RELATÓRIO PARCIAL PARA PRORROGAÇÃO DE PÓS-DOUTORADO PARECER DA ASSESSORIA CIENTÍFICA:

Câmpus de Botucatu

Instituto de Biociências – Seção Técnica Acadêmica

Rua Professor Doutor Antonio Celso Wagner Zanin, 250 - CEP 18618-689 - Botucatu - SP - Brasil Tel (14) 3880 0789/0790 - sta.ibb@unesp.br

Fls. Proc. nº Rubr. RELATÓRIO PARCIAL PARA PRORROGAÇÃO DE PÓS-DOUTORADO

PARECER DA ASSESSORIA CIENTÍFICA:

Relator...: Prof(a) Dr(a) Luis Antonio Justulin Junior

Pedido nº...: 2419

Interessado(a): Karina Basso Santiago

Supervisor(a).: Prof(a) Dr(a) José Maurício Sforcin

Período...: 01/02/2019 - 01/02/2020

Novo término: 31/01/2021

Parecer: (X) Aprovado

( ) Em análise (necessário retornar ao relator após modificações) ( ) Denegado

Avaliação: ( ) Excelente ( ) Muito Bom

( X ) Muito Bom com deficiências facilmente sanáveis ( ) Bom

( ) Bom com deficiência ( ) Regular

( ) Com sérias deficiências

Analisar o projeto segundo os seguintes parâmetros: 1-Justificativa;

2-Fundamentação Científica;

3-Relevância para o avanço da área; 4-Metodologia

5-Relevância dos recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto.

Análise: O presente relatório parcial descreve os avanços alcançados pela Pós-Doutoranda Karina Basso Santiago em seu Projeto de Pós-Doutorado intitulado “AÇÃO DA PRÓPOLIS ASSOCIADA AO DOCETAXEL SOBRE CÉLULAS DE CÂNCER DE PRÓSTATA E SOBRE MONÓCITOS HUMANOS: NOVA ABORDAGEM TERAPÊUTICA?” Realizado no período de 02/2019 a 12/2019. Conforme destacado pela Pós-Doutoranda, houve problemas com a cultura da linhagem de células tumorais prostáticas LNCaP, assim como com a entrega de materiais. Os autores então optaram pela utilização da linhagem MCF-7 de tumor de mama nos mesmos ensaios. Como resultado, destaca-se que o tratamento com a associação entre própolis e docetaxel apresentou maior potencial citotóxico sobre essas células quando comparado como os compostos administrados isoladamente, sem afetar a

viabilidade de monócitos humanos. Além disso, os autores destacam que o

tratamento por 24 e 48 h com docetaxel manteve a produção de IL-1β, TNF-α e

IL-10 por monócitos humanos e aumentou a produção de IL-6 após 24 h. A própolis

também apresentou efeito modulador, induzindo a secreção de IL-1β após 24 h e

IL-6 em 24 e 48 h. A associação entre própolis e docetaxel estimulou a produção de ambas as citocinas. Os tratamentos com própolis e a associação aumentaram a

Câmpus de Botucatu

Instituto de Biociências – Seção Técnica Acadêmica

Rua Professor Doutor Antonio Celso Wagner Zanin, 250 - CEP 18618-689 - Botucatu - SP - Brasil Tel (14) 3880 0789/0790 - sta.ibb@unesp.br

Fls. Proc. nº Rubr.

expressão de HLA-DR após 24 h, e diminuíram a expressão de CD80 após 48 h. Apesar destes efeitos, os autores não observaram alteração da expressão dos receptores TLR-2 e TLR-4. Estes resultados são interessantes e demonstram o potencial da própolis como moduladores de atividade de monócitos em cultura. De maneira geral, os dados apresentados demonstram que, apesar dos contratempos, ox experimentos foram realizados a contento e os resultados encontram-se bem apresentados e demonstram o empenho e dedicação da Pós-Doutoranda na realização dos seus experimentos.

Ainda assim, a Pós-Doutoranda solicita prorrogação das atividades de seu estágio de Pós-Doutorado por um período de 12 meses, para que sejam realizados os experimentos utilizando-se as células tumorais prostáticas. Conforme descrito pela Pós-Doutoranda, os problemas com as células LNCaP foram sanados, sendo possível o projeto inicial para que o projeto seja finalizado na sua totalidade. Para tanto, a Pós-Doutoranda propõe as atividades listadas abaixo:

Após a entrega deste relatório, iniciaremos as seguintes etapas: - Ensaios de viabilidade (MTT) após tratamento das células LNCaP;

- Ensaios de tipo de morte celular (citometria de fluxo) após tratamento das células LNCaP e células MCF-7;

- Avaliação do efeito do sobrenadante de monócitos tratados sobre a proliferação de células LNCaP e MCF-7.

- Padronização e execução dos ensaios de migração e invasão celular das linhagens LNCaP e MCF-7

Além da descrição dos resultados obtidos durante o período coberto pelo relatório, a Pós-Doutoranda também descreve sua participação em vários eventos científicos nacionais e internacionais, como a apresentação de trabalhos. Também foi coautora de 2 trabalhos pulicados em revistas internacionais indexadas, assim como colaborou na elaboração de 2 manuscritos que se encontram submetidos para publicação também em revistas internacionais.

Por fim, destaco a avaliação positiva por parte do Supervisor quanto à participação da Pós-Doutoranda nas atividades realizadas pelo grupo, inclusive com participação na disciplina de Imunologia, oferecida pelo Departamento de Microbiologia e Imunologia. Diante do exposto, acredito ser viável a prorrogação de prazo por um período de 12 meses, conforme solicitada pela Pós-Doutoranda, para que finalize seus experimentos e conclua seu estágio de Pós-Doutorado a contento. Assim, a data de término prevista para o estágio será 31/01/2021.

Atenciosamente,

Data: 06/01/2020

Assinatura:

12/12/2019 :: UNESP : Reitoria - SisPROPe ::

prope.unesp.br/sisprope/sis/posdoc_unesp/2017_criar_pedido_novo.php?id_perfil=8&pedido=2419 1/5

STA CPP funcionário

(Exibir instruções)

Pedido=2419 (resolução 91/2017) (homologado )

Resoluções Pós-Doutorado

Para visualizar os anexos, click sobre o respectivo ícone

I - Dados do Candidato (Pós-Doutorando)

E-mail: *karinabtu@yahoo.com.br Pesquisar Nome:KARINA BASSO SANTIAGO

CPF:313.996.798-56 Documentos:

Currículo Lattes atualizado; Cópia do RG;

Para estrangeiros, RNE ou protocolo. Enviar também cópia de página do passaporte com visto de permanência no Brasil, em vigência, ou protocolo;

Cópia do CPF;

Cópia do diploma de doutorado ou Ata da defesa da tese; Cópia da apólice do seguro

II - Dados do Supervisor Responsável

Nome

completo: José Maurício Sforcin Campus: Campus de Botucatu

Unidade: Instituto de Biociências de Botucatu

Departamento: DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA E-mail: sforcin@ibb.unesp.br

Telefone: 38800445

Documentos:

Currículo Lattes atualizado (atualizar o link do Lattes em Meus dados);

III - Projeto e Planos de Atividades

Título: *

Área: * CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Local de

realização: * Campus de Botucatu Instituto de Biociências de Botucatu Período de

realização: *início: 01/02/2019 término: 01/02/2020 (dd/mm/aaaa)

Prorrogado

até: Solicitar prorrogação (mostrar histórico de prorrogações) novo término

solicitado: *31/01/2021 (dd/mm/aaaa) justificativa: *

CPP: *

aprova: sim não

justificativa:

Gravar parecer da CPP Limpar parecer

Relatório Científico com a avaliação do supervisor.

O supervisor deverá anexar o Relatório Científico juntamente com a sua avaliação para que a CPP possa emitir o parecer sobre o pedido de prorrogação.

(Máximo 20 páginas)

Dados dos Supervisores de Pesquisa e/ou Extensão e/ou de Atividades de Formação Docente:

Nome dos Supervisor de Atividades de Formação Docente:

José Maurício Sforcin

Ação da própolis associada ao docetaxel sobre células de câncer de próstata e sobre monócitos humanos: nova abordagem terapêutica?

O projeto está sendo desenvolvido a contento. Porém, tivemos problemas com a célula tumoral estudada e começamos o

Início

Pós-doutorado

SisPROPe - Pós-Doc na Unesp

SisPROPe - Pós-Doc na Unesp

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Reitoria - PROPe

Meus dados | Sair Usuário: sta-IBB

12/12/2019 :: UNESP : Reitoria - SisPROPe ::

prope.unesp.br/sisprope/sis/posdoc_unesp/2017_criar_pedido_novo.php?id_perfil=8&pedido=2419 2/5 Departamento:MICROBIOLOGIA E IMUINOLOGIA

Disciplina(s):IMUNOLOGIA BÁSICA Semeste/Ano:1/2019 Carga Horária:20 Nome do Supervisor de Atividades de Extensão:

José Maurício Sforcin

Departamento:MICROBIOLOGIA E IMUINOLOGIA Atividades:

Limite máximo de caracteres: 3000 Semeste/Ano:2/2019

Carga Horária:04

Declaração de realização de atividade de Formação Docente e Extensionista.

