Alexandre dos Santos Rodrigues

Alexandre dos Santos Rodrigues

Modulação da ERK 2 (p42 MAPK) por receptores de adenosina em

células gliais da retina de aves:

Envolvimento na captação celular do nucleosídeo

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A

OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS (BIOFISICA)

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2006

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

UFRJ

Modulação da ERK 2 por receptores de adenosina em células gliais da retina: Envolvimento na captação celular do nucleosídeo

ALEXANDRE DOS SANTOS RODRIGUES

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), IBCCF, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica).

Orientador: Prof. Roberto Paes de Carvalho

Rio de Janeiro Outubro/2006

Rodrigues, Alexandre dos Santos

Modulação da ERK 2 por receptores de adenosina em células gliais da retina: Envolvimento na captação celular do nucleosídeo / Alexandre dos Santos Rodrigues. Rio de Janeiro: UFRJ, IBCCF0 , 2006.

Vi, 68f.

Orientador: Prof. Roberto Paes de Carvalho

Dissertação (Mestrado) – UFRJ/ IBCCF0 /Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2006.

Referências Bibliográficas: f.

1. Adenosina . 2. MAPK. 3. Células Gliais. 4. Retina. I. Paes-de-Carvalho, R. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica). III. Título.

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Neurobiologia Celular, pertencente ao Departamento de Neurobiologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense sob orientação do Prof. Roberto Paes de Carvalho e na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e pelo Programa de Núcleos de Excelência (PRONEX-MCT).

Procure os seus caminhos, mas não magoe ninguém nessa procura. Arrependa-se, volte atrás, peça perdão! Não se acostume com o que não o faz feliz, revolte-se quando julgar necessário. Alague seu coração de esperanças. Se achar que precisa voltar, volte! Se perceber que precisa seguir, siga! Se estiver tudo errado, comece novamente. Se estiver tudo certo, continue. Se sentir saudades, mate-a. Se perder um amor, não se perca! Se o achar, segure-o!

Dedico este trabalho, especialmente, aos meus pais e meu tio João Carlos, que sempre me apoiaram nesta longa jornada e em outras etapas de minha vida com seus comportamentos e incentivos.

Ao meu orientador, Roberto Paes de Carvalho, ao meu ex-orientador Luiz Roberto Leão Ferreira e à aluna Jainne Martins Ferreira, que sempre contribuíram e ainda contribuem para o meu crescimento como pesquisador e como pessoa, pelos ensinamentos e pela demonstração de seriedade e determinação na pesquisa científica.

AGRADECIMENTOS

Ao Roberto Paes de Carvalho, meu orientador, por ter me ajudado a “andar” no trilho certo da pesquisa e por ter me ajudado nos momentos difíceis.

Ao Luiz Roberto Leão Ferreira, ex-orientador de Iniciação, que contribui até hoje com conversas que são bem realistas e nas quais procura demonstrar a melhor maneira de enfrentar a vida acadêmica.

À Jainne Martins Ferreira, uma pessoa de grande coração, bem inteligente, sempre disposta a ajudar e discutir algo e que foi fundamental e colaboradora nos

experimentos de captação de adenosina.

À Ana Lúcia Marques Ventura, chefe do Laboratório de Neuroquímica (UFF), por manter uma colaboração estreita com o Laboratório de Neurobiologia Celular e estar sempre aberta para discussões sobre a pesquisa científica.

Aos professores do Departamento de Neurobiologia (UFF), por lutarem pelo crescimento do departamento, apesar das diversas restrições burocráticas e/ou financeiras e estimularem a cooperação por saberem da sua importância para o melhor andamento da pesquisa científica nos dias atuais, visto que os investimentos ainda são bem abaixo do esperado, e seguirem no desenvolvimento da formação de novos talentos.

Aos colegas do Laboratório de Neurobiologia Celular e do Departamento, por

manterem um clima de harmonia e pelos grandes momentos de alegria. Gostaria de fazer um agradecimento especial ao ex-aluno de Iniciação Científica Igor Luís Araújo da Silva, que iniciou este projeto e colaborou firmemente para eu alcançar este momento.

Aos colegas de laboratório e departamento:

Daniel e Pablo, grandes pessoas, que estão sempre dispostas a ajudar e mais do que isso são batalhadores pois lutam e brigam bastante por seus objetivos e pelo coletivo.

Rochele e Rodrigo, que são ex-alunos do lab, que contribuíram em discussões do lab e eram bem descontraídos.

Cristiane, colega de lab e prédio, super tranqüila e também uma pessoa super agradável na convivência diária.

E a todos os colegas e ex-colegas do lab Mariana, Octávia, Marcelo, Camila, Renato, Márcia, Raquel, Luciane, Telmo, Karin, Vivian, Orlando, Rafael, Tatiane e Elisa.

Ao apoio técnico de Luzeli, figura ímpar e da técnica anterior, Elaine. Aos professores com os quais tive aula ao longo do curso deste Mestrado,

especialmente do curso de Bases Bioquímicas da Transmissão Sináptica, que foi muito proveitoso e onde pude adquirir novas conhecimentos e amizades.

Aos colegas de Pos-graduação, em especial Brian Njaine, Eduardo Sequerra, Juliana Adão e Bernardo Stutz que contribuíram de diferentes maneiras com a amizade e a aprendizagem.

Aos meus amigos mais próximos Camila, Fábio, Fabrício, Francisco, Liana e Talita.

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES xii

LISTA DE ABREVIATURAS xiv

RESUMO xvi ABSTRACT xvii

1. INTRODUÇÃO 01

1.1 Metabolismo e transporte de adenosina através da membrana

01

1.2 Receptores de adenosina 05

1.3 Papéis fisiológicos da adenosina no sistema nervoso 07

1.4 MAPKs 08

1.4.1 ERKs 09

1.4.2 ERK 5 11

1.4.3 SAPKs 11

1.5 Regulação das ERKs por adenosina 13

1.6. Retina, um modelo biológico de estudo 14

1.7 Adenosina na retina 16

1.8 Captação de adenosina e regulação por vias de sinalização

18

2. OBJETIVOS 20

3. METODOLOGIA 21

3.1 Materiais 21

3.2 Obtenção de culturas mistas de embrião de pinto 21 3.3 Obtenção de culturas purificadas de glia de retina de

embrião de pinto

22

3.4 Preparo das amostras celulares para análise em gel de poliacrilamida

22

3.5 Fracionamento em gel desnaturante de poliacrilamida e transferência das proteínas para membrana PVDF

23

revelação do western blot

3.7 Experimentos de captação de [3H] adenosina 24

3.8 Análise estatística 24

4. RESULTADOS 25

4.1 Provável liberação de adenosina por células gliais e estimulação basal da fosforilação de ERK 2

28

4.2 Caracterização da fosforilação da ERK 2 por receptores de adenosina

31

4.3 A fosforilação de ERK 2 induzida por receptor A1 de

adenosina é mediada pela via clássica de fosforilação das MAPKs

35

4.4 Envolvimento de PKC e Src na via de sinalização

elicitada pelo receptor A1 na ativação de ERK 2 em culturas

purificadas de células gliais

35

4.5 Transportadores de adenosina: um alvo direto para a fosforilação da ERK 2 38 5. DISCUSSÃO 46 6. CONCLUSÕES 54 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 55 23

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ESQUEMA 1: Representação esquemática do ENT1 humano (A) e do CNT1 humano (B) (Retirado de Podgorska et al., 2005)

02

ESQUEMA 2: Vias do metabolismo celular da adenosina (Modificado a partir de Latini e Pedata, 2001)

05

ESQUEMA 3: Representação esquemática deduzida da seqüência de aminoácidos do receptor A1 de adenosina

(Siegel, GJ et al., Livro Basic Neurochemistry, 1999)

06

ESQUEMA 4: Vias de sinalizações simplificadas das MAP kinases (Modificado de

http://www.bch.msu.edu/faculty/gallo/mapk-pathways-new.jpg)

09

ESQUEMA 5: Possíveis vias de sinalizações ativadas por p38 na regulação da diferenciação e sobrevivência neuronal (Retirado de Takeda e Ichijo, 2002)

