Bragantia
Print ISSN 0006-8705
Table of contents
Bragantia vol.66 no.3 Campinas 2007
Basic Areas•
Chromose duplication of triploid hybrids between
elephantgrass and pearl millet
Barbosa, Sandro
;
Vide, Lisete Chamma da
;
Pereira, Antônio Vander
;
Abreu, Juscélio Clemente De
•
Water deficiency intensifies physiological symptoms of
citrus variegated clorosis in 'Natal' sweet orange plants
Machado, Eduardo Caruso
;
Oliveira, Ricardo Ferraz de
;
Ribeiro, Rafael
Vasconcelos
;
Medina, Camilo Lázaro
;
Stuchi, Eduardo Sanches
;
Pavani,
Luiz Carlos
Plant Breeding
•
Correlations between appearance and yield characters,
and path analyses for potato tuber appearance
Silva, Giovani Oleário Da
;
Pereira, Arione da Silva
;
Souza, Velcio Queiroz
de
;
Carvalho, Fernando Irajá Félix de
;
Fritsche Neto, Roberto
•
Genetic gain prediction by selection index in a UNB-2U
popcorn population under recurrent selection
Santos, Fabrício Santana
;
Amaral Júnior, Antonio Teixeira do
;
Freitas
Júnior, Silvério de Paiva
;
Rangel, Ramon Macedo
;
Pereira, Messia
Gonzaga
•
Selection for fruit yield and quality in 'Piramoita'
summer squash comparing two breeding methods
Cardoso, Antonio Ismael Inácio
•
Behaviour of Mexican wheat genotypes in the State of
São Paulo
Biudes, Gustavo Barnabé
;
Carmago, Carlos Eduardo de Oliveira
;
Ferreira
Filho, Antonio Wilson Penteado
;
Azevedo Filho, Joaquim Adelino
Plant Protection
•
Performance of Lecanicillium lecaniion culture media
containing vitamins and yeast extract concentrations
Wenzel, Inajá Marchizeli
;
Monteiro, Antonio Carlos
;
Pereira, Gener Tadeu
•
Toxicity of pesticides used in peach orchard on adults
Trichogramma pretiosum
Giolo, Fabrizio Pinheiro
;
Grützmacher, Anderson Dionei
;
Manzoni,
Cristiane Gindri
;
Lima, Crislaine Alves Barcellos de
;
Nörnberg, Sandro
Daniel
•
Selectivity of insecticides to Orius insidiosus
Torres, Fabrícia Zimermann Vilela
;
Carvalho, Geraldo Andrade
;
Souza,
Jander Rodrigues de
;
Rocha, Liuz Carlos Dias
•
Characterization of cotton vein mosaic vírus by Aphis
gossyphii transmission with relation to persistence and
time necessary for inoculation
Michelotto, Marcos Doniseti
;
Busoli, Antonio Carlos
•
Use of geostatistics to evaluate Mahanarva fimbriolata
spatial distribuition on sugarcane
Dinardo-Miranda, Leila Luci
;
Vasconcelos, Antonio Carlos Machado
;
Veira, Sidney Rosa
;
Fracasso, Juliano Vilela
;
Grego, Célia Rerina
Crop Production and Management
•
Different management of black oat crop cover in orchard
at Southern Brazil
De Rossi, Andrea
;
Rufato, Leo
;
Giacobbo, Clevison Luiz
;
Costa, Vagner
Brasil
;
Vitti, Maurício Roberto
;
Mendez, Marta Elena Gonzaz
;
Fachinello,
José Carlos
•
A quantitative analysis of the primary system of
laticifers in the stem of young plants of clones and
seedlings of rubber tree
Moraes, Larissa Alexadra Cardoso
;
Moraes, Vicente Haroldo de
Figueiredo
•
Evaluation of japanese cucumber experimental lines and
hybrids under protected cultivation
Cardoso, Antonio Ismael Inácio
Soils and Plant Nutrition
•
Soil compaction and least limiting water range on
development and productivity of maize
Freddi, Onã Da Silva
;
Centuron, José Frederico
;
Beutler, Amauri Nelson
;
Aratani, Ricardo Garcia
;
Leonel, Cristian Luarte
;
Silva, Álvaro Pires da
•
Exchangeable and non-exchangeable contents of
aluminum after lime and gypsum application in an Oxisol
under no-tillage
Zambrosi, Fernando César Bachiega
;
Alleoni, Luís Reynaldo Ferracciú
;
Caires, Eduardo Fávero
•
Characterization of isolated rhizobia from Pachyrhyzus
erosus L. cultivated in saline soil of the State of
Pernambuco, Brazil
Freitas, Ana Dolores Santiago de
;
Vieira, Carolina Lucena
;
Santos,
Carolina Etiene de Rosália e Silva
;
Stamford, Newton Pereira
;
Lyra,
Maria do Carmo Catanho Pereira de
Note
•
Yield of sugar cane as affected by fluorine
Otto, Rafael
;
Faria, Maria Regina Meireles de
;
Queiroz, Fábio Eduardo de
Campos
;
Moura, Thiago Augusto de
;
Vitti, Godofredo Cesar
;
Cantarella,
Heitor
Agrometeorology
•
Potencial vegetation model for the Northeast Region of
Brazil as a function of precipitation
Nascimento, Robson de Sousa
;
Brito, José Ivaldo Barbosa de
Methodology and Experimental Techniques
•
Experimental methodology in conditions of restriction of
space for soybean
Martin, Thomas Newton
;
Jauer, Adilson
;
Dutra, Luiz Marcelo Costa
;
Santi, Antônio Luís
;
Zabot, Lucio
Bragantia
Print ISSN 0006-8705
Bragantia vol.66 no.3 Campinas 2007
Duplicação cromossômica de híbridos triplóides de
capim-elefante e milheto
Chromose duplication of triploid hybrids between elephantgrass and
pearl millet
Sandro BarbosaI, *; Lisete Chamma Da VideII; Antônio Vander PereiraIII; Juscélio
Clemente De AbreuIV
IDepartamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL-MG, Rua
Gabriel Monteiro da Silva, 714, Centro, 37130-000 Alfenas (MG), Brasil. E-mail: [email protected]
IIDepartamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras - UFLA, Caixa Postal 37,
37200-000 Lavras (MG) Brasil E-mail: [email protected]
IIIEmbrapa - Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento, 610, 36038-330 Juiz de Fora (MG),
Brasil. E-mail: [email protected]
IVUniversidade Vale do Rio Verde - UninCor, Av. Castelo Branco, 82; Chácara das Rosas,
37410-000 Três Corações (MG), Brasil
RESUMO
O objetivo deste estudo foi duplicar o complemento cromossômico de híbridos triplóides de capim-elefante e milheto para obtenção de plantas hexaplóides férteis. Esta estratégia
permitirá o uso de hexaplóides em programas de melhoramento genético do capim-elefante, por meio da transferência de alelos com as características desejadas, tornando possível sua propagação via semente. Seedlings, plântulas e segmentos caulinares cultivados in vitro foram tratados com colchicina a 0,05% ou 0,1% aplicadas por 12 ou 24 horas. Seedlings de
genótipos híbridos diferentes e meristemas de dois híbridos interespecíficos cultivados in vivo foram tratados por 24 horas com colchicina a 0,05%. A duplicação cromossômica foi
Palavras-chave: Duplicação cromossômica, colchicina, poliploidia, híbrido interespecífico,
Pennisetum purpureum, Pennisetum glaucum.
ABSTRACT
The aim of this study was to duble the chromose number of elephantgrass and pearl millet triploid hybrids in order to obtain hexaploid fertile plants. This strategy would allow the use of the hexaploids in the elephantgrass breeding program as a bridge for transfering alleles of desired characteristics and making possible propagation by seed. Seedlings, plantlets and stem segments were cultivated in vitro and treated with 0.05% or 0.1% colchicine for 12 or 24 h.
Seedlings of different hybrid genotypes and meristems of two interspecific hybrids were
cultivated in vivo and treated for 24 h with 0.05% colchicine. Chromose duplication was
confirmed by countings in the root tip cells. Pollen viability, in vitro germination tests and seed production were used to evaluate the fertility of the hexaploids. Seedlings cultivated in vitro and treated with 0.1% colchicine for 24 h were the most efficient method of polyploidy induction, as 38% of the surviving plants have twice the number of chromose viable pollen grains and fertile seeds.
Key words: Chromose duplication, colchicine, polyploidy, interespecific hybrid, Pennisetum
purpureum, P. glaucum.
