ANÁLISE DA EXPRESSÃO E SEQÜENCIAMENTO DE FRAGMENTOS DE
ANTICORPOS RECOMBINANTES CONTRA Ralstonia solancearum
Bruno Duarte Bertuloso
1, Guilherme Rocha Lino de Souza
21
Universidade Federal do Espírito Santo (CCA/UFES), brunoduarte@hotmail.com
2
Universidade Federal de Goiás (DBBM/ICB/UFG), grlino@gmail.com
Resumo - Fragmentos gênicos das cadeias leve (VLCL) e pesada (VHCH1) de anticorpos humanos foram
utilizados para a construção de uma biblioteca Fab e selecionados contra antígenos totais de Ralstonia
solanacearum, bactéria causadora da murcha bacteriana do eucalipto. Bacteriófagos filamentosos
recombinantes foram obtidos pela transformação de bactérias E. coli com fagomídeos contendo os fragmentos gênicos dos anticorpos. A complexidade inicial da biblioteca foi determinada em torno de 108 unidades formadoras de colônia (ufc/mL). Um imunoensaio foi realizado para análise da expressão heteróloga da região codificante dos fragmentos Fab em solução. Após seleção contra os antígenos alvo, os clones mais reativos foram seqüenciados e as seqüências submetidas à análise nos bancos de dados disponíveis.
Palavras-chave:R. solanacearum, Anticorpos recombinantes, seqüenciamento.
Área do Conhecimento: Ciências Biológicas
Introdução
No Brasil, a Murcha Bacteriana causada por
Ralstonia solanacearum foi descrita primeiramente
por VON PARSEVAL (1922) em batata e fumo (TAKATSU E LOPES, 1997). Em virtude dos grandes prejuízos causados, é considerada uma das bactérias fitopatogênicas mais importantes do mundo. Sua ampla distribuição geográfica em mais de 200 espécies de plantas como hospedeiros, faz dessa bactéria um patógeno de difícil controle (HAYWARD, 2000; GENIN e BOUCHER, 2002). Como agravante, na falta de hospedeiro, a bactéria é capaz de sobreviver no solo associadas com plantas daninhas e até matéria orgânica por períodos prolongados (HAYWARD, 1991).
Ao contrário dos animais superiores, as plantas não apresentam sistema imunológico. Anticorpos, neste caso, só poderão ser utilizados para diagnósticos de doenças ou como proteínas recombinantes expressas nos tecidos vegetais. Como o eucalipto não é utilizado para alimentação humana ou animal e sua propagação se dá na maioria das vezes por cultura de tecido, uma abordagem interessante é a expressão de fragmentos de anticorpos nos tecidos vegetais para controle de doenças infecciosas e parasitárias nas plantas.
Vários trabalhos demonstram a aplicabilidade dos anticorpos como auxilio no controle dos fitopatógenos (ORECCHIA et al., 2008; SALDARELLI et al., 2005; CHEN et al., 2007). O presente trabalho tem como objetivo a
caracterização de anticorpos recombinantes reativos a Ralstonia solanacearum, uma bactéria de grande importância econômica para a cultura do eucalipto no Brasil.
Metodologia
A biblioteca construída a partir dos fragmentos gênicos das cadeias leve (VLCL) e pesada (VHCH1) de anticorpos Fab humanos e expressos na superfície de bacteriófagos recombinantes foi cedida pela Universidade Federal de Uberlândia para seleção de fagos recombinantes reativos a antígenos totais de Ralstonia solanacearum. A complexidade inicial da biblioteca avaliada em torno de 108 unidades formadoras de colônia (ufc/mL) foi determinada pela titulação dos fagos recombinantes em bactéria E.coli.
Um Ensaio de dot blot foi realizado para análise da expressão heteróloga da região codificante dos fragmentos Fab. Os anticorpos recombinantes são produzidos fusionados à um epitopo de hemaglutinina, o que permite sua determinação nos imunoensais por meio de anticorpos monoclonais anti HA. Aproximadamente 5 µL da cultura de cada clone individual foram pipetados e depositados em membrana de nitrocelulose 0,45
µm (Hybridization transfer membranes Amersham
Biosciences) e deixado secar a temperatura
ambiente. Em seguida a membrana foi bloqueada com uma solução de BSA 3% em PBS e incubada a 4ºC sob agitação durante a noite. A membrana foi lavada rapidamente por 3 vezes com PBST 0,05% e imersa em uma solução contendo o
anticorpo primário (anti-HA), diluído 1:2500 em PBS (rabbit polyclonal IgG anti HA) seguido de incubação sob agitação durante 2 horas a temperatura ambiente. Em seguida a membrana foi lavada três vezes rapidamente com PBST e incubada com o anticorpo secundário anti-rabbit IgG (diluição de 1:2500) conjugado com fosfatase alcalina. A membrana foi lavada 3 vezes com PBST e 1 vez com APB (tampão da fosfatase alcalina) e revelado com o substrato NBT/BCIP. Para parar a reação, a membrana foi lavada em água corrente.