12

ESQUEMA 6: Representação da estrutura laminar da retina (Retirado de

www.pime.iit.edu/DrJennifer/images/Retina- icon.jpg)

15

ESQUEMA 7: Modelo esquemático de uma possível via de sinalização ativada pelo receptor A1

53

FIGURA 1: Neca induz aumento da fosforilação da ERK em culturas de células gliais

26

FIGURA 2: Neca induz aumento transiente da fosforilação da

FIGURA 6: Efeito do DPMA na fosforilação da ERK nas células gliais em cultura

33

FIGURA 7: Inibição da ERK em células gliais por ativação do receptor A2a é dose dependente

34

FIGURA 8: Inibição da MEK por PD 98059 em células gliais bloqueou o estímulo na ERK induzido por ativação do receptor A1

36

FIGURA 9: Efeitos do PP1 e da Cheleritrina (CHE) na fosforilação da ERK em culturas de células purificadas de glia

37

FIGURA 10: Curva de adenosina não-marcada em culturas mistas

39

FIGURA 11: Curva de adenosina não-marcada em culturas purificadas de glia

40

FIGURA 12: Efeito do PD 98059 na captação de adenosina em culturas mistas, purificadas de glia e purificadas de neurônios

42

FIGURA 13: O efeito do U0126 na captação de adenosina em culturas mistas é dose dependente

43

FIGURA 14: Curva de (3H)-Adenosina com diferentes concentrações de adenosina não-marcada na presença ou ausência de U0126 em culturas de células mistas

44

FIGURA 15: Curva de (3H)-Adenosina com diferentes concentrações de adenosina não-marcada na presença ou ausência de U0126 em culturas purificadas de glia

LISTA DE ABREVIATURAS

ADA - Adenosina Deaminase Ado - Adenosina

AMP – Adenosina 3´- 5´ - monofosfato

AMPc – Adenosina 3´- 5´ - monofosfato cíclico ATP – Adenosina 5´ - trifosfato

bFGF – Fator de crescimento básico de fibroblasto BME - Meio basal de Eagle

BSA – Albumina Sérica Bovina

C21 – Vigésimo primeiro dia de cultura

CAMK II – Proteína quinase II dependente de cálcio e calmodulina CHA - N6 - Ciclohexiladenosina

CHE – Cloreto de Queleritrina

CMF - Solução salina balanceada de Hank’s livre de cálcio e magnésio CNTs – Transportadores Concentrativos de Nucleosídeos

CREB – Proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMPc DMSO - Dimetilsulfóxido

DPCPX - 1,3-dipropil-8-ciclopentilxantina

DPMA - N6-[2-(3,5-Dimetoxifenil)-2-(metilfenil)-etil] adenosina)

E11 – Décimo primeiro dia de estágio de desenvolvimento embrionário EGF – Fator de crescimento epidérmico

eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial

ENTs – Transportadores Equilibrativos de Nucleosídeos ERKs – Proteínas quinases regulada por sinal extracelular GMPc – Guanosina 3´- 5´ - monofosfato cíclico

JNKs - c-jun-N-terminal quinase

Km – Constante de Afinidade de Michaelis-Menthen

LTP – Potenciação de Longo Termo MAP - Proteína associada ao microtúbulo

MAPKs – Proteínas quinases ativadas por mitógenos MEM – Meio Essencial Mínimo

mGLUR – Receptor metabotrópico de glutamato

MKPs - Proteínas fosfatases específicas para MAP kinases NBMPR – S-(Nitrobenzil)-6-tioinosina

NECA - 5’-N-etilcarboxiamidoadenosina NGF – Fator de crescimento nervoso NMDA – N-metil-D-aspartato

NO – Óxido Nítrico

PD98059 - 2’ - amino-3’ - metoxiflavona PDBU -Forbol 12,13-dibutirato

PKA - Proteína quinase dependente de cAMP PLC – Fosfolipase C

PKC - Proteína quinase dependente de Ca++

Rap1 - Proteína monomérica ligante de nucleotídeos de guanina Ras – Proteína monomérica ligante de nucleotídeos de guanina SAH - S-adenosilhomocisteína

SAPK – Proteína quinase ativada por sinal de stress SDS – Dodecil sulfato de sódio

SNC – Sistema Nervoso Central TBS - Solução tampão de Tris Trk – Receptor tirosina quinase

RESUMO

Células gliais possuem papéis fundamentais durante o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC), tais como migração neuronal, neuroproteção e regulação da concentração de glutamato. As células de Muller, o principal e predominante tipo de célula glial na retina, expressam vários receptores e transportadores para neurotransmissores, inclusive de adenosina (Ado). Ado é importante na regulação da expressão de receptores, proliferação, diferenciação celular, além de participar em processos de reparo celular e na neuroproteção da excitotoxicidade induzida por glutamato. A presença de Ado e de seu transportador foi observada em neurônios e células gliais. Nossos objetivos neste trabalho foram estudar a fosforilação das cinases reguladas por fatores extracelulares (ERKs) induzida por ativação de receptores de Ado em culturas purificadas de glia e caracterizar a participação da via da ERK na captação de Ado em diferentes tipos de culturas de células da retina. Culturas mistas e culturas puras de glia de retinas foram utilizadas para quantificação da fosforilação da ERK através da técnica de Western Blot e para os experimentos de captação de (3H)-Ado. Nossos resultados mostram que a Ado endógena regula a fosforilação da ERK 2, pois a incubação das culturas com adenosina deaminase (0,5 U/ml) reduziu em 50% o nível basal da fosfo-ERK 2. A incubação com CHA (1 µM), um agonista seletivo do receptor A1, provocou um

aumento de cerca de 2x na fosforilação da ERK 2 e este efeito foi completamente bloqueado por DPCPX (10 μM), um antagonista do receptor A1. DPMA (1 µM) não

provocou efeito aditivo quando incubado junto com o CHA. PD 98059 (25 µM), um inibidor da MEK, bloqueou a estimulação pelo CHA e o mesmo efeito foi observado com PP1 (10 µM) ou Queleretrina (100 nM), inibidores da Src e da PKC, respectivamente. A inibição da ERK 2 nas culturas de glia com PD 98059 (25 µM) reduziu em aproximadamente 40% a captação de Ado. Nas culturas mistas, o uso de PD 98059 (25 µM) ou UO126 (10 µM), dois inibidores da MEK com estruturas químicas bem distintas, também reduziram a captação em cerca de 50 a 60%. Em conclusão, a fosforilação da ERK 2 na glia de Muller da retina é regulada por Ado endógena e estimulada pela ativação do receptor A1 e envolve pelo menos a

participação da PKC, Src e da MEK. A via da ERK também possui um papel na regulação da captação de Ado em diferentes tipos de cultura de retina.

ABSTRACT

Glial cells play fundamental roles during central nervous system development, such as regulation of neuronal migration, neuroprotection and regulation of glutamate concentration. Muller cells, the main and predominant type of glial cell in the retina, express several neurotransmitter receptors and transporters, including for adenosine (Ado). Ado is important in the regulation of receptor expression, proliferation, cellular differentiation, and also participates in cellular repair processes and neuroprotection from glutamate-induced excitotoxicity. The presence of Ado and its transporter was observed in neurons and glial cells. Our objectives in the present work were to study the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases (ERKs) induced by activation of Ado receptors in purified cultures of retinal glia cells and to characterize the participation of the ERK pathway in Ado uptake by different types of retina cultures. Mixed cultures of neurons and glial cells or purified cultures of glial cells were used for quantification of ERK phosphorylation by western blot and for experiments of (3H) Ado uptake. Our results show that endogenous Ado regulates ERK 2 phosphorylation, since the incubation of cultures with adenosine deaminase (0,5 U/ml) reduced 50% of the basal phospho ERK 2 level. The incubation with CHA (1 μM), an A1 receptor selective agonist, promoted a 2 fold increase in ERK 2

phosphorylation and this effect was completely blocked by DPCPX (10 μM), an A1 receptor antagonist. DPMA (1 μM) did not produce any additive effect when added together with CHA. PD 98059 (25 μM), a MEK inhibitor, blocked the stimulation by CHA and the same effect was observed with PP1 (10 μM) or Cheleritrine chloride (100 nM), respectively Src and PKC inhibitors. The inhibition of ERK 2 in glia cultures with PD 98059 (25 μM) reduced Ado uptake by approx. 40%. In mixed cultures, PD 98059 (25 μM) or U0126 (10 μM), two inhibitors of MEK with different chemical structures, also reduced Ado uptake by the same amount. In conclusion, ERK 2 phosphorylation in retinal Muller glial cells is regulated by endogenous Ado and stimulated by activation of A1 receptors involving at least the participation of PKC, Src

and MEK. ERK pathway also plays a role in the regulation of Ado uptake in different types of retina cultures.