1. INTRODUÇÃO
Entre as espécies do gênero Pennisetum, o capim-elefante (P. purpureum) e o milheto (P.
glaucum) destacam-se, respectivamente, como forrageiras de elevado potencial de produção e
cereal de importância econômica (PEREIRA et al., 2001). O capim-elefante é amplamente cultivado por todo o Brasil. Entretanto, a expansão da área cultivada de capim-elefante é
limitada pelo custo do uso da propagação vegetativa, visto que a maioria das cultivares produz sementes de baixo vigor (PEREIRA et al., 2001 e PEREIRA et al., 2003). A obtenção de
cultivares que possam ser propagadas por sementes agregando características como porte baixo, adaptação ao pastejo e resistência às cigarrinhas das pastagens tem ido considerado o principal objetivo do melhoramento dessa forrageira (PEREIRA et al., 2003). Uma das
estratégias de melhoramento do capim-elefante, visando obter cultivares propagadas por meio de sementes, tem sido a hibridação interespecífica com o milheto seguido de indução de
poliploidia cromossômica (JAUHAR, 1981; JAUHAR and HANNA, 1998; HANNA,1999; SCHANCK, 1999; PEREIRA et al., 2001).
Dentro do gênero Pennisetum, o milheto é anual, alógama, com 2n = 2x = 14 e genoma AA e integrante do conjunto gênico primário, juntamente com outras duas espécies silvestres
diplóides (P. mollissimum e P. violaceum). O capim-elefante é perene, alógama, com 2n = 4x = 28 e genomas A'A'BB e compõe o conjunto gênico secundário. O terceiro conjunto é
constituído pelas demais taxas (MARTEL et al., 1996).
O híbrido de capim-elefante e milheto é um triplóide estéril com 2n = 3x = 21 cromossomos e genoma AA'B, que pode ser propagado vegetativamente. A restauração da fertilidade pode ser conseguida pela duplicação cromossômica, utilizando colchicina (KRISHNASWAMY e RAMAN, 1954; HANNA, 1981; HANNA et al., 1984) ou outros antimitóticos (ABREU et al., 2006). Embora tenha se observado na literatura relatos de duplicação cromossômica do híbrido
triplóide resultando em hexaplóides férteis de capim-elefante e milheto (HANNA, 1981; HANNA et al., 1984), no entanto, diversos problemas têm sido verificados na obtenção de hexaplóides férteis em híbridos desenvolvidos no Brasil (ABREU et al., 2006). Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo adaptar e desenvolver métodos de duplicação cromossômica, utilizando diferentes explantes e seedlings triplóides estéreis provenientes do cultivo in vitro e
in vivo para restaurar sua fertilidade e contribuir para a obtenção de cultivares superiores com
capacidade de propagação por meio de sementes.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Material genético
Foram utilizados seis híbridos triplóides obtidos pelo programa de melhoramento do capim-elefante da Embrapa Gado de Leite, a partir do cruzamento entre genótipos de capim-capim-elefante e de milheto (Tabela 1).
Foram realizados cinco experimentos, nos quais diferentes métodos de exposição à colchicina foram utilizados, variando concentração e tempo de exposição, bem como material genético (Tabela 2).
Em todos os experimentos foi incluído um híbrido cujas características botânico-agronômicas dos genitores eram complementares (CNPGL94-60-01) e um híbrido cujos genitores
apresentavam características divergentes (CNPGL2000-65-227).
Na indução de poliploidia de meristemas laterais foram tratados cinco meristemas dos triplóides CNPGL94-43-01, CNPGL94-60-01 e CNPGL2000-65-227 em solução de colchicina 0,05% por 6, 15 e 24 horas. Após o tratamento, os meristemas foram submetidos à inoculação em meio MS + 2 mg/L de BAP e mantidos sob condição de iluminação de 2000 lux e
temperatura constante de 25 + 2 ºC. Após 60 dias do tratamento, os explantes que se desenvolveram e perfilharam foram contados e individualizados em novos tubos de ensaio, contendo meio MS suplementado com 0,5 mg/L de ANA. Após 45 dias de cultivo in vitro, esses explantes foram aclimatados e cultivados em hidroponia.
Pontas de raízes para análise citogenética foram coletadas em duas etapas do experimento: uma na transferência dos explantes sobreviventes ao tratamento de indução para a hidroponia e outra na transferência das plantas do cultivo hidropônico para vasos contendo terra e
substrato Plantmax (1:1).
Para a indução de poliploidia em seedlings, dois híbridos triplóides (CNPGL94-60-01 e
CNPGL2000-65-227) foram cultivados in vitro por 60 dias. Após esse período, foram obtidos explantes de 1,5 cm de parte aérea e 2,0 cm de sistema radicular, que foram induzidos à duplicação cromossômica tendo sido mergulhados até a altura do coleto em soluções de colchicina nas concentrações de 0,05% e 0,1%, por períodos de 12 e 24 horas. Foram utilizados 12 explantes de cada híbrido.
O material tratado foi cultivado in vitro por 60 dias e em seguida transferido para cultivo hidropônico por 30 dias. Amostras de raízes dos períodos de cultivo in vitro e hidropônico foram retiradas para análise citogenética.
Plântulas originadas do cultivo in vitro de seedlings triplóides (CNPGL94-60-01 e CNPGL2000-65-227) foram cultivadas em meio MS com 2 mg/L de BAP por 60 dias e receberam o mesmo tratamento para indução de poliploidia descrito para seedling in vitro. Para cada genótipo foram obtidas 18 plântulas.
Segmentos caulinares dos híbridos triplóides cultivados in vitro, foram mergulhados em soluções de colchicina 0,05% e 0,1%, por 12 e 24 horas. O material foi lavado e cultivado in
vitro por 60 dias, sendo então transferido para um sistema hidropônico. Foram avaliadas 18
plântulas por híbrido. Os procedimentos de coleta de raízes e transferência para os vasos em casa de vegetação foram os mesmos aplicados para seedlings in vitro.
A partir dos seedlings híbridos triplóides CNPGL94-43-01, CNPGL2000-65-227, HA, HB e HC, cultivados por 60 dias em sistema de hidroponia, foram obtidos explantes de 6 cm incluindo parte aérea e radicular, que foram mergulhados até a altura do coleto em solução de colchicina 0,05% por 24 horas. Raízes de 15 seedlings tratados de cada híbrido foram lavadas em água corrente por 4 horas, conforme Hanna et al. (1984). Após 30 dias de cultivo hidropônico, as plantas sobreviventes foram transferidas para vasos e coletadas raízes para análise
citogenética.
Análise citogenética
As análises citogenéticas foram realizadas de acordo com os procedimentos adaptados por Techio et al. (2002) para Pennisetum. Foram realizadas a contagem do número cromossômico em células meristemas de pontas de raízes e a análise in vitro da viabilidade polínica. Para cada tratamento foram analisadas cinco lâminas e avaliadas entre 33 a 126 prometáfases e metáfases.
A viabilidade do pólen foi estimada por testes de germinação in vitro, conforme descrito por Techio et al. (2005). Esse método baseia-se na porcentagem de grãos de pólen germinados, sendo considerados viáveis aqueles grãos de pólen com tubo polínico de comprimento igual ou superior ao seu diâmetro.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na indução de poliploidia in vitro foram empregados como explantes meristemas laterais,
seedlings e plântulas. Apesar de os tecidos meristemáticos geralmente constituírem as
principais fontes de explantes usadas na clonagem de plantas in vitro (VIEIRA e APPEZZATO-DA-GLÓRIA, 2001), notou-se que esse tecido é inadequado para indução de poliploidia, embora a cultura de meristema tenha sido usada com sucesso por LYRENE and PERRY (1982) na
produção e seleção de mirtilo (Vaccinium myrtillus L.) poliplóide in vitro. No presente trabalho, dos três genótipos tratados nos diferentes intervalos de tempo, as análises citogenéticas
mostraram uma única plântula mixoplóide, entre as nove sobreviventes. Esta sobrevivente é resultante da exposição de meristemas do híbrido CNPGL94-43-01a solução de colchicina por 24 horas. A plântula apresentou metáfases com números cromossômicos variando de 14 a 42 (Figura 1), sendo o número 21 mais freqüente (43%). Os demais sobreviventes eram
triplóides.
Dos 41 sobreviventes da indução de duplicação em seedlings in vitro foram obtidos 8 hexaplóides, 9 mixoplóides e o restante permaneceu triplóide (Tabela 3).
Pela análise citogenética em pontas de raízes coletadas in vitro das plantas V37-3C e V14-1A do híbrido CNPGL2000-65-227, verificou-se variação no número cromossômico entre 14 e 42. A avaliação citogenética de raízes coletadas de estacas dessas plantas permitiu observar que houve estabilização das células no nível hexaplóide. A duplicação cromossômica dessas plantas levou à produção de polens viáveis, constatada por meio de testes de germinação in vitro, cuja freqüência de polens germinados foi de 58,3% para a planta V37-3C e 63,8% para a V14-1A. O tratamento de plântulas in vitro apesar de ter resultado em um número maior de
sobreviventes (56 plantas) apenas 3 deles eram hexaplóides, 15 eram mixoplóides e o restante triplóide (Tabela 4).
Observou-se na planta V83-4A, proveniente do CNPGL2000-65-227, 42 cromossomos na
análise citogenética, a qual também produziu pólen viável revelando que houve restauração da fertilidade. No teste de viabilidade polínica, as plantas mixoplóides resultantes dos diferentes tratamentos desse híbrido, produziram polens viáveis variando em uma freqüência de 3,8% a 37,6%.
