CARACTERÍSTICAS DA SOLUBILIDADE PROTÉICA E
ISOLAMENTO DA GLOBULINA PRINCIPAL DE CAUPÍ
(Vigna unguiculata (L.) Walp.) CULTIVAR BR 14-MULATO*
Valdir Augusto NEVES** Daniela Degan PEREIRA** Alexandra Hissae Rocha SHOSHIMA** Olga Luisa TAVANO**
RESUMO: O objetivo do trabalho foi determinar a com-posição química, características de solubilidade das pro-teínas e o isolamento da globulina principal de caupí cul-tivar BR-14 Mulato. A farinha descorticada apresentou 29,32% de proteína, 3,59% de cinzas, 1,4% de extrato etéreo. A solubilidade das proteínas da farinha mostrou-se dependente das condições de extração, tais como: tipo e concentração de sal, tempo e pH. A extração fracionada e seqüencial das proteínas mostrou que 77,94% da proteína total foi solubilizada, a fração globulina com 41,99% do total, seguido da albumina 10,11% e glutelina 7,81%. A globulina principal isolada e submeti-da à cromatografia de filtração em gel mostrou um peso molecular de 174 kDa. Apresentou um elevado grau de homogeneidade na eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio, revelando ser consti-tuída de cerca de 5 subunidades, com predomínio de duas majoritárias na faixa de 40 a 50 kDa e um teor de glícides de 1,10%.
PALAVRAS-CHAVE: Caupí BR-14 MULATO; Vigna unguiculata; composição química; solubilidade; fracionamento.
Introdução
As plantas da família das leguminosas são cultiva-das em todo o mundo, compreendendo 600 gêneros em apro-ximadamente 19.000 espécies, porém apenas 15 a 20 espécies têm significado econômico03. As proteínas de reserva de
al-guns gêneros e espécies de leguminosas representam, jun-tamente com os cereais, a principal fonte protéica da dieta humana, sobretudo nas regiões onde o consumo de proteí-na animal é reduzido03,09,15. As sementes de leguminosas
uti-lizadas na alimentação humana contêm cerca de 20 a 30% de proteína, exceto a soja e o tremoço, cujos teores protéicos situam-se na faixa de 40% e mais30. Em algumas regiões do
mundo, as sementes de leguminosas são a única fonte de
proteína na dieta12, 14.
Devido ao seu elevado teor protéico as leguminosas têm sido utilizadas na produção de concentrados, isolados protéicos e incorporação a outros alimentos. Diferentes pro-cedimentos de extração têm se mostrado variáveis quanto a sua eficiência de acordo com uma série de fatores; Sgarbieri30,
utilizando um mesmo meio extrator, observou variações de solubilidade em 10 espécies de diferentes variedades de leguminosas; comportamento semelhante foi verificado por vários autores e para diferentes condições experimentais; tais como: tipo e concentração de sal e pH 01,21,25,29.
A literatura existente sobre extração, caracterização química e bioquímica, e composição de aminoácidos de pro-teínas do feijão-comum (Phaseolus vulgaris), da soja (Glicine max.) e da ervilha (Pisum sativum) é abundante; no entanto, no que diz respeito às proteínas do caupí (Vigna unguiculata) os estudos são incompletos13,27, o que não permite a
elabo-ração de painel abrangente e conclusivo a respeito das ca-racterísticas das diferentes frações protéicas dessa leguminosa.
O caupí, feijão-de-corda ou feijão macassar (Vigna unguiculata (L.) Walp) é uma cultura muito disseminada nas áreas semi-áridas do Nordeste brasileiro, tendo um impor-tante papel sócio-econômico para a população rural. A culti-var "BR 14-Mulato", utilizada nesse trabalho, foi obtida a partir de cruzamento entre as cultivares CNC0434 nigeriano e a BR1-POTY (CNCx27-2E). A CNC0434 possui imunidade ao mosaico severo do caupí (CpSMV-Cowpeq Severe Mosaic Vírus) do grupo Comovirus e ao mosaico severo do caupí (CpGMV-Cowpeq Golden Mosaic Vírus) do grupo Geminivirus. A BR1-POTY foi obtida do cruzamento Pitiuba x Tvu 410, apresenta resistência ao vírus do grupo Potyvírus (transmitidos por pulgões), como CpAMV-Cowpea Aphidborn Mosaic Vírus. A cultivar "BR 14-Mulato" possui algumas características agronômicas importantes e apresen-ta alapresen-ta produtividade, alcançando rendimento de até 62,5% superior a cultivares locais, em condições de sequeiro, e quando irrigado a produtividade é cinco vezes maior que cultivares locais. A fração protéica total das sementes é uma
*Trabalho elaborado com o auxílio do Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP (Processo PADC-FCF-UNESP n° 2003/24-IV) e bolsas concedidas pela FAPESP (Processo n° 00/14019-5 e 00/14020-3).
