Figura 5 – Fotomicrografias de cortes de rim cefálico mostrando: a) agregados de células linfóides positivas para células T (*). Barra - 100 µm; b) em maior aumento acúmulo de linfócitos imunopositivos para células T; c) macrófagos positivos para CD68 (seta) ; d) células da linhagem granulocítica positivas para lisozima (seta).
Figura 6 - Fotomicrografias de decalques de rim cefálico mostrando: a) proeritroblasto (Pe), eritroblasto basófilo (EB) e eritroblasto policromático (EP); b) eritroblasto ortocromático (EO) e eritrócitos maduros (Er); c) quatro reticulócitos mostrando precipitado de cor azul no citoplasma; d) Progranulócito (Gb); e) metagranulócito neutrófilo (MN) e neutrófilo (Nt); f) prolinfócito (PL) e neutrófilo (Nt); g) linfoblasto (Lb), linfócitos (Lf) e dois eritrócitos; h) monoblasto (Mb); i) monócito com núcleo reniforme; j) monócito circundado por sete linfócitos; l,m) tromboblasto (Tb); n) trombócito (Tr). Rosenfeld.
Figura 7 – Fotomicrografias de decalques de rim cefálico mostrando: Granulócitos jovens (GJ) e maduros (GM) positivos para: a) PAS, b) Sudan Black B, c) Mieloperoxidase; d) Fosfatase Ácida positiva em células das linhagens granulocítica (N), monocítica (M), linfocítca (L) e trombocítica (T); e) Esterase positiva em células das linhagens granulocítica (N), monocítica (M) e linfocítca (L), f) trombócito (T) positivo para esterase com fluoreto.
Figura 8 – Eletromicrografias de rim cefálico mostrando: a) processos de células mesoteliais (seta); tecido conjuntivo ({) contendo parte do citoplasma de mastócito (M) repleto de grânulos elétron-densos (g), fibras nervosas amielínicas (FN); células reticulares do tipo fibroblasto (CRF) e processos celulares (*) na região subcapsular; b) axônio em maior aumento repleto de neurofilamentos (Nf) e microtúbulos (Mt); c) parte de uma célula mesotelial evidenciando projeções citoplasmáticas (seta), pinocitose (cabeça de seta cheia), vesículas pinocíticas (v), grânulos elétron-densos (seta vazia), retículo endoplasmático rugoso (REG), mitocôndria (m).
Figura 9 – Eletromicrografia do rim cefálco mostrando célula reticular do tipo macrófago (CRM) apresentando núcleo eucromático (N), nucléolo (n) evidente, mitocôndrias (m), vesículas (ponta de seta), vacúolos (v) e grânulos (seta), linfócito (Lf) apoiado em uma célula reticular do tipo macrófago.
m v v v * a CRM N n Lf
Figura 10 – Eletromicrografias de rim cefálico mostrando: a) cinco linfócitos (Lf) apoiados em um macrófago (M); b) macrófago (M) com núcleo (N) chanfrado, citoplasma contendo lisossomos (seta) de tamanhos e densidades variadas, fagolisossomos (*); c) centro melano-macrofágico revestido por uma cápsula citofibrilar ({), melano-macrófagos com grânulos esféricos compactados no citoplasma, elétron-densos e de tamanhos diferentes.
Lf
Lf
Lf Lf
Figura 11 – Eletromicrografias de rim cefálico mostrando: a) proeritroblasto; b) eritroblasto basófilo; c) eritroblasto policromatófilo; d) eritrobalsto ortocromático; e) eritrócito jovem; f) eritrócito maduro; g) microtúbulos marginais (seta) de eritrócito maduro.
Figura 12 – Eletromicrografias de rim cefálico mostrando: a) três metagranulócito neutrófilo (MN e seta) contendo grânulos elétron-densos (G); b) neutrófilo contendo grânulos elétron-densos grandes (G) e pequenos (seta); c) linfócitos com variação morfológica do núcleo e presença de grânulo (seta).