Extração do DNA plasmidial para
seqüenciamento (Miniprep). Para a extração do
DNA plasmidial foi utilizada a técnica de lise alcalina, porém com algumas modificações. Uma placa deep well contendo a cultura citada anteriormente foi centrifugada por 6 minutos a 3700rpm a 20ºC para sedimentação das células. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em 240µL de uma solução de GET (glicose 20%, EDTA 0,5M pH 8,0 e Tris HCl 1M pH 7,4), posteriormente, 80µL da suspensão de células foram transferidos para uma microplaca já contendo 2µL de Ribonuclease A. Foram adicionados ainda, a cada poço, 80µL de NaOH 0,2 N/ SDS 1%, solução responsável pela lise das células. Em seguida, foram adicionados a cada poço, 80 µL de KOAc 3M para que houvesse a inativação da ação do NaOH, a placa foi incubada por mais 10 minutos e pulsada até chegar a 3700rpm, para precipitação e eliminação dos debris celulares. Após o pulso, a placa foi incubada aberta em estufa a 90ºC por exatos 20 minutos. Posteriormente, a placa foi selada, colocada para esfriar em gelo picado e centrifugada por 25 minutos, 3700rpm a 20ºC. Após a centrifugação, 100 µL de sobrenadante foram transferidos para uma placa Millipore® com filtro, acoplados a uma placa de fundo V e centrifugados por 6 minutos, 3700rpm a 20ºC. A placa filtro foi descartada, e ao filtrado, presente na microplaca inferior (fundo V), foram adicionados 100 µL de Isopropanol Absoluto para precipitação do DNA. A placa foi centrifugada por 45 minutos, 3700rpm a 20ºC para que houvesse formação do pellet de DNA. O sobrenadante foi descartado e 200 µL de etanol 70% foram acrescentados cuidadosamente, com o intuito de fazer uma lavagem retirando assim, o isopropanol e quaisquer resíduos ainda presentes de álcool. A placa foi centrifugada por 10 minutos, 3700rpm a 20ºC, o sobrenadante foi descartado e a placa pulsada invertida a 800rpm, para retirada do álcool residual e em seguida foi coberta com papel toalha para secagem durante 1 hora a temperatura ambiente. O DNA extraído foi ressuspendido em 30 µL de água MilliQ (SANTOS et al., 2006).
Qualificação das amostras de DNA. A
qualificação e quantificação do DNA a ser seqüenciado foram feitas a partir de análises em gel de eletroforese. Foi utilizado um gel de agarose 0,8%, preparado com tampão TAE 1X (Tris- Acetate-EDTA) e corado com Brometo de Etídeo, onde foram aplicados 3 µL das amostras diluída em água. A corrida foi feita em uma cuba horizontal ligada a uma fonte a 100 volts. Os géis foram corados com brometo de etídio e documentados em processador de imagens Imager Máster VDS (Video Documentation System) após cerca de 40 minutos de corrida.
Seqüenciamento dos fragmentos de
anticorpos Fab dos clones selecionados e
análise nos bancos de dados. O
seqüenciamento foi realizado utilizando o Kit
DyEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing
(Amershan Biosciences) em um seqüenciador automático capilar MegaBACE. As amostras foram preparadas para seqüenciamento em placas de 96 poços contendo aproximadamente 400 ng de DNA plasmidial e 2,5 pmoles do oligonucleotídeo mmB4 (senso) ou 2,5 pmoles do oligonucleotídeo mmB5(reverso) em um volume final de 10 µL. A reação de seqüenciamento foi realizada com 25 ciclos de 95 ºC por 20 segundos, 50 ºC por 15 segundos, 60 ºC por 1 minuto. A reação foi precipitada conforme descrito no Kit e as placas
de seqüenciamento foram injetadas
imediatamente no seqüenciador automático. As seqüências foram analisadas utilizando o programa IgBLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)
utilizando um bancos de dados de
Imunoglobulinas humanas.
Resultados
Análisedos clones selecionados por dot blot.