mistura complexa de globulinas, albuminas, prolaminas e glutelinas, sendo as duas primeiras os principais componen-tes09. A proporção dessas frações na proteina total difere
entre as espécies, variedades e/ou cultivares leguminosas09,25,30, o que explica as diferenças de suas
pro-priedades funcionais e sua qualidade nutricional. A globulina é a fração protéica principal representando 50-70% do to-tal05,09,20,25,28,29. Há dois tipos de globulinas nas sementes: as
vicilinas e as leguminas com coeficientes de sedimentação em ultracentrifugação de 7S e 11S, respectivamente22.
Para quantificar com rigor a participação de cada pro-teína é essencial estabelecer condições de extração, tais como: a concentração e tipo de sal, o pH e a proporção massa de material e volume de meio extrator 04,10,21,25,29. As
característi-cas de solubilidade destas proteínas apresentam-se distin-tas; os métodos de isolamento das frações baseiam-se na solubilidade diferencial em meio salino e o isolamento e ca-racterização, em várias espécies, tem revelado a presença de frações com propriedades físico-químicas e nutricionais dis-tintas05, 07, 08, 09, 10, 21, 29, 31.
Nesse sentido esse trabalho procura estender os co-nhecimentos até agora acumulados sobre a proteína do caupí (Vigna unguiculata (L.) Walp.), e apresenta os seguintes propósitos:
- determinar a composição química do caupí cultivar "BR 14-Mulato";
- realizar estudo de solubilidade da proteína em fun-ção de diferentes variáveis;
- isolar e identificar as principais frações protéicas, - isolar e identificar a fração globulina principal; - determinar o teor de açúcares nas frações protéicas isoladas.
Material e métodos Material
Preparação da farinha
As sementes de caupí (Vigna unguiculata L. (Walp)), var. "BR 14-Mulato", provenientes da Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola-EBDA, foram escolhidas e lim-pas da sujidade. Os grãos embebidos em água (12h/4°C), descascados manualmente, os cotilédones separados e se-cos com aeração à temperatura de 50°C. O material foi moído em moinho de bolas e tamisado até passagem em tamis de 60 mesh. Seguiu-se o desengorduramento com hexano (1:8) à temperatura ambiente, com agitação constante. Obteve-se assim, após filtração e secagem à temperatura ambiente, a farinha desengordurada, que foi estocada em frasco apro-priado e armazenada à temperatura de 4°C.
Métodos
Composição química
Umidade, extrato etéreo, fibra, cinzas, proteína bruta e carboidratos foram determinados pelos métodos oficiais da AOAC02. O nitrogênio total foi determinado pelo método
de Kjeldahl02. O teor de proteína foi estimado
multiplicando-se a porcentagem de nitrogênio total pelo fator de conver-são de 6,25. A proteína também foi determinada pelo método de Lowry et al.17 utilizando-se albumina de soro bovino como
padrão.
Otimização de extração da proteína da farinha da semente Solubilidade protéica: o efeito da relação massa de farinha:solvente (1:10, 1:20, 1:30 e 1:50) e do tempo na solubi-lidade das frações protéicas foram obtidas pela dispersão de alíquotas de farinha descorticada em solução de NaCl 1,0 M, pH 7,0; seguido de homogeneização, em agitador magnéti-co, por uma hora a 4oC e de centrifugação (15000 g/40 min/
4°C). O efeito de pH na solubilidade protéica foi realizado conforme descrito acima com o pH da solução ajustado por adição de HCl/NaOH 2,0 N e a uma relação massa x solvente de 1:20. Na medida do efeito conjunto de pH e sal, a farinha descorticada foi dispersa em água destilada-desionizada (re-lação 1:20), feita a adição de sal até a concentração desejada, o pH ajustado e seguido o procedimento citado para solubi-lidade, exceto que a proteína foi determinada pelo método de Lowry et al.17. O efeito do tipo e concentração de sal na
solubilidade da proteína foi realizado numa relação farinha solvente de 1:20 e sem ajustes de pH.