O menor número de sobreviventes (17 plantas) foi obtido no tratamento de segmentos
caulinares, sendo dois com complemento cromossômico duplicado e o restante, mixoplóides e triplóides (Tabela 5).
A planta hexaplóide V138-4B teve o nível de ploidia 6x confirmado em meristemas coletados nos estádios de plântula in vitro e adulta, observando-se, em ambas, 100% das metáfases com 42 cromossomos. A presença de pólen viável com freqüência de 32,6% de germinação in
vitro, juntamente com a avaliação citogenética evidenciaram a estabilização do nível
hexaplóide, bem como a restauração da fertilidade nessa planta.
Os resultados de sobrevivência obtidos com a exposição de seedlings e plântulas in vitro
revelaram que a colchicina mantém o mesmo efeito em diferentes concentrações e tempos de exposição. Contudo, comparando-se o efeito desse químico sobre os diferentes explantes e genótipos avaliados, verificou-se que a colchicina afetou drasticamente o desenvolvimento de meristemas e segmentos caulinares. Especificamente para Pennisetum, o efeito tóxico da colchicina, segundo ABREU et al. (2006), foi letal para gemas axilares in vivo e segmentos caulinares in vitro. De acordo com ROTH (1984) e SCHIFINO-WITTMANN (2000), a utilização de altas concentrações de colchicina ou a exposição de tecidos por tempo inadequado, além da forma de aplicação da droga, podem levar à morte de células e plantas, posto que a tolerância à colchicina varia de acordo com a espécie. Como a toxicidade das substâncias antimitóticas é expressiva e o objetivo desse tipo de experimentação está centrado na obtenção do maior número possível de sobreviventes com o complemento cromossômico duplicado, a variação do tipo de explante a ser utilizado torna-se um requisito indispensável, completando aquelas variáveis citadas anteriormente.
Com relação à indução de poliploidia em seedlings in vivo, dos quinze tratados do híbrido HA (BAG 64 x M64), 12 sobreviveram ao tratamento com colchicina 0,05% por 24 horas. Desses sobreviventes, uma planta teve o complemento cromossômico duplicado, uma era triplóide e o restante mixoplóides. Do híbrido HB sobreviveram nove plantas, sendo uma duplicada, cinco mixoplóides e três triplóides. O híbrido HC foi o que melhor respondeu ao tratamento com
Nas plantas hexaplóides dos híbridos HA e HB havia pólen em suas panículas, porém não foi possível averiguar a viabilidade polínica desses materiais devido à pouca disponibilidade de pólen para execução do protocolo de germinação in vitro. Todos os sobreviventes do CNPGL94-43-01 produziram polens viáveis, pois foram coletadas sementes nas panículas da maioria das plantas.
Tendo em vista os resultados tanto nos tratamentos de seedlings in vitro como in vivo, utilizados nos diferentes tratamentos, verifica-se que esse material é o mais indicado para experimentos de duplicação cromossômica nos híbridos entre capim-elefante e milheto avaliados.
Os tratamentos com 0,05% de colchicina por 12 horas e 0,1% por 24 horas geraram entre as plantas sobreviventes a maior freqüência de hexaplóides, 29% e 38%, respectivamente. Esses resultados foram similares aos obtidos por HANNA et al. (1984), que relataram que 30% dos
seedlings sobreviventes ao tratamento com solução de 0,05% de colchicina por 24 horas eram
duplicados. ABREU et al. (2006), tratando seedlings in vivo com solução de colchicina 0,05% por 24 horas e 0,1% por 12 horas, obteve 13% e 20% de sobreviventes em cada tratamento, respectivamente, sendo todos mixoplóides. Segundo o mesmo autor, a diminuição do tempo e o aumento da concentração de colchicina não exerceram pouca influência sobre a taxa de sobrevivência e a proporção de números cromossômicos na análise dos mixoplóides. Essa observação não está de acordo com os resultados deste trabalho, ou seja, concentrações mais elevadas associadas a tempos maiores de exposição aumentaram as probabilidades de se obter hexaplóides induzidos.
A exposição de plântulas e segmentos caulinares cultivados in vitro e expostas aos diferentes tratamentos de indução geraram entre 38% e 13% de sobrevivência, respectivamente, a partir de 144 explantes tratados. No que diz respeito ao explante plântulas, apenas três plantas
tiveram seus cromossomos duplicados. Para segmentos caulinares, essa freqüência não chegou a 1,5%. Experimentos in vitro utilizando segmentos caulinares do CNPGL94-43-01 foram
desenvolvidos por ABREU et al. (2006) com intuito de promover a indução de poliploidia nos estádios iniciais de desenvolvimento, porém o autor não obteve sobreviventes nos tratamentos com colchicina.
A exposição de seedlings in vitro revelou que plantas, cujo complemento cromossômico foi duplicado, podem reverter à condição triplóide. CARVALHO (2000) e PAGLIARINI (2001) relataram que é freqüente o alopoliplóide reverter parcial ou totalmente à condição diplóide, após alguns ciclos de divisão, principalmente devido à proliferação das células diplóides remanescentes que se multiplicam a taxas superiores àquelas das células poliplóides. HANNA et al. (1984) não relataram a ocorrência de eliminação cromossômica quando induziram poliploidia em híbridos triplóides de capim-elefante e milheto utilizando como explantes seedlings cultivados in vivo mergulhados em solução de colchicina 0,05% por 24 horas. Segundo ABREU et al. (2006), a eliminação cromossômica em híbridos induzidos de capim-elefante e milheto estaria relacionada com os graus de parentesco dos genitores utilizados, pois esses poderiam compartilhar do mesmo controle genético para eliminação de cromossomos.
Assim, buscou-se utilizar, em todos os experimentos realizados, pelo menos um híbrido cujas características dos genitores fossem complementares e outro cujas características fossem geneticamente divergentes, não importando os atributos forrageiros. O sucesso na duplicação
distantes, vem dar suporte às explicações aventadas por ABREU et al. (2006) com relação à eliminação cromossômica em híbridos induzidos de capim-elefante e milheto. Segundo o autor, híbridos triplóides cujos genitores são ecotipos com controle genético diferenciados para a eliminação cromossômica possuem maiores possibilidades de terem o complemento
cromossômico duplicado com sucesso.
4. CONCLUSÕES
1. Na duplicação cromossômica em híbridos de capim-elefante e milheto, o explante mais adequado foi seedlings desenvolvido in vivo e in vitro e expostos a soluções de colchicina 0,05% e 0,1% por 24 horas.
2. Híbridos de capim-elefante e milheto cujos genitores possuem características botânico-agronômicas não complementares foram mais resistentes aos efeitos tóxicos da colchicina gerando maior número de sobreviventes e hexaplóides induzidos.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à FAPEMIG pelo apoio financeiro à pesquisa e à CAPES pela bolsa de estudo concedida ao primeiro autor.
REFERÊNCIAS
ABREU, J. C. de; DAVIDE, L. C.; PEREIRA, A. V.; BARBOSA, S. Mixoploidia em híbridos de capim-elefante x milheto tratados com agentes antimitóticos. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, v. 41, n.11, p.1629-1635, 2006.
[
Links
]
CARVALHO, J. F. R. P. Análise cariotípica e indução in vitro de poliploidia em Urucum
(Bixa orellana L.). UFV, 2000. 124 f. (Tese de doutorado em Genética e Melhoramento de
plantas), Viçosa, 2000. [
Links
]
HANNA, W. W. Method of reproduction in napiergrass and in the 3X and 6X alloploid hybrids with pearl millet. Crop Science, Madison, v. 21, p.123-126, 1981.
[
Links
]
HANNA, W. W.; GAINES, T. P.; GONZALEZ, B.; MONSON, W. G. Effect of ploidy on yield and quality of pearl millet x napier grass hybrids. Agronomy Journal, Madison, v. 76, n. 6, p.
969-MARTINS, C.E.; BRESSAN, M.; PEREIRA, A.V. (ed) Biologia e Manejo do Capim-elefante. Juiz de Fora, Embrapa - Gado de Leite, p. 17 - 28, 1999. [
Links
]
JAHUAR, P. P. Cytogenetics and breeding of pearl millet and related species. New York: Alan R. Liss, 1981. [
Links
]
JAUHAR, P. P.; HANNA, W.W. Cytogenetics and genetics of pearl millet. Advances Agronomy, New York, v. 64, p. 1-26, 1998.
[
Links
]
KRISHNASWAMY, N.; RAMAN, V.S. Studies on the interspecific hybrid of Pennisetum typhoides Stapf and Hubb. x P. purpureum Schumach. III. The cytogenetics of the colchicine-induced amphidiploid. Genetica, Netherlands, v. 27, p. 253-272, 1954. [
Links
]
LYRENE, P.M.; PERRY, J.L. Production and selection of blueberry polyploids in vitro. Journal
Heredit, Cary, v. 73, n. 5, p. 377-378, 1982.