O objetivo deste ensaio foi selecionar e avaliar a expressão dos fragmentos Fab indiretamente pela observação da expressão do epítopo da hemaglutinina (HA) fusionada ao anticorpo clonado no vetor. O reconhecimento deste epítopo de hemaglutinina pelo anticorpo monoclonal Anti-HÁ reflete a correta expressão deste epítopo e conseqüentemente, pela sua proximidade ao fragmento Fab, podemos inferir sobre a integridade de todo o sistema de expressão. Bactérias contendo o fagomídeo recombinante, isto é, aquele que possui o fragmento Fab foram cultivados individualmente em placas do tipo deep
well e a expressão dos anticorpos recombinantes
em solução foi induzido pela adição de IPTG, um indutor da expressão das proteínas heterólogas clonadas no vetor. Os fragmentos Fab solúveis foram analisados por ensaio de dot blot em uma membrana de nitocelulose (figura 1). Podemos observar uma heterogeneidade da expressão de
hemaglutinina dos clones Fab. Alguns clones são altamente expressos outros têm um nível de expressão menor e são fracamente visualizados na membrana, mas em todos os poços podemos observar algum nível de expressão.
Figura 1 – Membrana de nitrocelulose com 96
amostras de clones com alta e baixa expressão do fragmento de anticorpo Fab (seta preta e vermelha como exemplos respectivamente).
Seqüenciamento e análise dos clones isolados nos bancos de dados. Foram seqüenciados 96 clones do terceiro ciclo de seleção, ou seja, os clones mais reativos aos antígenos de R. solanacearum. O DNA para a reação de seqüenciamento foi extraído segundo protocolo para preparação de DNA plasmidial em placa de microtitulação. As amostras foram analisadas em gel de agarose 0,8% para avaliação da qualidade e quantificação. A figura 2 ilustra um gel de agarose 0,8% com o padrão de bandeamento característico para DNA plasmidial com 3 bandas de alto peso molecular. Podemos observar neste gel uma boa qualidade e quantidade de DNA suficiente para o seqüenciamento dos insertos referentes ao gene que codifica os fragmentos de anticorpos Fab recombinantes .
Figura 2 – Miniprep do DNA plasmidial em gel
eletroforese agarose 0,8%, corado com brometo de etídeo e visualizado por meio de luz ultravioleta. Poço de 1 a 9 - amostras de DNA plasmidial de clones aleatoriamente escolhidos. MM – marcador de peso molecular (100pb). Cada placa contendo amostras de DNA foi seqüenciada utilizando um iniciador complementar
ao vetor e as reações foram seqüenciadas utilizando o seqüenciador automático MegaBACE (Amersham Biosciences). Foi observada uma boa qualidade das seqüências atribuídas possivelmente a uma satisfatória qualidade do DNA extraído. A figura 3 mostra um layout da página do programa MegaBACE Sequencing
Score Card , específico do seqüenciador automático capilar, onde podemos observar a representação de 96 amostras e a qualidade do seqüência de DNA analisada. As amostras em verde demonstram o seqüenciamento de no mínimo 500 bases com uma alta qualidade da seqüência.
Figura 3 - Layout da página do programa
MegaBACE Sequence Score Card com uma representação da placa de seqüenciamento com 96 amostras, onde as cores verde indicam seqüências acima de 500pb e alta qualidade.
As seqüência foram analisadas utilizando o programa IgBLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) que automaticamente traduz as seqüências de nucleotídeos para seqüências de proteínas e compara estas seqüências com um banco de dados GenBank de imunoglobulinas humanas (BENSON et al., 2000)e alinhadas utilizando o programa clustalW (THOMPSON et al, 1994). Apenas duas seqüências de anticorpos foram determinadas utilizadas para a análise nos bancos de dados. (figura 4)
Figura 4 – Seqüências de aminoácidos referentes
aos fragmentos de anticorpos Fab. FWR (frameworks) e CDR (Regiões Determinantes de Complementaridade) de dois clones C05 (acima) e C07 (abaixo).
FWR1 CDR1 FWR2 CDR2
Discussão
A grande diferença na expressão dos clones observada no ensaio de dot blot realizado para análise da expressão heteróloga da região codificante dos fragmentos Fab pode ser explicada pelas condições intrínsecas de cada bactéria. É interessante a escolha dos clones com níveis detectáveis de expressão, pois isso garante que realmente esta bactéria possui o DNA plasmidial, contendo o DNA recombinante dos fragmentos de anticorpos Fab, que poderão ser extraídos e seqüenciados posteriormente.
Verificamos que os clones (fagos) do terceiro ciclo de seleção haviam perdido o inserto (gene fragmento Fab) por motivos não identificados nesse trabalho. Alguns autores relatam problemas de instabilidade observada em bibliotecas que apresentam alguns tipos de anticorpos e durante os passos de amplificação que envolve processo de transfecção viral (RAPOPORT et. al., 1995, citado por BRÍGIDO e MARANHÃO, 2002), o que pode explicar o favorecimento de alguns tipos de anticorpos durante a seleção ou até mesmo a perda do inserto no fagomideo.
Outro problema seria o crescimento celular nas culturas que expressam proteínas de fusão. O que poderia ocasionar uma relativa tendenciosidade da biblioteca, que passaria a expressar, preferencialmente, as formas mais toleradas pela bactéria (KENAN et al., 1994).