Proposta para as Atividades de Pesquisa.

Introdução:

Limite máximo de caracteres: 6000 Objetivos:

Limite máximo de caracteres: 3000 Material e

Métodos:

PROFERIR PALESTRA JUNTO AO CURSO DE EXTENSÃO UNIVERSITÁRIA SOBRE PRÓPOLIS

O câncer de próstata é o segundo câncer mais comum em homens. O câncer de próstata é o quinto tipo de câncer que mais mata a população masculina, com uma estimativa de 307.000 mortes, representando 6,6% do total da mortalidade por câncer em homens. Ao contrário da incidência, há relativamente menor variação nas taxas de mortalidade ao redor do mundo (aproximadamente 3 a 30 mortes a cada 100.000 indivíduos) (FERLAY et al., 2015). Atualmente, a utilização de testes para detecção de antígeno específico da próstata (PSA) e subsequente biópsia em países mais desenvolvidos têm facilitado a detecção precoce deste tumor (FERLAY et al., 2015). Entretanto, a detecção do PSA é controversa e não padronizada em todo o mundo, pois, apesar de esta dosagem ser o método de triagem mais frequente, sua especificidade é limitada. Assim, ainda é indispensável o exame de toque retal, que por sua vez é evitado por muitos homens em decorrência de fatores culturais em diferentes populações (TOURINHO-BARBOSA et al., 2016).

Para o estudo in vitro dos tumores de próstata, diferentes linhagens celulares imortalizadas têm sido utilizadas, e a maior parte dos estudos é realizada com 4 linhagens principais: LNCaP, RWPE-1, DU145 e PC3. Essas linhagens podem ser diferenciadas de acordo com sua morfologia celular, classificação histológica da neoplasia gerada, gradação clínica, sítio de metástase e responsividade à ablação de andrógeno. As células LNCaP foram primariamente obtidas de um adenocarcinoma prostático humano, de sítio ósseo metastático, e serão utilizadas neste projeto.

No processo de metástase, as células tumorais potencialmente imunogênicas podem ser expostas ao sistema imune, que as reconhecerá e tentará restringir seu crescimento (KITAMURA et al., 2015). Dentre as células do sistema imune atuantes contra o tumor, tem sido demonstrada a importante participação de monócitos e macrófagos no controle da angiogênese, metástase e invasão tumoral (CHITTEZHATH et al., 2014).

Monócitos constituem uma população de leucócitos mononucleares que se desenvolve na medula óssea a partir de monoblastos e são liberados na corrente sanguínea, podendo adentrar nos tecidos, diferenciando-se em macrófagos. Monócitos representam 10% dos leucócitos no sangue humano, estando presentes também em mamíferos, aves, anfíbios e peixes. Têm importante papel na manutenção da homeostase, por removerem células apoptóticas e componentes tóxicos. Monócitos também podem favorecer o elo entre a defesa inata contra micro-organismos e a resposta imune adaptativa (AUFFRAY et al., 2009).

Embora monócitos participem da resposta imune antitumoral, há evidências de que monócitos e macrófagos também possam favorecer a progressão do tumor. Os estudos têm focado principalmente no papel dos macrófagos, enquanto que a contribuição de monócitos na progressão do tumor tem sido pouco avaliada (CHITTEZHATH et al., 2014). Os quimioterápicos utilizados no tratamento de câncer podem atuar também em células do sistema imunológico, modulando sua atividade. Como exemplo, o taxol é capaz de elevar a produção de IL-1? por monócitos humanos, a qual pode iniciar uma resposta inflamatória contra o tumor ou impedir sua vascularização, restringindo seu crescimento, além de aumentar a capacidade fagocítica em

monócitos/macrófagos (WHITE et al., 1998).

O docetaxel é o derivado semissintético mais potente do paclitaxel, derivado de extratos das folhas do teixo europeu (Taxus baccata), descoberto na década de 1980 (RINGEL & HORWITZ, 1991) e aprovado como medicamento pela Food and Drug Administration em 1996 para tratamento do câncer de mama localmente avançado ou metastático (TAGUCHI et al., 1994). Atualmente, o docetaxel é utilizado no tratamento de cânceres de mama, pulmão de células não pequenas, gástrico, cabeça e pescoço, ovário, esôfago, útero, bem como o câncer de próstata (TAGUCHI et al. 1994).

Visando associar o uso do docetaxel com produtos naturais estudados no tratamento do câncer, a própolis tem sido considerada promissora. A própolis é produzida por abelhas africanizadas a partir de exsudatos e resinas coletados de diferentes fontes vegetais, além da adição de cera e secreção das glândulas do inseto (BURDOCK, 1998). Este produto tem sido intensamente investigado por nosso grupo de pesquisa, avaliando principalmente sua ação imunomoduladora, antitumoral e antimicrobiana (SFORCIN, 2007; SFORCIN & BANKOVA, 2011; SFORCIN, 2016). A própolis vem sendo apontada como agente citotóxico, antitumoral e quimiopreventivo contra vários tipos de tumores (BANSKOTA et al., 2001; OR?OLI?, 2010; SEDA VATANSEVER et al., 2010; WATANABE et al., 2011). Dados recentes de nosso grupo demonstraram que a própolis exerceu ação citotóxica sobre células A549 de câncer de pulmão, induzindo apoptose e diminuindo o potencial de membrana

mitocondrial devido à superexpressão de genes pró-apoptóticos (Bax e Noxa) e redução do gene antiapoptótico Bcl-XL (FRIÓN-HERRERA et al., 2015).

A própolis também apresenta atividade moduladora na resposta imune antitumoral. Ratos tratados com própolis apresentaram maior atividade citotóxica de células natural killer (NK) contra células tumorais (SFORCIN et al., 2002). A própolis estimulou também a produção de citocinas pró-inflamatórias por animais portadores de melanoma e submetidos a estresse crônico (MISSIMA et al., 2009), favorecendo a ativação da resposta imune celular antitumoral.

Como objetivos gerais, visamos investigar a ação da combinação entre própolis e docetaxel (P + DOC) sobre a linhagem celular LNCaP e sobre monócitos humanos, visando desenvolver uma associação que seja capaz de combater as células tumorais e também modular a atividade de monócitos no microambiente tumoral, sem prejuízo das funções de células envolvidas na resposta imune.

Nossa meta é avaliar se a inclusão da própolis, simultaneamente com o quimioterápico, poderia favorecer este cenário.

4.1. Preparação do extrato etanólico de própolis, da solução de docetaxel e associações

Para preparação do extrato, 30 g de própolis da amostra congelada serão trituradas e colocadas em 100 mL de etanol 70%, ao abrigo de luz e sob agitação moderada. Após uma semana, filtraremos os extratos em papel de filtro e a concentração final (mg/mL) será calculada após a obtenção do peso seco da solução. Para os ensaios

12/12/2019 :: UNESP : Reitoria - SisPROPe ::

prope.unesp.br/sisprope/sis/posdoc_unesp/2017_criar_pedido_novo.php?id_perfil=8&pedido=2419 3/5

filtro e a concentração final (mg/mL) será calculada após a obtenção do peso seco da solução. Para os ensaios com células LNCaP e monócitos, a própolis será diluída em meio RPMI 1640 completo (suplementado com 10% de soro fetal bovino - Cultilab, Brasil), para obtenção das concentrações 1, 5, 10, 25, 50 e 100 µg/mL. O docetaxel será obtido da Sigma-Aldrich - EUA e diluído em meio RPMI completo para obtenção das concentrações a serem utilizadas: 1, 5, 10, 25, 50 e 100 nM. Para a elaboração das associações, as concentrações de docetaxel e própolis serão associadas uma a uma, a fim de identificar a combinação que apresente menor quantidade de docetaxel e maior potencial citotóxico sobre células tumorais.

4.2. Obtenção das células LNCaP

Células da linhagem LNCaP serão cultivadas em meio RPMI completo, contendo penicilina/estreptomicina (1%), a 37°C e 5% de CO2. As células confluentes (90%) serão descoladas da garrafa utilizando tripsina-EDTA e plaqueadas na concentração de 1 x 105 células/mL em placas de 96 poços, sendo incubadas por 24 h a 37°C, para aderência.

