Microcápsulas poliméricas inteligentes de nano híbridos
de porfirina-ouro com vista a aplicações em Terapia
Fotodinâmica e Bio imagem
Sofia Garcez da Silva Serra
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia Biológica
Orientadores: Doutora Vanda Isabel Roldão Canelas Vaz Serra
Doutor Pedro Miguel Neves Ribeiro Paulo
Júri
Presidente: Professor Doutor Duarte Miguel de França Teixeira dos Prazeres
Orientador: Doutora Vanda Isabel Roldão Canelas Vaz Serra
Vogais: Doutora Ana Isabel Abrantes Coutinho
III Prefácio
O trabalho apresentado nesta tese foi realizado no Centro de Química Estrutural do Instituto Superior Técnico (Lisboa, Portugal), durante o período Fevereiro-Novembro 2019, supervisionado por Dra.
Vanda Isabel Roldão Canelas Vaz Serra e Dr. Pedro Miguel Neves Ribeiro Paulo.
Declaração
Declaro que o presente documento é um trabalho original da minha autoria e que cumpre todos os requisitos do Código de Conduta e Boas Práticas da Universidade de Lisboa.
V
Agradecimentos
À Doutora Vanda Vaz Serra, orientadora desta dissertação, agradeço a oportunidade de contactar com o mundo da fotoquímica bem como toda a supervisão, ensinamentos, apoio, encorajamento e amizade, fulcrais para o desenvolvimento deste trabalho sob um agradável ambiente de trabalho.
Ao Doutor Pedro Miguel Paulo, orientador desta dissertação, agradeço a disponibilidade com que me recebeu no estágio de Verão que foi o ponto de partida para o presente trabalho, bem como todos os ensinamentos e incentivo que me transmitiu ao longo deste percurso.
À professora Sílvia Costa, agradeço o interesse demonstrado pelo meu trabalho, bem como a disponibilidade em acompanhar o seu desenvolvimento.
A todos os professores com os quais tive o prazer de contactar ao longo destes cinco anos agradeço a partilha de conhecimentos e experiências.
Ao colega de laboratório David agradeço toda a paciência, partilha de experiências e boa disposição com que me recebeu desde a minha primeira passagem pelo CQE.
À colega de laboratório e amiga Inês, agradeço o enorme apoio, paciência, empenho e troca de ideias que tanto me ajudaram na realização desta dissertação.
Às minhas colegas e amigas de faculdade Sara, Patrícia, Ana e Marta, por estarem sempre presentes, pela motivação e ajuda, pelas longas conversas e ótimos momentos de escape repletos de gargalhadas.
À minha colega Tânia pela partilha da sua experiência enquanto aluna desta instituição que, pelas palavras amigas e conselhos, tanto me apoiou e ajudou a estar preparada para as possíveis adversidades que daí viriam.
Às minhas amigas de longa data Catarina, Nídia e Ariana por todos estes anos de amizade e companheirismo e apoio constante.
Á minha família. Em especial aos meus pais, por todas as lições de vida, sacrifícios, apoio incondicional, carinho, ombro amigo e motivação sem os quais o alcançar desta etapa seria impossível. E às minhas avós, pela constante preocupação, ternura e palavras amigas com que sempre me recebem.
Ao Gonçalo, pela ótima companhia, apoio, incentivo e carinho que tanto melhoram e facilitam o ultrapassar de qualquer desafio.
Ao Instituto Superior Técnico e ao Centro de Química Estrutural pela oportunidade de realização desta dissertação.
VII
Resumo
O objetivo desta dissertação é o desenvolvimento de um sistema fotoativo de microcápsulas de polieletrólito com propriedades óticas e fotodinâmicas acrescidas que potenciem a sua aplicação em bioimagem/terapia fotodinâmica de tecidos tumorais. Para tal, foram construídos diferentes híbridos destes sistemas inteligentes através da sua dupla funcionalização com um conhecido fotossensibilizador porfirínico, 5,10,15,20-tetraquis(4-N-metil-piridinio)porfirina (TMPyP), e nanobastonetes de ouro. A incorporação de nanopartículas de ouro visa promover o aumento de fluorescência do fotossensibilizador, por si só um fraco emissor, por efeitos plasmónicos.