Fracionamento das proteínas.
Alíquotas da farinha foram homogeneizadas, numa relação massa x solvente de 1:10, com água destilada a 4oC
por uma hora e centrifugadas a 15000 g/40 min/4°C. O resí-duo (R1) foi separado e o sobrenadante (S1) extensivamente dialisado a 4oC contra água destilada-desionizada por 24
horas. O dialisado foi centrifugado (15000 g/40 min/4°C) para remoção de parte das proteínas insolúveis em água (globulina A). O sobrenadante foi liofilizado e constituía as albuminas. O resíduo R1 foi ressolubilizado em NaCl 0,5 M, homogeneizado e centrifugado conforme citado acima. O resíduo R2 foi separado e o sobrenadante (S2) dialisado con-tra água destilada-desionizada por 24 horas com sucessivas mudanças do solvente. Após centrifugação o precipitado representou a proteína insolúvel em água (globulina B). Ambas frações (globulina A e B) foram reunidas e liofilizadas. O resíduo R2 foi homogeneizado numa mistura de etanol-água 75%, centrifugado como citado acima e o sobrenadante constituiu as prolaminas. O precipitado da extração etanol-água foi seco, ressuspenso em NaOH 0,1 N (relação 1:10) tratado como citado acima para as outras frações e sobrenadante e precipitado liofilizados, correspondendo a fração glutelina e insolúvel, respectivamente.
Extração da globulina principal.
A fração globulina principal foi isolada de acordo com método proposto por Aluko & Yada01 e submetida à
cromatografia em filtração em gel e eletroforese. Cromatografia de filtração em gel.
princi-pal foram, separadamente, cromatografadas em coluna con-tendo resina de Sephacryl S-300 HR (1,0 x 110 cm) previamente equilibrada com tampão fosfato de potássio 5,0 mM em pH 7,5, contendo 0,5 M de NaCl e 0,05% de azida sódica. O perfil da eluição foi acompanhado registrando-se leitura a 280 nm. Do material obtido, foram retiradas alíquotas para a determinação de proteína pelo método de Lowry et al17, para eletroforese em
gel de poliacrilamida-SDS e para determinação de açúcar pelo método de Dubois et al11.
Estimativa do peso molecular por cromatografia de filtração em gel
A estimativa do peso molecular da globulina principal foi feita com o auxílio de cromatografia em gel de Sephacryl S-300 HR (1,0 x 110 cm), previamente equilibrada com tampão fosfato de potássio 5,0 mM em pH 7,5, contendo 0,5 M de NaCl e 0,05% de azida sódica. As proteínas usadas como padrões foram: citocromo C (12,4 kDa), lactato desidrogenase (130 kDa), ferritina (480 kDa), tireoglobulina (680 kDa) e albumina do soro bovino (66 kDa). Os volumes de eluição das proteínas (Ve) foram determinados medindo-se a absorvância a 280 nm. O comprimento de onda adotado para a medida do citocromo C foi 550 nm. O volume de exclusão da coluna (Vo) foi determina-do com azul de dextrana 2000.
Eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio A determinação do número e dos pesos moleculares das subunidades foi realizada em eletroforese de gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio, sistema de pH descontínuo, utilizando o procedimento descrito por Laemmli16.
Na curva de calibração foram utilizadas as seguintes proteínas de pesos moleculares conhecidos: albumina de soro bovino (66 kDa), ovoalbumina (43 kDa), anidrase carbônica (30 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa), fosforilase b (94 kDa) e lactalbumina (14,4 kDa). O gel foi corado por imersão em solu-ção de coomassie blue R-250 (0,1% de coomassie blue R-250 em 40 % de metanol e 10 % de ácido acético glacial) durante 30 minutos e descorado também por imersão em solução de ácido acético glacial, metanol e água destilada (40 % de metanol e 10 % de ácido acético).
Determinação de açúcares
A determinação do teor de açúcares foi feita
utilizando-se o reagente Fenol-ácido sulfúrico como descrito por Dubois et al11, e solução de glicose como padrão. As amostras não
purificadas sofreram precipitação por TCA (ácido tricloroacético) a 10%, seguida de centrifugação a 7600 rpm/15 min/4°C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado nova-mente ressuspendido em TCA 10 %, centrifugado e então o novo precipitado ressuspendido em tampão borato / KOH 0,1 M em pH 9,5. Esta solução final, contendo a proteína, foi utilizada na determinação do teor de açúcar.