[
Links
]
MARTEL, E.; RICHROCH, A.; SAAR, A. Assessment of genome organization among diploid species (2n=2x=14) belonging to primary and tertiary gene pools of pearl millet using
fluorescent in situ hybridization with rDNA probes. Genome, Otawa, v. 39, n. 4, p.680-687, 1996. [
Links
]
PAGLIARINI, M.S. Citogenética aplicada ao melhoramento. In: NASS, L. L.; VALOIS, A. C. C.; MELO, I. S.; VALADARES-INGLIS, M. C. Recursos genéticos e melhoramento.
Rondonópolis: Fundação Mato Grosso, 2001. p.871-910.
[
Links
]
PEREIRA, A.V.; VALLE, C.B.; FERREIRA, R.P.; MILES, J.W. Melhoramento de forrageiras tropicais. In: NASS, L.L.; VALOIS, A.C.C.; MELO, I.S.; VALADARES-INGLIS, M.C. Recursos
genéticos e melhoramento. Rondonópolis: Fundação Mato Grosso, 2001. p.549-602.
[
Links
]
PEREIRA, A.V.; SOBRINHO, F.S.; SOUZA, F.H.D.; LÊDO, F.J.S. Tendências do melhoramento genético e produção de sementes de forrageiras no Brasil. In: VII SIMPÓSIO SOBRE
ATUALIZAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS. Tema: "Melhoramento de Plantas e produção de sementes no Brasil", 2003. Lavras. Anais... Lavras (MG): UFLA, 2003. p. 23-35. [
Links
]
ROTH, P.S. Indução de poliploidia em clones de Eucalyptus urophyla S. T. Blake. 1984. 79 f. Dissertação (Mestrado em Genética de Plantas) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 1984. [
Links
]
SCHANCK, S.C.; Propagação vegetativa e sexual do capim-elefante. In: PASSOS, L.P.;
CARVALHO, L.A.; MARTINS, C.E.; BRESSAN, M.; PEREIRA, A.V. (Ed.). Biologia e manejo do
do Sul: a review. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 4, n. 23, p. 989-995, 2000. [
Links
]
TECHIO, V.H.; DAVIDE, L.C.; PEREIRA, A.V., BEARZOTI, E. Cytotaxonomy of some species and of interspecific hybrids of Pennisetum (Poaceae, Poales). Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 25, n 2, p. 203-209, 2002. [
Links
]
TECHIO, V.H. Genomic analysis in Pennisetum purpureum x P. glaucum hybrids. Caryologia, v. 58, n. 1, p. 28-33, 2005. [
Links
]
VIEIRA, M.L.C; APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B. Fundamentos e aplicações da cultura de tecidos no melhoramento. In: NASS, L. L.; VALOIS, A. C. C.; MELO, I. S.; VALADARES-INGLIS, M. C.
Recursos genéticos e melhoramento. Rondonópolis: Fundação Mato Grosso, 2001. p.
911-938.
[
Links
]
Recebido para publicação em 13 de junho de 2006 e aceito em 22 de março de 2007.
* Autor correspondente.
©
2007 Instituto Agronômico
Avenida Barão de Itapura, 1481
13020-902 Campinas SP - Brazil
Tel.: +55 19 3231-5422 - ramal 116
Fax: (55 19) 3231-5422 - ramal 215
Bragantia, Campinas, v.66, n.3, p.365-372, 2007
ÁREAS BÁSICAS
DUPLICAÇÃO CROMOSSÔMICA DE HÍBRIDOS TRIPLÓIDES DE CAPIM-ELEFANTE E MILHETO (1)
SANDRO BARBOSA (2*); LISETE CHAMMA DAVIDE (3); ANTÔNIO VANDER PEREIRA (4); JUSCÉLIO CLEMENTE DE ABREU (5)
RESUMO
O objetivo deste estudo foi duplicar o complemento cromossômico de híbridos triplóides de capim-elefante e milheto para obtenção de plantas hexaplóides férteis. Esta estratégia permitirá o uso de hexaplóides em programas de melhoramento genético do capim-elefante, por meio da transferência de alelos com as características desejadas, tornando possível sua propagação via semente. Seedlings, plântulas e segmentos caulinares cultivados in vitro foram tratados com colchicina a 0,05% ou 0,1% aplicadas por 12 ou 24 horas. Seedlings de genótipos híbridos diferentes e meristemas de dois híbridos interespecíficos cultivados in vivo foram tratados por 24 horas com colchicina a 0,05%. A duplicação cromossômica foi confirmada pela contagem de cromossomos em células meristemáticas de pontas de raízes. A viabilidade polínica, os testes de germinação in vitro e a produção de sementes foram utilizados para avaliar a fertilidade dos hexaplóides. Seedlings cultivados in vitro e tratados com colchicina a 0,1% por 24 horas tiveram a melhor resposta à indução de poliploidia; em 38% das plantas sobreviventes observaram-se o conjunto cromossômico duplicado e a presença de pólens viáveis, confirmando a fertilidade dos hexaplóides.
Palavras-chave: Duplicação cromossômica, colchicina, poliploidia, híbrido interespecífico, Pennisetum purpureum, Pennisetum glaucum.
ABSTRACT
CHROMOSE DUPLICATION OF TRIPLOID HYBRIDS BETWEEN ELEPHANTGRASS AND PEARL MILLET
The aim of this study was to duble the chromose number of elephantgrass and pearl millet triploid hybrids in order to obtain hexaploid fertile plants. This strategy would allow the use of the hexaploids in the elephantgrass breeding program as a bridge for transfering alleles of desired characteristics and making possible propagation by seed. Seedlings, plantlets and stem segments were cultivated in vitro and treated with 0.05% or 0.1% colchicine for 12 or 24 h. Seedlings of different hybrid genotypes and meristems of two interspecific hybrids were cultivated in vivo and treated for 24 h with 0.05% colchicine. Chromose duplication was confirmed by countings in the root tip cells. Pollen viability, in vitro
(1) Recebido para publicação em 13 de junho de 2006 e aceito em 22 de março de 2007.
(2) Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL-MG, Rua Gabriel Monteiro da Silva, 714,
Centro, 37130-000 Alfenas (MG), Brasil. E-mail: [email protected] (*) Autor correspondente.
(3) Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras – UFLA, Caixa Postal 37, 37200-000 Lavras (MG) Brasil E-mail:
(4) Embrapa - Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento, 610, 36038-330 Juiz de Fora (MG), Brasil. E-mail: [email protected]
desenvolvidos no Brasil (ABREU et al., 2006). Nesse
contexto, o presente trabalho teve como objetivo adaptar e desenvolver métodos de duplicação cromossômica, utilizando diferentes explantes e seedlings triplóides estéreis provenientes do cultivo in vitro e in vivo para restaurar sua fertilidade e contribuir para a obtenção de cultivares superiores c o m c a p a c i d a d e d e p r o p a g a ç ã o p o r m e i o d e sementes.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Material genético
Foram utilizados seis híbridos triplóides obtidos pelo programa de melhoramento do capim-elefante da Embrapa Gado de Leite, a partir do cruzamento entre genótipos de capim-elefante e de milheto (Tabela 1).
germination tests and seed production were used to evaluate the fertility of the hexaploids. Seedlings cultivated in vitro and treated with 0.1% colchicine for 24 h were the most efficient method of polyploidy induction, as 38% of the surviving plants have twice the number of chromose viable pollen grains and fertile seeds.
Key words: Chromose duplication, colchicine, polyploidy, interespecific hybrid, Pennisetum purpureum, P. glaucum.
1. INTRODUÇÃO
Entre as espécies do gênero Pennisetum, o capim-elefante (P. purpureum) e o milheto (P. glaucum) destacam-se, respectivamente, como forrageiras de elevado potencial de produção e cereal de importância econômica (PEREIRA et al., 2001). O capim-elefante é
amplamente cultivado por todo o Brasil. Entretanto, a expansão da área cultivada de capim-elefante é limitada pelo custo do uso da propagação vegetativa, visto que a maioria das cultivares produz sementes de baixo vigor (PEREIRA et al., 2001 e PEREIRA et al.,
2003). A obtenção de cultivares que possam ser propagadas por sementes agregando características como porte baixo, adaptação ao pastejo e resistência às cigarrinhas das pastagens tem ido considerado o principal objetivo do melhoramento dessa forrageira
(PE R E I R A et al., 2003). Uma das estratégias de
melhoramento do capim-elefante, visando obter cultivares propagadas por meio de sementes, tem sido a hibridação interespecífica com o milheto seguido de indução de poliploidia cromossômica (JAUHAR, 1981;
JAUHAR and HANNA, 1998; HANNA,1999; SCHANCK, 1999;
PEREIRA et al., 2001).
Dentro do gênero Pennisetum, o milheto é anual, alógama, com 2n = 2x = 14 e genoma AA e integrante do conjunto gênico primário, juntamente com outras duas espécies silvestres diplóides (P. mollissimum e P. violaceum). O capim-elefante é perene, alógama, com 2n = 4x = 28 e genomas A’A’BB e compõe o conjunto gênico secundário. O terceiro conjunto é constituído pelas demais taxas (MARTEL et al., 1996).