1) INTRODUÇÃO

1.1) Metabolismo e transporte de adenosina através da membrana

A adenosina é um nucleosídeo composto de uma base purínica, a adenina, e de uma pentose, a ribose. A adenosina pode ser encontrada no interior de todos os tipos celulares ou, ainda, pode ser liberada em grandes quantidades em eventos hipóxicos e isquêmicos(Ribeiro et al., 2002; Schulte e Fredholm, 2003). Não é considerada um neurotransmissor clássico, pelo fato de não ser armazenada nem liberada por vesículas sinápticas, sendo, portanto, classificada como um neuromodulador que é liberado da célula através de transportadores bi-direcionais de nucleosídeos e nucleobases localizados na membrana plasmática.

Os transportadores de nucleosídeos dividem-se em concentrativos e equilibrativos. Os equilibrativos transportam nucleosídeos em ambas as direções celulares de acordo com os níveis destes nos meios intra e extracelulares, enquanto os transportadores concentrativos promovem o influxo de nucleosídeos contra o gradiente de concentração, através do uso de energia derivada do gradiente de concentração de sódio existente nas membranas celulares (Podgorska et al., 2005). Os transportadores equilibrativos de nucleosídeos dividem-se em sensíveis e insensíveis ao inibidor nitrobenziltioinosina (NBMPR), sendo que os sensíveis são inibidos nas concentrações nanomolares desta droga, enquanto que os insensíveis são resistentes a concentrações de até 1 μM (Podgorska et al., 2005). Atualmente existem descritos 4 subtipos de transportadores equilibrativos, que são nomeados ENT1, ENT2, ENT3 e ENT4, sendo que apenas o ENT1 e o ENT3 são sensíveis ao NBMPR, sendo este último bem menos susceptível à inibição (Podgorska et al., 2005). Estes transportadores podem ser glicosilados e possuem 11 domínios transmembrana dispostos com a cauda N-terminal citoplasmática e a cauda C-terminal localizada no espaço extracelular (Esquema 1a). Os transportadores

concentrativos são divididos em 3 subtipos (CNT1, CNT2 e CNT3), também podem ser glicosilados e possuem 13 domínios transmembrana dispostos com a cauda N-terminal citoplasmática e a cauda C-N-terminal localizada no espaço extracelular (Esquema 1b). No sistema nervoso central (SNC), a presença predominante do transportador equilibrativo é extremamente importante nos processos de liberação e captação de adenosina, além de outros nucleosídeos e nucleobases purínicos e pirimidínicos (Jennings et al., 1998; Latini e Pedata, 2001).

Esquema 1: Representação esquemática do ENT1 humano (A) e do CNT1 humano (B) (Retirado

de Podgorska et al., 2005)

No SNC, a adenosina pode ser originada intracelularmente a partir de 5´-AMP, através da ação de enzimas do tipo 5´-nucleotidase, que podem ser encontradas em cinco isoformas. Uma destas isoformas, a ecto-5´-nucleotidase, é responsável pela degradação extracelular do AMP e principal responsável pela modulação dos níveis extracelulares de adenosina (Latini e Pedata, 2001). A ecto-5´-nucleotidase é uma enzima ancorada à membrana plasmática com seu sítio catalítico exposto do lado

extracelular e, como demonstrado anteriormente, pode ser expressa em células gliais e neuronais (ver Franco et al., 1986). No lado intracelular, a adenosina pode ser produzida por duas vias diferentes, por ação da 5´-nucleotidase citosólica, como descrito anteriormente, ou pela hidrólise da S-adenosilhomocisteína (SAH), numa reação catalisada pela SAH hidrolase. A via metabólica envolvendo a 5´

-nucleotidase citosólica parece ser mais importante em situações de estresse metabólico, caracterizada por um aumento do catabolismo de ATP e um conseqüente aumento na concentração intracelular de AMP. Isto decorre do fato de que a enzima possui um Km para o AMP na faixa de 1-14mM e a concentração

intracelular fisiológica de AMP está na faixa de 0,1-0,5mM. Alguns autores consideram, por este fato, a 5´-nucleotidase citosólica como um sensor de estresse metabólico (Latini e Pedata, 2001). A via de consumo de adenosina por condensação com L-homocisteína através da S-adenosilhomocisteína (SAH) hidrolase parece possuir uma menor importância no cérebro pelo fato de haver uma menor disponibilidade do substrato(L-homocisteína) e portanto menor formação de SAH (Reddington e Pusch, 1983).

Por outro lado, os mecanismos de metabolização da adenosina envolvem as enzimas adenosina deaminase e adenosina quinase. A enzima adenosina deaminase promove a deaminação da adenosina à inosina. Esta via metabólica é majoritariamente citosólica e seu local de expressão parece estar correlacionado com a presença de transportadores de adenosina (Nagy et al., 1985). No entanto, relatos recentes sugerem a existência de uma ecto-adenosina deaminase, que poderia estar ancorada aos receptores A1 de adenosina, catalisando a degradação

de adenosina no meio extracelular, apesar de promover o aumento da ligação de adenosina ao receptor A1 (Franco et al., 1997; Latini e Pedata, 2001). A adenosina

levando à formação de AMP. A inibição da adenosina quinase pode levar ao aumento da concentração de adenosina extracelular no hipocampo e conseqüente modulação da transmissão sináptica dos neurônios(Pak et al., 1994). A adenosina quinase possui um valor de Km menor que o da adenosina deaminase, 2μM e

17-45μM, respectivamente, no cérebro de rato. Em concentrações fisiológicas, a atividade da adenosina quinase pode ser máxima. No entanto, concentrações elevadas de adenosina podem levar a uma inibição da enzima. Deste modo, a principal via de metabolização da adenosina em condições fisiológicas deve ser a fosforilação promovida pela adenosina quinase. Em situações de estresse metabólico, quando há aumento da concentração intra e extracelular de adenosina, a adenosina deaminase pode ser a principal via de degradação intracelular (ver Phillips e Newsholme, 1979; Latini e Pedata, 2001).

O esquema 2 mostra as diferentes vias de metabolização de adenosina envolvidas na regulação direta da concentração intra ou extracelular desta purina.

A liberação de adenosina pode ser decorrente de diferentes estímulos, dentre os quais podemos destacar a despolarização, promovida por altas concentrações de KCl em culturas cerebelares (Sweeney, 1996), por baixa estimulação elétrica em fatias hipocampais (Cunha et al., 1996), por ativação de receptores ionotrópicos do tipo NMDA e não-NMDA em fatias corticais (Hoehn e White, 1990) e por eventos hipóxicos em neurônios e astrócitos corticais (Parkinson et al., 2002).

Esquema 2: Vias do Metabolismo celular da Adenosina (Modificado a partir de Latini e Pedata,

2001). AK: adenosina quinase; ADA: adenosina deaminase; 5-IT: inibidor da AK; EHNA e DCF:

inibidores de ADA; PDE: fosfodiesterase; es e ei: equilibrativo sensível e insensível à NBMPR, respectivamente; Pi: fosfato inorgânico e SAH: S-adenosilhomocisteína.