O efeito da concentração da porfirina e da posição relativa porfirina/ouro (núcleo vs revestimento) na intensificação de fluorescência foi estudada nestes sistemas construídos segundo metodologias de adsorção camada por camada. A adsorção de polieletrólitos de carga oposta foi seguida por medição do potencial zeta. A dupla funcionalização bem como a caracterização das propriedades óticas e eletrónicas dos híbridos foi seguida por espectroscopia de absorção UV-Vis e fluorescência de estado estacionário e resolvida no tempo e comparada com os sistemas contendo apenas uma das funcionalidades. As imagens obtidas por conjugação de microscopia eletrónica de transmissão e varrimento (STEM), estão de acordo com os resultados obtidos por espectroscopia de absorção UV-Vis e comprovam a presença de um revestimento eficiente de nanopartículas de ouro na superfície de partículas micrométricas aproximadamente esféricas, apenas aquando da adsorção da nanopartícula na última camada do revestimento.
A aquisição de imagens por microscopia confocal de tempos de vida de fluorescência (FLIM) permitiu observar um aumento de fluorescência de 8 vezes para microcápsulas de polieletrólitos contendo porfirina e nanopartícula de ouro em diferentes compartimentos (núcleo e revestimento). O aumento da concentração de porfirina não induziu alteração significativa na sua emissão.
Palavras-Chave: Microcápsulas, Polieletrólitos, Porfirina, Nanobastonete de ouro, Terapia
IX
Abstract
The aim of this dissertation is the development of a photoactive polyelectrolyte microcapsule system with improved optical and photodynamic properties that enables its application in bioimaging / photodynamic therapy of tumor tissues. Therefore, different hybrids of these intelligent systems were constructed through their dual probe functionalization with a well-known porphyrin photosensitizer, 5,10,15,20-tetrakis (4-N-methylpyridinium)porphyrin (TMPyP) and gold nanorods. The incorporation of gold nanoparticles aims to promote fluorescence increase of the photosensitizer, by itself a weak emitter, through plasmonic effects.
The effect of porphyrin concentration and relative position of porphyrin / gold (core vs shell) on fluorescence intensification was studied in these systems built by layer by layer adsorption methodologies. Adsorption of opposite charge polyelectrolytes was followed by zeta potential measurement. The dual functionality, as well as the characterization of the optical and electronic properties of the hybrids, was followed by UV-Vis absorption spectroscopy and steady state fluorescence over time and compared with systems containing only one of the functionalities. The images obtained by conjugation of transmission and scanning electron microscopy (STEM) agree with the results obtained by UV-Vis absorption spectroscopy and show the presence of an efficient coating of gold nanoparticles on the surface of micrometric particles approximately spherical, only when the nanoparticle is adsorbed on the shell last layer.
Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) showed a fluorescence intensification of 8 times in polyelectrolyte microcapsules with porphyrin and gold nanoparticles immobilized at different compartments (core and shell). An increase in porphyrin concentration did not induce a significative alteration in its emission.
Keywords: Microcapsules, Polyelectrolytes, Porphyrin, Gold Nanorod, Photodynamic Therapy,
XI
Índice
Agradecimentos ... V Resumo ... VII Abstract ... IX Lista de Tabelas ... XIII Lista de Figuras ... XV Lista de Abreviaturas ... XIX
1. Introdução ... 1
1.1. Microcápsulas ... 2
1.1.1. Revestimento ... 3
1.1.2. Núcleo ... 3
1.2. Terapia Fotodinâmica e Bio imagem ... 4
1.3. As porfirinas como fotossensibilizadores eficientes ... 7
