Esquema 6: Representação da estrutura laminar da retina (Retirado de
3) METODOLOGIA 3.1) Materiais
Adenosina, BSA, CHA, CHE, DPCPX, DPMA, Glutamina, NECA, Penicilina e Estreptomicina foram obtidas da Sigma/RBI Chem.Co. (Missouri, Estados Unidos). BME, CMF, MEM, Soro Fetal Bovino e Tripsina foram obtidas da GIBCO (Nova York, Estados Unidos). ADA e U0126 foram obtidas da Calbiochem (Califórnia, Estados Unidos). PD 98059 e PP1 foram obtidas da Biomol (Pensilvânia, Estados Unidos). [3H] Adenosina (16Ci/mmol), Kit ECL e anticorpos secundários anti-camundongo e anti-coelho conjugados à peroxidase foram obtidas da Amersham (Buckinghamshire, Inglaterra). O anticorpo monoclonal de camundongo contra p-ERK foi obtido da Cell Signaling (Madison, Estados Unidos) e o anticorpo policlonal de coelho contra ERK Total foi obtido da Promega (Madison, Estados Unidos).
Todos os outros reagentes foram de pureza analítica.
3.2) Obtenção de culturas mistas de embrião de pinto:
Ovos de galinha fertilizados da espécie White Leghorn foram obtidos a partir de uma granja local e eram mantidos em uma incubadora a 38 0C em atmosfera umidificada. Culturas em monocamada de células de retina de pinto foram preparadas como previamente descrito (de Mello et al., 1978). Resumidamente, as retinas de embrião de pinto de 8 dias (E8) foram dissecadas dos demais tecidos oculares, incluindo o epitélio pigmentar, em solução salina livre de cálcio e magnésio (CMF) (NaCl, 131 mM; KCl, 4.09 mM; NaH2PO4.7H2O, 0.92 mM; KH2PO4, 0.45 mM;
glucose.H2O, 12.2 mM; NaHCO3, 9.4 mM) e dissociadas quimicamente com tripsina
0,1% em uma solução CMF por 20 minutos a 37ºC. Em seguida, a solução foi retirada e as retinas foram suspensas em meio basal de Eagle (BME) suplementado com 5% de soro fetal bovino inativado termicamente, penicilina (100U/mL) e estreptomicina (100μg/mL), dissociadas mecanicamente e semeadas em placas de
cultura de 40mm de diâmetro, seguindo a proporção de meia retina por placa de cultura. As culturas foram mantidas a 37ºC em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. O meio de cultura foi trocado com 1 dia de cultura (C1). Os experimentos
foram realizados após 3 dias em cultura (C3).
Nos experimentos de captação de (3 H) Adenosina, as células foram mantidas
em meio essencial mínimo (MEM), suplementado da mesma maneira como descrito anteriormente para o meio BME, semeadas em placas de 24 poços na densidade de 2,5 x 106 células/poço, sendo o volume final de cada poço de 0,5 ml, e foram mantidas sob as mesmas condições descritas anteriormente. Os experimentos foram realizados após 3 ou 4 dias em cultura (C3-C4).
3.3) Obtenção de culturas purificadas de glia de retina de embrião de pinto: As culturas purificadas de glia foram obtidas através de um protocolo semelhante àquele utilizado para a preparação das culturas mistas, porém usando células de embrião de pinto de 11 dias (E11), na densidade de 1,65 x 106 células/ ml. Nos experimentos para identificação da marcação de p-ERK em glia, as células foram mantidas em BME ou MEM, enquanto que nos experimentos de captação de (3 H) Adenosina as células foram mantidas em MEM. A troca de meio foi realizada em C3, C7, C10, C14 e C17. Os experimentos foram realizados em culturas de 20 a 21 dias (C20-C21) de idade.
3.4) Preparo das amostras celulares para análise em gel de poliacrilamida: Após a realização dos experimentos, onde as culturas mistas ou purificadas de glia foram incubadas com drogas específicas, a solução de Hank’s com as diferentes drogas foi aspirada da placa e substituída por tampão de amostra para eletroforese (10% glicerol, 100mM 2-mercaptoetanol, 2%SDS). As amostras foram aquecidas a 100oC por 6 minutos para promover a desnaturação das proteínas e em
de proteínas foi realizada através do método de Bradford (Bradford MM, 1976). Uma vez determinada a concentração de proteínas de cada amostra, foi adicionado o corante azul de bromofenol em uma concentração final de 0,02%.
3.5) Fracionamento em gel desnaturante de poliacrilamida e transferência das proteínas para membrana PVDF
Os géis de poliacrilamida contendo SDS foram preparados de acordo com o protocolo descrito por Laemli (1970), sendo que o gel de corrida tinha a concentração de 9% de acrilamida. Após a aplicação dos extratos protéicos no gel, as proteínas migraram em função de seus pesos moleculares. Ao final da corrida, o gel de separação foi retirado da placa e as proteínas transferidas para a membrana de PVDF por eletrodifusão, conforme descrito por Towbin et al. (1979).