Figura 14 – Eletromicrografias de rim cefálico mostrando: a) monoblasto contendo grânulos elétron-densos (seta); b) monócito com núcleo de chanfrado acentuada e citoplasma vacuolizado (V).
Figura 15 – Eletromicrografias de rim cefálico mostrando: a) tromboblasto evidenciando um vacúolo (V) desenvolvido e SCCS (seta); b) trombócito mostrando vacúolo (V) e SCCS (seta).
,m
a
V
V
Estudos recentes mostram considerável interesse em pesquisar os diferentes aspectos do RC em peixes teleósteos, especialmente aqueles relacionados com a estrutura e os aspectos morfo-citoquímicos, histoquímicos, imunohistoquímicos e ultra-estruturais de seus componentes estromais e celulares (Romano et al. 2002; Petrie-Hanson & Peterman, 2005; Fischer & Koellner 2007). Apesar disso, os estudos disponíveis na literatura que abordam estes aspectos ainda são incompletos (Smith et al. 1970; Zapata, 1983; Tatner & Manning, 1985; Zuasti & Ferrer, 1989; Meseguer et al. 1995; Fijan, 2002; Romano et al. 2002; Petrie-Hanson & Peterman, 2005; Fischer & Koellner 2007). Os nossos resultados permitem caracterizar a estrutura anatômica, os constituintes citofibrilares do estroma, as células das séries eritrocítica, granulocítica, linfocítica, monocítica e trombocítica e a distribuição topográfica dos leucócitos no RC em C. parallelus.
A localização anatômica do RC em C. parallelus é semelhante àquela observada em todas as demais espécies de peixes teleósteos (Romano et al. 1997, Press & Even 1999). No entanto, a estrutura anatômica do RC com divisão em duas porções, isto é, bilateral observado em C. parallelus, bem como na maioria dos peixes, difere daquela dos salmonídeos, que apresentam o rim como um único órgão (Press & Evensen 1999).
Histologicamente, o RC de C. parallelus apresenta uma delgada cápsula de tecido conjuntivo constituído por fibras de colágeno I e III coradas pelos métodos de Tricrômio de N.M.C e Gomori respectivamente (Castro & Camargo, 1951; Gomori, 1936). Estes métodos seletivos para colágeno demonstram também que o estroma deste órgão é constituído por uma fina trama de fibras reticulares onde um elevado número de células do parênquima é sustentado, formando um verdadeiro tecido hematopoiético. Esta trama fibrilar parece ser comum no RC de todos os teleósteos e presente também em outros tipos de órgãos com função hematopoiética encontrados em condrictes (Sailendri & Muthukkaryppan 1975; Sorensen et al 1997; Pacheco et al. 2002).
Já em relação ao aspecto estrutural do parênquima do RC de C. parallelus, foi possível evidenciar agregados de células linfóides pequenas, concentrados ao redor dos vasos sangüíneos e dos CMMs, também observado em outras espécies de peixes
(Agius, 1980; Press et al. 1994; Romano et al. 1997). No entanto, informações sobre a identificação e caracterização de sub populações desses linfócitos nestes agregados, especialmente para linfócitos T ainda são limitadas (Press et al. 1994; Romano et al. 1997; Fournier-Betz et al. 2000; Romano et al. 2007). Os nossos resultados imunohistoquímicos permitem identificar populações de linfócitos T imunopositivos para o antígeno CDRO45 nos agregados linfóides, em disposição nodular. Além do mais foram observados populações de linfócitos imunonegativos, indicando possivelmente a presença também de linfócitos B. Entre as células que constituem esses agregados e que circundam os mesmos, foram observados macrófagos, monócitos e seus precursores com forte imunopositividade para CD68 e células da linhagem granulocítica em diversas fases de maturação, positivas para lisozima e PAS. O arranjo estrutural entre o sistema vascular e os CMMs, rodeados por agregados linfóides com presença de células monócitos/macrófagos e granulócitos, reforça o significado imunológico deste órgão, relacionado à resposta imune inata, apresentação de antígenos, memória imunológica e produção de anticorpos (Lamers & Haas 1985; Imagawa et al. 1990; Press et al. 1996; Kollner et al. 2001). Por outro lado, estes anticorpos monoclonais poderão ser utilizados em pesquisas relacionadas a questões básicas que permanecem ainda sem respostas tais como ao local de origem das linhagens dos monócitos, granulócitos e linfócitos (cells B e T) e o período em que estas células se tornam imunocompetentes.