4.3. Ensaio de viabilidade pelo método do MTT

Células LNCaP (1 x 105 células/mL) serão adicionadas a cada poço da placa de 96 poços e incubadas com própolis, docetaxel e suas combinações por 24, 48 e 72 h a 37°C e 5% de CO2. Células incubadas somente com meio RPMI completo serão consideradas controle.

A viabilidade celular será analisada através do método de redução pelo MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]} (Sigma-Aldrich, EUA).

4.4. Obtenção de monócitos humanos

O sangue será obtido de 5 indivíduos voluntários saudáveis, que assinarão um termo de consentimento para retirada de sangue, dando ciência desta pesquisa. Serão aceitos indivíduos acima de 18 anos, não fumantes e que não estejam doentes e nem utilizando medicação de espécie alguma. Tais indivíduos serão informados desta pesquisa através de cartazes afixados nos murais do Instituto de Biociências, e participarão desta pesquisa somente aqueles que tiverem interesse por livre e espontânea vontade.

Amostras de sangue (20 mL) serão coletadas e colocadas em tubos estéreis contendo 200 µL de heparina. Células mononucleares do sangue periférico serão obtidas por meio da separação em gradiente de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suécia) com centrifugação a 200 x g por 30 minutos. O anel rico em células mononucleares será coletado e lavado por 2 vezes com meio de cultura RPMI por 10 minutos a 200 x g. Em seguida, os monócitos (CD14+) serão isolados pela técnica de seleção magnética (?MACS: magnetic-activated cell sorting?) negativa. As células serão incubadas com anticorpos monoclonais acoplados a esferas magnéticas (Monocyte Isolation Kit II Human, Miltenyi Biotec Inc, EUA), que contêm coquetéis de anticorpos biotinilados que se ligam especificamente às suas moléculas alvo; no entanto, o coquetel para isolamento de células CD14+ não contém anticorpos contra essa molécula, por esta razão, monócitos (CD14+) tendem a não ser marcados por estes anticorpos biotinilados. Esta interação anticorpo-biotina permite que as células marcadas sejam retidas quando submetidas ao campo magnético da plataforma, logo, as células CD14+ não retidas à coluna serão coletadas. A contagem das células viáveis será realizada por meio da coloração com solução de azul Tripan, e a concentração celular será ajustada para 1 x 106 células/mL.

Para o teste de viabilidade de monócitos humanos, através do ensaio do MTT, as combinações que apresentem menor quantidade de docetaxel e maior potencial citotóxico sobre células tumorais serão avaliadas.

4.5. Cultura de monócitos para avaliação de marcadores de superfície e dosagem das citocinas

As culturas de monócitos, contendo 1 x 106 células/mL, serão incubadas com as concentrações de própolis, docetaxel e combinações que não apresentarem citotoxicidade. Após 24 h, os sobrenadantes serão coletados e armazenados a ?70ºC para posterior dosagem de citocinas, e as células serão utilizadas para avaliação dos marcadores de superfície.

4.5.1. Avaliação de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo

Nos ensaios de citometria de fluxo, utilizaremos o citômetro de fluxo modelo FACS CaliburTM (BD Becton Dickinson and Company, EUA).

Para avaliação da presença dos marcadores celulares (TLR-4, TLR-2, HLA-DR, CD80 e CD40), os monócitos (1x106/mL) serão colocadas em tubos para citômetro e centrifugadas por 10 minutos a 1700 rpm. O sobrenadante será descartado e as culturas serão incubadas por 24 horas a 37ºC com docetaxel, própolis e combinações. Em seguida, as células serão lavadas, ressuspendidas em 500 µL de solução eletrolítica (ISOTON II) e incubadas com os anticorpos monoclonais fluoresceinados específicos. As células serão separadas em dois grupos (A e B). No grupo A, as células estimuladas serão incubadas com 5 µL dos anticorpos anti-TLR-2 conjugado com FITC (clone TL2.1 - Biolegend, EUA) e anti-TLR-4 conjugado com PE (clone HTA125 - Biolegend, EUA). No grupo B, os monócitos serão incubados com 5 µL dos anticorpos anti-HLA-DR conjugado com FITC (clone L243 - Biolegend, EUA), CD80 conjugado com PE (clone D210 - Biolegend, EUA) e anti-CD40 conjugado com APC (clone 5C3 - Biolegend, EUA). Para cada teste, será incluído um tubo controle onde as células serão incubadas com 5 µL dos anticorpos de controle isotípico marcados com os respectivos fluorocromos dos testes (PE, FITC, PerCP/Cy5.5 e APC ? Biolegend, EUA) durante 30 minutos ao abrigo da luz à 4ºC. As células serão marcadas com 5 µL anti-CD14 conjugado com PerCP/Cy5.5 (clone HCD14 - Biolegend, EUA), o que permitirá a seleção do gate apenas dos monócitos CD14+. Após a incubação, as células serão centrifugadas por 10 minutos a 1700 rpm para lavagem, fixadas em 450 ?L de ISOTON II contendo 50 ?L de paraformaldeído 5% e analisadas por citometria de fluxo.

Será padronizada a aquisição de 30.000 eventos por amostra e será otimizada a população de interesse estabelecendo gate com base em parâmetros de tamanho (FSC) e granulosidade (SSC). Os resultados serão expressos em percentual de células CD14 positivas.

4.5.2. Determinação de citocinas pela técnica de ELISA

A determinação da concentração de TNF-?, IL-6, IL-10 e IL-1? será realizada através de ensaio

imunoenzimático (ELISA). Inicialmente serão adicionados 100 µL de salina tamponada com fosfato (PBS) e anticorpos monoclonais diluídos conforme instruções do fabricante (R & D Systems, EUA) às placas de poliestireno (Maxisorp-Nunc, EUA), e incubadas overnight a 4ºC em câmera úmida. Após 3 lavagens dos poços com PBS acrescido de Tween 20 (0,05%), ocorrerá o bloqueio dos poços com albumina sérica bovina (Sigma-Aldrich, EUA) em PBS (10%) para saturação dos sítios de ligação e, em seguida, a placa será incubada a temperatura ambiente por 1h. A seguir, nova sequência de lavagens será realizada e alíquotas de 100 µL dos sobrenadantes das culturas de células serão adicionadas com posterior incubação por 2 h a temperatura ambiente. Os poços serão novamente lavados e, ao anticorpo de detecção policlonal biotinilado, será adicionado o conjugado estreptoavidina-peroxidase, incubando-se novamente por 20 min. Novas lavagens serão realizadas e, para revelação, serão adicionados 100 µL da solução contendo o substrato peróxido de hidrogênio e tetrametilbenzidina. Após 20 minutos a temperatura ambiente, a reação enzimática será interrompida pela adição de 50 µL de H2SO4 2N. As leituras serão realizadas em leitor de ELISA com filtro de 490 nm.

4.6. Avaliação do efeito do sobrenadante de monócitos tratados com P + DOC sobre a proliferação de células LNCaP

Para avaliar se a combinação P + DOC escolhida influencia o microambiente tumoral, monócitos serão tratados com P + DOC por 24 h. O sobrenadante será removido e meio RPMI completo será adicionado, seguido de incubação por 24 h. Posteriormente, o sobrenadante desta cultura será coletado e adicionado sobre a cultura de LNCaP (constituindo 20% do volume total). Após o período de 72 h, será avaliada a taxa de proliferação celular pelo ensaio de MTT (LASZKIEWICZ, 2015).

12/12/2019 :: UNESP : Reitoria - SisPROPe ::

prope.unesp.br/sisprope/sis/posdoc_unesp/2017_criar_pedido_novo.php?id_perfil=8&pedido=2419 4/5 Limite máximo de caracteres: 9000

Resultados:

Limite máximo de caracteres: 30000 Discussão:

Limite máximo de caracteres: 12000 Referencias:

Limite máximo de caracteres: 3000

Cronograma Proposto:

Atividades:

Limite máximo de caracteres: 3000

IV - Declaração de Cessão de Direitos de Propriedade intelectual dos resultados gerados durante o Programa de Pós-Doutorado.

Declaro que Li e aceito a Delaração de Reconhecimento de Direitos de Propriedade Intelectual

(Exibir declaração de cessão)

V - Financiamento

Modalidade: * PD-III sem financiamento

- Pós-doutorado modalidade III - sem financiamento e que não se enquadrem nos incisos anteriores.

TERMO DE COMPROMISSO DE PÓS-DOUTORADO MODALIDADE SEM BOLSA

Eu, KARINA BASSO SANTIAGO, aprovado(a) para participar do Programa de Pós-Doutorado do(a) Instituto de Biociências

de Botucatu, declaro estar ciente das regras do Programa e demais normas universitárias, e comprometo-me a cumpri-las.

Declaro, ainda, estar ciente de que o Pós-Doutorado não gera vínculo empregatício com a Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" - UNESP, e que possuo meios para me manter durante o período de realização do Pós-Doutorado.

