O meio básico usado foi o WPM (Lloyd e McCown, 1980) contendo 3% de sacarose, 0,65% de ágar e pH ajustado para 5,8 ± 0,1, antes da autoclava-gem. Após a inoculação, o material foi mantido em sala de crescimento com temperatura de 27ºC, na ausência de luz.
Ciênc. agrotec., Lavras, v.24 (Edição Especial), p.56-63, dez., 2000 O delineamento experimental adotado foi o de
blocos casualizados com 5 repetições. A avaliação foi realizada ao final de 30 dias, em que foram observados a ocorrência de crescimento, grau de oxidação e forma-ção de raízes e/ou brotações. A avaliaforma-ção da ocorrência de crescimento foi realizada por meio de um critério de notas, sendo 0 = ausência de crescimento; 1 = pouco crescimento (formação de calos sem ocupar toda a su-perfície do explante) e 2 = muito crescimento (forma-ção de calos ocupando toda a superfície do explante inoculado e suas adjacências).
A análise dos dados foi realizada pelo Proc GLM (General Linear Models Procedure) do programa estatístico SAS (SAS® Institute, 1993).
3) Subcultivo de calos II
Com base nos resultados do experimento anteri-or, foram produzidos calos em meio WPM suplementa-do com 10,74µM ANA + 2,22µM BAP, 3% de saca-rose, 0,65% de ágar e pH ajustado para 5,8 ± 0,1, antes da autoclavagem. Esses foram divididos em 2 e 4 fragmentos e submetidos aos seguintes trata-mentos: 1) meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP; 2) meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 500 mg.L-1 de extrato de malte; 3) meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 1000 mg.L-1 de extrato de malte; 4) meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 1500 mg.L-1 de extrato de malte.
O meio básico utilizado foi o WPM contendo 3% de sacarose, 0,65% de ágar, 100 mg.l-1 de PVP-40, pH ajustado para 5,8 ± 0,1. Após a inoculação, o mate-rial foi mantido no escuro, em sala de crescimento, com temperatura de 27ºC.
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados com 12 repetições. Trinta dias após a inoculação, foi realizada a avaliação final do experimento, que consistiu em verificar o aumento de matéria fresca, subtraindo-se da matéria fresca final a matéria fresca inici-al. A porcentagem de crescimento dos calos formados tam-bém foi calculada de acordo com a fórmula:
% cresc. = PF - PI x 100 PI
em que, PF = peso final PI = peso inicial.
Os dados foram submetidos ao Proc. GLM (General Linear Models Procedure) do programa esta-tístico SAS (SAS® Institute, 1993) para análise.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 1) Indução de calogênese
A presença de calos foi detectada 20 dias após a inoculação, tanto nos explantes mantidos na presença quanto na ausência de luz. Observou-se que, para esse mesmo período, a formação de calos nos explantes mantidos sob iluminação foi maior em relação aos mantidos no escuro. A partir do vigésimo dia de ino-culação, os explantes mantidos na presença de luz apre-sentaram desenvolvimento inferior em relação aos ex-plantes mantidos na ausência de luz, os quais permane-ceram em melhores condições até a avaliação final aos 60 dias. Resultados semelhantes foram encontrados por Wickremesinhe e Arteca (1993), em que calos de Taxus spp., mantidos num regime de 16h luz/8h escuro, apre-sentaram pior aspecto visual e menor quantidade de calos formados, quando comparados com os calos mantidos na ausência de luz.