Acredita-se que o RC em peixe teleósteo é equivalente a medula óssea de mamíferos (Sailendri & Muthukkaruppan, 1975; Fanger, 1982; Mesenguer et al. 1995; Petrie-Hanson e Ainswortho 2000) e os nossos resultados morfo-citoquímicos obtidos na análise de decalques confirmam este fato ao demonstrar a presença de células das séries eritrocítica, granulocítica, monocítica, linfocítica e trombocítica neste órgão. Os critérios utilizados neste estudo para caracterizar as fases de maturação celular foram baseados nos aspectos morfológicos e nas propriedades tintoriais e citoquímicas, conforme descritos por Fijan (2002). De modo geral os estágios de maturação das linhagens celulares observados neste estudo correspondem àqueles descritos em várias espécies de peixes (Mahajan & Dheer 1980; Maiti et al. 2000; Fijan, 2002). No entanto, vale ressaltar que os resultados morfo-citoquímicos revelam que em relação à série granulocítica foi observado fases de diferenciação de apenas um único tipo de granulócito no RC de C. parallelus, correspondente ao neutrófilo.
hematopoiético, linfóide e endócrino, semelhante àqueles observados por Roberts, 1989; Imagawa et al. 1996. A ausência de túbulos renais no RC em C parallelus, assim com em outros teleósteos (Weinreb, 1963; Cannon et al. 1980; Zuasti & Ferrer, 1988), reflete a origem pronéfrica do RC, no qual se formam os primeiros túbulos durante a ontogenia e regridem quando o rim médio e caudal assume a função de órgão excretor (Zapata, 1979; Imagawa, 1994).
O presente estudo descreve pela primeira vez em peixe teleósteo, as características ultra-estruturais da cápsula e sua inter-relação com as células reticulares subcapsulares do RC em peixe. Assim, a cápsula mostra-se constituída por uma delgada camada de tecido conjuntivo revestido por uma camada de células mesotelias. As características ultra-estruturais das células mesoteliais sugerem um processo ativo de transcitose associado com alta permeabilidade para solutos.
A rede citofibrilar estromal do RC de C. parallelus é composta por células endoteliais, células reticulares (do tipo fibroblasto e do tipo macrófago), macrófagos, MMs e fibras reticulares. As células endoteliais e uma camada externa de células reticulares, formam assim um limite entre o tecido hematopoiético e o sangue, além do mais existem extensas áreas de contato entre as células endoteliais ou reticulares com as células hematopoiéticas, semelhante àquela descrita em outros teleósteos (Meseguer et al. 1991; Imagawa et al. 1994) e àquela do padrão do estroma hematopoiético de mamíferos (Weiss & Sakai 1984). Os dois tipos de células reticulares encontradas neste estudo apresentam características ultra-estruturais semelhantes àquelas observadas em outros peixes (Meseguer et al. 1995) e mamíferos (Bainton, 1985). Na região subcapular, observa-se uma camada de células reticulares do tipo fibroblasto. A partir desta região as mesmas se distribuem em toda extensão do tecido hematopoiético, associadas as células reticulares do tipo macrófago, formando uma rede de sustentação mecânica das células hemtopoiéticas. Além do mais, as células reticulares do tipo fibroblasto apresentam características ultra-estruturais típicas de células que sintetizam colágeno. Já as células reticulares do tipo macrófago apresentam características que lhes permitem exercer função associada a remoção de partículas e células senescentes, conforme descrito previamente por Zapata 1983, Mesenguer et al. 1995. Diante destas observações é possível admitir que ambas as células reticulares possam contribuir decisivamente na formação de um microambiente hematopoiético adequado no RC de C. parallelus.