Análises Estatísticas
Os resultados foram analisados estatisticamente por análise de variância, adotando-se p 0,05.
Resultados e discussão
Os resultados da composição química da farinha de caupí, cultivar "BR 14- MULATO" com casca e descorticada, estão apresentadas nas Tabelas 1 e 2. As análises foram reali-zadas em triplicatas para cada amostra. Encontra-se na litera-tura uma variação de 18 a 35 % no teor de proteína de diversas variedades de caupí18, portanto esses resultados situam-se
dentro do esperado. Valor médio de 29,3 % de proteína foi encontrado em estudo com outra variedade de caupí23. A fibra
bruta, como já era esperado, teve seus valores superiores nas amostras da farinha com casca, sendo que a concentração de fibra está diretamente relacionada ao conteúdo de casca. Na literatura resultado de 6,66 % de fibras tem sido registrado em estudo com caupí23. O caupí contém baixo teor de lipídeos
estando esses presentes na faixa de 0,7 a 3,5 %26. Os teores de
cinzas não sofreram grandes alterações nas farinhas analisa-das, mesmo após desengorduramento. Os resultados encon-trados estavam bem próximos aqueles da literatura (3,4 a 4,9 %)18. O feijão de corda contém de 50 a 60 % de carboidratos26.
O valor médio da concentração de carboidratos não sofreu grandes alterações após desengorduramento, sendo encon-trado teores de 53,18 % para a farinha integral com casca e 52,44 % da mesma farinha, após desengorduramento.
Podemos notar que os resultados da Tabela 3 demons-tram não haver diferenças expressivas no que diz respeito a % de proteína extraída em função da variação da relação massa de farinha:volume de extrator. Observando os resultados da Ta-bela 4 verifica-se que o tempo de 15 minutos de extração já se torna satisfatório, não havendo aumentos expressivos no de-correr da variação do tempo de extração entre 30 e 90 min.
Tabela 1 - Composição centesimal da farinha do caupí (Vigna unguiculata L. WALP), BR-14 Mulato
Componente Farinha integral* (%) Farinha desengordurada (%) Umidade 9,45 0,14 9,58 0,81 Proteínas 24,66 0,24 25,48 0,19 Lipídeo 3,01 0,02 1,62 0,023 Fibras 6,35 0,87 7,79 0,14 Cinzas 3,35 0,02 3,09 0,00 Carboidratos 53,18 52,44
Tabela 2 - Composição centesimal da farinha do caupí (Vigna unguiculata L. WALP), BR-14 Mulato
Componente Farinha integral* (%) Farinha desengordurada (%) Umidade 7,12 0,13 9,04 0,09 Proteínas 27,99 0,10 29,32 0,40 Lípides 2,98 0,02 1,40 0,014 Fibras 2,46 0,88 5,42 0,40 Cinzas 3,14 0,06 3,59 0,31 Carboidratos 56,31 51,23
* sem casca. Resultados representam médias desvio padrão de três determinações.
Tabela 4 - Efeito do tempo de homogeneização na solubilida-de da proteína da farinha do caupí (Vigna unguiculata L. WALP), BR-14 Mulato*
A solubilidade das proteínas é o resultado, entre ou-tros fatores, da interação polar com o solvente, interações iônicas com sal presente na solução e de forças eletrostáticas de repulsão. O pH afeta a natureza e a distribuição de cargas da proteína, por isso as proteínas apresentam diferenças de solubilidade em função do pH do solvente e, de um modo geral, esta é maior em pH alcalino, mínima na faixa de pH 4,0 a 5,0, com algumas proteínas apresentando alta solubilidade em extremos de pH ácido. O efeito combinado de pH e con-centração salina na solubilidade foi verificado e a análise da Tabela 5 indica que nos pHs 4,0 a 5,0 obtivemos a menor solubilidade na ausência de sal, sendo o pH 4,5 com a míni-ma solubilidade (pI). A adição de NaCl em concentrações crescentes provocou alterações nos perfis da curvas de so-lubilidade com progressiva redução na soso-lubilidade em va-lores de pHs ácidos. A possível explicação para esse com-portamento é que abaixo de pH 4,0-4,5 e a baixa força ionica, o número de cargas positivas da molécula tende a aumentar, e essa protonação exerce um efeito de expansão da molécula por repulsão o que aumenta sua solubilidade. A presença do sal em concentrações crescentes acarretaria no rompimento
dessas forças, redução de interações por pontes de hidrogê-nio, aumento na hidrofobicidade de superfície e formação de agregados moleculares por interação hidrofóbica, com refle-xos na solubilidade.