1.3.1. Estrutura e propriedades ... 10 1.4. Nanopartículas de ouro ... 12 2. Técnicas Experimentais ... 15 2.1. Fluorescência ... 15 2.2. Absorvância UV-VIS ... 17 2.3. Emissão de fluorescência ... 19 2.4. Potencial Zeta ... 20
2.5. Microscopia Eletrónica de Varrimento ... 23
2.6. Microscopia Eletrónica de Transmissão ... 24
2.7. Microscopia confocal de fluorescência ... 25
2.7.1. Microscopia de tempos de vida de fluorescência (FLIM) ... 26
3. Secção experimental ... 29
3.1. Materiais ... 29
3.2. Procedimentos ... 29
3.3. Métodos ... 31
XII 4.1. Preparação de microcápsulas de polieletrólitos não funcionalizadas
[CaCO3PSS](PSSPAH)n ... 36
4.1.1. Preparação de micropartículas de CaCO3 ... 36
4.1.2. Construção das microcápsulas: revestimento com polieletrólitos ... 39
4.2. Interação da porfirina TMPyP com polieletrólitos, PSS e PAH, em solução ... 42
4.3. Preparação de microcápsulas contendo o núcleo inorgânico dopado com porfirina e nanobastonetes de ouro [CaCO3 TMPyP PSS AuNR]PSSPAH ... 44
4.3.1. Preparação do sistema [CaCO3PSSTMPyP]PSSPAHPSS ... 44
4.3.2. Co-precipitação de AuNR: Preparação do sistema [CaCO3PSSTMPyPAuNR]PSSPAH ... 47
4.4. Preparação de microcápsulas contendo AuNR na rede de polieletrólitos [CaCO3 TMPyP PSS]PSSPAH(AuNRPSS) ... 51
4.4.1. Revestimento dos AuNR ... 51
4.4.2. Adsorção de AuNR ao revestimento das microcápsulas ... 53
4.5. Intensificação de fluorescência por efeito plasmónico ... 56
5. Conclusões e Perspetivas Futuras ... 67
6. Referências Bibliográficas ... 69
XIII
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Comprimentos de onda dos máximos de absorção (λAmáx) e emissão (λFmáx) da TMPyP em solução aquosa e em soluções dos polieletrólitos PSS e PAH. ... 43 Tabela 2 – Comprimentos de onda dos máximos de absorção (λAmáx) e emissão (λFmáx) da TMPyP presente no núcleo de CaCO3 e PSS. λexc = 429 nm. ... 47 Tabela 3 – Comprimentos de onda dos máximos de absorção (λAmáx) do plasmão longitudinal dos nanobastonetes de ouro livres numa solução de CTAB e funcionalizados com PSS. ... 52 Tabela 4 - Comprimentos de onda dos máximos de absorção (λAmáx) e emissão (λFmáx) a λexc =429 nm
dos sistemas híbrido [CaCO3 PSS TMPyPdil]PSSPAH(AuNRPSS) e [CaCO3 PSS
TMPyPconc]PSSPAH(AuNRPSS). ... 55 Tabela 5 – Tempos de vida de fluorescência dos sistemas: [CaCO3PSSTMPyP]PSSPAHPSS; [CaCO3PSSTMPyPAuNR]PSSPAH e [CaCO3PSSTMPyPAuNR]PSSPAH Oco (λexc = 639 nm). ... 60 Tabela 6 - Tempos de vida de fluorescência dos sistemas: [CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAH e [CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAH(AuNRPSS) e (λexc = 639 nm). ... 64 Tabela 7 – Tempos de vida de fluorescência dos sistemas [CaCO3PSSTMPyPconc]PSSPAH e [CaCO3PSSTMPyPconc]PSSPAH(AuNRPSS) (λexc=639 nm). ... 66
XV
Lista de Figuras
Figura 1 – Síntese de microcápsulas por adsorção consecutiva de polieletrólitos de carga negativa (cinzento) e de carga positiva (preto) numa partícula molde (a-e). Preparação de microcápsulas ocas
por destruição da partícula molde (f). (adaptado)[9] ... 2
Figura 2 – Estrutura química dos polieletrólitos (A) poliestirenosulfonato, PSS, e (B) hidrocloreto de polialilamina, PAH. ... 3
Figura 3 – Diagrama de Jablonski modificado. (adaptado)[5] ... 5
Figura 4 – Reações de tipo I e II para produção das espécies oxidadas responsáveis por conferir citoxicidade às células tumorais. (adaptado)[34] ... 6
Figura 5 – Estruturas moleculares da hematoporfirina (Hp) e sua derivada (HpD).[45] ... 8
Figura 6 – Estrutura molecular de fotossensibilizadores porfirínicos. ... 9
Figura 7 – Estrutura molecular (A) porfina, (B) clorina e (C) bacterioclorina. [41] ... 10
Figura 8 – Espetros de absorção (azul) e emissão (vermelho) de uma porfirina livre... 11
Figura 9 – Estrutura molecular da TMPyP. ... 11