O híbrido de capim-elefante e milheto é um triplóide estéril com 2n = 3x = 21 cromossomos e genoma AA’B, que pode ser propagado vegetativamente. A restauração da fertilidade pode ser conseguida pela duplicação cromossômica, utilizando colchicina (KRISHNASWAMY e RAMAN, 1954; HANNA, 1981;
HANNA et al., 1984) ou outros antimitóticos (ABREU et
al., 2006).
Embora tenha se observado na literatura relatos de duplicação cromossômica do híbrido triplóide resultando em hexaplóides férteis de capim-elefante e milheto (HANNA, 1981; HANNA et al., 1984),
no entanto, diversos problemas têm sido verificados na obtenção de hexaplóides férteis em híbridos
Tabela 1. Híbridos triplóides selecionados pela Embrapa Gado de Leite, em Coronel Pacheco (MG) e utilizados nos experimentos Genitores Híbridos Capim-elefante Milheto BAG 54 M 36 CNPGL94-43-01 BAG 75 M 24 CNPGL94-60-01 BAG 19 M 24 CNPGL2000-65-227 BAG 64 M 64 HA BAG 28 M 64 HB BAG 65 M 41 HC Indução de poliploidia
Foram realizados cinco experimentos, nos q u a i s d i f e r e n t e s m é t o d o s d e e x p o s i ç ã o à c o l c h i c i n a f o r a m u t i l i z a d o s , v a r i a n d o concentração e tempo de exposição, bem como material genético (Tabela 2).
Em todos os experimentos foi incluído um híbrido cujas características botânico-agronômicas dos genitores eram complementares (CNPGL94-60-01) e um híbrido cujos genitores apresentavam características divergentes (CNPGL2000-65-227).
Bragantia, Campinas, v.66, n.3, p.365-372, 2007 Na indução de poliploidia de meristemas
laterais foram tratados cinco meristemas dos triplóides CNPGL94-43-01, CNPGL94-60-01 e CNPGL2000-65-227 em solução de colchicina 0,05% por 6, 15 e 24 horas. Após o tratamento, os meristemas foram submetidos à inoculação em meio MS + 2 mg/L de BAP e mantidos sob condição de iluminação de 2000 lux e temperatura constante de 25 + 2 ºC. Após 60 dias do tratamento, os explantes que se desenvolveram e perfilharam foram contados e individualizados em novos tubos de ensaio, contendo meio MS suplementado com 0,5 mg/L de ANA. Após 45 dias de cultivo in vitro, esses explantes foram aclimatados e cultivados em hidroponia.
Pontas de raízes para análise citogenética foram coletadas em duas etapas do experimento: uma na transferência dos explantes sobreviventes ao tratamento de indução para a hidroponia e outra na transferência das plantas do cultivo hidropônico para vasos contendo terra e substrato Plantmax (1:1).
Para a indução de poliploidia em seedlings, dois híbridos triplóides (CNPGL94-60-01 e CNPGL2000-65-227) foram cultivados in vitro por 60 dias. Após esse período, foram obtidos explantes de 1,5 cm de parte aérea e 2,0 cm de sistema radicular, que foram induzidos à duplicação cromossômica tendo sido mergulhados até a altura do coleto em soluções de colchicina nas concentrações de 0,05% e 0,1%, por períodos de 12 e 24 horas. Foram utilizados 12 explantes de cada híbrido.
O material tratado foi cultivado in vitro por 60 dias e em seguida transferido para cultivo hidropônico por 30 dias. Amostras de raízes dos períodos de cultivo in vitro e hidropônico foram retiradas para análise citogenética.
Plântulas originadas do cultivo in vitro de seedlings triplóides (CNPGL94-60-01 e CNPGL2000-65-227) foram cultivadas em meio MS com 2 mg/L de BAP por 60 dias e receberam o mesmo tratamento para indução de poliploidia descrito para seedling in vitro. Para cada genótipo foram obtidas 18 plântulas.
Segmentos caulinares dos híbridos triplóides cultivados in vitro, foram mergulhados em soluções de colchicina 0,05% e 0,1%, por 12 e 24 horas. O material foi lavado e cultivado in vitro por 60 dias, sendo então transferido para um sistema hidropônico. Foram avaliadas 18 plântulas por híbrido. Os procedimentos de coleta de raízes e transferência para os vasos em casa de vegetação foram os mesmos aplicados para seedlings in vitro.
A partir dos seedlings híbridos triplóides CNPGL94-43-01, CNPGL2000-65-227, HA, HB e HC, cultivados por 60 dias em sistema de hidroponia, foram obtidos explantes de 6 cm incluindo parte aérea e radicular, que foram mergulhados até a altura do coleto em solução de colchicina 0,05% por 24 horas. Raízes de 15 seedlings tratados de cada híbrido foram lavadas em água corrente por 4 horas, conforme HANNA et al.
(1984). Após 30 dias de cultivo hidropônico, as plantas sobreviventes foram transferidas para vasos e coletadas raízes para análise citogenética.
Tabela 2. Experimentos realizados para indução de duplicação cromossômica, utilizando diferentes concentrações de colchicina e tempos de tratamento em híbridos de capim-elefante x milheto
Experimento Explantes Híbrido triplóide Colchicina Tempo
% Horas 1 Meristemas CNPGL94-43-01 0,05 6, 15 e 24 CNPGL94-60-01 CNPGL2000-65-227 2 Seedlings in vitro CNPGL94-60-01 0,05 e 0,10 12 e 24 CNPGL2000-65-227 3 Plântulas in vitro CNPGL94-60-01 0,05 e 0,10 12 e 24 CNPGL2000-65-227 4 Segmentos caulinares CNPGL94-60-01 0,05 e 0,10 12 e 24 in vitro CNPGL2000-65-227 5 Seedlings in vivo CNPGL94-43-01 0,05 24 CNPGL2000-65-227 H A H B H C
Análise citogenética
As análises citogenéticas foram realizadas de acordo com os procedimentos adaptados por TECHIO
et al. (2002) para Pennisetum. Foram realizadas a contagem do número cromossômico em células meristemas de pontas de raízes e a análise in vitro da viabilidade polínica. Para cada tratamento foram analisadas cinco lâminas e avaliadas entre 33 a 126 prometáfases e metáfases.
A viabilidade do pólen foi estimada por testes de germinação in vitro, conforme descrito por TECHIO
et al. (2005). Esse método baseia-se na porcentagem de grãos de pólen germinados, sendo considerados viáveis aqueles grãos de pólen com tubo polínico de comprimento igual ou superior ao seu diâmetro.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na indução de poliploidia in vitro foram empregados como explantes meristemas laterais, seedlings e plântulas. Apesar de os tecidos meristemáticos geralmente constituírem as principais fontes de explantes usadas na clonagem de plantas in vitro (VIEIRA e APPEZZATO-DA-GLÓRIA, 2001), notou-se
que esse tecido é inadequado para indução de poliploidia, embora a cultura de meristema tenha sido usada com sucesso por LYRENE and PERRY (1982) na
produção e seleção de mirtilo (Vaccinium myrtillus L.) poliplóide in vitro. No presente trabalho, dos três genótipos tratados nos diferentes intervalos de tempo, as análises citogenéticas mostraram uma única plântula mixoplóide, entre as nove sobreviventes. Esta sobrevivente é resultante da exposição de meristemas do híbrido CNPGL94-43-01a solução de colchicina por 24 horas. A plântula apresentou metáfases com números cromossômicos variando de 14 a 42 (Figura 1), sendo o número 21 mais freqüente (43%). Os demais sobreviventes eram triplóides.
Dos 41 sobreviventes da indução de duplicação em seedlings in vitro foram obtidos 8 hexaplóides, 9 mixoplóides e o restante permaneceu triplóide (Tabela 3).
Pela análise citogenética em pontas de raízes coletadas in vitro das plantas V37-3C e V14-1A do híbrido CNPGL2000-65-227, verificou-se variação no número cromossômico entre 14 e 42. A avaliação citogenética de raízes coletadas de estacas dessas plantas permitiu observar que houve estabilização das células no nível hexaplóide. A duplicação cromossômica dessas plantas levou à produção de polens viáveis, constatada por meio de testes de germinação in vitro, cuja freqüência de polens germinados foi de 58,3% para a planta V37-3C e 63,8% para a V14-1A.
Figura 1. Metáfases de híbridos mixoplóides (A, B, C) e hexaplóides (D) de capim-elefante e milheto após exposição a diferentes tempos e concentrações de colchicina. A) 14 cromossomos; B) 21 cromossomos; C) 28 cromossomos; D) 42 cromossomos. Barra 5 µm.
O tratamento de plântulas in vitro apesar de ter resultado em um número maior de sobreviventes (56 plantas) apenas 3 deles eram hexaplóides, 15 eram mixoplóides e o restante triplóide (Tabela 4).