Em estudo realizado com caupí verificou-se mínima solubilidade em faixa de pH de 4,0 a 8,0 e máxima solubilidade em pH 2,0 e 12,024. El-Sayed-Abdel-Aal et al13 obtiveram,
para a farinha de grão-de-bico, mínimo de solubilidade na faixa de pH entre 3,5 a 4,2 e máximo de solubilidade nos pHs inferiores a 3,0 e superiores a 8,0. Os autores verificaram que o máximo de solubilidade das proteínas ocorreu com adição de NaCl 0,5 M.
O efeito de diferentes sais na extração mostra uma dependência do tipo de sal, sua concentração e pH da solu-ção. Podemos notar na Tabela 6 que próximo aos valores de pHs alcalinos houve uma maior solubilização na dependên-cia do sal. Neves25 estudou o efeito de sais e do hidróxido de
sódio na solubilização das proteínas da lentilha e verificou que o Na2CO3 1,0 % e NaOH 0,02 % foram os mais eficientes, enquanto o NaH2PO4, na faixa de pH ácido, mostrou o menor índice de solubilização entre vários sais utilizados.
Tabela 3 - Efeito da proporção massa-volume na extração de proteínas da farinha de caupí (Vigna unguiculata L. WALP), BR-14 Mulato* Tempo de homogeneização (min) Proteína solubilizada** (%) 15 70,48a 0,65 30 71,49b 0,00 60 69,55a 0,93 90 74,70c 1,74
* solvente utilizado NaCl 1,0 M, pH 7,0, relação massa-volume 1:10. * * determinada pelo método de Lowry et al17. Resultados representam médias desvio padrão de três determinações. Valores contendo letras iguais sobrescritas não apresentam diferenças significativas (p<0,05).
* solvente utilizado na extração: NaCl 1,0 M, pH 7,0; tempo de extração 60 minutos.
** determinada pelo método de Lowry et al17. Resultados representam médias desvio padrão de três determinações. Valores contendo letras iguais sobrescritas não apresentam diferenças significativas (p<0,05).
Proporção massa:volume Proteína solubilizada** (%) 1:10 73,15a 0,22 1:20 68,94b 1,74 1:30 69,63b 0,65 1:50 76,52c 1,31
Tabela 5 - Efeito do pH e NaCl na solubilização da proteína da farinha do caupí (Vigna unguiculata L. WALP), BR-14 Mulato*
Tabela 6 - Efeito do tipo de sal na solubilização das proteínas da farinha do caupí (Vigna unguiculata L. WALP), BR-14 Mulato*
Sal Concentração pH Proteína solubilizada**
% 0,5% 10,27 67,48a 0,87 1,0% 10,54 56,20b 0,00 Na2CO3 1,5% 10,68 71,86ac 3,90 0,02 N 10,81 72,75c 1,30 0,05 N 11,92 75,79c 3,48 NaOH 0,10 N 12,59 72,10c 0,43 0,2% 6,02 54,66bh 1,96 0,5% 5,92 33,82d 0,44 Hexametafosfato de sódio 1,0% 5,75 26,44e 0,22 0,2% 5,84 20,76f 1,09 0,5% 5,53 21,90f 0,87 Pirofosfato de sódio 1,0% 5,22 21,17f 0,65 0,5% 6,30 40,51g 0,22 1,0% 6,44 52,59h 1,09 Na2SO4 5,0% 6,35 58,52i 0,65 0,5% 6,65 39,13g 3,69 1,0% 6,37 46,07j 0,87 K2SO4 1,5% 6,45 56,93bi 2,39 0,5% 6,53 47,16j 2,18 1,0% 6,54 40,51g 1,09 Acetato de sódio 1,5% 6,69 45,13j 0,00
*extração conforme descrito em material e métodos. **determinada pelo método de Lowry et al17. Resultados representam médias desvio padrão de três determinações. Valores contendo letras iguais sobrescritas não apresentam diferenças significativas (p<0,05).