Figura 10 – Radiação eletromagnética interage com nanopartículas metálicas, provoca a oscilação dos seus eletrões de condução em relação ao núcleo.[51] ... 13
Figura 11 – Nanobastonetes de ouro e variação do seu espetro de absorção UV-Vis consoante a razão largura/altura (AR) da nanopartícula. (adaptado) [49] ... 14
Figura 12 – Diagrama de Jablonski. Possíveis transições entre estados eletrónicos: absorção de fotão, conversão interna, relaxação vibracional, fluorescência, cruzamento intersistemas e fosforescência, e respetivos tempos.[61] ... 15
Figura 13 – Medição da absorvância num espetrofotómetro de feixe duplo. (adaptado)[62] ... 18
Figura 14 – Medição da emissão de fluorescência num espetrofluorímetro convencional. (adaptado)[62] ... 20
Figura 15 - Representação esquemática potencial eletrocinético, potencial zeta, determinado no limite na camada difusa. (adaptado)[64] ... 21
Figura 16 - Configuração ótica típica de um instrumento de eletroforese Laser Doppler. (adaptado)[64] ... 22
Figura 17 – Componentes de um microscópio eletrónico de varrimento (SEM).(adaptado)[67] ... 24
Figura 18 - Componentes de um microscópio eletrónico de transmissão (TEM).(adaptado)[68] ... 25
Figura 19 – Microscopia confocal de fluorescência (esquerda) e microscopia de fluorescência convencional (direita). (adaptado)[62] ... 26
Figura 20 – Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC). (adaptado)[62] ... 27
Figura 21 - Espetros de absorção UV-Vis da TMPyP em solução aquosa (—) e dos AuNR em solução de CTAB (—). Espetro de emissão de fluorescência da TMPyP em solução aquosa (—) (λexc = 445 nm). ... 33
Figura 23 - – Representação esquemática da arquitetura dos sistemas estudados. ... 34
Figura 24 –Formas polimórficas do carbonato de cálcio: calcite, aragonite e vaterite.[77] ... 36
Figura 25 – Imagens de microscopia confocal ótica. Micropartículas de CaCO3 na ausência (A e B) e presença (C) de PSS durante a síntese. ... 38
XVI
Figura 26 - Imagem de microscopia eletrónica de varrimento (SEM) do sistema [CaCO3PSS] (A) e respetivo histograma de distribuição de tamanho das partículas, ajustados por uma função Gaussiana, para uma amostra populacional de 35 pontos (<d> = 1,8 µm, σd = 0,32 µm) (B). ... 39 Figura 27 – Variação do Potencial Zeta (ƺ) do sistema em função do número de camadas de PSS e PAH adsorvidas. ... 40 Figura 28 – Espetros de absorção UV-Vis normalizados (A) e de emissão em estado estacionário (B) da porfirina TMPyP (C = 7,4 µM) em água (λexc = 445 nm) e em solução aquosa de polieletrólitos PSS (3 mg/mL) e PAH (12 mg/mL) (λexc = 450 nm). ... 42 Figura 29 - Imagem de microscopia eletrónica de varrimento (A) e respetivo histograma de distribuição de tamanho das partículas (B), ajustado por uma função Gaussiana, do sistema [CaCO3PSSTMPyP], para uma amostra populacional de 35 pontos (<d> = 2,2 µm, σd = 0,34 µm). Para comparação, a imagem e o respetivo histograma do sistema [CaCO3PSS] encontra-se na Figura 26. ... 44 Figura 30 – Espetros de absorção UV-Vis das soluções de adsorção de TMPyP concentrada (C=2,3110-4 M, a vermelho tracejado) e diluída (C=3,2210-5 M, a azul tracejado) e dos respetivos sobrenadantes após adsorção (linhas contínuas: azul para a porfirina diluída e vermelho para a concentrada) usados nos cálculos da eficiência de encapsulamento e do número de moles adsorvido na reação de co-precipitação para a preparação do sistema [CaCO3PSSTMPyP]. ... 45 Figura 31 – Espetros de absorção UV-Vis e de emissão a λexc=429 nm dos sistemas [CaCO3PSSTMPyPdil] e [CaCO3PSSTMPYPconc] (A) [CaCO3PSSTMPyP]PSSPAH (B). ... 46
Figura 32 – Imagens de SEM (A) e TEM (B) do sistema híbrido [CaCO3PSSTMPyPAuNR]PSSPAH e
respetiva análise química por EDS (C) ... 48
Figura 33 – Espetros de absorção UV-Vis dos sobrenadantes de adsorção da TMPyP e AuNR, das