O RC em peixes teleósteos parece ser a principal fonte de produção de macrófagos (Braun-Nesje et al. 1981). No RC de C. parallelus foram identificados tanto monócitos quanto macrófagos ao redor dos CMMs. A presença destes fagócitos ao redor destes centros e sua atividade de fagocitose de partículas também foram descritas por Press & Evensen 1999; Romano et al. 2002. Além do mais, foi observada a presença de vários linfócitos ao redor de CMMs e também intimamente associados a um único macrófago. Esta relação célula-célula reforça novamente a hipótese de que realmente tanto os macrófagos quanto os CMMs participam como células apresentadoras de antígenos (Lamaers & Haas 1985, Press & Evensen 1999).
As observações realizadas ao microscópio eletrônico do parênquima hematopoiético do RC de C. parallelus permitiram caracterizar diversos estágios de maturação em todas as linhagens celulares: eritropoiese, granulopoiese, linfopoiese, monopoiese e trombopoiese, fases também observadas ao microscópio de luz. Este tipo de estudo que integra os aspectos morfo-citoquímicos e ultra-estruturais, permite caracterizar de forma inequívoca as linhagens celulares do tecido hematopoiético, de difícil diferenciação especialmente entre as linhagens dos linfócitos e trombócitos (Rowley et al. 1988) e dos neutrófilos e monócitos (Weinreb 1963; Cannon et al., 1980).
As mudanças ultra-estruturais básicas observadas durante a maturação das células da série eritropoiética em C parallelus foram descritas também em outras espécies de peixes (Yammamoto & Iuchi 1975; Zapata, 1980; Fanger, 1986; Zuasti et al. 1989). No entanto, a presença de bandas de microtúbulos marginais identicadas no citoplasma de eritrócitos em C parallelus não foram observadas em Sparus auratus (Zuasti et al. 1989).
Quanto à granulopoiese, foi possível identificar no RC de C parallelus apenas as fases de maturação do neutrófilo. A presença de uma única série de células granulocíticas no RC não é uma característica comum em peixes teleósteos, com exceção de alguns peixes que apresentam uma ou duas séries de células granulocíticas (Cannon et al. 1980; Savage, 1983; Hightower et al., 1984) a grande maioria dos teleósteos apresentam três séries (Fey, 1966; Zapata, 1979; Fanger, 1986; Zuasti et al. 1988; Messeguer et al. 1990; Romano et al. 2002).
Existe uma grande controvérsia em relação a existência de um ou dois tipos de grânulos no citoplasma dos granulócitos em teleósteo, especialmente do granulócito neutrófilo (Fey, 1966; Cannon et al. 1980; Zuasti & Ferrer, 1988; Messeguer et al. 1990). No presente estudo foram observados dois tipos de grânulos citoplasmáticos
grânulo de aspecto esférico, elétron-denso com a região central elétron-lúcida foi observado primeiro na fase progranulócito, enquanto que o grânulo de aspecto esférico, pequeno, comparativamente dezenas de vezes menor foi observado somente nas fases de metagranulócito neutrófilo e neutrófilo maduro. Estas observações são compatíveis com as descrições realizadas em outros peixes teleósteos (Cannon et al. 1980; Savage, 1983). Por outro lado, Zuasti & Ferrer, 1988 observaram apenas um único tipo de grânulo em heterófilo de Sparus auratus. Bielek (1981) relata que um tipo de grânulo citoplasmático morfologicamente homogêneo pode apresentar características citoquímicas diferentes.