Proteína solubilizada** (%) NaCl (M)
pH Zero 0,1 0,3 0,5 1,0 2,0 79,72aA 0,22 70,97aB 0,65 62,37aC 6,15 65,29aC 2,39 43,83aD 0,44 3,0 76,12bA 1,30 44,97bB 0,0 50,32bC 0,56 51,26bC 1,34 24,39bD 3,05 4,0 14,11cAC 1,21 15,38cA 0,87 25,80cB 0,87 50,12bcC 2,39 11,52cE 1,52 4,5 10,38dA 0,22 14,88dB 2,61 28,32cdC 1,52 40,92cD 6,06 31,06dE 0,22 5,0 14,36cA 1,96 11,23dA 2,61 32,08dB 2,61 60,82aC 0,21 36,42eB 1,95 6,0 34,14eA 0,65 25,59eB 0,65 69,30aC 0,21 71,45dD 0,87 75,10fE 0,65 7,0 75,26bA 1,23 51,87fB 0,21 68,53aC 1,30 76,36eA 0,87 72,51gD 0,22 8,0 74,86bA 0,87 64,40agB 5,64 68,53aB 0,87 82,20fC 1,74 74,05fA 0,65 9,0 80,33afA 1,52 64,96gB 0,21 69,59aBC 3,95 68,95adC 2,82 69,34hC 0,22
10,0 81,02afgA 1,96 79,24hAB 2,95 72,83aeB 3,82 76,63eAB 1,08 76,72fB 1,30
11,0 81,91fgA 1,52 73,44iB 0,87 78,51eA 2,95 88,44gC 1,08 80,82iA 1,12
12,0 88,44gAD 1,52 75,81hB 0,87 83,13fAC 0,86 82,19fC 0,44 85,16jD 0,65
*relação massa-volume 1:20 em qualquer das extrações conforme descrito em material e métodos **determinada pelo método de Lowry et al17
. Resultados representam médias desvio padrão de três determinações. Valores contendo letras iguais sobrescritas (minúsculas para colunas e maiúsculas para linhas) não apresentam diferenças significativas(p<0,05).
A extração e isolamento sequencial das frações protéicas levou à solubilização de aproximadamente 78 % da proteína total da farinha (Tabela 7). A fração globulina do caupí é predominante, em comparação às outras, correspondendo a 41,99% da proteína total da semente, seguida das frações albumina e glutelina. A fração prolamina encontra-se em quantidades mínimas nas leguminosas em geral29, e por isso não foi quantificada.
Sathe & Salunkhe29 registraram valores para
globulina e albumina de 73,4 e 21,18 %, respectiva-mente, para Phaseolus vulgaris. Mahajan et al.18
rela-taram valores para as frações globulina e albumina do Vigna mungo de 62,81 e 12,06 %, respectivamente. Bhatty04 também verificou variações destas frações
em oito diferentes espécies de leguminosas, onde o conteúdo de albumina e globulina destas leguminosas variaram de 8,1 a 14,1 % de albumina e de 30,5 a 42 % de globulina. Neves et al26 obtiveram 42 e 11% para
globulina e albumina, respectivamente, com fração dialisável de 22,7% para lentilha comercial do tipo Chileno, enquanto valores de 49,8 e 9,87% para as mesmas frações foram registrados para lentilha var. Precoz. Por outro lado, Deshpande & Nielsen10
en-contraram variações de 31 a 46% e de 29,5 a 51,6% de nitrogênio solúvel para as frações hidrosolúveis e solúveis em sal em 11 variedades de feijão. Grandes variações podem ser esperadas para essas frações numa dependência do método de extração e alguns autores04,10 sugerem que as diferenças encontradas na
literatura decorrem, possivelmente, da contaminação cruzada das proteínas hidrosolúveis e solúveis em sal o que acarreta numa dependência do método de extra-ção utilizado.
Levando-se em conta o procedimento proposto por Aluko & Yada01, utilizado nesse trabalho, o
percentual de rendimento na extração da globulina principal foi de 45,54 em relação ao total de proteínas inicialmente presente na amostra. A globulina princi-pal representou 23,82 % da proteína total da farinha, correspondendo a 63,98 % da fração globulina total.