Candidato de acordo: sim não

Motivo:

Comprovante de AFASTAMENTO da Instituição de origem quando pertinente.

Carta de aceite do supervisor.

VI - Etapas após o envio do projeto: - Análise documental:

Verificação, pela CPP, dos anexos e dos campos preenchidos. Documentação correta? sim não

- Parecer da Assessoria Científica:

Ainda não temos resultados oriundos deste projeto de pesquisa, pois trata-se de pedido inicial.

Ainda não temos discussão dos dados, pois trata-se de pedido inicial.

AUFFRAY, C.; SIEWEKE, M.H.; GEISSMANN, F. Blood monocytes: development, heterogeneity, and relationship with dendritic cells. Annual review of immunology, v.27, p.669-692, 2009.

BANSKOTA, A.H.; TEZUKA, Y.; KADOTA, S. Recent progress in pharmacological research of propolis. Phytotherapy Research, v.15, p.561-571, 2001.

BURDOCK, G. A. Review of the biological properties and toxicity of bee propolis (propolis). Food and Chemical Toxicology, v.36, p.347-363, 1998.

CHITTEZHATH, M. DHILLON, M. K.; LIM, J. Y.; LAOUI, D.; SHALOVA, I. N.; TEO, Y. L.; CHEN, J.; KAMARAJ, R.; RAMAN, L.; LUM, J.; THAMBOO, T. P.; CHIONG, E.; ZOLEZZI, F.; YANG, H.; VAN GINDERACHTER, J. A.; POIDINGER, M.; WONG, A. S.; BISWAS, S. K. Molecular profiling reveals a tumor-promoting phenotype of monocytes and macrophages in human cancer progression. Immunity, v.41, p.815-829, 2014.

FERLAY, J.; SOERJOMATARAM, I.; DIKSHIT, R.; ESER, S.; MATHERS, C.; REBELO, M.; PARKIN, D.M.; FORMAN, D.; BRAY, F. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer, v.136, p.359-386, 2015.

FRIÓN-HERRERA, Y.; DIAZ-GARCIA, A.; RUIZ-FUENTES, J.; RODRIGUEZ-SANCHEZ, H.; SFORCIN, J.M. Brazilian green propolis induced apoptosis in human lung cancer A549 cells through mitochondrial-mediated pathway. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v.67, p.1448-1456, 2015.

KITAMURA, T.; QIAN, B.Z.; POLLARD, J.W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Reviews Immunology, v.15, p.73-86, 2015.

LASZKIEWICZ, N.S. Migração e invasão celular in vitro de células humanas expressando variantes da proteína LMP1 do vírus de Epstein-Barr (EBV). 2015. 79p. Dissertação (Mestrado) ? Programas de Pós-graduação em Patologia, Faculdade de Medicina, UNESP - Botucatu, 2015.

MISSIMA, F.; PAGLIARONE, A.C.; ORSATTI, C.L.; SFORCIN, J.M. The effect of propolis on pro-inflammatory cytokines produced by melanoma-bearing mice submitted to chronic stress. Journal of ApiProduct and ApiMedical Science, v.1, p.11-15, 2009.

MOTAWI, T.K.; ABDELAZIM, S.A.; DARWISH, H.A.; ELBAZ, E.M.; SHOUMAN, S.A. Modulation of tamoxifen cytotoxicity by caffeic acid phenethyl ester in MCF-7 breast cancer cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v.2016, p.1-13, 2016.

ORSOLIC, N. A review of propolis antitumor action in vivo and in vitro. Journal of ApiProduct and ApiMedical Science, v.2, p.1-20, 2010.

RINGEL, I., HORWITZ, S.B. Studies with RP 56976 (taxotere): a semisynthetic analogue of taxol. Journal of the National Cancer Institute, v.83, p.288-291, 1991.

SEDA VATANSEVER, H.; SORKUN, K.; ISMET DELILO?LU GURHAN, S.; OZDAL-KURT, F.; TURKOZ, E.; GENCAY, O.; SALIH, B. Propolis from Turkey induces apoptosis through activating caspases in human breast carcinoma cell lines. Acta Histochemica, v.112, p.546-556, 2010.

SFORCIN, J.M. Propolis and the immune system: a review. Journal of Ethnopharmacology, v.113, p.1-14, 2007.

Todas as atividades (revisão bibliográfica, execução dos experimentos, redação do relatório final e dos artigos a serem publicados) serão realizados em um ano.

12/12/2019 :: UNESP : Reitoria - SisPROPe ::

prope.unesp.br/sisprope/sis/posdoc_unesp/2017_criar_pedido_novo.php?id_perfil=8&pedido=2419 5/5 Parecer * _{aprovado denegado}

Avaliação: * Muito Bom

Análise: *

Obs.: Analisar o projeto segundo os seguintes parâmetros: 1-Justificativa; 2-Fundamentação Científica; 3-Relevância para o avanço da área; 4-Metodologia e 5-Relevância dos recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto.

- Homologação pela unidade - Comissão Permanente de Pesquisa (CPP):

Homologa? * _{sim não}

Justificativa: *

Obs.: Ao homologar a inscrição, a CPP deve informar o diretor da unidade.

Não há pendências neste pedido.

Cancelar pedido Finalizar antecipado Finalizar (concluir) pedido Sair

Comentários PROPe (visualização permitida apenas aos analistas da PROPe):

Pedido=2419 (resolução 91/2017) (homologado )

Críticas, dúvidas e sugestões: http://prope.unesp.br/falecomaprope/

Política de Privacidade Política de Serviço

UNESP - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"

Desenvolvido por Aptor Software - Dúvidas e sugestões: http://prope.unesp.br/falecomaprope/

Projeto adequadamente delineado que propõe a avaliação do efeito combinado do tratamento com própolis e docetaxel (droga utilizada em quimioterapia) no combate a proliferação de células tumorais prostáticas e melhoria da resposta imune antitumoral, a partir de experimentação de células tumorais prostáticas e monócitos humanos. Trata-se de pesquisa inédita com potencial para geração de formas alternativas de tratamento do câncer de próstata. Embora não haja menção quanto a solicitação de recursos e agencia de fomento, este assessor pressupõe que o supervisor disponha dos bens e consumíveis necessários para viabilizar a proposta. Ante ao exposto dou parecer favorável à aprovação do projeto de pos-doutoramento.

1 Campus de Botucatu

RELATÓRIO CIENTÍFICO PARCIAL REFERENTE AO

PÓS-DOUTORADO

AÇÃO DA PRÓPOLIS ASSOCIADA AO DOCETAXEL SOBRE

CÉLULAS DE CÂNCER DE PRÓSTATA E SOBRE MONÓCITOS

HUMANOS: NOVA ABORDAGEM TERAPÊUTICA?

Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu

Supervisor: Prof. Dr. José Maurício Sforcin

Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu

PEDIDO PROPe: 2419

Período coberto pelo relatório científico: 02/2019 a 12/2019

2 Resumo do presente relatório

Devido a problemas com a cultura da linhagem LNCaP e com a entrega de materiais, optamos por utilizar a linhagem MCF-7 de tumor de mama em nossos ensaios. O tratamento com a associação entre própolis e docetaxel sobre esta linhagem apresentou maior potencial citotóxico sobre essas células tumorais se comparado à utilização destes produtos isoladamente, sem afetar a viabilidade de monócitos humanos. O tratamento por 24 e 48 h com docetaxel manteve a produção de IL-1β, TNF-α e IL-10 por monócitos humanos e aumentou a produção de IL-6 após 24 h. A própolis apresentou modulador, induzindo a secreção de IL-1β após 24 h e IL-6 em 24 e 48 h. A associação entre própolis e docetaxel estimulou a produção de ambas as citocinas. Os tratamentos com própolis e a associação aumentaram a expressão de HLA-DR após 24 h, e diminuíram a expressão de CD80 após 48 h. Não houve alteração da expressão dos receptores TLR-2 e TLR-4. Tomados em conjunto, nossos resultados indicaram que a própolis exerceu efeitos moduladores sobre monócitos cultivados por 24 e 48 h. Devido à série de contratempos que prejudicaram o cronograma de realização deste projeto, encaminhamos à assessoria o pedido de prorrogação do prazo de estágio de pós-doutoramento por mais 12 meses para finalização do projeto da melhor forma possível.

3 1. Etapas realizadas no período coberto pelo relatório

Inicialmente o presente projeto foi delineado visando avaliar a ação da própolis associada ao docetaxel sobre células de câncer de próstata e sobre monócitos. Porém, durante a execução do projeto, tivemos problemas com as células de câncer de próstata e resolvemos seguir os experimentos com células de câncer de mama. Para tal, utilizamos a linhagem celular de câncer de mama MCF-7 com o intuito de desenvolver uma associação que seja capaz de combater as células tumorais e também modular a atividade de monócitos no microambiente tumoral, sem prejuízo das funções de células envolvidas na resposta imune. Portanto, nossa meta é avaliar se a própolis simultaneamente com o quimioterápico, poderia favorecer este cenário, evidenciando assim a implicação prática desta pesquisa.