Vários clones detectados no seqüenciamento sem o inserto foram submetidos à restrição do vetor (pComb3X) com a enzima Sfi I para a tentativa de visualização, em gel de eletroforese, do inserto (Fab) liberado do vetor submetido ao corte com esta mesma enzima. Não foram detectados quaisquer fragmentos com tamanho característico do inserto o que comprova sua ausência nos clones testados (dados não demonstrados). A figura 7 mostra a seqüência de dois clones (C05 e C07) e o alinhamento com as seqüências depositadas nos bancos de dados. As seqüências de aminoácidos dos anticorpos determinados possuem três regiões mais conservadas (frameworks) intercaladas com regiões variáveis (CDRs) responsáveis pelo reconhecimento antigênico.
Nossa análise da variabilidade da biblioteca de anticorpos ficou comprometida pela baixa quantidade de clones contendo as seqüências de DNA dos fragmentos Fab. Devido o tamanho do inserto, apenas duas CDRs foram observadas em cada clone, demonstrando a necessidade do seqüenciamento da outra extremidade da seqüência com o primer reverso para a total caracterização do anticorpo.
Conclusão
Em uma perspectiva futura é preciso testar os clones obtidos quanto a um provável efeito bactericida ou bacteriostático em culturas de
Ralstonia solanacearum. A comprovação da
eficiência dos anticorpos garante sua utilização para o diagnóstico da doença e em programas de melhoramento genético de plantas.
Mesmo utilizando uma biblioteca combinatorial de anticorpos recombinantes contra proteínas humanas, foi possível a seleção de clones contra a bactéria R. solanacearum, provavelmente devido à uma semelhança entre epitopos ou regiões com a mesma conformação tridimensional entre antígenos humanos e bacterianos.
A análise da diversidade da biblioteca de anticorpos foi comprometida pela baixa quantidade de seqüências necessitando de caracterização de novos clones contendo comprovadamente o inserto referente ao gene que codifica os fragmentos Fab.
Depois de comprovado algum efeito sobre o fitopatógeno, os anticorpos caracterizados poderão ser utilizados para a transformação de eucalipto com a finalidade da expressão do anticorpo nos tecidos vegetais e avaliação do efeito bactericida ou bacteriostático dos clones.
Referências
BRÍGIDO, M.M., MARANHÃO, A.Q. Bibliotecas apresentadas em fagos. Biotecnologia Ciência &
Desenvolvimento. v.26, p.41, 2002.
CHEN, G., YIN, Y.P., YUAN, Q., XIA, Y.X., WANG, Z.K. High efficient expression and bio-activity assay of recombinant antibody for citrus bacterial canker disease. v.47, p.1066-1069. 2007.
GENIN,S., BOUCHER,C. Rasltonia solanacearum: secrets of a major pathogen unveiled by analysis of its genome. Molecular Plant Pathology. v.3,p. 111-118. 2002.
HAYWARD, A.C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum. Annual Review Phytopathology v. 29, p.65-87. 1991.
HAYWARD, A.C. Rasltonia solanacearum. In:
Encyclopedia of Microbiology.. San Diego:
Academic Press. v.4, p.32-40. 2000.
KENAN, D.J., TSAI, D.E., KEENE, J.D. Exploring molecular diversity with combinatorial shape libraries. Trends Biochem. Sci., v.19, p.57-63, 1994.
ORECCHIA, M., NO¨LKE, G., SALDARELLI, P., DELL’ORCO, M., UHDE-HOLZEM, K., SACK, M., MARTELLI, G., FISCHER, R., SCHILLBERG S. Generation and characterization of a recombinant antibody fragment that binds to the coat protein of grapevine leafroll-associated virus 3. Arch Virol. 2008.
RAPOPORT, B., PORTOLONO, S., McLachlan, S.M. Combinatorial libraries: new insights into human organ specific autoantibodies.
Immunology today, v. 16, p.43-49, 1995.
SALDARELLI, P., KELLER, H., DELL'ORCO, M., SCHOTS, A., ELICIO, V., MINAFRA, A. Isolation of recombinant antibodies (scFvs) to grapevine virus B. J. Virol. Methods. v.124, p.191-195. 2005. SANTOS F. A. A.; SOUZA G. R. L.; ALMEIDA J. F.; PRUDENCIO C. R.; ORTEGA J.M.; SILVA A. B.; GOULART L. R. Sequenciamento de ESTs (Expressed Sequence Tags) do Schistosoma mansoni – Projeto Genoma Mineiro FAPEMIG-CNPq. Horizonte Científico, v.1, p.1-23. 2006. TAKATSU A., LOPES,C.A. Murcha-bacteriana em hortaliças: avanços científicos e perspectivas de controle. Horticultura Brasileira. v.15, p.170-177. 1997.