Explantes mantidos na presença apenas de BAP, nas concentrações de 2,22µM e 4,44µM, mostra-ram pequena formação de calos, sugerindo que o BAP, utilizado isoladamente, é capaz de induzir a formação de calos a partir de segmentos foliares de pequizeiro. O efeito do BAP na formação de calos também foi demonstrado em segmentos foliares de castanheira-do-Brasil (Camargo, 1997) e de caquizeiro (Tao e Sugiura, 1992). Porém, quan-do essa citocinina estava associada ao ANA (meio suple-mentado com 2,22µM BAP + 10,74µM ANA; meio acres-cido de 4,44µM BAP + 10,74µM ANA), os calos formados apresentam-se maiores, indicando interação entre esses re-guladores de crescimento (Figura 1). Quando adicionaram-se ao meio apenas 10,74µM ANA, não houve alteração em relação ao controle, indicando que esse regulador de crescimento isoladamente não tem efeito na indução de calos a partir de segmentos foliares de pequizeiro, efeito esse também observado por Rey e Mroginski (1996), trabalhando com Aeschynomene spp. Observou-se também que nos tratamentos contendo ANA e BAP, os explantes apresentaram comportamentos dife-renciados como enrugamento da folha, formação de raiz diretamente do explante, calos duros e com raíz e coloração variando entre o branco, marrom e acinzen-tado (Figura 2).
Ciênc. agrotec., Lavras, v. 24, (Edição Especial), p. 56-63, dez., 2000 O enraizamento ocorreu naturalmente a partir
do 45o dia após a inoculação, somente nos explantes mantidos no escuro. A rizogênese em calos também foi igualmente observada por Paiva Neto (1996) t r a b a l h a n d o c o m t e c i d o f o l i a r d e m o r e i r a (Chlorophora tinctoria).
A porcentagem de formação de calos está apresentada na Tabela 1. Observa-se que todos os explantes mantidos no escuro apresentaram formação de calos superior em relação aos explantes mantidos na presença de luz, com exceção do tratamento cujo meio não foi acrescido de reguladores de crescimento (controle) e o meio acrescido apenas de 10,74mM ANA.
FIGURA 1 - Aspecto visual dos explantes foliares de Caryocar brasiliense mantidos na presença (A) e
ausên-cia (B) de luz 60 dias após a inoculação, em meio suplementado com 4,44 M BAP e 10,74 M ANA. UFLA, Lavras/MG, 1998.
FIGURA 2 - Comportamento diferenciado de explantes foliares de Caryocar brasiliense cultivados em meio contendo
Ciênc. agrotec., Lavras, v.24 (Edição Especial), p.56-63, dez., 2000
TABELA 1 - Formação de calos em explantes foliares de pequizeiro mantidos na presença e ausência de luz em meio suplementado com ANA e BAP. UFLA, Lavras/MG, 1998.
Porcentagem de calos
Reguladores de crescimento Presença de luz Ausência de luz
Sem reguladores 0 0 2,22µM BAP 16,66 33,33 4,44µM BAP 8,33 41,66 10,74µM ANA 0 0 10,74µM ANA e 2,22µM BAP 66,66 83,33 10,74µM ANA e 4,44µM BAP 58,33 91,33 2) Subcultivo de calos I e II
As maiores médias de matéria fresca de calos (Figura 3) foram observadas para o meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 500 mg/L extrato de malte, meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 200 mg/L caseína hidrolizada e o meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP. Esses três tratamentos também foram os que apresentaram calos com melhor aspecto visual.
Os tratamentos cujos meios não foram mentados com reguladores de crescimento ou suple-mentados apenas com 50 ml/L água de coco apresenta-ram as menores médias de peso de matéria fresca, indi-cando que a adição de ANA e BAP ao meio de cultivo é fundamental para o subcultivo dos calos de pequizeiro.
O meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 50 ml/L água de coco e o meio acresci-do de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 250 mg/L ex-trato de levedura, apesar de não diferirem estatistica-mente dos outros tratamentos empregados, apresenta-ram calos com aspecto oxidado e/ou necrosado. A colo-ração dos calos formados variou entre branco acinzen-tado, branco amarelado a marrom. Oxidação dos calos foi observada em pequeno grau e houve a formação de brotações e raízes (Figura 4).
Segundo Caldas, Haridsan e Ferreira (1990) e Pierik (1985), misturas complexas como extrato de le-vedura, água de coco, extrato de malte e caseína
hidro-lizada podem ser usadas para incrementar os meios nutritivos para a cultura de tecidos de plantas.