Observou-se na planta V83-4A, proveniente do CNPGL2000-65-227, 42 cromossomos na análise citogenética, a qual também produziu pólen viável revelando que houve restauração da fertilidade. No teste de viabilidade polínica, as plantas mixoplóides resultantes dos diferentes tratamentos desse híbrido, produziram polens viáveis variando em uma freqüência de 3,8% a 37,6%.
O menor número de sobreviventes (17 plantas) foi obtido no tratamento de segmentos caulinares, sendo dois com complemento cromossômico duplicado e o restante, mixoplóides e triplóides (Tabela 5).
A planta hexaplóide V138-4B teve o nível de ploidia 6x confirmado em meristemas coletados nos estádios de plântula in vitro e adulta, observando-se, em ambas, 100% das metáfases com 42 cromossomos. A presença de pólen viável com freqüência de 32,6% de germinação in vitro, juntamente com a avaliação citogenética evidenciaram a estabilização do nível hexaplóide, bem como a restauração da fertilidade nessa planta.
Os resultados de sobrevivência obtidos com a exposição de seedlings e plântulas in vitro revelaram que a colchicina mantém o mesmo efeito em diferentes concentrações e tempos de exposição. Contudo, comparando-se o efeito desse químico sobre os
Bragantia, Campinas, v.66, n.3, p.365-372, 2007
Tabela 4. Níveis de ploidia das plantas obtidas por cultivo de plântulas in vitro, expostas a diferentes tempos e concentrações de colchicina. (* presença de pólen, Mix = mixoplóide)
Concentração
Tempo CNPGL 2000-65-227 CNPGL 94-60-01
de colchicina Indivíduos Ploidia Indivíduos Ploidia
% hora N.º N.º 10 3x 4 3x 12 3 Mix* - -1 6x - -0,05 9 3x 1 3x 24 2 Mix * 1 Mix 1 6x - -6 3x 1 3x 12 2 Mix * - -0,1 4 3x 3 3x 24 5 Mix* 1 Mix 1 6x * -
-Tabela 3. Níveis de ploidia, obtidos em até três avaliações das plantas sobreviventes ao tratamento de seedlings híbridos cultivados in vitro, expostos a diferentes tempos e concentrações de colchicina. (* presença de pólen, ** pólen viável, Mix = mixoplóide)
Concentração
Tempo CNPGL 2000-65-227 CNPGL 94-60-01
de Colchicina Indivíduos Ploidia Indivíduos Ploidia
% hora N.º N.º
4 3x 2 3x
12 1 Mix / Mix 1 Mix
0,05 2 Mix / 6x ** 1 6x
3 3x 1 3x
24 1 Mix / Mix 1 Mix
1 Mix / 6x ** 6 3x 1 Mix / Mix 12 3 Mix* 1 3x 1 Mix / 6x - -1 6x / Mix / 3x - -0,1 3 3x 2 3x 1 Mix / Mix - -24 2 6x - -1 Mix / 6x * - -1 6x / Mix / 3x -
-diferentes explantes e genótipos avaliados, verificou-se que a colchicina afetou drasticamente o desenvolvimento de meristemas e segmentos caulinares. Especificamente para Pennisetum, o efeito tóxico da colchicina, segundo ABREU et al. (2006), foi
letal para gemas axilares in vivo e segmentos caulinares in vitro. De acordo com ROTH (1984) e
SC H I F I N O-WI T T M A N N (2000), a utilização de altas
concentrações de colchicina ou a exposição de tecidos por tempo inadequado, além da forma de aplicação
da droga, podem levar à morte de células e plantas, posto que a tolerância à colchicina varia de acordo com a espécie. Como a toxicidade das substâncias antimitóticas é expressiva e o objetivo desse tipo de experimentação está centrado na obtenção do maior número possível de sobreviventes com o complemento cromossômico duplicado, a variação do tipo de explante a ser utilizado torna-se um requisito indispensável, completando aquelas variáveis citadas anteriormente.
Com relação à indução de poliploidia em seedlings in vivo, dos quinze tratados do híbrido HA (BAG 64 x M64), 12 sobreviveram ao tratamento com colchicina 0,05% por 24 horas. Desses sobreviventes, uma planta teve o complemento cromossômico duplicado, uma era triplóide e o restante mixoplóides. Do híbrido HB sobreviveram nove plantas, sendo uma duplicada, cinco mixoplóides e três triplóides. O híbrido HC foi o que melhor respondeu ao tratamento com 100% de sobrevivência. Porém, apenas uma planta foi duplicada, sendo onze mixoplóides e três triplóides. Em relação ao híbrido CNPGL2000-65-227, sobreviveram 14 plantas, sendo quatro com nível 6x de ploida, três com 3x e sete mixoplóides. Para o CNPGL94-43-01, obtiveram-se onze plantas, sendo três diplóides, uma tetraplóide e sete mixoplóides.
Nas plantas hexaplóides dos híbridos HA e HB havia pólen em suas panículas, porém não foi possível averiguar a viabilidade polínica desses materiais devido à pouca disponibilidade de pólen para execução do protocolo de germinação in vitro. Todos os sobreviventes do CNPGL94-43-01 produziram polens viáveis, pois foram coletadas sementes nas panículas da maioria das plantas.
Tendo em vista os resultados tanto nos tratamentos de seedlings in vitro como in vivo, utilizados nos diferentes tratamentos, verifica-se que esse material é o mais indicado para experimentos de duplicação cromossômica nos híbridos entre capim-elefante e milheto avaliados.
Os tratamentos com 0,05% de colchicina por 12 horas e 0,1% por 24 horas geraram entre as plantas sobreviventes a maior freqüência de hexaplóides, 29% e 38%, respectivamente. Esses resultados foram similares aos obtidos por HANNA et al. (1984), que
relataram que 30% dos seedlings sobreviventes ao tratamento com solução de 0,05% de colchicina por
24 horas eram duplicados. AB R E U et al. (2006),
tratando seedlings in vivo com solução de colchicina 0,05% por 24 horas e 0,1% por 12 horas, obteve 13% e 20% de sobreviventes em cada tratamento, respectivamente, sendo todos mixoplóides. Segundo o mesmo autor, a diminuição do tempo e o aumento da concentração de colchicina não exerceram pouca influência sobre a taxa de sobrevivência e a proporção de números cromossômicos na análise dos mixoplóides. Essa observação não está de acordo com os resultados deste trabalho, ou seja, concentrações mais elevadas associadas a tempos maiores de exposição aumentaram as probabilidades de se obter hexaplóides induzidos.
A exposição de plântulas e segmentos caulinares cultivados in vitro e expostas aos diferentes tratamentos de indução geraram entre 38% e 13% de sobrevivência, respectivamente, a partir de 144 explantes tratados. No que diz respeito ao explante plântulas, apenas três plantas tiveram seus cromossomos duplicados. Para segmentos caulinares, essa freqüência não chegou a 1,5%. Experimentos in vitro utilizando segmentos caulinares do CNPGL94-43-01 foram desenvolvidos por ABREU et al. (2006) com
intuito de promover a indução de poliploidia nos estádios iniciais de desenvolvimento, porém o autor não obteve sobreviventes nos tratamentos com colchicina.
A exposição de seedlings in vitro revelou que plantas, cujo complemento cromossômico foi duplicado, podem reverter à condição triplóide. CARVALHO (2000) e PAGLIARINI (2001) relataram que é
freqüente o alopoliplóide reverter parcial ou totalmente à condição diplóide, após alguns ciclos de divisão, principalmente devido à proliferação das células diplóides remanescentes que se multiplicam a taxas superiores àquelas das células poliplóides.
Tabela 5. Níveis de ploidia, obtidos em até duas avaliações das plantas sobreviventes ao tratamento de segmentos caulinares cultivados in vitro, expostos a diferentes tempos e concentrações de colchicina. (** presença de pólen viável, Mix = mixoploidia)
Concentração Tempo CNPGL 2000-65-227 CNPGL 94-60-01
Indivíduos Ploidia Indivíduos Ploidia
% hora N.º N.º 12 1 3x Sem sobreviventes -0,05 6 3x Sem sobreviventes -24 1 Mix - -2 6x** - -12 1 3x Sem sobreviventes -0,1 4 3x 1 3x 24 1 Mix -
-Bragantia, Campinas, v.66, n.3, p.365-372, 2007 HANNA et al. (1984) não relataram a ocorrência de
eliminação cromossômica quando induziram poliploidia em híbridos triplóides de capim-elefante e milheto utilizando como explantes seedlings cultivados in vivo mergulhados em solução de colchicina 0,05% por 24 horas. Segundo ABREU et al.
(2006), a eliminação cromossômica em híbridos induzidos de capim-elefante e milheto estaria relacionada com os graus de parentesco dos genitores utilizados, pois esses poderiam compartilhar do mesmo controle genético para eliminação de cromossomos.