3.6) Incubação da membrana com anticorpos específicos e revelação do Western Blot
A membrana PVDF contendo as proteínas foi inicialmente incubada com 5% de leite desnatado em solução tampão de Tris (TBS) pH 7,6 contendo 0,1% Tween (TBS-T), por 1 hora, para bloquear a adsorção inespecífica dos anticorpos. Em seguida, a membrana foi incubada com anticorpos específicos (1:2000 anti p-ERK e 1:5000 anti ERK total), nas diluições recomendadas pelo fabricante, em TBS-T por toda a noite a 40 C. No dia seguinte, após 3 lavagens sucessivas em TBS-T, a membrana foi incubada, por período de 1 hora com um anticorpo secundário (1:5000 para ambos os anticorpos secundários), capaz de reconhecer e ligar-se ao anticorpo primário. Em seguida, a membrana foi lavada por 3 vezes em TBS-T e, por último, realizou-se uma lavagem em TBS. A imunodetecção das proteínas específicas foi promovida pela reação quimioluminescente do sistema ECL, catalisada pela enzima peroxidase conjugada ao anticorpo secundário.
Em alguns experimentos, para a realização do controle do carregamento, após a revelação as membranas foram lavadas em água milli-Q e, em seguida, incubadas em uma solução de glicina 0,2M pH 2,2 por 30 minutos sob agitação suave para a retirada dos anticorpos ligados à membrana. Após este período, as membranas foram lavadas por 3 vezes em TBS e, em seguida, realizou-se o mesmo procedimento de bloqueio e incubação com os anticorpos descritos anteriormente.
O nível de fosforilação da ERK foi determinado pela análise densitométrica das imagens dos filmes obtidos na reação de quimioluminescência, utilizando-se um Scanner e o programa Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD, Estados Unidos).
3.7) Experimentos de captação de [3H] Adenosina
No inicio dos experimentos, o meio das culturas foi retirado e as placas lavadas 2 vezes com Hank´s (NaCl 140 mM; KCl 5 mM; Hepes 20 mM; glucose 4 mM; MgCl2
1 mM; CaCl2 2 mM). Em seguida, as células foram pré-incubadas por 15 minutos na
ausência ou presença de diferentes drogas e incubadas com (3H) Adenosina
(0.5 μCi/ml) por 15 minutos. Após este tempo, novamente as culturas foram lavadas 2 vezes com Hank´s, lisadas com água para determinação da radioatividade intracelular e armazenadas no freezer a -20 0C.
Posteriormente, as amostras foram descongeladas e a radioatividade determinada por contagem em cintilação líquida.
3.8) Análise Estatística
Os dados foram analisados pelo teste t de student ou por ANOVA seguido pelo pós- teste de Bonferroni, com a utilização do programa GraphPad Prism.
4) RESULTADOS
Com o objetivo de avaliar a modulação da fosforilação da ERK 2 por receptores de adenosina em diferentes tipos de culturas de células de retina, utilizamos a técnica de western blot. Esta metodologia permite determinar, através da utilização de anticorpos específicos, o nível de fosforilação da enzima. Conforme descrito na literatura, o nível de atividade desta enzima pode ser diretamente relacionado ao seu nível de fosforilação (Schulte e Fredholm, 2003). Neste trabalho, a detecção da MAP quinase é referida como sendo a ERK 2 porque foi demonstrado que na retina de pinto a marcação do anticorpo anti-fosfo-ERK 1/2 revela somente uma banda, que foi identificada como ERK 2 pelo fato de co-migrar com a ERK 2 humana (Désiré et al., 2000).
Inicialmente, avaliamos os níveis de fosforilação de ERK 2 em culturas mistas e purificadas de células gliais incubadas com o agonista não-seletivo para receptores de adenosina NECA (Fig. 1). A incubação de culturas purificadas de glia com NECA (10μM), por período de 5 minutos, induziu aumento de cerca de 2,5
vezes no nível de fosforilação de ERK 2, em comparação às células não- estimuladas. Por outro lado, não conseguimos detectar um estímulo de fosforilação de ERK 2 com esta mesma droga em culturas mistas de 3 ou 21 dias. Sendo assim, decidimos investigar os mecanismos envolvidos na regulação da fosforilação de ERK 2 por receptores de adenosina nas células da glia de Muller.
Em seguida, avaliamos o curso-temporal de fosforilação da ERK 2 induzida por NECA em culturas purificadas de glia e observamos um nível máximo de ativação após 3 minutos de estímulo (Fig. 2). Após 10 min, o estímulo havia diminuído drasticamente, retornando ao nível basal após 20 minutos de estímulo. Este resultado demonstrou que a fosforilação da ERK 2 nas células gliais induzida por ativação de receptores de adenosina ocorre de modo transiente.