2. Metodologia

A metodologia apresentada inicialmente sofreu alteração em relação às células tumorais estudadas. Inicialmente propusemos analisar a linhagem tumoral de câncer de próstata (LNCaP), mas devido a problemas de contaminação da linhagem e pela demora em recebermos uma nova linhagem, optamos por dar início às atividades utilizando as células MCF-7, linhagem celular de câncer de mama. As demais metodologias não sofreram alterações e, por esta razão, não se encontram apresentadas.

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP (CAAE 68218117.4.0000.5411 e 18751819.1.0000.5411).

2.1. Análise estatística

A análise dos dados foi realizada através do software Graph Pad Prism 5 (GraphPad, USA) utilizando Análise de Variância (ANOVA) para medidas repetidas, seguida do teste de comparações múltiplas de Dunnett (P < 0,05). Os dados estão apresentados como média e desvio-padrão.

4 3. Resultados e discussão

3.1. Viabilidade celular

As concentrações de própolis propostas foram determinadas por trabalhos de nosso grupo, correspondendo a 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 75 e 100 µg/mL (CINEGAGLIA et al., 2013; BÚFALO

et al., 2014; SANTIAGO et al., 2016). Na Figura 1 estão apresentados os resultados obtidos após

o tratamento da linhagem MCF-7 com diferentes concentrações de própolis após 24, 48 e 72 h.

Figura 1. Viabilidade (%) de células MCF-7 tratadas com própolis nas concentrações 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 h. Experimentos realizados em quintuplicata. Os dados representam a média e desvio-padrão de 3 experimentos similares. Significativamente diferente do controle (células incubadas somente com meio de cultura): * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001.

5 Em relação à atividade citotóxica da própolis sobre a linhagem MCF-7, não foi observado efeito nas concentrações mais baixas. Nossos resultados demonstraram que esse apiterápico reduziu a viabilidade de MCF-7 nas concentrações mais altas (50, 75 e 100 µg/mL) no período de 72 h de tratamento. Este dado concorda com outros trabalhos (CINEGAGLIA et al., 2013; SILVA et al., 2017), que demonstraram citotoxicidade de concentrações maiores de própolis sobre outras linhagens tumorais (osteossarcoma canino e células HEp-2), sendo que as células MCF-7 utilizadas neste projeto se mostraram mais resistentes à atividade de nossa amostra de própolis do que as células de osteossarcoma canino e células HEp-2 testadas por esses autores respectivamente.

O potencial antitumoral de amostras de própolis de outros países também tem sido avaliado. Choudhari et al. (2013) observaram o efeito citotóxico do extrato etanólico de própolis indiana sobre MCF-7 nas concentrações de 100 e 250 µg/mL após tratamento por 24 h. Diferentes amostras de própolis da Turquia também apresentaram atividade contra MCF-7 em concentrações mais altas (500, 250, 125 e 63 µg/mL) em tratamento de 24 h (SEDA VATANSEVER et al., 2010). Xuan e colaboradores (2014) observaram que a própolis chinesa, rica em flavonoides e componentes fenólicos, reduziu a viabilidade de células MCF-7 e MDA-MB-231 nas concentrações de 25, 50, 100 e 200 µg/mL, em períodos de 24 e 48 h. Kamiya e colaboradores (2012) realizaram um estudo comparativo entre própolis chinesa, rica em pinocembrina e CAPE, própolis verde brasileira rica em bacarina e artepilina C e própolis vermelha brasileira, contendo quercetina e naringenina, demonstrando que a própolis vermelha (1, 10 e 20 µg/mL) apresentou melhores resultados na redução da viabilidade de MCF-7 tratadas por 24 h. A própolis verde tem como principal fonte vegetal a Baccharis dracunculifolia (alecrim-do-campo), tendo uma composição química semelhante à própolis utilizada em nossas linhas de pesquisa. Segundo este estudo, nas concentrações 0.1, 1, 10 e 20 µg/mL a própolis verde não levou à morte das células MCF-7, concordando com os resultados apresentados neste relatório. Tais trabalhos demonstram que própolis de diferentes regiões apresentam diferentes componentes químicos, os quais são os responsáveis por sua atividade biológica.

Realizamos ensaios com um range de concentrações de docetaxel (1; 2,5; 5; 10; 25; 50; 75 e 100 nM). Os resultados desse ensaio sobre a linhagem MCF-7 estão dispostos na Figura 2.

6 As concentrações utilizadas de docetaxel demonstraram efeito inibidor sobre o crescimento celular, indicando que a linhagem MCF-7 se mostrou sensível mesmo às menores concentrações de docetaxel.

Figura 2. Viabilidade (%) de células MCF-7 controle (incubadas somente com meio de cultura) ou tratadas com docetaxel (D) nas concentrações 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75 e 100 nM, por (A) 24, (B) 48 e (C) 72 h. Experimentos realizados em quintuplicata. Os dados representam a média e desvio-padrão de 3 experimentos similares. Significativamente diferente do controle: ** P < 0,01; *** P < 0,001.

7 De acordo com o trabalho de Morse e colaboradores (2005), o docetaxel nas concentrações de 10 e 100 nM apresentou ação citotóxica nas células MCF-7 (4,5% e 25,4% após 24 h, e 11,2% e 53,2% após 48 h, respectivamente). Tais resultados são semelhantes aos encontrados em nossos ensaios.

Quanto à curva de crescimento, os resultados obtidos com o docetaxel estão dispostos na Figura 3. Comparados ao controle, apenas os tratamentos com 1 e 2,5 nM de docetaxel não apresentaram atividade inibidora do crescimento celular em 72 h de tratamento. Todas as demais concentrações (≥ 10 nM) foram efetivas em reduzir a taxa de multiplicação da linhagem MCF-7.

Figura 3. Curva de crescimento de células MCF-7 tratadas com docetaxel nas concentrações 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75 e 100 nM, por 24, 48 e 72 h. Experimentos realizados em quintuplicata. Os dados representam a média de 3 experimentos similares.

Hernández-Vargas et al. (2007) também observaram ocorrência de curva de crescimento bifásica em células expostas a concentrações nanomolares de docetaxel, havendo menor inibição do crescimento utilizando concentrações menores que 10 nM e superiores a 50 nM, tal como demonstrado em nossos resultados. Justamente esse crescimento bifásico pode indicar a presença dos dois mecanismos de morte celular induzidos pelo docetaxel (apoptose e catástrofe mitótica). Em baixas concentrações (< 10 nM), Hernández-Vargas e colaboradores observaram uma população celular apresentando hipodiploidia (conteúdo de DNA < 2n) após 24 h de exposição.

8 Na concentração de 100 nM, houve parada no ciclo celular na fase G2/M em mais de 80% das células.

Diferentes concentrações de docetaxel também podem atuar sobre diferentes alvos moleculares. No mesmo trabalho de Hernández-Vargas e colaboradores (2007), utilizando a concentração de 4 nM, foi observada indução dos genes CDKN1A/p21, TNFRSF6/Fas,

Tp531NP1 e SOD2, alvos de p53. Por outro lado, o tratamento com 100 nM regulou os

transcritos associados com a fase G2/M e pontos de checagem de reparo do DNA (AURKA/STK15, PLK1, VEGFC, BUB1B e MAD2L1).

Por possuir diferentes componentes ativos, a utilização de produtos naturais concomitantemente à utilização de medicamentos tradicionais pode favorecer a farmacocinética do medicamento pela regulação de enzimas e transportadores envolvidos no metabolismo hepático e intestinal, subjugando uma possível resistência das células tumorais aos medicamentos e também eliminando os efeitos adversos dos quimioterápicos (TSAI et al., 2017).

Como exemplo, o extrato da planta Wedelia chinensis possui atividade anti-inflamatória, reduzindo a produção de diferentes citocinas pró-inflamatórias por macrófagos e células de câncer de próstata, impedindo a infiltração de células mieloides no sítio tumoral. A associação entre esse extrato e docetaxel potencializou a indução da morte celular de tumores ortotópicos de câncer de próstata, além de diminuir a perda de peso das cobaias, bem como reduziu o dano tecidual no fígado e rins causados pelo docetaxel (TSAI et al., 2017).

Nosso grupo observou a ação citotóxica da geoprópolis produzida por meliponíneos associada a diferentes quimioterápicos (carboplatina, doxorrubicina e metotrexato) sobre células tumorais HEp-2 (BARTOLOMEU et al., 2016). Também analisamos o efeito da própolis produzida por abelhas africanizadas associada à carboplatina contra células de osteossarcoma canino (BERNARDINO et al., 2018), demonstrando a efetividade de combinações entre estes produtos naturais e os quimioterápicos.