1.2) Receptores de adenosina

A adenosina liberada ou produzida no meio extracelular vai atuar através da ligação aos seus receptores, que são classificados como membros da família de receptores acoplados a proteína G. A estrutura destes receptores é caracterizada pela presença de sete domínios transmembrana (Esquema 3). Ao interagir com uma proteína G, o receptor inicia uma via de sinalização intracelular através da ativação

Ativação de Receptores de Adenosina

Transportadores Concentrativos Transportadores Equilibrativos NH3 Inosina EHNA DCF _ADENOSINA Nucleotídeos AMP cíclico AMP cíclico Adenosina Inosina ADA

de uma enzima envolvida na produção de um segundo mensageiro. Os receptores de adenosina são divididos em quatro subtipos: receptores A1 A2A, A2B e A3. Os

receptores A1 e A3 podem estar acoplados negativamente à adenilil ciclase,

enquanto os receptores A2A e A2B podem estar acoplados positivamente à adenilil

ciclase. Os receptores A1 e A2 foram descobertos na década de 60 com base no

efeito antagonista de metilxantinas (ver Degubareff T e Sleator Jr W, 1965). Na década de 80, os receptores A2 foram subdivididos em A2A e A2B ,com base na

diferença de afinidade para a ligação à adenosina, sendo o receptor A2A considerado

o de alta afinidade e o A2B de baixa afinidade (verDaly et al., 1983). Finalmente, na

década de 90, foi descoberto o último subtipo de receptor de adenosina, denominado A3 (Zhou et al., 1992), que é insensível ao antagonismo pelas xantinas

(Fredholm et al., 2001) e é provável que esta característica farmacológica tenha contribuído para que este fosse o último a ser descoberto na família de receptores de adenosina (Schulte e Fredholm, 2003).

Esquema 3: Representação esquemática deduzida da seqüência de aminoácidos do receptor

1.3) Papéis fisiológicos da Adenosina no Sistema Nervoso

A adenosina pode exercer diversos efeitos neuromodulatórios através da inibição ou potenciação da atividade neuronal. Estes efeitos poderão variar em função do subtipo de receptor e do modelo celular envolvido. Na retina, a ação inibitória da adenosina envolve o receptor A1 presenteem células ganglionares. Neste caso, a

produção de adenosina é decorrente da degradação do ATP liberado pela glia, em resposta ao aumento da condutância de canais de potássio (Newman, 2003a). Outro papel regulador do receptor A1 foi visto em animais que eram mantidos sob total

escuridão e, quando expostos a um breve estímulo luminoso sofriam um atraso no ritmo circadiano normal, que era bloqueado por prévia ativação destes receptores, supostamente, ao nível pré-sináptico do trato retinohipotalâmico (Sigworth e Rea, 2003). Em neurônios do neostriatum, a ativação de receptor A2A de adenosina

aumenta a fosforilação do resíduo Thr-34 em DARPP-32, uma proteína relacionada com a regulação de canais iônicos e receptores de neurotransmissores. Este efeito é regulado pela ativação de receptores mGlu5 do grupo I (Nishi et al., 2003). A ativação do receptor A2A em culturas purificadas de neurônios também pode

apresentar um papel neuroprotetor, especialmente na retina, no caso da excitoxicidade provocada pelo glutamato (Ferreira e Paes-de-Carvalho, 2001) e na morte induzida pela troca de meio em culturas purificadas de neurônios e fotorreceptores (Paes-de-Carvalho et al., 2003). Em células endoteliais, a ativação do receptor A2A de adenosina produz aumento de GMPc e do transporte de

L-arginina , substrato para a produção de NO pela eNOS, de forma dependente da ativação de tirosina quinases, ERKs e hiperpolarização da membrana (Wyatt et al., 2002). Os processos regulados pela ativação do receptor A3 de adenosina são

receptor de adenosina em astrócitos pode apresentar tanto efeitos neuroprotetores como neurotóxicos, que irão variar de modo dose-dependente (Jacobson et al., 1999) sendo que um trabalho mais recente demonstrou a presença do receptor A3

em células ganglionares da retina de rato e sua ativação teve um efeito protetor na morte celular induzida por ativação do receptor P2X7, via bloqueio do aumento de

cálcio (Zhang et al., 2006).

A adenosina é uma molécula extremamente importante na regulação de processos de proliferação e diferenciação celular. No sistema nervoso central, já foi descrito que a adenosina é importante na interrupção do processo proliferativo e na indução da diferenciação de células precursoras de oligodendrócitos, que ocorre através da liberação de adenosina pelos neurônios do gânglio da raiz dorsal, em função de sua atividade elétrica intrínseca ou via formação extracelular por ação de uma ecto-nucleotidase, demonstrando a importância da interação neurônio-glia na maturação do sistema nervoso central. No sistema nervoso periférico, no entanto, a adenosina não possui efeitos sobre a diferenciação das células de Schwann, sugerindo o envolvimento de outros mecanismos na regulação dos processos de diferenciação e proliferação celular (Stevens et al., 2002).

Além da regulação de processos de proliferação e de diferenciação celular, a adenosina apresenta um papel modulador, tanto positivo como negativo, sobre a apoptose. Toda modulação destes diferentes processos culminam com a ativação de um grupo de proteínas conhecidas como MAPKs, as proteínas quinases ativadas por mitógenos.

1.4) MAPKs

As MAPKs (Esquema 4) constituem uma família de proteínas quinases que atuam promovendo a fosforilação de proteínas em resíduos de serina e de treonina e são os efetores finais de módulos de quinases seqüenciais bem conservados.

Estes módulos podem ser ativados por receptores acoplados às proteínas G ou por receptores tirosina quinases. Esta família de enzimas pode ser dividida em três sub-famílias principais: ERKs (Proteínas quinases reguladas por sinais extracelulares), p38 e JNK. Esta última é conhecida também como proteína quinase ativada por sinais de estresse, SAPK (Schulte e Fredholm, 2003), embora a p38 também tenha sido relacionada ao estresse.

Esquema 4: Vias de sinalização simplificadas das MAP kinases (Modificado de

http://www.bch.msu.edu/faculty/gallo/mapk-pathways-new.jpg).

1.4.1) ERKs

A sub-família das ERKs é constituída por seis diferentes isoformas: ERK1, ERK2, ERK3α, ERK3β, ERK5 e ERK7. As ERKs mais bem estudadas são ERK1, ERK2 e ERK5. No Sistema Nervoso, as ERKs 1/2, também conhecidas como p44 MAPK e p42 MAPK, respectivamente, estão geralmente relacionadas com a regulação de processos de proliferação, diferenciação celular, LTP (“long-term potentiation”) e

plasticidade sináptica através do aprendizado (Sweatt, 2001; Schulte e Fredholm, 2003). A ativação das ERK1/2 foi observada inicialmente pela ativação de receptores tirosina quinases (Trks). Dados mais recentes mostram que a fosforilação das ERK1/2 pode ser promovida por diferentes tipos de receptores, tais como receptores metabotrópicos de glutamato do grupo I (Choe e Wang, 2001), receptores de glucagon (Jiang et al., 2001) e influxo de Ca++ por canais de cálcio do tipo L (Dolmetsch et al., 2001). Uma característica do processo de diferenciação neuronal é a formação de dendritos. Descrito em diversos tipos celulares, este processo pode envolver ativação das ERKs 1/2. Vogt Weisehorn et al. (2001) demonstraram a presença de dois mecanismos de neuritogênese em uma linhagem celular com origem no SNC, a linhagem AS583-8, um deles de resposta rápida, mediado por AMPc e independente das ERK1/2, e o outro de resposta lenta, mediado por bFGF dependente das ERK1/2. Piiper et al. (2002) demonstraram a indução da neuritogênese por AMPc de maneira dependente das ERKs 1/2 e de receptores de EGF. As ERK 1/2, de modo geral, quando ativas translocam-se para o núcleo onde podem atuar fosforilando diretamente diversos fatores de transcrição, tais como CREB, Elk-1 e c-fos (Wahlin, 2000; Schulte e Fredholm, 2003), ou indiretamente através da fosforilação e ativação da p90rsk (Sweatt, 2001). Deste modo, as ERKs 1/2 podem modular processos de diferenciação e de proliferação celular (Volmat e Pouysségur, 2001). No entanto, além dos substratos nucleares, as ERKs 1/2 podem catalisar a fosforilação de substratos não-nucleares, como por exemplo canais de potássio na membrana, levando a uma redução da sua condutância, que parece estar envolvida na formação da memória de longa duração (Morozov et al., 2003) e na formação de dendritos dependente de atividade em neurônios simpáticos.