quatro etapas de lavagem inerentes e do revestimento com PSS e PAH. ... 49 Figura 34 - – Espetros de absorção UV-Vis (—) e de emissão ao λexc = 429 nm (—) das cápsulas [CaCO3 PSS TMPyP AuNR]PSSPAH. ... 50 Figura 35 - Espetros de absorção UV-Vis dos nanobastonetes de ouro antes (AuNR) e após funcionalização com o polieletrólito PSS (AuNR_PSS). ... 52 Figura 36 - Imagens de SEM (A) e TEM (B) do sistema [CaCO3PSSTMPyP]PSSPAH(AuNRPSS) e respetiva análise por EDS (C). ... 53 Figura 37 - Espetros de absorção UV-Vis dos sobrenadantes da co-precipitação da TMPyP, do revestimento com PSS e PAH (A) e da adsorção dos AuNR seguida das etapas de lavagem inerentes ao procedimento (B). ... 54 Figura 38 - – Espetros de absorção UV-Vis (—) e de emissão ao λexc = 429 nm (—) das cápsulas [CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAH(AuNRPSS). ... 55 Figura 39 - Imagens de microscopia de fluorescência (λexc = 639 nm, ~1,44 µW) dos sistemas (A, B)
[CaCO3PSSTMPyP]PSSPAHPSS (C, D) [CaCO3PSSTMPyPAuNR]PSSPAH e (E, F)
[CaCO3PSSTMPyPAuNR]PSSPAH Oco. Histograma intensidade de fluorescência em função da posição na cápsula (G) Média e desvio padrão da intensidade máxima (H) e média (I) para amostras populacionais de 15 a 30 cápsulas de cada um dos três sistemas. ... 58
XVII
Figura 40 - – Variação da intensidade de fluorescência em função do tempo (λexc = 639 nm, ~ 1,44
µW) dos sistemas: [CaCO3PSSTMPyP]PSSPAH (A) [CaCO3PSSTMPyPAuNR]PSSPAH (B) e
[CaCO3PSSTMPyPAuNR]PSSPAH Oco (C)... 59 Figura 41 - Imagens de microscopia de fluorescência (λexc.=639 nm, ~1,44 µW) dos sistemas (A, B)
[CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAH (C, D) [CaCO3PSS]PSSPAH(AuNRPSS) (E, F)
[CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAH(AuNRPSS). Histograma intensidade de fluorescência em função da posição na cápsula para estes três sistemas (G). Média e desvio padrão da intensidade máxima (H) e média (I) de uma amostra populacional de 15 a 30 cápsulas de cada um dos três sistemas. ... 61 Figura 42– Variação da intensidade de fluorescência em função do tempo (λexc.= 639 nm, ~ 1,44 µW)
(A) [CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAHPSS; (B) [CaCO3PSS]PSSPAH(AuNRPSS); (C)
[CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAH(AuNRPSS), mostrando um evento de longa duração; (D) Ampliação de
C e respetivo histograma de intensidade de fluorescência; (E)
[CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAH(AuNRPSS), mostrando vários eventos de curta duração; (F) Ampliação de E e respetivo histograma de intensidade de fluorescência. ... 62 Figura 43 – Espetro fotoluminescência (λexc. = 639 nm, ~ 7,2 µW) para os sistemas: híbrido [CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAH(AuNR PSS) (—) e [CaCO3PSSTMPyPdil]PSSPAH (—). ... 63 Figura 44 – Decaimentos de fluorescência do sistema [CaCO3PSTMPyPdil]PSSPAH(AuNRPSS) (—) e [CaCO3PSSTMyPdil]PSSPAH (—). Onde (a) corresponde ao traço de fluorescência C (evento de longa duração) e (b) ao traço de fluorescência E (evento de curta duração) da Figura 42. ... 63 Figura 45 - Imagens de microscopia de fluorescência (λexc.=639 nm, ~1,44 µW) dos sistemas (A, B) [CaCO3PSSTMPyPconc]PSSPAHPSS, (C, D) [CaCO3PSSTMPy]PSSPAH(AuNRPSS) e (E, F, G, H) [CaCO3PSSTMPyPconc]PSSPAH(AuNRPSS). Histograma intensidade de fluorescência em função da posição na cápsula para os três sistemas (G). Média e desvio padrão da intensidade máxima (E) e média (F) de cápsulas de cada um dos três sistemas, amostra populacional de 15 a 30 elementos. . 65 Figura 46– Variação da intensidade de fluorescência em função do tempo (λexc=639 nm, ~ 1,44 µW) do sistema [CaCO3PSSTMPyPconc]PSSPAHPSS (A) e (B). Onde (C) e (D) representam uma ampliação de A e B, respetivamente, bem como dos seus histogramas de intensidade de fluorescência. ... 66
XIX
Lista de Abreviaturas
AuNRs – Nanobastonetes de ouro CaCO3 – Carbonato de cálcio