Com base nos resultados apresentados em nossos ensaios de viabilidade celular, escolhemos as concentrações 5, 10 e 25 nM de docetaxel para serem combinadas com diferentes concentrações de própolis (25, 50, 75 e 100 µg/mL) e testadas sobre a linhagem MCF-7. A porcentagem de viabilidade celular está apresentada na Figura 4. Após 24 h não foi observado efeito de nenhuma combinação sobre a viabilidade celular. Após 48 h de tratamento, as combinações com própolis (25 e 75 µg/mL) apresentaram redução da viabilidade celular. Após

9 72 h de tratamento, todas as combinações reduziram a porcentagem de células viáveis, indicando que os tratamentos exerceram efeito sobre a linhagem MCF-7.

Figura 4. Viabilidade (%) de células MCF-7 controle (células incubadas somente com meio de cultura) ou tratadas com as combinações de docetaxel (D - 5, 10 e 25 nM) e própolis (P - 25, 50, 75 e 100 µg/mL), por (A) 24, (B) 48 e (C) 72 h. Experimentos realizados em quintuplicata. Os dados representam a média e desvio-padrão de 3 experimentos similares. Significativamente diferente do controle: *P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001.

10 Quanto à curva de crescimento das células, todas as combinações apresentaram menor média de D.O. do que a apresentada pelo grupo controle após 48 e 72 h de tratamento, indicando que todas as combinações escolhidas atuaram sobre o crescimento celular (Figura 5).

Os tratamentos com docetaxel (5, 10 e 25 nM) apresentaram retomada da taxa de crescimento após 48 h. Todas as combinações de própolis com o quimioterápico na concentração de 25 nM não foram capazes de inibir a retomada do crescimento.

Os resultados indicaram que as diferentes combinações entre própolis e docetaxel mostraram-se mais efetivas no controle da viabilidade celular e do crescimento da linhagem MCF-7 em relação à própolis e ao docetaxel isoladamente. Apenas a combinação de própolis 25 µg/mL + docetaxel 10 nM apresentou redução constante da taxa de crescimento da linhagem nos 3 períodos de tempo, indicando seu potencial inibidor da multiplicação de células MCF-7. Assim, esta combinação foi escolhida para dar prosseguimento ao nosso projeto com monócitos humanos.

11 Figura 5. Curva de crescimento de células MCF-7 tratadas com as combinações de docetaxel (5, 10 e 25 nM) e própolis (25, 50, 75 e 100 µg/mL), por (A) 24, (B) 48 e (C) 72 h. Experimentos realizados em quintuplicata. Os dados representam a média e desvio-padrão de 3 experimentos similares.

12 Com relação à resposta imune, o tratamento com docetaxel de mulheres com diferentes cânceres de mama pode modular a imunidade das mesmas. Após 6 sessões de quimioterapia a cada 21 dias, foi observada maior ação citotóxica das células NK e LAK, maior produção de IL-6, GM-CSF e INF-γ, e menor produção de IL-1β, TNF-α e PGE2. A liberação destes mediadores químicos pode estar associada à atividade do quimioterápico sobre o sítio tumoral e sobre as respostas imunes das pacientes, além de ocorrer possível reação hepática decorrente do tratamento com taxanos. Foi observada profunda, porém reversível, linfopenia causada pelo uso do quimioterápico, a qual pode ser associada ao risco aumentado de infecções oportunistas (TSAVARIS et al., 2002).

Após a realização dos ensaios avaliando a ação da própolis em combinação ou não com o docetaxel sobre as células MCF-7, analisamos a viabilidade de monócitos humanos após incubação com a combinação escolhida. Os tratamentos com própolis e docetaxel, isolados ou em combinação, não afetaram a viabilidade dessas células, como demonstrado na Figura 6.

Figura 6. Viabilidade (%) de monócitos controle ou tratados com própolis (P - 25 µg/mL), docetaxel (D - 10 nM), sua combinação (P + D) e LPS (5 µg/mL) por 48 h. Os dados representam média e desvio-padrão de 5 indivíduos.

Conforme observado, nenhum dos tratamentos afetou a viabilidade dos monócitos humanos após 48 h. De fato, em relação à própolis, os resultados obtidos corroboram os dados de Búfalo et al. (2014) e Santiago et al. (2016), os quais demonstraram que a viabilidade celular de monócitos humanos não é afetada após incubação com própolis em diferentes concentrações ao longo do tempo.

Quanto ao docetaxel, este não apresentou atividade citotóxica contra células dendríticas derivadas de monócitos tratadas com concentrações menores que 100 nM in vitro (NAKASHIMA et al., 2005). Em pacientes tratados com o quimioterápico, foi observada

13 neutropenia, sem diminuição do número de monócitos e linfócitos (TONG et al., 2000). Wenner e colaboradores (2012) verificaram que o tratamento de camundongos com tumor ortotópico de próstata com docetaxel reduziu o número de leucócitos, o que foi evitado após a associação do medicamento ao extrato do cogumelo Trametes versicolor. Nesse trabalho, os autores observaram também que essa associação favoreceu a redução do tumor e a infiltração de células T citolíticas no sítio tumoral.

3.2. Produção de citocinas

Visto que a própolis em combinação ou não com docetaxel não afetou a viabilidade de monócitos, avaliamos a produção de citocinas por estas células. Nas Figuras 7 e 8 estão apresentadas as produções de IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-10 após 24 e 48 h de tratamento, respectivamente.

Figura 7. Produção (pg/mL) de IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-10 por monócitos humanos tratados com própolis (P – 25 µg/mL), docetaxel (D – 10 nM), sua combinação (P + D), LPS (5 µg/mL) ou apenas meio de cultura (controle – C) por 24 h. Os dados representam média e desvio-padrão de 5 indivíduos. *significativamente diferente do controle (P < 0,05); # significativamente diferente da associação P+D (P < 0,05).

14 Não foram observadas alterações estatisticamente significativas na produção de IL-1β por monócitos após 24 h de incubação com todos os tratamentos. Contudo, observa-se que a produção induzida pela própolis e por sua associação com o docetaxel parece ser mais elevada do que a apresentada pelo grupo controle, embora sem diferença estatística. Após 48 h, a própolis em combinação ou não com docetaxel induziu aumento na produção desta citocina sugerindo que a ação da própolis sobre a produção desta citocina pode depender do tempo de tratamento.

Figura 8. Produção (pg/mL) de IL-1β, IL-6 e IL-10 por monócitos humanos incubados com meio

de cultura (controle), própolis (P - 25 µg/mL), docetaxel (D - 10 nM), sua combinação (P+D), e LPS (5 µg/mL) por 48 h. Os dados representam a média e desvio-padrão de 5 indivíduos. **significativamente diferente do controle (P < 0,01); *** (P < 0,001); ##significativamente diferente da própolis (P < 0,01); ### (P < 0,001); +++ significativamente diferente do docetaxel (P < 0,001).

Quanto à ação do docetaxel, na concentração utilizada nestes ensaios, os resultados obtidos após 24 h foram semelhantes àqueles obtidos após 48 h, demonstrando que este quimioterápico não alterou a produção de IL-1β por monócitos humanos ao longo do tempo. Nossos resultados estão de acordo com dados obtidos por outros pesquisadores, os quais não

15 observaram alterações na produção de IL-1β por macrófagos murinos RAW 246.7 (ELSEA et al., 2008) e por monócitos U937 tratados com docetaxel e co-cultivados com células de tumor prostático (MAHON et al., 2015). Entretanto, em trabalho publicado em 2018, Millrud e colaboradores observaram maior produção de IL-1β por macrófagos humanos tratados por 18 h com concentrações mais elevadas do quimioterápico (1 e 10 µM). Assim, pode-se verificar que os resultados obtidos podem variar dependendo da concentração de quimioterápico utilizado, bem como do modelo celular adotado.

Faz-se importante observar o comportamento desta citocina no ambiente tumoral, porque altas concentrações da mesma podem estimular o crescimento e invasão das células tumorais, bem como resistência à quimioterapia (BALKWILL & MANTOVANI, 2001; APTE et al., 2006; DE PALMA & LEWIS, 2013; CHITTEZHATH et al., 2014; LIN & KARIN, 2017; QIU et al., 2018).