O envolvimento das ERKs 1/2 na formação dos dendritos parece estar relacionado à fosforilação da proteína associada ao microtúbulo (MAP) (Vaillant et

al., 2002). A inativação das ERKs 1/2 ocorre pela ação de proteínas fosfatases especificas, MKPs (Proteínas fosfatases específicas para MAP kinases), e pela ação de proteínas fosfatases inespecíficas, tais como as tirosinas e serina/treonina fosfatases (Brondello et al., 1997; Zhou et al., 2002).

1.4.2) ERK 5

A ERK 5 tem sido correlacionada com o estresse osmótico ou oxidativo. No entanto, dados recentes têm demonstrado a sua ativação por receptores tirosina quinases, tais como os receptores de EGF e de NGF (Kamakura et al., 1999), sugerindo um papel adicional importante para ERK 5 na regulação de processos de diferenciação e de proliferação celular.

A ativação das ERK 1/2 por RTK parece regular negativamente a ativação da ERK 5 pelo receptor de EGF e por H2O2 (Mody et al., 2001).

A cascata de ativação da ERK 5 também já foi correlacionada com efeito neuroprotetor. A ativação da ERK 5 por receptores de neurotrofinas em axônios distais parece estar envolvida com a indução de um sinal retrógrado de sobrevivência, inclusive com a ativação de CREB estimulada por ERK 5 (Watson et

al., 2001).

1.4.3) SAPKs (“stress activated protein kinases”): p38 e JNK

A ativação das SAPKs de uma maneira geral tem sido relacionada a sinais de estresse, tais como citocinas pró-inflamatórias, radiação UV, raios-X, choques térmico e osmótico (Takeda e Ichijo, 2002). Esta subfamília de MAPKs é constituída por p38 e JNK (“cJUN N terminal Kinase”).

A p38 pode ser encontrada em quatro isoformas: p38α, p38β, p38γ e p38δ.

Embora classicamente estas quinases estejam relacionadas à regulação de processos apoptóticos, existem evidências do papel da p38 na diferenciação neuronal mediada por AMPc e na sobrevivência de células PC12 induzida por NGF

(Hansen et al., 2000; Takeda e Ichijo, 2002). O esquema 5 mostra um possível mecanismo de regulação da diferenciação e da sobrevivência neuronal dependente de ativação da p38. Esta MAPK também participa da regulação da sobrevivência neuronal dependente de atividade, migração neuronal, controle da tradução de proteínas e no tráfego endocítico (Takeda e Ichijo, 2002). Além destes processos, a p38 participa do “checkpoint” do ciclo celular na retina de pinto em desenvolvimento (Campos et al., 2002). Quanto à forma clássica de ativação da p38 em processos apoptóticos, foi relatado que a morte de células progenitoras neurais induzida por óxido nítrico era bloqueada por um inibidor especifico desta enzima, o SB203580 (Cheng et al., 2001). Os dados acima somente vêm confirmar a possibilidade de existirem diferentes respostas fisiológicas mediadas pela ativação de p38.

Esquema 5: Possíveis vias de sinalização ativadas por p38 na regulação da diferenciação e

sobrevivência neuronal (Retirado de Takeda e Ichijo, 2002)

A JNK pode ser encontrada em três isoformas: JNK1, JNK2 e JNK3. Como mencionado anteriormente, essa proteínas são ativadas por sinais de estresse e

apresentam importante papel na regulação de processos apoptóticos (Takeda e Ichijo, 2002).

O mecanismo inativador das SAPKs parece ser semelhante ao das ERKs, com a presença de fosfatases específicas das MAPKs regulando o tempo de ativação das SAPKs.

1.5) Regulação das ERKs por adenosina

Na literatura existem diversos relatos que correlacionam a fosforilação de MAPKs mediada por ativação de receptores de adenosina. A ativação das ERKs 1/2 mediada pelo receptor A1 em células CHO foi demonstrada ser dose e

tempo-dependente e com envolvimento da MEK, pois o inibidor desta enzima, PD 98059, bloqueou completamente o efeito estimulatório induzido pela ativação do receptor A1. O bloqueio da proteína Gi pela toxina pertussis, o bloqueio das tirosinas quinases

com genisteína e a inibição da PI3-kinase por LY 294002 ou Wortmannina também impediram o efeito da adenosina, indicando também o envolvimento destas vias (Dickenson et al., 1998). Em outro estudo, Robinson e Dickenson (2001) identificaram que, na linhagem de células de músculo liso DDT1MF-2, a regulação

das ERKs 1/2 é semelhante à observada em células CHO, mas a fosforilação é independente de tirosina kinases. Schulte e Fredholm (2000) transfectaram todos os subtipos de receptores de adenosina em células CHO e através do agonista não-seletivo de receptores de adenosina NECA demonstraram que a ativação de qualquer subtipo do receptor é capaz de aumentar a fosforilação de ERK induzida por adenosina nestas células. Germack e Dickenson (2004) caracterizaram as cascatas de sinalização de ERKs induzidas por ativação de receptores de adenosina em cardiomiócitos de ratos neonatos, e demonstraram que as ERKs podem ser ativadas por qualquer um dos subtipos de receptores de adenosina. Além disso, mostraram que a fosforilação das ERKs mediada por receptores A3 parece ser

dependente de PLC e PKC, que mediariam a ativação da adenilil ciclase que então seria responsável pelo disparo da via de sinalização das MAPKs. Schulte e Fredholm (2002) caracterizaram que a fosforilação das ERKs em células CHO transfectadas com o receptor A3 depende da proteína Gi , da subunidade βγ, Ras,

PI3-kinase e MEK. Arslan e Fredholm (2000) demonstraram que a ativação do receptor A2a ocasionou um aumento da fosforilação das ERKs 1/2 de maneira

dose-dependente em células PC12.

Outros estudos também identificaram a ativação das MAPKs por receptores A2a e

caracterizaram os alvos intermediários da sinalização. Um exemplo é o estudo que demonstrou que em células CHO a via de sinalização envolve pelo menos a participação da Gαs, adenilil ciclase, PKA, Rap1, B-Raf e MEK, enquanto que em

células HEK 293 a via de sinalização está associada com ativação da Ras (Seidel et al., 1999).

1.6) RETINA, UM MODELO BIOLÓGICO DE ESTUDO

A retina de pinto (Esquema 6) é um excelente modelo para estudos biológicos e bioquímicos do desenvolvimento neuronal (Coulombre, 1955). Culturas de células retinianas de pinto demonstram muitas propriedades neuroquímicas do tecido in vivo (Paes-de-Carvalho e de Mello, 1982; Paes-de-Carvalho et al., 1990b). A retina possui a mesma origem embrionária das estruturas do SNC e por isto pode ser considerada como um modelo de estudo das interações das células neurais. A retina é composta de fotorreceptores (cones e bastonetes), células horizontais, células bipolares, células amácrinas, células ganglionares e células gliais, que possuem um padrão de neurogênese bem caracterizado a nível temporal e espacial, levando à formação das camadas celulares da retina madura (Prada et al., 1991).

Esquema 6: Representação da estrutura laminar da retina (Retirado de

http://www.pime.iit.edu/DrJennifer/images/Retina-icon.jpg).

As células gliais, conhecidas como Glia de Muller na retina de pinto, são consideradas classicamente como células de suporte neuronal. Recentemente, a sua importância em processos de migração celular, modulação da transmissão sináptica, remoção de debris celulares e como uma fonte geradora de novos neurônios em processos degenerativos, tem sido demonstrada (Fischer e Reh , 2003). A glia de Muller expressa diversos receptores e transportadores de neurotranmissores, receptores purinérgicos e canais iônicos dependentes de voltagem (Kubrusly et al., 2005).

A modulação sináptica da transmissão neuronal pelas células gliais pode ser positiva ou negativa. Além disso, pode ser realizada diretamente através da ativação de receptores na célula glial, ou indiretamente por estimulação da liberação de transmissores pela glia e atuação em receptores neuronais (Newman, 2003 a,b).