Em relação às células da série linfóide em C parallelus, foram identificadas apenas duas fases de maturação celular, semelhantes àquelas observadas em outras espécies de peixes (Savege, 1983; Zuasti & Ferrer 1989). Além do mais, alguns linfócitos observados no RC de C. parallelus apresentam grânulos citoplasmáticos, enquanto aqueles observados em Sparus auratos, Pleuronectes platessa, Fundulus heteroclitus não apresentaram grânulos (Ferfuson, 1976; Hightonwer et al., 1984; Zuasti & Ferrer, 1989). Observou-se ainda a presença de plasmócitos no RC de C. parallelus com características estruturais semelhantes àquelas de plasmócitos de vertebrados ectotérmicos (Campbell, 1970; Zapata & Solas 1979; Zapata, 1980; Kilarsky & Plytycz 1981;). A dilatação acentuada da cisterna do reticulo endoplasmático rugoso é uma das características mais importante desta célula. A presença desta célula no RC de C.
parallelus reforça a idéia de que o RC em teleósteos representa um sítio de
proliferação de linfócitos B (Romano et al., 1997) e de produção de imunoglobulina (Chiller et al., 1969; Smith et al. 1970).
A literatura consultada apresenta relatos incompletos sobre os aspectos ultra-estruturais da série monocítica no RC de peixes teleósteos (Zuasti & Ferrer 1989; Messeguer et al. 1991; Romano et al. 2002). Estes estudos descrevem unicamente a presença de monócitos no RC deste animal, sem relatar a presença de monoblastos. No entanto, no presente estudo foi possível identificar tanto monoblastos quanto monócitos no RC de C. parallelus.
Quanto à trombopoiese em C. parallelus verificou-se que durante a maturação celular ocorre um aumento da condensação nuclear e do desenvolvimento do SCCS, semelhante as observações realizadas por Zapata, 1980; Esteban et al. 1989 e Zuasti et al. 1989.
4.1.6 Conclusão
Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que o RC de C.
parallelus é um órgão fundamentalmente hematopoiético (eritropoiese, granulopoiese,
linfopoiese, monocitopoiese e trombopoiese), com características morfo-citoquímicas e ultra-estruturais semelhantes àquelas observadas na medula óssea de mamíferos; as reações imunohistoquímicas podem ser utilizadas para identificar e caracterizar a distribuição topográfica das células das linhagens granulocítica, monocítica e de linfócitos em tecidos linfóides e hematopoiéticos em peixes teleósteos.
4.1.7 Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) do Ministério da Educação, Ciência e Cultura, Brasil.
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em robalo (Centropomus parallelus): variação sazonal, sexo e maturação gonadal” Aceito pela revista “Aquaculture” (vide anexo 3)
Hematological parameters and phagocytic activity in fat snook (Centropomus
parallelus): seasonal variation, sex and gonadal maturation
Antenor Aguiar Santosa,*,**, Maria José T. Ranzani-Paivac, Yara Julianod, Mizue I. Egamib*
a
UNIFESP/EPM, SP, Brazil; Morphology Department and Laboratory of Environmental Impact and Histopathology –Adventist University Center of São Paulo – UNASP, Brazil bMorphology Department – Histology Division and Comparative Hematology Laboratory - UNIFESP-EPM, SP, Brazil
c
Fishery Institute, Av. Francisco Matarazzo, 455 CEP 05001-900, São Paulo, SP, Brazil d School of Medicine of Sto Amaro – UNISA.