O perfil cromatográfico em coluna de Sephacryl S-300 das frações albumina, globulina total e globulina principal
es-Tabela 7 - Composição das frações protéicas da farinha descorticada desengordurada do caupí, cultivar "BR 14-Mulato*. Fração % Proteína/ Farinha % Proteína/ Total de proteína Farinha descorticada 29,32 100 Solúveis em sal 22,86 1,68 77,94 5,71 Albumina 2,97 0,46 10,11 1,57 Globulina Total 12,31 0,45 41,99 1,54 Prolamina** - - Glutelina 2,29 0,30 7,81 1,049 Resíduo Final 1,88 0,15 6,4 0,52
* Utilizou-se como base de cálculo 29,32 % de proteína na farinha decorticada e desengordurada. ** Não foi quantificada. Resultados representam médias desvio padrão de três determinações.
tão presentes nas Figuras 1, 2 e 3, respectivamente. Observa-mos na Figura 1 a presença de diversos picos de proteínas mostrando ser essa fração heterogênea, um aspecto caracte-rístico de albuminas de leguminosas por constituírem-se de diferentes proteínas metabólicas.
Na Figura 2, pode-se observar a presença de picos com absorção a 280 nm, os dois primeiros apresentam proteínas com características físicas semelhantes. Nos últimos dois pi-cos eluídos não foi detectado proteína, quando determinada pelo método de Lowry et al17. Por outro lado, o perfil de eluição
da globulina principal (Figura 3) apresentou apenas um pico de proteína, onde a totalidade da proteína aplicada foi eluída no mesmo. Isso demonstra uma única forma de proteína com peso molecular nessa faixa de eluição, fato comprovado na eletroforese.
O gráfico de relação Ve / Vo, contra o logaritmo do peso molecular (não mostrado) permitiu estimar o peso molecular para a globulina principal de caupí em 174 ± 10 kDa. O peso molecular das proteínas em diferentes espécies de leguminosas pode apresentar variações na dependência de vários fatores. Segundo Derbyshire et al09, as globulinas tipo vicilina, com
coeficiente de sedimentação 7S, apresentam pesos moleculares na faixa entre 140000 e 200000 daltons. Dessa forma a globulina principal do caupí extraída e isolada nesse trabalho corresponde a uma proteína do tipo vicilina.
Podemos notar nas eletroforeses da Figura 4 que as frações protéicas majoritárias apresentam subunidades com pesos moleculares na faixa de 43 a 66 kDa. A eletroforese da globulina total isolada revela que essa fração protéica é cons-tituída por no mínimo 6 cadeias polipeptídicas, com pesos moleculares na faixa de 14,4 a 66 kDa, com a predominância de 3 bandas maiores na faixa de 40 a 60 kDa. Na eletroforese a globulina principal isolada mostra-se praticamente a mesma após passagem na coluna de Sephacryl S-300 indicando a pre-sença de ao menos 5 polipeptídeos com dois majoritários na faixa de 40 a 50 kDa, típico de fração 7 S de leguminosas19,20,32.
Mandaokar et al19 verificaram que a vicilina purificada do grão
de bico é constituída de 5 polipeptídeos principais que se apre-sentam na faixa de pesos moleculares entre 14 a 45 kDa. O teor de açúcares foi determinado nas frações protéicas do caupí e os resultados encontram-se na Tabela 8, expressos como percentuais de glícides na massa total de proteína da fração.
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93 Frações (n°) A b s o rv â n c ia a 2 8 0 n m
FIGURA 1 - Perfil cromatográfico da fração albumina do caupí, cultivar "BR 14-MULATO", em coluna de Sephacryl S- 300 HR (1,0 x 110 cm). A proteína foi eluída com auxílio de tampão fosfato de potássio 5,0 mM em pH 7,5 contendo 0,5 M de NaCl e 0,05% de azida sódica, volumes de 4,0 mL foram coletados por fração. 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93 Frações (nº) A b s o rv â n c ia a 2 8 0 n m
FIGURA 2 - Perfil cromatográfico da fração globulina to-tal do caupí, (Vigna unguiculata Walp) cultivar "BR 14-MULATO", em coluna de Sephacril S- 300 HR (1,0 x 110 cm). A proteína foi eluída com auxílio de tampão fosfato de potássio 5,0 mM em pH 7,5, contendo 0,5 M de NaCl e 0,05% de azida sódica, volumes de 5,0 mL foram coletados por fração.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 Frações (nº) A b s o rv â n c ia a 2 8 0 n m kDa
94 66 43 30 20,1 14,4
PM 1 2 3 4 PM
FIGURA 3 - Perfil cromatográfico da fração globulina
prin-cipal do caupí, (Vigna unguiculata Walp) cultivar "BR 14-MULATO", em coluna de Sephacril S- 300 HR (1,0 x 110 cm). A proteína foi eluída com auxílio de tampão fosfato de potássio 5,0 mM em pH 7,5, contendo 0,5 M de NaCl e 0,05% de azida sódica, volumes de 4,4 mL foram coletados por fração.