Assim, buscou-se utilizar, em todos os experimentos realizados, pelo menos um híbrido cujas características dos genitores fossem complementares e outro cujas características fossem geneticamente divergentes, não importando os atributos forrageiros. O sucesso na duplicação cromossômica obtida para o híbrido CNPGL2000-65-227, cujos genitores são geneticamente distantes, vem dar suporte às explicações aventadas por ABREU et al. (2006) com relação à
eliminação cromossômica em híbridos induzidos de capim-elefante e milheto. Segundo o autor, híbridos triplóides cujos genitores são ecotipos com controle genético diferenciados para a eliminação cromossômica possuem maiores possibilidades de terem o complemento cromossômico duplicado com sucesso.
4. CONCLUSÕES
1. Na duplicação cromossômica em híbridos de capim-elefante e milheto, o explante mais adequado foi seedlings desenvolvido in vivo e in vitro e expostos a soluções de colchicina 0,05% e 0,1% por 24 horas.
2. Híbridos de capim-elefante e milheto cujos genitores possuem características botânico-agronômicas não complementares foram mais resistentes aos efeitos tóxicos da colchicina gerando maior número de sobreviventes e hexaplóides induzidos.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à FAPEMIG pelo apoio financeiro à pesquisa e à CAPES pela bolsa de estudo concedida ao primeiro autor.
REFERÊNCIAS
ABREU, J. C. de; DAVIDE, L. C.; PEREIRA, A. V.; BARBOSA, S. Mixoploidia em híbridos de capim-elefante x milheto tratados com agentes antimitóticos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 41, n.11, p.1629-1635, 2006.
CARVALHO, J. F. R. P. Análise cariotípica e indução in vitro de poliploidia em Urucum (Bixa orellana L.). UFV, 2000. 124 f. (Tese de doutorado em Genética e Melhoramento de plantas), Viçosa, 2000.
HANNA, W. W. Method of reproduction in napiergrass and in the 3X and 6X alloploid hybrids with pearl millet. Crop Science, Madison, v. 21, p.123-126, 1981.
HANNA, W. W.; GAINES, T. P.; GONZALEZ, B.; MONSON, W. G. Effect of ploidy on yield and quality of pearl millet x napier grass hybrids. Agronomy Journal, Madison, v. 76, n. 6, p. 969-971, 1984.
HANNA, W. W.; Melhoramento do Capim-elefante. In: PASSOS, L.P.; CARVALHO, L.A.; MARTINS, C.E.; BRESSAN, M.; PEREIRA, A.V. (ed) Biologia e Manejo do Capim-elefante. Juiz de Fora, Embrapa – Gado de Leite, p. 17 – 28, 1999. JAHUAR, P. P. Cytogenetics and breeding of pearl millet and related species. New York: Alan R. Liss, 1981.
JAUHAR, P. P.; HANNA, W.W. Cytogenetics and genetics of pearl millet. Advances Agronomy, New York, v. 64, p. 1-26, 1998.
KRISHNASWAMY, N.; RAMAN, V.S. Studies on the interspecific hybrid of Pennisetum typhoides Stapf and Hubb. x P. purpureum Schumach. III. The cytogenetics of the colchicine-induced amphidiploid. Genetica, Netherlands, v. 27, p. 253-272, 1954.
LYRENE, P.M.; PERRY, J.L. Production and selection of blueberry polyploids in vitro. Journal Heredit, Cary, v. 73, n. 5, p. 377-378, 1982.
MARTEL, E.; RICHROCH, A.; SAAR, A. Assessment of genome organization among diploid species (2n=2x=14) belonging to primary and tertiary gene pools of pearl millet using fluorescent in situ hybridization with rDNA probes. Genome, Otawa, v. 39, n. 4, p.680-687, 1996.
PAGLIARINI, M.S. Citogenética aplicada ao melhoramento. In: NASS, L. L.; VALOIS, A. C. C.; MELO, I. S.; VALADARES-INGLIS, M. C. Recursos genéticos e melhoramento. Rondonópolis: Fundação Mato Grosso, 2001. p.871-910. PEREIRA, A.V.; VALLE, C.B.; FERREIRA, R.P.; MILES, J.W. Melhoramento de forrageiras tropicais. In: NASS, L.L.; VALOIS, A.C.C.; MELO, I.S.; VALADARES-INGLIS, M.C. Recursos genéticos e melhoramento. Rondonópolis: Fundação Mato Grosso, 2001. p.549-602.
PEREIRA, A.V.; SOBRINHO, F.S.; SOUZA, F.H.D.; LÊDO, F.J.S. Tendências do melhoramento genético e produção de sementes de forrageiras no Brasil. In: VII SIMPÓSIO SOBRE ATUALIZAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS. Tema: “Melhoramento de Plantas e produção de sementes no Brasil”, 2003. Lavras. Anais... Lavras (MG): UFLA, 2003. p. 23-35.
ROTH, P.S. Indução de poliploidia em clones de Eucalyptus urophyla S. T. Blake. 1984. 79 f. Dissertação (Mestrado em Genética de Plantas) – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 1984.
SCHANCK, S.C.; Propagação vegetativa e sexual do capim-elefante. In: PASSOS, L.P.; CARVALHO, L.A.; MARTINS, C.E.; BRESSAN, M.; PEREIRA, A.V. (Ed.). Biologia e manejo do capim-elefante. Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, 1999. p. 1-16, SCHIFINO-WITTMANN, M.T. The cytogenetics and evolution of forage legumes from Rio Grande do Sul: a review. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 4, n. 23, p. 989-995, 2000. TECHIO, V.H.; DAVIDE, L.C.; PEREIRA, A.V., BEARZOTI, E. Cytotaxonomy of some species and of interspecific hybrids of Pennisetum (Poaceae, Poales). Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 25, n 2, p. 203-209, 2002.
TECHIO, V.H. Genomic analysis in Pennisetum purpureum x P. glaucum hybrids. Caryologia, v. 58, n. 1, p. 28-33, 2005. VIEIRA, M.L.C; APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B. Fundamentos e aplicações da cultura de tecidos no melhoramento. In: NASS, L. L.; VALOIS, A. C. C.; MELO, I. S.; VALADARES-INGLIS, M. C. Recursos genéticos e melhoramento. Rondonópolis: Fundação Mato Grosso, 2001. p. 911-938.
Bragantia
Print ISSN 0006-8705
Bragantia vol.66 no.3 Campinas 2007
Deficiência hídrica agrava os sintomas fisiológicos da
clorose variegada dos citros em laranjeira 'Natal'
Water deficiency intensifies physiological symptoms of citrus variegated
clorosis in 'Natal' sweet orange plants
Eduardo Caruso MachadoI, *; Ricardo Ferraz De OliveiraII; Rafael Vasconcelos
RibeiroI; Camilo Lázaro MedinaIII; Eduardo Sanches StuchiIV; Luiz Carlos PavaniV IInstituto Agronômico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento em Ecofisiologia e Biofísica,
Caixa Postal 28, 13001-970 Campinas (SP). E-mail: [email protected]
IIEscola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Departamento de Ciências Biológicas, Caixa
Postal 9, 13418-900 Piracicaba (SP). E-mail: [email protected]
IIIConplant, Rua Francisco Andreo Aledo, 22, 13084-200 Barão Geraldo (SP). E-mail:
IVEmbrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Caixa Postal 7, 48380-000 Cruz das Almas (BA).
E-mail: [email protected]
VUniversidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento
de Engenharia Rural, Via de acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n, 14884-900 Jaboticabal (SP). E-mail: [email protected]
RESUMO
A clorose variegada dos citros (CVC) é uma doença que tem promovido sérios prejuízos aos laranjais das regiões Norte e Nordeste do Estado de São Paulo, onde a deficiência hídrica e as altas temperaturas são mais frequentes. Assim, este trabalho objetivou a avaliação do efeito da deficiência hídrica no desenvolvimento de sintomas fisiológicos em laranjeira 'Natal' com CVC. Foram realizadas medidas do potencial da água na folha, transpiração, condutância estomática e assimilação de CO2, em laranjeiras em condições naturais e submetidas à
quando irrigadas. De fato, a irrigação diminuiu o efeito da CVC, porém não impediu o
estabelecimento da doença em laranjeiras inoculadas com Xylella fastidiosa. Em relação aos demais tratamentos, as plantas infectadas e mantidas sob condições naturais (sem irrigação) apresentaram maior comprometimento das trocas gasosas, mesmo quando as avaliações fisiológicas foram feitas em período úmido (verão).
Palavras-chaves: Citrus sinensis, relações hídricas, trocas gasosas, Xylella fastidiosa.
ABSTRACT
Citrus variegated chlorosis (CVC) is a disease that has caused serious economical losses in citrus grove located in the North and Northeastern regions of São Paulo State, where water deficiency and high temperature occur frequently. Therefore, the aim of this work was to evaluate the influence of water deficiency on the development of physiological symptoms in 'Natal' sweet orange plants with CVC. Measurements of leaf water potential, transpiration, stomatal conductance e CO2 assimilation were taken in plants under natural conditions and submitted to irrigation. The experimental design was in randomized blocks, with five
replications. Stomatal conductance, daily transpiration and leaf water potential were lower in CVC-affected plants. The daily CO2 assimilation was reduced in CVC-affected plants, even in irrigated ones. In fact, irrigation decreased the negative effects of CVC, however, it did not prevent disease establishment in sweet orange plants inoculated with Xylella fastidiosa. Compared to other treatments, infected plants submitted to natural conditions (without irrigation) exhibited higher constrain of leaf gas exchange, even when measurements were taken during humid period (summer).