CTAB – do inglês Cetyltrimethylammonium bromide, Brometo de N-cetil-N,N,N-trimetil-amónio EDS – do inglês Energy Dispersive X-ray Spectroscopy, Espectroscopia de Dispersão por Raios-X EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
FLIM – do inglês Fluorescence lifetime imaging microscopy, Microscopia de tempo de vida de fluorescência
FRET - do inglês Förster Resonance Energy Transfer, Transferência de energia por ressonância de Förster
IARC –do inglês International Agency for Research on Cancer, Agência Internacional de Investigação de cancro
LBL – do inglês Layer by layer, Camada sobre camada
LSP – do inglês Localized Surface Plasmon, Plasmão localizado de superfície
LSPR – do inglês Localized Surface Plasmon Resonance, Ressonância de plasmão localizado de superfície
NIR – do inglês near-infrared, Infravermelho próximo NP – Nanopartícula
PAH – do inglês Polyallylamine hydrochloride, hidrocloreto de polialilamina) PDT – do inglês Photodynamic therapy, Terapia fotodinâmica
PE – Polieletrólito
PS ou P – do inglês Photosensitizer, fotossensibilizador PSS – do inglês Poly styrenesulfonate, Poliestirenosulfonato
ROS – do inglês Reactive Oxygen Species, Espécies reativas de oxigénio rpm – rotações por minuto
SEM – do inglês Scanning Electron Microscopy, Microscopia Eletrónica de Varrimento
SERS – do inglês Surface-Enhanced Raman Scattering, Dispersão de Raman amplificada por superfície
SPR – do inglês Surface Plasmon Resonance, Ressonância plasmónica de superfície
TCSPC – do inglês Time Correlated Single Photon Counting, Contagem de fotões individuais correlacionada no tempo
TEM – do inglês Transmission Electron Microscopy, Microscopia Eletrónica de Transmissão
TMPyP - do inglês 5,10,15,20-Tetrakis(4-N-methylpyridinium)porphyrin, 5,10,15,20-tetraquis(4-N-metil-piridinio)porfirina
UV-Vis – Ultravioleta-visível
1
1. Introdução
De acordo com um estudo realizado pela Organização Mundial de Saúde, do inglês World Health Organization (WHO), em 2018 registou-se o aparecimento de 18,1 milhões de novos casos de cancro. Esta doença é a segunda causa de morte a nível mundial, sendo responsável por cerca de 9,6 milhões de mortes. Entre os vários tipos de cancro, os quatro mais comuns são o cancro da mama (incidência de 46,3 milhões), da próstata (29,3 milhões), do pulmão (22,5 milhões) e do intestino (19,7 milhões). Segundo a Agência Internacional de Investigação do Cancro, do inglês International Agency for Research on Cancer (IARC), estima-se que o número de casos de cancro em 2040 seja de 29,5 milhões, o que traduz um aumento de incidência de 63%, com uma mortalidade de 16,4 milhões.[1]
A deteção destas doenças no seu estado inicial é fulcral para o sucesso do tratamento e recuperação. Atualmente os métodos de deteção disponíveis são extremamente dispendiosos, demorados e complexos, como é o caso dos procedimentos de biopsia, dos testes sanguíneos com marcadores específicos para as células tumorais e das técnicas de ressonância magnética (MRI) e tomografia computorizada (TC).[2] De entre os diversos métodos em vigor para o tratamento do cancro destacam-se a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia. Estas técnicas podem ser utilizadas individualmente ou combinadas consoante o tipo, localização e estado de desenvolvimento do cancro.[3][4] A cirurgia implica a remoção do tecido tumoral de forma invasiva e, portanto, com riscos de infeção associados e não é aplicável no tratamento de metástases. A quimioterapia é o método usualmente aplicado no tratamento de cancros metastizados e consiste na administração intravenosa de fármacos, que são limitados pela sua estabilidade, solubilidade, especificidade e seletividade. A radioterapia utiliza elevadas doses de radiação para impossibilitar a multiplicação das células cancerígenas.