1.7) Adenosina na Retina

Diversos trabalhos na literatura relatam a presença de adenosina, seus receptores e transportadores em retinas de diferentes origens. Schaeffer e Anderson (1981) mostraram em culturas de células da retina de rato a presença de um sistema de captação de alta afinidade de adenosina que é fortemente dependente de sódio, o que indica a presença de transportadores concentrativos nestas células. Braas e colaboradores (1987) demonstraram a presença de adenosina e de sítios para o receptor A1 em retinas de diferentes animais como ratos, cobaias, macacos e

humanos. Um outro trabalho também demonstrou a presença de sítios receptores A1

em retinas de coelhos através da medida da inibição da atividade da adenilil ciclase estimulada por forscolina, além de demonstrar a presença de um sistema de captação de adenosina nestas mesmas retinas (Blazynski, 1987). Um sistema de captação de adenosina foi observado através de estudos de autoradiografia em retinas de coelhos e de peixes (Ehinger e Perez, 1984). Por outro lado, a adenosina captada por retinas de coelhos também pode ser liberada, principalmente sob a forma de hipoxantina e xantina, na presença de um estímulo despolarizante com cloreto de potássio (Perez et al., 1986). Além disso, a captação de adenosina em neurônios da retina de coelho é inibida fortemente na presença de NBMPR, um inibidor de uma classe de transportadores equilibrativos de nucleosídeos (Blazynski,1991), indicando que o transporte de adenosina ocorre via um transportador e não por simples difusão.

Na retina de pinto foi demonstrado que adenosina eleva a produção de AMPc em retinas intactas de embriões de pinto, com o pico de produção ocorrendo no 17o dia de estágio embrionário, sendo o efeito estimulatório também observado em culturas mistas de células de retina de embrião de pinto (Paes-de-Carvalho e de Mello, 1982). Em um outro estudo, foi demonstrado que entre o 10o dia e o 20o diade

desenvolvimento da retina de pinto, a ativação do receptor A1 é capaz de inibir o

acúmulo de AMPc induzido pela dopamina (Paes-de-Carvalho e de Mello, 1985). A expressão do receptor A1 na retina em desenvolvimento foi estudada através do

ensaio de ligação de (3H)-CHA, um agonista seletivo do receptor A1, demonstrando

a presença de receptores em diversos estágios de desenvolvimento, sendo que no 17o dia foram encontrados os níveis mais elevados deste receptor (Paes-de-Carvalho, 1990a). Em culturas purificadas de neurônios e fotorreceptores da retina de pinto, demonstra-se a existência de um sistema de captação específico de alta afinidade para adenosina. Sob um estímulo despolarizante ocorre aumento da liberação de adenosina, mas, no entanto, a maior parte da radioatividade liberada é encontrada na forma de inosina (Paes-de-Carvalho et al., 1990b). Neste mesmo trabalho, a incubação das culturas com um inibidor do ENT1, NBMPR, provocou uma inibição da captação de mais de 80% e também foi demonstrado que a captação era independente de íons sódio, o que indica que na retina de pinto a expressão do ENT1 é majoritária.

Outros trabalhos correlacionaram a adenosina e sua modulação em efeitos fisiológicos. A ativação do receptor A2A em culturas purificadas de neurônios

apresenta um papel neuroprotetor, especialmente na retina, no caso da excitoxicidade provocada pelo glutamato (Ferreira e Paes-de-Carvalho, 2001) e na morte induzida pela troca de meio (Paes-de-Carvalho et al., 2003).

Em trabalho recente de nosso grupo demonstrou-se que a liberação de purinas em culturas mistas estimuladas por ativação de receptores NMDA é bloqueada na presença de NBMPR, um inibidor do transportador de nucleosídeos, ou na presença de KN 62, um inibidor da CAMK II, o que indica a modulação do transportador por esta cinase ou por alguma via indireta (Paes-de-Carvalho et al.,

2005). O interessante foi que, este estudo mostrou a possibilidade da liberação de um neurotransmissor ser dependente de cálcio e mediada por transportador.

1.8) Captação de Adenosina e Regulação por vias de sinalização

Primeiramente torna-se necessário esclarecer as diferenças entre transporte e captação de uma substância. O transporte caracteriza-se apenas pelo componente de passagem da substância pelas membranas celulares catalizada por um determinado transportador, sem a influência do componente metabolismo. Para se estudar o transporte, os ensaios são feitos em tempos muito curtos (geralmente até 1 minuto) de modo que o componente de metabolismo da substância seja minimizado. Chamamos de captação a um processo medido em tempos mais longos de exposição da célula à substância, que consiste no transporte propriamente dito através de transportadores mais o metabolismo resultante da ação de enzimas. No caso da adenosina, as enzimas envolvidas no processo de captação são a adenosina cinase que leva à formação de AMP, e a adenosina deaminase, que leva à formação de inosina. A inibição da adenosina cinase, por exemplo, leva a uma diminuição drástica da captação de adenosina sem afetar o transporte do nucleosídeo.

Diversos trabalhos na literatura demonstram que os transportadores de nucleosídeos podem ser regulados por ação de diversos agonistas ou por proteínas cinases. A exposição aguda ao etanol de células de linfoma S49 provocou uma severa inibição da captação de adenosina e este efeito parece ocorrer através da diminuição de transportadores sensíveis ao NBMPR na membrana celular (Nagy et al., 1990). Posteriormente este mesmo grupo mostrou que este efeito inibitório do etanol na captação de adenosina é dependente da ativação de PKA (Nagy et al., 1991). Um outro trabalho deste mesmo grupo, também em células cromafins da medula adrenal, demonstrou que a ativação da PKC provoca uma redução da captação de

adenosina e uma diminuição da presença de sítios ligantes dos transportadores sensíveis ao NBMPR (Delicado et al., 1991). Estes efeitos inibitórios na captação por ação da PKA e PKC também foram observados em uma linhagem de neuroblastoma (Sen et al., 1999). No entanto, também já foi demonstrado que a ativação da PKC pode regular positivamente a captação de adenosina (Coe et al., 2002). Sweeney (1996) mostrou que a inibição da subunidade α da Gi ou Go com toxina pertussis leva

a uma diminuição da liberação de adenosina em culturas de neurônios granulares do cerebelo evocada por um estímulo despolarizante com potássio, enquanto que a ativação da subunidade α da Gs com toxina de cólera provocou um estímulo da

liberação de adenosina nas mesmas condições descritas acima. ATP foi capaz de aumentar significativamente o transporte de uridina em vesículas de membranas plasmáticas de células chromafins, um efeito que pode ser mediado por aumento da inserção de transportadores na membrana (Delicado et al., 1994).

Em células endoteliais fetais humanas demonstrou-se que a inibição do transporte de adenosina por glicose ocorre de modo dose e tempo-dependente e tem a participação da PKC, óxido nítrico e ERKs (Montecinos et al., 2000). Este efeito inibitório das ERKs na captação foi observado de maneira similar em culturas de linfócitos B, onde a inibição da MEK provocou um aumento da expressão do RNAm do ENT1 que havia sido diminuído pelas altas concentrações de glicose (Sakowicz et al., 2005). Em sinaptossomos hipocampais, demonstrou-se que a ativação dos receptores A2a provoca um aumento da captação de adenosina e este efeito é

revertido pela inibição da PKC (Pinto-Duarte et al., 2005).

2) OBJETIVOS

• Investigar a modulação da atividade da ERK 2 por receptores de adenosina em diferentes tipos de culturas de retina

• Estudar o efeito de inibidores da ERK na captação de adenosina nas culturas

3) METODOLOGIA 3.1) Materiais

Adenosina, BSA, CHA, CHE, DPCPX, DPMA, Glutamina, NECA, Penicilina e Estreptomicina foram obtidas da Sigma/RBI Chem.Co. (Missouri, Estados Unidos). BME, CMF, MEM, Soro Fetal Bovino e Tripsina foram obtidas da GIBCO (Nova York, Estados Unidos). ADA e U0126 foram obtidas da Calbiochem (Califórnia, Estados Unidos). PD 98059 e PP1 foram obtidas da Biomol (Pensilvânia, Estados Unidos). [3H] Adenosina (16Ci/mmol), Kit ECL e anticorpos secundários anti-camundongo e anti-coelho conjugados à peroxidase foram obtidas da Amersham (Buckinghamshire, Inglaterra). O anticorpo monoclonal de camundongo contra p-ERK foi obtido da Cell Signaling (Madison, Estados Unidos) e o anticorpo policlonal de coelho contra ERK Total foi obtido da Promega (Madison, Estados Unidos).