Quanto à produção de TNF-α, após 24 h de tratamento, os resultados obtidos apresentaram alto desvio-padrão, não possibilitando a observação de diferenças significativas entre os tratamentos (Figura 7), e esta citocina não foi detectada após 48 h. Esses resultados demonstraram grande variabilidade de resposta, o que pode ser comumente encontrado em ensaios envolvendo seres humanos. Embora não tenhamos obtido diferença estatística significativa, os tratamentos com própolis (P = 0,0560) e sua associação com docetaxel (P = 0,0532) após 24 h indicaram forte tendência à maior produção de TNF-α. Tal atividade imunomoduladora da própolis sobre monócitos humanos, na concentração utilizada neste ensaio, já fora observada por Búfalo et al. (2014) e Conti et al. (2015a) incubando as células com a própolis por 18 h.

Como dito anteriormente, o docetaxel, isoladamente, não alterou a produção de TNF-α em monócitos humanos, tanto em 24 h como 48 h após incubação. Tais resultados sugerem que esse quimioterápico não apresenta ação sobre essas células e sobre macrófagos murinos, como relatado nos estudos de Manthey et al. (1993) e Burkhart et al. (1994) após tratamento in vitro por 4 h. Contudo, esse quimioterápico, na concentração de 5 µM, induziu maior expressão de

TNF-α em macrófagos murinos RAW 264.7 após 6 h de tratamento (ELSEA et al., 2008). Em

pacientes, a concentração sérica de TNF-α se mostrou aumentada em 30% dos pacientes tratados com docetaxel, indicando que esse quimioterápico pode modular a produção de citocinas sistemicamente em parte da população (TONG et al., 2000).

16 Conforme observado na Figura 7, após 24 h apenas a própolis e sua associação com o quimioterápico induziram aumento na produção de IL-6, sem alteração induzida pelo tratamento com o docetaxel isoladamente. Após 48 h de incubação (Figura 8), a própolis, o docetaxel e sua associação aumentaram a produção dessa citocina. Esses resultados indicam o papel modulador da própolis sobre a produção desta citocina por monócitos humanos em diferentes concentrações e períodos de tempo (SANTIAGO et al., 2016; CARDOSO et al., 2017). Quanto ao quimioterápico, concentrações superiores de docetaxel (5 e 100 µM) não alteraram a produção dessa citocina por macrófagos murinos RAW 246.7 tratados por 48 h (ELSEA et al., 2008), indicando que o docetaxel possui ação imunomoduladora sobre a produção desta citocina quando utilizado em concentrações menores.

De modo geral, ao analisar a produção de TNF-α, IL-1β e IL-6 neste projeto, pode-se verificar que a própolis isoladamente ou em combinação com docetaxel induziu aumento na produção destas citocinas pró-inflamatórias por monócitos humanos após 24 e 48 h, enquanto o quimioterápico isoladamente não afetou a produção das mesmas. Este achado é interessante, pois as concentrações de própolis e docetaxel foram escolhidas por exercerem ação citotóxica contra células de câncer de mama (MCF-7), mas não sobre monócitos. Além disso, a própolis pode favorecer a ativação de monócitos, que são células circulantes do sangue periférico e sujeitas à ação dos quimioterápicos.

Como discutido anteriormente, embora a presença de citocinas pró-inflamatórias contribua para a ação antitumoral do sistema imunológico, a produção elevada destas citocinas também está associada ao aparecimento de efeitos colaterais sistêmicos característicos da quimioterapia, prejudicando o prognóstico e a qualidade de vida do paciente (ELSEA et al., 2008; MAUER et al., 2015). Assim, os dados apresentados indicaram ação imunomoduladora da própolis sobre monócitos humanos, bem como a ação inibitória da própolis sobre a proliferação das células tumorais (MCF-7). No entanto, é preciso atentar para os aspectos positivos e negativos da imunomodulação exercida por este apiterápico.

A respeito da produção de IL-10, os tratamentos com própolis, docetaxel e sua associação por 24 e 48 h não alteraram a produção desta citocina. Assim, os dados sugerem que nossa amostra de própolis não promove alteração na produção desta citocina de maneira tempo-dependente, embora essa modulação possa acontecer de forma concentração-tempo-dependente, conforme observado em trabalhos prévios de nosso grupo (BÚFALO et al., 2014; CONTI et al.,

17 2015a). Quanto ao quimioterápico adotado, foi observado seu efeito inibitório sobre a produção de IL-10 por células mieloides supressoras isoladas de sítios tumorais e tratadas com 11 nM de docetaxel (KODUMUDI et al., 2010). Todavia, esses resultados in vitro não foram observados em pacientes que se submeteram ao tratamento por 4 semanas com o quimioterápico (TONG et

al., 2000).

Citocinas produzidas pelas células tumorais e pelas células mieloides presentes no sítio tumoral podem levar à diferenciação dos monócitos atraídos para a região. Em presença de TGF-β, IL-6 e IL-10, os monócitos podem se diferenciar em macrófagos M2, com características mais anti-inflamatórias. Em tumores de mama e de tireoide, a IL-10 favorece a diferenciação de monócitos em macrófagos que se disseminam por todo o sítio tumoral. Esses macrófagos associados ao tumor (TAM) são fracos produtores de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1β, TNF-α e IL-6, além de produzirem baixos níveis de espécies reativas do oxigênio, não possuindo, assim, ação eficiente contra as células tumorais. Essas células associadas ao tumor também apresentam deficiência na apresentação de antígenos e na habilidade de ativar respostas imunes adaptativas, apresentando baixa expressão de MHC (ALLAVENA et al., 2007).

A respeito da ação da própolis sobre monócitos humanos, esta variou de acordo com o período de tratamento utilizado (24 e 48 h), o que pode ser interessante para observar a dinâmica de ação deste apiterápico junto ao docetaxel. Quanto à produção de citocinas, nossos resultados permitem concluir que a própolis induz aumento na produção das citocinas pró-inflamatórias por monócitos humanos, enquanto o quimioterápico isoladamente não afetou a produção das mesmas. Se hipotetizarmos a utilização da própolis por um paciente sob tratamento quimioterápico, nossos achados sugerem que a própolis pode favorecer a ativação da imunidade inata destes indivíduos frente a diferentes desafios antigênicos, o que indica benefícios deste apiterápico aos indivíduos. Por outro lado, se considerarmos a relação destas citocinas com tumores, há que se levar em conta o que cada uma delas pode acarretar (CHITTEZHATH et al., 2014; MAUER et al., 2015). Assim, o balanço entre as diferentes citocinas produzidas pelas células envolvidas na resposta imune, bem como pelas células tumorais, pode direcionar para uma resposta eficiente ou não das células imunes contra o tumor.

Avaliar a ação do docetaxel sobre monócitos humanos é importante para entender a interferência do quimioterápico na resposta imune do paciente. Embora nossos ensaios in vitro realizados até aqui não tenham revelado ação do docetaxel, ensaios realizados in vivo têm

18 demonstrado sua ação biológica. Em camundongos com tumor ovariano, a administração de docetaxel induziu secreção de CFS-1 e CCL2 que atraíram monócitos e macrófagos teciduais para o sítio tumoral, direcionando essas células para um fenótipo pró-tumoral (LU & MENG, 2019).

3.3. Expressão de marcadores

Após 24 h de tratamento, foi observado o papel imunomodulador da própolis sobre a expressão de HLA-DR por monócitos, isoladamente ou associada ao docetaxel (Figura 9). Nestes ensaios, nosso extrato de própolis apresentou papel estimulador sobre a expressão de HLA-DR por monócitos humanos. O resultado obtido demonstra uma ação positiva da própolis, visto que o receptor HLA-DR é peça fundamental para a apresentação de antígenos pelas células estudadas. A redução da expressão dessa molécula seria preocupante, visto que sua menor expressão está associada ao aumento do risco de infecções hospitalares e menor sobrevida de pacientes submetidos a tratamento quimioterápico (KIM et al., 2010; HOTCHKISS et al., 2013; HIGASHI

et al., 2015). O quimioterápico não apresentou ação sobre a expressão dessas moléculas, o que já

fora relatado em trabalhos realizados utilizando células dendríticas e macrófagos (NAKASHIMA

et al., 2005; MILLRUD et al., 2018). Após 48 h não houve diferença significativa entre os

tratamentos (dados não mostrados).

Figura 9. Porcentagem (%) de monócitos que expressam HLA-DR e intensidade mediana de fluorescência (MIF) de HLA-DR após incubação com meio de cultura (controle - C), própolis (P - 25 µg/mL), docetaxel (D - 10 nM), sua combinação (P+D), e LPS (5 µg/mL) por 24 h. Os dados representam a média e desvio-padrão de 5 indivíduos. **significativamente diferente do controle (P < 0,01); *** (P < 0,001); ## significativamente diferente da associação P+D (P < 0,01); ### significativamente diferente da associação P+D (P < 0,001).