* Federal University of São Paulo – Paulista School of Medicine, Brazil – mail code: 04023-4000
**Author to whom correspondence should be addressed. Tel.: +55-11-58165630; fax: +55-11-55764268; e-mail: antenor.aguiar@terra.com.br
4.2.1 Resumo
O objetivo deste trabalho foi estabelecer os valores hematológicos e avaliar a capacidade fagocítica de macrófagos peritoneais do robalo relacionando sexo, estádio de maturação gonadal e ciclo sazonal. Os resultados hematológicos não mostraram diferenças significantes entre machos e fêmeas. Quanto ao estádio de maturação gonadal, verificou-se que somente os valores de eritrócitos (Er), em fêmeas, se mostraram significantemente elevados no estádio III (em maturação) e diminuídos no estádio V (esgotado). A análise dos resultados da série eritrocítica, leucocítica, trombócitos e atividade fagocítica relacionada ao sexo e ao ciclo sazonal mostrou diferenças estatisticamente significantes: a) em machos hematócrito (Ht) e hemoblobina (Hb) elevados na primavera e baixos no inverno; b) em ambos os sexos o volume corpuscular médio (VCM) altos na primavera e verão e baixos no outono; c) em fêmeas, trombócitos elevados no outono e baixos nas demais estações; d) em ambos os sexos capacidade fagocítica (CF) e índice fagocítico (IF) elevados no verão e baixos no inverno. Os resultados mostraram que a primavera e verão correspondem às estações do ano de melhor resposta hematológica e fagocítica para a sobrevivência do robalo em seu habitat natural. Os parâmetros estudados poderão ser utilizados, para a manutenção e controle desta espécie na criação em cativeiro.
Dentre as inúmeras espécies de peixes marinhos nativas do Brasil uma das que se destaca é a do robalo Centropomus parallelus, pelo seu grande interesse comercial e elevado consumo como fonte alimentar. Além do mais, essa espécie apresenta muitos aspectos biológicos favoráveis à aqüicultura: é um peixe euriahalino, estuarino-dependente, tem hábitos gregários, é tolerante a altas densidades, resistente a água eutrofizada, crescimento rápido, eficiente na conversão alimentar em biomassa e resistente a doenças (Tucker, 1998; Cerqueira and Tsuzuki 2009). C parallelus pertence à família Centropomidae, sendo encontrada desde a Flórida até a Argentina, nas Américas Tropical e Subtropical, incluindo o Leste da América Central, ou seja, Caribe, Cuba e Porto Rico (Patrona, 1984; Rivas, 1986; Muhlia-Melo, 1995). Estudos relacionados aos hábitos alimentares, à biologia reprodutiva e ao desenvolvimento ou cultivo desse animal, vem sendo conduzido em várias regiões tropicais e subtropicais (Temple et al., 2004; Alves et al., 2006; Tsuzuki et al., 2007). Apesar dessa espécie apresentar grande potencial que permite a criação em cativeiro, ainda faltam dados que aportem os conhecimentos biológicos básicos necessários ao seu cultivo ideal. Por exemplo, não foram encontrados estudos relacionados aos aspectos hematológicos, aos mecanismos de resistência natural bem como do sistema imune, particularmente quando relacionados às variações sazonais.
Sabe-se que em peixes as variações sazonais desafiam os mecanismos próprios de sobrevivência ou de aclimatação principalmente no inverno, quando a resposta imune específica destes animais sofre supressão e como conseqüência esses animais se tornam amplamente susceptíveis a patógenos oportunistas (Mann and Huang 2000). Por exemplo, o pargo, Sparus aurata, quando criado ao longo da costa do Mediterrâneo, foi acometido por uma condição patológica conhecida como “doença do inverno” ou “síndrome do inverno”, caracterizada por provocar lesão significante durante as estações frias (Tort et al., 1998). Os Centropomidae, quando expostos a temperaturas inferiores a 14oC deixam de se alimentar, perdem o equilíbrio e morrem (Hawells nd SansKi 1990). Nesse sentido o conhecimento das respostas hematológicas e imunológicas ao longo das estações sazonais poderia contribuir na avaliação da resistência contra doenças infecciosas, principalmente em épocas frias e com isso possibilitar, provavelmente, o aumento da taxa de sobrevivência e diminuir o período e o custo necessário para o cultivo (Hart and Purser, 1996; Le Morvan, Troutaud and