Todos os outros reagentes foram de pureza analítica.

3.2) Obtenção de culturas mistas de embrião de pinto:

Ovos de galinha fertilizados da espécie White Leghorn foram obtidos a partir de uma granja local e eram mantidos em uma incubadora a 38 0C em atmosfera umidificada. Culturas em monocamada de células de retina de pinto foram preparadas como previamente descrito (de Mello et al., 1978). Resumidamente, as retinas de embrião de pinto de 8 dias (E8) foram dissecadas dos demais tecidos oculares, incluindo o epitélio pigmentar, em solução salina livre de cálcio e magnésio (CMF) (NaCl, 131 mM; KCl, 4.09 mM; NaH2PO4.7H2O, 0.92 mM; KH2PO4, 0.45 mM;

glucose.H2O, 12.2 mM; NaHCO3, 9.4 mM) e dissociadas quimicamente com tripsina

0,1% em uma solução CMF por 20 minutos a 37ºC. Em seguida, a solução foi retirada e as retinas foram suspensas em meio basal de Eagle (BME) suplementado com 5% de soro fetal bovino inativado termicamente, penicilina (100U/mL) e estreptomicina (100μg/mL), dissociadas mecanicamente e semeadas em placas de

cultura de 40mm de diâmetro, seguindo a proporção de meia retina por placa de cultura. As culturas foram mantidas a 37ºC em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. O meio de cultura foi trocado com 1 dia de cultura (C1). Os experimentos

foram realizados após 3 dias em cultura (C3).

Nos experimentos de captação de (3 _{H) Adenosina, as células foram mantidas}

em meio essencial mínimo (MEM), suplementado da mesma maneira como descrito anteriormente para o meio BME, semeadas em placas de 24 poços na densidade de 2,5 x 106 células/poço, sendo o volume final de cada poço de 0,5 ml, e foram mantidas sob as mesmas condições descritas anteriormente. Os experimentos foram realizados após 3 ou 4 dias em cultura (C3-C4).

3.3) Obtenção de culturas purificadas de glia de retina de embrião de pinto: As culturas purificadas de glia foram obtidas através de um protocolo semelhante àquele utilizado para a preparação das culturas mistas, porém usando células de embrião de pinto de 11 dias (E11), na densidade de 1,65 x 106 células/ ml. Nos experimentos para identificação da marcação de p-ERK em glia, as células foram mantidas em BME ou MEM, enquanto que nos experimentos de captação de (3 H) Adenosina as células foram mantidas em MEM. A troca de meio foi realizada em C3, C7, C10, C14 e C17. Os experimentos foram realizados em culturas de 20 a 21 dias (C20-C21) de idade.

3.4) Preparo das amostras celulares para análise em gel de poliacrilamida: Após a realização dos experimentos, onde as culturas mistas ou purificadas de glia foram incubadas com drogas específicas, a solução de Hank’s com as diferentes drogas foi aspirada da placa e substituída por tampão de amostra para eletroforese (10% glicerol, 100mM 2-mercaptoetanol, 2%SDS). As amostras foram aquecidas a 100o_{C por 6 minutos para promover a desnaturação das proteínas e em}

de proteínas foi realizada através do método de Bradford (Bradford MM, 1976). Uma vez determinada a concentração de proteínas de cada amostra, foi adicionado o corante azul de bromofenol em uma concentração final de 0,02%.

3.5) Fracionamento em gel desnaturante de poliacrilamida e transferência das proteínas para membrana PVDF

Os géis de poliacrilamida contendo SDS foram preparados de acordo com o protocolo descrito por Laemli (1970), sendo que o gel de corrida tinha a concentração de 9% de acrilamida. Após a aplicação dos extratos protéicos no gel, as proteínas migraram em função de seus pesos moleculares. Ao final da corrida, o gel de separação foi retirado da placa e as proteínas transferidas para a membrana de PVDF por eletrodifusão, conforme descrito por Towbin et al. (1979).

3.6) Incubação da membrana com anticorpos específicos e revelação do Western Blot

A membrana PVDF contendo as proteínas foi inicialmente incubada com 5% de leite desnatado em solução tampão de Tris (TBS) pH 7,6 contendo 0,1% Tween (TBS-T), por 1 hora, para bloquear a adsorção inespecífica dos anticorpos. Em seguida, a membrana foi incubada com anticorpos específicos (1:2000 anti p-ERK e 1:5000 anti ERK total), nas diluições recomendadas pelo fabricante, em TBS-T por toda a noite a 40 C. No dia seguinte, após 3 lavagens sucessivas em TBS-T, a membrana foi incubada, por período de 1 hora com um anticorpo secundário (1:5000 para ambos os anticorpos secundários), capaz de reconhecer e ligar-se ao anticorpo primário. Em seguida, a membrana foi lavada por 3 vezes em TBS-T e, por último, realizou-se uma lavagem em TBS. A imunodetecção das proteínas específicas foi promovida pela reação quimioluminescente do sistema ECL, catalisada pela enzima peroxidase conjugada ao anticorpo secundário.

Em alguns experimentos, para a realização do controle do carregamento, após a revelação as membranas foram lavadas em água milli-Q e, em seguida, incubadas em uma solução de glicina 0,2M pH 2,2 por 30 minutos sob agitação suave para a retirada dos anticorpos ligados à membrana. Após este período, as membranas foram lavadas por 3 vezes em TBS e, em seguida, realizou-se o mesmo procedimento de bloqueio e incubação com os anticorpos descritos anteriormente.

O nível de fosforilação da ERK foi determinado pela análise densitométrica das imagens dos filmes obtidos na reação de quimioluminescência, utilizando-se um Scanner e o programa Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD, Estados Unidos).

3.7) Experimentos de captação de [3H] Adenosina

No inicio dos experimentos, o meio das culturas foi retirado e as placas lavadas 2 vezes com Hank´s (NaCl 140 mM; KCl 5 mM; Hepes 20 mM; glucose 4 mM; MgCl2

1 mM; CaCl2 2 mM). Em seguida, as células foram pré-incubadas por 15 minutos na

ausência ou presença de diferentes drogas e incubadas com (3_{H) Adenosina}

(0.5 μCi/ml) por 15 minutos. Após este tempo, novamente as culturas foram lavadas 2 vezes com Hank´s, lisadas com água para determinação da radioatividade intracelular e armazenadas no freezer a -20 0C.

Posteriormente, as amostras foram descongeladas e a radioatividade determinada por contagem em cintilação líquida.

3.8) Análise Estatística

Os dados foram analisados pelo teste t de student ou por ANOVA seguido pelo pós-teste de Bonferroni, com a utilização do programa GraphPad Prism.

4) RESULTADOS

Com o objetivo de avaliar a modulação da fosforilação da ERK 2 por receptores de adenosina em diferentes tipos de culturas de células de retina, utilizamos a técnica de western blot. Esta metodologia permite determinar, através da utilização de anticorpos específicos, o nível de fosforilação da enzima. Conforme descrito na literatura, o nível de atividade desta enzima pode ser diretamente relacionado ao seu nível de fosforilação (Schulte e Fredholm, 2003). Neste trabalho, a detecção da MAP quinase é referida como sendo a ERK 2 porque foi demonstrado que na retina de pinto a marcação do anticorpo anti-fosfo-ERK 1/2 revela somente uma banda, que foi identificada como ERK 2 pelo fato de co-migrar com a ERK 2 humana (Désiré et al., 2000).

Inicialmente, avaliamos os níveis de fosforilação de ERK 2 em culturas mistas e purificadas de células gliais incubadas com o agonista não-seletivo para receptores de adenosina NECA (Fig. 1). A incubação de culturas purificadas de glia com NECA (10μM), por período de 5 minutos, induziu aumento de cerca de 2,5

vezes no nível de fosforilação de ERK 2, em comparação às células não-estimuladas. Por outro lado, não conseguimos detectar um estímulo de fosforilação de ERK 2 com esta mesma droga em culturas mistas de 3 ou 21 dias. Sendo assim, decidimos investigar os mecanismos envolvidos na regulação da fosforilação de ERK 2 por receptores de adenosina nas células da glia de Muller.