Indução e manutenção de calos utilizando-se água de coco e caseína hidrolizada também foram de-monstradas por Baumert et al. (1992) e Rajbhandari e Stomp (1997). Camargo (1997) observou que a taxa de crescimento dos calos de castanheira-do-Brasil, quando subcultivados, foi semelhante para os meios contendo reguladores de crescimento e água de coco, sendo signifi-cantemente superiores ao meio sem reguladores de cresci-mento. Esses resultados vêm, de certa forma, confirmar os resultados obtidos neste experimento, em que a diferença significativa encontrada foi entre o tratamento contendo reguladores de crescimento e extrato de malte e os trata-mentos sem reguladores de crescimento.
A formação de estruturas como raízes e/ou bro-tações em calos também foi observada em explantes de
Aeschynomene spp. (Rey e Mroginski, 1996); em
cas-tanheira-do-Brasil (Camargo, 1997) e em Bauhinia
purpurea (Kumar, 1992).
A porcentagem de crescimento dos calos sub-cultivados em meios suplementados com diferentes concentrações de extrato de malte é demonstrada na fi-gura 5. Na presença de extrato de malte, a formação de calos foi maior quando utilizou-se a concentração de 1000 mg/L. Embora o uso do extrato de malte no meio de cultura tenha proporcionado a formação de calos com melhor aspecto visual, a maior percentagem de crescimento de calos foi obtida na ausência de extrato de malte. Pela análise de variância (Tabela 2),
Ciênc. agrotec., Lavras, v. 24, (Edição Especial), p. 56-63, dez., 2000
FIGURA 3 - Peso médio de matéria fresca (g) para calos de explantes foliares de pequizeiro, submetidos a 10,74 M ANA
+ 2,22 M BAP (T1); meio sem reguladores de crescimento (T2); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP (T3); 50 ml/L água de coco (T4); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP + 500 mg/L extrato de malte (T5); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP + 50 ml/L água de coco (T6); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP + 250 mg/L extrato de levedura (T7); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP + 200 mg/L caseína hidrolizada (T8). Tratamentos com a mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de significância. UFLA, Lavras/MG, 1998.
FIGURA 4 - Aspecto visual de brotações (A) e raízes (B), indicadas pelas setas, formadas a partir de calos de pequizeiro
62
Ciênc. agrotec., Lavras, v. 24, (Edição Especial), p. 56-63, dez., 2000
Fonte GL QM F Bloco 3 0,1147 NS Tratamento 3 0,0807 NS Resíduo 39 0,096 Total 45 CV= 46,88%
TABELA 2 - Análise de variância do ganho de matéria fresca de calos cultivado na presença de diferentes concentrações
de extrato de malte. UFLA, Lavras/MG, 1998.
observa-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Esse resultado indica que, mesmo com o aumento na sua concentração, o ex- trato de malte adicionado ao meio de cultivo não fa- vorece um maior crescimento dos calos em relação ao meio de cultivo sem extrato de malte.
CONCLUSÕES
a) É possível promover o estabelecimento in
vitro do pequizeiro (Caryocar brasiliense Camb.)
pela formação de calos a partir de segmentos foliares;
FIGURA 5 - Crescimento de calos de explantes foliares de pequizeiro, em percentagem, na presença de diferentes
concentrações de extrato de malte 5,37 M ANA + 1,11 M BAP (T0); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP + 500 mg/L extrato de malte (T1); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP + 1000 mg/L extrato de malte (T2); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP + 1500 mg/L extrato de malte (T3). UFLA, Lavras/MG, 1998.
b) A manutenção dos explantes foliares na au-sência de luz induz a formação de calos com melhor aspecto visual;
c) A formação de calos pode ser obtida em meio WPM suplementado com 2,22µM BAP + 10,74µM ANA, bem como com 4,44µM BAP + 10,74µM ANA;
d) Substâncias complexas, como extrato de malte e caseína hidrolizada, adicionadas ao meio WPM, favorecem o subcultivo de calos de pequizeiro.
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