19 Em relação à expressão de CD80, não foi observada diferença estatística significativa entre os tratamentos, embora tenha sido observada uma ligeira diminuição da porcentagem de células que expressam essa molécula após o tratamento com a associação por 24 h (Figura 10). A porcentagem de células que expressam CD80 se mostrou estatisticamente diminuída após 48 h. Tal diminuição já fora observada por nosso grupo em trabalho que evidenciou que a própolis reduziu a expressão de CD80 induzida pela enterotoxina B de E. coli em monócitos (CONTE et

al., submetido).

Figura 10. Porcentagem (%) de monócitos que expressam CD80 e intensidade mediana de fluorescência (MIF) de CD80 após incubação com meio de cultura (controle - C), própolis (P - 25 µg/mL), docetaxel (D - 10 nM), sua combinação (P+D), e LPS (5 µg/mL) por 24 e 48 h. Os dados representam a média e desvio-padrão de 5 indivíduos. **significativamente diferente do controle (P < 0,01); *** (P < 0,001); ### significativamente diferente da associação P+D (P < 0,001).

24 h

20 Citocinas como IL-4 e IL-10 podem estar envolvidas na modulação da expressão de CD80 (SCHMITTEL et al., 1995; CREERY et al., 1996). Como em nossos experimentos não foi observada alteração na produção de IL-10 com os tratamentos em 24 e 48 h, acreditamos que a própolis possa atuar em outras vias intracelulares envolvidas no processo de expressão gênica e transcrição desse marcador.

Novamente o quimioterápico não alterou a porcentagem de células expressando CD80, o que está de acordo com dados da literatura utilizando células dendríticas e células mieloides supressoras murinas (NAKASHIMA et al., 2005; KODUMUDI et al., 2010).

Quanto ao TLR-2 e TLR-4, não observamos alterações significativas na expressão desses receptores induzida pelos tratamentos por 24 h (Figuras 11 e 12) nem por 48 h (dados não apresentados). Todavia, podemos observar uma tendência de redução da intensidade de fluorescência de TLR-2 nas células tratadas com docetaxel, o que indica que esse quimioterápico possa atuar de maneira inibitória sobre a intensidade de expressão dessa molécula na superfície dos monócitos. Tal diminuição foi revertida quando o docetaxel foi utilizado concomitantemente com a própolis.

Figura 11. Porcentagem (%) de monócitos que expressam TLR-2 e intensidade mediana de fluorescência (MIF) de TLR-2 após incubação com meio de cultura (controle - C), própolis (P - 25 µg/mL), docetaxel (D - 10 nM), sua combinação (P+D), e LPS (5 µg/mL) por 24 h. Os dados representam a média e desvio-padrão de 5 indivíduos (P > 0,05).

21 Figura 12. Porcentagem (%) de monócitos que expressam TLR-4 e intensidade mediana de fluorescência (MIF) de TLR-4 após incubação com meio de cultura (controle - C), própolis (P - 25 µg/mL), docetaxel (D - 10 nM), sua combinação (P+D), e LPS (5 µg/mL) por 24 h. Os dados representam a média e desvio-padrão de 5 indivíduos (P > 0,05).

A respeito da expressão de TLR-4, ensaios de nosso grupo observaram o papel modulador da própolis sobre este receptor quando o apiterápico foi utilizado em concentrações mais baixas do que a utilizada neste projeto (SANTIAGO et al., 2016).

Compostos fenólicos existentes na própolis podem interagir com lipídios na membrana celular por adsorção física e adentrar no citoplasma inespecificamente (CIGUT et al., 2011). Assim, alguns componentes presentes na própolis podem agir sobre a expressão de moléculas de superfície, induzindo sua produção e expressão, bem como se associando a elas. Deste modo, trabalhos anteriores de nosso laboratório avaliaram possíveis alvos de ligação de componentes da própolis, bloqueando os receptores TLR-2 e TLR-4 em monócitos humanos. O bloqueio destes receptores seria uma das maneiras de avaliar se a ação da própolis e dos compostos isolados seria dependente destes receptores celulares, já que constituintes poderiam se ligar a estes e exercer sua atividade biológica. Nestes ensaios, a produção de TNF-α e IL-10 induzida pela própolis e pelos ácidos cinâmico e cafeico foi inibida somente pelo anticorpo monoclonal anti-TLR-4 (CONTI et

al., 2013; BÚFALO et al., 2014). Os resultados obtidos sugeriram que o TLR-4 é um possível

alvo de ligação desses componentes. Todavia, outros receptores de superfície também podem estar envolvidos na ação dos constituintes da própolis, tais como a dectina-1, o receptor de manose (MR), receptor para o sistema complemento (CR), entre outros, os quais são capazes de reconhecer produtos microbianos, levando à estimulação da fagocitose, atividade microbicida e

22 produção de citocinas, como também de se ligar a constituintes de produtos naturais (UNDERHILL & OZINSKY, 2002).

É importante destacar que as atividades da própolis apresentadas neste trabalho são características de nossa amostra de própolis, cuja composição química já foi devidamente analisada (BANKOVA et al., 1998; CONTI et al., 2015b). Vale ressaltar que é sempre necessário associar os achados biológicos à composição química da amostra de própolis que está sendo estudada, pois outras amostras com outras características químicas podem apresentar resultados distintos dos aqui apresentados. Assim, como não há ainda uma padronização universal quanto aos ensaios com própolis, o recomendado é investigar e relacionar os resultados obtidos com amostras devidamente caracterizadas (SFORCIN & BANKOVA, 2011; SFORCIN, 2016).

5. Alterações no cronograma e dificuldades encontradas na execução do projeto até o presente momento:

Infelizmente, houve atraso no desenvolvimento do projeto como um todo, ocasionado por problemas com as células de câncer de próstata LNCaP (contaminação) e atraso na entrega de materiais importados essenciais ao projeto. Todos estes contratempos nos impossibilitaram de iniciar os ensaios centrais do projeto conforme cronograma estabelecido previamente.

Nesse momento vale ressaltar que os problemas com as células LNCaP foram sanados, portanto gostaríamos de retomar o projeto inicial e finalizarmos a contento o estágio de pós-doutoramento.

6. Plano de atividades para o próximo período

Após a entrega deste relatório, iniciaremos as seguintes etapas:

 Ensaios de viabilidade (MTT) após tratamento das células LNCaP;

 Ensaios de tipo de morte celular (citometria de fluxo) após tratamento das células LNCaP e células MCF-7;

 Avaliação do efeito do sobrenadante de monócitos tratados sobre a proliferação de células LNCaP e MCF-7.

 Padronização e execução dos ensaios de migração e invasão celular das linhagens LNCaP e MCF-7.

23 7. Atividades desenvolvidas pelo bolsista

7.1. Participação em eventos científicos e cursos

 Workshop “Redação de Patentes, Além dos Guias + Oficinas Práticas”, realizado no Salão Nobre da Faculdade de Medicina da UNESP de Botucatu, nos dias 14 e 15 de fevereiro de 2019 com carga horária de 11 horas.

 7th

Annual Meeting of the International Cytokine & Interferon Society, realizado em Viena, Áustria, no período de 20 a 23 de outubro de 2019.

 Avaliador no VII ENCISE - Encontro Científico e Simpósio de Educação do

UniSALESIANO, “EDUCAÇÃO: As Asas da Transformação”, realizado em Lins, Brasil,

no período de 07 a 11 de outubro de 2019.

 XLIV Congress of the Brazilian Society of Immunology. Immunotherapy: recent advances and future for therapeutic interventions – IMMUNO 2019, realizado em Florianópolis, Brasil, no período de 29 de setembro a 02 de outubro de 2019.

 Treinamento teórico/prático de preparo de bibliotecas para NGS: RNAseq. Realizado no IBTec da UNESP de Botucatu, Brasil, nos dias 23 e 24 de Julho de 2019 com carga horária de 16 horas.

7.2. Trabalhos apresentados em eventos científicos

 SANTIAGO, K. B.; CARDOSO, E. O.; CONTI, B. J.; CONTE, F. L.; OLIVEIRA, L. P. G.; TASCA, K. I.; ROMAGNOLI, G. G.; GOLIM, M. A.; CRUZ, M. T.; SFORCIN, J. M. Propolis may affect human CD4+ T cells differentiation induced by MAGE-1-treated dendritic cells. 7th Annual Meeting of the International Cytokine & Interferon Society, realizado em Viena, Áustria, no período de 20 a 23 de outubro de 2019.

 CARDOSO, E. O.; SANTIAGO, K. B.; CONTE, F. L.; RODRIGUES, J. C. Z.; TASCA, K. I.; ROMAGNOLI, G. G.; BASTOS, J. K.; SFORCIN, J. M. Propolis drives human monocytes to a pro-inflammatory action during the treatment with docetaxel. 7th Annual Meeting of the International Cytokine & Interferon Society, realizado em Viena, Áustria, no período de 20 a 23 de outubro de 2019.