Em seguida, avaliamos o curso-temporal de fosforilação da ERK 2 induzida por NECA em culturas purificadas de glia e observamos um nível máximo de ativação após 3 minutos de estímulo (Fig. 2). Após 10 min, o estímulo havia diminuído drasticamente, retornando ao nível basal após 20 minutos de estímulo. Este resultado demonstrou que a fosforilação da ERK 2 nas células gliais induzida por ativação de receptores de adenosina ocorre de modo transiente.

NECA

+ -

+

p-ERK

-

+

10µM

-10µM

Figura 1: Neca induz aumento da fosforilação da ERK em culturas de células gliais. A: Efeito do Neca na fosforilação da ERK em culturas de retina de pinto. B: Quantificação da fosforilação de ERK dos experimentos. As culturas mistas (C3) e as culturas puras de glia (C21) foram estimuladas por 5´ com o Neca (10 μM), agonista não seletivo dos receptores de adenosina. Os resultados estão expressos em % do controle e foram realizados 2 experimentos.

A

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(%

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NECA

10µM

p-ERK

Figura 2: Neca induz um aumento transiente da fosforilação da ERK em culturas de células gliais. Efeito do Neca na fosforilação da ERK em culturas de retina de pinto. As culturas puras de glia (C21) foram estimuladas por diversos tempos (3; 5; 10; 15; 20; 30; 45 e 60 minutos) com o Neca (10 μM), agonista não seletivo dos receptores de adenosina. O experimento foi realizado uma única vez.

27

3 5 10 15 20

4.1) Provável liberação de adenosina por células gliais e estimulação basal da fosforilação de ERK 2.

Com a realização destes experimentos, havíamos verificado a existência de grandes variações no sinal basal de fosforilação da ERK 2 em culturas purificadas de glia, sugerindo que a adenosina liberada pela cultura, definida aqui como adenosina endógena, pudesse estar interferindo neste processo. Deste modo, fomos investigar de modo indireto se as células gliais poderiam estar liberando adenosina para o meio extracelular, de forma a promover um estimulo endógeno à fosforilação basal de ERK 2. Para testar esta hipótese, incubamos culturas de células gliais com diferentes concentrações de adenosina deaminase (ADA), uma enzima que degrada a adenosina à inosina, e avaliamos o nível de fosforilação de ERK 2. A incubação de culturas purificadas de glia com ADA , por 5 minutos, mostrou um efeito dose-dependente na inibição da fosforilação basal da ERK 2 (Fig. 3). Sendo assim, passamos a pré-incubar as culturas com esta enzima, antes de cada experimento, para prevenir o efeito induzido pela adenosina endógena e desta maneira evitar que os resultados fossem mascarados pela presença de níveis variáveis da adenosina no meio extracelular.

Nosso próximo passo foi identificar qual receptor de adenosina estaria envolvido na fosforilação basal da ERK 2. Dados do nosso laboratório haviam demonstrado a presença do receptor A1 em células da glia de Muller mantidas

em cultura através da técnica de Binding. Então testamos o DPCPX (10 μM),

um antagonista seletivo dos receptores A1 de adenosina. A incubação por 5

minutos com esta droga provocou uma redução de aproximadamente 50% dos níveis de fosforilação basal da ERK 2 (Fig. 4).

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Figura 3: Adenosina endógena modula a fosforilação basal de ERK em culturas de células gliais. Efeito da incubação de Adenosina deaminase (ADA) em diferentes concentrações (0,1; 0,2 e 0,5 U/ml) por 5 minutos na fosforilação basal da ERK em culturas de retina de pinto. Os resultados estão expressos em % do controle e representam a média de 2 experimentos ± desvio da média.

29

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Figura 4: Bloqueio do receptor A₁ inibe a fosforilação basal da ERK em culturas de células gliais. A: Imagem representativa de um dos experimentos com o antagonista do receptor A₁, o DPCPX. B: Quantificação da fosforilação da ERK em culturas puras de glia. As culturas puras de glia (C21) foram tratadas por 5´ com o DPCPX (10 μM). Os resultados estão expressos em % do controle e representam a média de pelo menos 3 experimentos ± desvio da média.

** P < 0,01 em relação ao controle.

4.2) Caracterização da fosforilação da ERK 2 por receptores de adenosina Com o objetivo de caracterizar o tipo de receptor de adenosina envolvido na ativação da ERK 2, incubamos as culturas de células gliais com agonistas e antagonistas seletivos para alguns subtipos de receptores.

Para avaliarmos o papel do receptor A1 de adenosina na fosforilação da

ERK 2, incubamos culturas purificadas de glia com CHA, um agonista seletivo do receptor A1 de adenosina (Fig. 5). As culturas foram pré-incubadas com

ADA (0,5 U/ml) por 5 min e, em seguida, estimuladas por 3 min com CHA (1 μM). A ativação do receptor A1 de adenosina induziu um aumento no nível de

fosforilação da ERK 2 comparável àquele induzido por NECA, cerca de 2,5 vezes. O envolvimento do receptor A1 nesta via foi confirmado pela reversão do

efeito do CHA por um antagonista seletivo deste receptor, o DPCPX. Estes resultados demonstraram o papel do receptor A1 na regulação da fosforilação

de ERK 2 por adenosina em células gliais.

Avaliamos também a possibilidade de envolvimento do receptor A2A de

adenosina na modulação de ERK 2. DPMA (1μM), um agonista seletivo para

este subtipo de receptor, provocou um aumento de cerca de 70 ± 19 %, porém não significativo, na fosforilação da ERK 2 (P > 0,05). Quando esta droga foi incubada na presença de CHA não houve aumento aditivo (Fig. 6). Para identificar se o receptor A2A teria um efeito inibitório na fosforilação basal da

ERK 2, realizamos uma curva de concentração de DPMA, sem a prévia incubação com ADA. O efeito observado foi uma redução dose-dependente do nível de fosforilação basal da ERK 2 (Fig. 7). Estes dados sugerem que a ativação do receptor A2A pode reverter o efeito estimulatório do receptor A1 na

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Figura 5: A ativação do receptor A₁ estimula a fosforilação da ERK nas células gliais em cultura. A: Imagem representativa de um dos experimentos. B: Quantificação das condições experimentais realizadas nestes experimentos. As culturas foram pré-incubadas com ADA (0,5 U/ml) por 5´, na presença ou na ausência do DPCPX (10 μM), e em seguida, nas condições indicadas, foram tratadas com o agonista do receptor A₁, CHA (1 μM), por 3´. Os resultados estão expressos em % do controle e representam a média de pelo menos 3 experimentos ± desvio da média.

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Figura 6: Efeito do DPMA na fosforilação da ERK nas células gliais em cultura. A: Imagem representativa de um dos experimentos. B: Quantificação das condições

experimentais realizadas nestes experimentos. As culturas foram pré-incubadas com ADA (0,5 U/ml) por 5´, e em seguida, nas condições indicadas, foram tratadas com o agonista do receptor A₁, CHA (1 μM), ou DPMA (1 μM), agonista do receptor A_2A, isolados ou simultaneamente, por 3´. Os resultados estão expressos em % do controle e representam a média de pelo menos 3 experimentos ± desvio da média.

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Figura 7: Inibição da ERK em células gliais por ativação do receptor A_2A é dose dependente. A: Imagem representativa do experimento. B: Quantificação das condições experimentais realizadas nestes experimentos. As culturas foram tratadas com DPMA em diferentes doses por 5´. O resultado acima foi realizado uma vez, sendo que um outro experimento foi realizado e o resultado obtido foi similar ao apresentado acima

4.3) A fosforilação de ERK 2 induzida por receptor A1 de adenosina é mediada

pela via clássica de fosforilação das MAPKs

Como mencionado anteriormente, as ERKs 1/2 fazem parte da família de MAPKs. Estas enzimas fazem parte de módulos de quinases ativadas de modo sequencial. A primeira enzima deste módulo pertence à família das Raf quinases (ou MAPKKK), sendo ativada, de modo geral, pela proteína G monomérica Ras. A proteína quinase Raf ativa pode estimular, em seguida, uma proteína quinase da família da MEK (MAPKK), constituída de MEK-1 e MEK-2. Finalmente, a MEK ativada irá fosforilar e ativar as MAPKs ERK-1 e ERK-2.