FIGURA 4 - Eletroforese em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio das proteínas do caupí. (1) Albumina, (2) Globulina Total isolada, (3) Globulina P rin cip al iso lad a, ( 4) Glo bu lin a Pr incipal cromatografada em coluna de Sephacryil S-300 (tubo pico 1).
Tabela 8 - Teor de açucares das frações protéicas de caupí (Vigna unguiculata L. WALP) cultivar "BR 14-MULATO"
Fração protéica Teor de açúcar (%)
Globulina principal purificada** 1,11
Globulina principal purificada*** 1,10
Globulina Total 1,30
Albumina 3,57
Glutelina 10,43
** correspondente ao pico nº 2 da globulina total em gel de Sephacryl S-300 *** correspondente ao pico nº 1 da globulina principal em gel de Sephacryl S-300
Segundo Derbyshire et al09, o conteúdo de
carboidratos para globulina tipo legumina (11S) entre as leguminosas, Glycine max, Arachis hypogaea, Phaseolus aureus, Vicia faba, Phaseolus vulgaris e Brassica ssp, é menor que 1,0 %. Por outro lado o teor de açúcares da fração vicilina (7S) apresenta grandes variações situando-se entre 2-5 % com algumas espécies atingindo até 10%. Wright33
relatou de 1,2-5,5 % de açúcar em globulinas de Phaseolus vulgaris.
Conclusões
O feijão-de-corda (Vigna unguiculata L. Walp var. BR 14-Mulato) apresentou composição protéica semelhante à de outras variedades citadas na literatura. A extração da farinha de caupí em NaCl 0,5 M e pH 7,0, em diferentes rela-ções massa-volume o efeito do tempo de homogeneização não apresentaram diferenças expressivas nas % de proteína extraída. No ultimo caso não houve aumentos expressivos no decorrer da variação acima de 15 minutos. De um modo geral, a solubilidade das proteínas é maior em pH alcalino, mínima na faixa do pI de 4,0 a 5,0 e algumas apresentam solubilidade em extremos de pH ácido. O uso de NaCl 0,5 M na extração promoveu maior solubilidade dentre as diferen-tes concentrações do sal. O efeito de diferendiferen-tes sais na ex-tração mostrou uma dependência do tipo de sal, sua concen-tração e pH na solução. A globulina principal representou 23,82 % da proteína total da farinha correspondendo a 63,98 % da fração globulina total. A fração albumina se apresenta heterogênea com diversos picos de proteínas, um aspecto característico de albuminas de leguminosas, contrário da fra-ção globulina principal que apresenta um só pico de proteí-na demonstrando uma única forma molecular. O peso molecular estimado para a globulina principal foi 174 ± 10 kDa correspondendo a uma proteína do tipo vicilina (7S). O teor de carboidratos da globulina principal foi 1,10 % en-quanto a globulina total 1,30 %, a albumina 3,57 % e a glutelina 10,43 %.
NEVES, V.A.; PEREIRA, D.D.; SHOSHIMA, A.H.R.; TAVANO, O.L. Isolation and characteristics of the protein fractions of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp), var. BR-14-Mulato. Alim. Nutr., Araraquara, v.14, n.1, p. 47-55, 2003.
ABSTRACT: This study was carried out to evaluate the composition, protein solubility characteristics and isolation of the principal globulin of cowpea (Vigna unguiculata L.), var. BR-14 Mulato. Decorticated flour showed 29.32%, 3.59% and 1.4% for protein, ash and ether extract, respectively. The protein solubility was dependent of the extraction conditions, such as: salt type and concentration, time and pH. The protein sequential extraction solubilized 77.94% of the flour proteins and globulins represented 41.99%, albumins 10.11% and glutelins 7.81%. The isolated principal globulin was submmited to gel filtration chromatography and showed a molecular weight of 174 kDa. The
chromatographed protein showed a high degree of homogeneity on SDS-PAGE and a content of 1.1% of carbohydrate.
KEYWORDS: Cowpea BR-14 MULATO; Vigna unguiculata; chemical composition; solubility; fractionation.
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