Key words: Citrus sinensis, gas exchange, water relations, Xylella fastidiosa.
1. INTRODUÇÃO
A clorose variegada dos citros (CVC) é uma das principais doenças que afetam laranjeiras doces no Brasil. O agente causal desta doença é a Xylella fastidiosa (X.f.) bactéria limitada ao xilema. Essa bactéria, ao colonizar o xilema das plantas, causa entupimento dos vasos
condutores, o que diminui a condutância hidráulica do caule e o fluxo de seiva (MCELRONE et al., 2003; MACHADO ET AL., 2006). Os sintomas de deficiência hídrica em plantas infectadas pela X.f. são devidos à colonização e ao entupimento do xilema pelas próprias bactérias e/ou pela deposição de gomas e tiloses. Certamente, a severidade da doença está relacionada com o grau de colonização do xilema (HOPKINS, 1989; PURCELL & HOPKINS, 1996; ALVES et al., 2004). Assim, em plantas com CVC observam-se abscisão de folhas, necrose marginal,
crescimento atrasado na primavera, sintomas de deficiência hídrica e declínio geral do vigor (PURCELL e HOPKINS, 1996).
Em laranjeiras, o potencial de água de folha, a assimilação de CO2, a transpiração e a
condutância estomática são menores em plantas com CVC (MACHADO et al., 1994, MEDINA, 2002; HABERMANN et al., 2003; RIBEIRO et al., 2003a,b; 2004). A diminuição da fotossíntese em laranjeira com CVC pode estar relacionada com a diminuição na condutividade hidráulica do xilema e conseqüente fechamento estomático. Esses sintomas são atribuídos ao bloqueio dos vasos do xilema devido à colonização pelas bactérias (MACHADO et al., 1994). ALVES et al. (2004) observaram que a intensidade dos sintomas está relacionada com o bloqueio dos vasos do xilema, os quais podem causar reduções de até 50% no fluxo de seiva (MACHADO et al., 2006). Além dos efeitos difusivos, alguns autores sugerem que a limitação da fotossíntese em plantas infectadas pela X.f. também é devida a injúrias nas reações bioquímicas
(HABERMANN et al., 2003; RIBEIRO et al., 2003a,b; 2004; MACHADO et al., 2006).
Os últimos levantamentos da disseminação da CVC no Estado de São Paulo revelaram que a proporção de plantas infectadas aumentou de 22% em 1996 para 43% em 2005
(FUNDECITRUS, 2005). O estabelecimento e desenvolvimento de CVC são afetados por fatores ambientais, resultando em maior incidência nas regiões Norte (69%), Noroeste (56%) e
Central (51%) do Estado de São Paulo, quando comparadas às regiões Sul (4,7%) e Oeste (9,5%). De fato, nas regiões Sul e Oeste as temperaturas médias são menores e também há menor ocorrência de déficits hídricos, enquanto nas regiões Central, Noroeste e Norte as temperaturas são mais elevadas e a deficiência hídrica mais freqüente e com maior duração (RIBEIRO et al., 2006).
A patogenicidade de X.f. é agravada com a ocorrência de estresses ambientais (Hopkins, 1989), sendo o desenvolvimento da doença favorecido pela deficiência hídrica, outras
doenças, danos no sistema radicular e superprodução de frutos (HOPKINS, 1989; PURCELL e HOPKINS, 1996; MEDINA, 2002; MCELRONE e FORSETH, 2001). MCELRONE e FORSETH (2001) e MEDINA (2002) observaram que os sintomas e os efeitos negativos da X.f. em plantas envasadas são agravados pela ocorrência de deficiência hídrica. Em parreiras, os sintomas do mal de Pierce, também causado por X.f., são agravados por estresses adicionais (HOPKINS, 1989).
Visto que a CVC é mais severa nas regiões Norte e Noroeste do Estado de São Paulo, onde são mais freqüentes a ocorrência de deficiência hídrica e altas temperaturas, é desejável que se desenvolvam pesquisas que analisem como as condições ambientais afetam as respostas fisiológicas de plantas infectadas em condição de campo. Embora os mecanismos fisiológicos e bioquímicos que caracterizam o estabelecimento da doença não sejam bem compreendidos em condições de estresse, estudos têm mostrado que a redução no potencial de água de folha pode afetar o crescimento da planta sem afetar o desenvolvimento do patógeno (BOYER, 1995).
O objetivo desta pesquisa foi avaliar a influência da deficiência hídrica na ocorrência de sintomas fisiológicos em laranjeira 'Natal' causados pela CVC, considerando-se medidas de trocas gasosas e potencial de água na folha em plantas sadias e doentes cultivadas sob condições naturais ou sob irrigação.
em área de Latossolo Vermelho Distrófico típico textura argilosa a moderado hipoférrico. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados com quatro tratamentos e cinco repetições: laranjeiras sadias com (Sadia-100) ou sem (Sadia-0) reposição por irrigação de 100% da água evapotranspirada e laranjeiras doentes com (CVC-100) ou sem (CVC-0) reposição da água evapotranspirada.
O ensaio foi implantado em 19 de fevereiro de 1999 com mudas sadias de laranjeira da
variedade 'Natal' enxertadas em limoeiro 'Cravo'. O espaçamento de plantio foi de 6,0 m entre linhas e 4,0 m entre plantas na linha. Cada parcela era composta de 24 plantas distribuídas em 3 linhas de 8 plantas cada uma. A linha central de cada parcela foi reservada para as amostragens necessárias. A partir do plantio, foram feitas aplicações, em intervalos de aproximadamente 90 dias, de produtos sistêmicos via solo (aldicarb) e via tronco
(imidacloprid) para impedir a presença de cigarrinhas e evitar a disseminação da Xylella
fastidiosa (X.f.).
Nove meses após o plantio (novembro de 1999), metade das plantas foi submetida à
inoculação com X.f. pelo método descrito por NUNES et al. (2004). Esse método consistiu em enxertar, por meio de encostia, mudas inoculantes acondicionadas em tubetes de 120 mL. A planta inoculante foi enxertada no tronco principal das laranjeiras e lá permaneceu por seis meses. Para constatação da presença da bactéria na planta inoculada, utilizou-se o exame de reação de polimerase em cadeia (PCR) específica para X.f. estabelecido por POOLER e
HARTUNG (1995).
As plantas foram irrigadas utilizando-se um microaspersor autocompensado por planta, com vazão de 42 L h-1 e ângulo de molhamento de 300º. A irrigação foi realizada duas vezes por
semana, sendo o volume de água fornecido por planta resultante do balanço entre a lâmina d'água correspondente ao total de chuva efetiva ocorrida no intervalo (chuva que não excedia a capacidade de água disponível do solo 1,1 mm/cm até a profundidade de 0,60 m) entre as duas irrigações e a lâmina d'água relativa à evapotranspiração total da cultura, sendo
calculada por meio do produto da evapotranspiração de referência (ETo) estimada diariamente segundo o modelo de Penman-Monteith-FAO pelo coeficente de cultura (Kc) para citros (ALLEN et al., 1998). Os balanços hídricos foram feitos utilizando-se a planilha eletrônica desenvolvida por ROLIM et al. (1998).
As variáveis ambientais [temperatura do ar, saldo de radiação solar, fluxo de calor no solo, velocidade do vento, umidade relativa e déficit de pressão de vapor do ar (DPV)] foram monitoradas por meio de uma miniestação climatológica automática, localizada a 0,5 km do pomar.
Em 15 de agosto e 11 de outubro de 2000 e em 25 de julho e 19 de dezembro de 2002, foram feitas medidas da assimilação de CO2 (A), transpiração (E), condutância estomática (gs),
temperatura foliar e densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativos (DFFFA) com um sistema portátil de medidas de fotossíntese (LI-6400, Licor Inc. Lincoln NE, EUA). Essas
variáveis foram medidas entre 7 e 17 h, em intervalos de aproximadamente 1 hora. Com base nas medidas instantâneas de assimilação de CO2 e transpiração foram calculados os valores diários integrados: assimilação diária de CO2 (Ai, mmol m-2 d-1) e transpiração diária (Ei, mol
m-2 d-1). A partir desses valores integrados calculou-se a eficiência diária do uso da água
[EUA=Ai/Ei, mmol CO2 (mol H2O)-1]. Em todas as épocas de medidas, utilizaram-se folhas
completamente expandidas com idade entre 6 e 8 meses, com pouco ou nenhum sintoma de clorose, expostas ao Sol durante todo o período de medidas. Detalhes do método são