O desenvolvimento de novas técnicas que permitam ultrapassar as limitações dos métodos em vigor, com o objetivo de contrariar o crescente aumento da incidência e mortalidade do cancro, é um problema da atualidade. Deste modo, surge a necessidade de criar novos sistemas economicamente viáveis e de fácil síntese capazes de atuar, simultaneamente, como agentes de diagnóstico e terapêutico em fases inicias da doença.
As porfirinas são uma classe única de compostos que se encontra disponível na natureza em larga escala. São de síntese conhecida, biocompatíveis, biodegradáveis, não tóxicas para tecidos saudáveis e capazes de se acumular preferencialmente na zona tumoral.[3][4] Após ativação por absorção de luz, as porfirinas podem emitir fluorescência, o que possibilita a sua utilização como agente de contraste para deteção por bioimagem, e/ou gerar espécies de oxigénio altamente reativas e citotóxicas, úteis em terapia fotodinâmica.[5]
No entanto, tipicamente, as porfirinas são emissores fracos (ΦF<10%) e apresentam alguma agregação em meios fisiológicos, limitando a sua aplicação. A incorporação de porfirinas em sistemas de transporte/entrega como as microcápsulas de polieletrólito [7] e a interação com nanopartículas metálicas pode ajudar a ultrapassar estas dificuldades, por diminuição da agregação e intensificação da fluorescência.
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1.1. Microcápsulas
O desenvolvimento de sistemas que possibilitem o armazenamento e entrega de compostos biológicos ativos em organismos vivos, promovendo a sua libertação prolongada e controlada, representa um dos maiores desafios em biomedicina. Estes sistemas pretendem colmatar a rápida metabolização, degradação e sensibilidade a diversos estímulos, exógenos (variações no campo magnético, intensidade de ultrassons e irradiação) ou endógenos (alterações de pH, presença de enzimas e de reações redox), dos compostos biológicos.[6][7]
A utilização de cápsulas de polímeros surge como uma alternativa versátil e economicamente atrativa/viável. Numa cápsula destacam-se dois compartimentos distintos onde uma vasta gama de compostos, desde iões a macromoléculas (proteínas, péptidos, lípidos, polímeros, micelas, fármacos e nanopartículas), podem ser incorporados e protegidos do ambiente hostil envolvente [8]: a) o revestimento, formado por adsorção sucessiva de várias camadas de polieletrólitos (PE) de carga oposta (adsorção camada por camada, do inglês Layer by layer - LBL) na superfície de uma partícula molde e b) o núcleo, obtido após remoção da partícula molde. (Figura 1)
Figura 1 – Síntese de microcápsulas por adsorção consecutiva de polieletrólitos de carga negativa (cinzento) e de carga positiva (preto) numa partícula molde (a-e). Preparação de microcápsulas ocas por destruição da partícula molde (f). (adaptado)[9]
O tipo de partícula molde e de revestimento influencia significativamente as propriedades de uma cápsula, tais como o seu tamanho, que varia com o diâmetro da partícula molde, e o modo de incorporação / transporte de moléculas no interior da sua cavidade.
A incorporação de moléculas pode ocorrer após a formação da cápsula ou simultaneamente com esta. Na primeira situação, as moléculas podem ficar adsorvidas a uma camada de polieletrólito por alteração da permeabilidade do revestimento (devido a modificações de pH, polaridade, força iónica ou temperatura) - método de pós-encapsulamento. Na segunda situação, as moléculas ficam retidas no
3
substrato poroso que serve de suporte à cápsula por co-precipitação com o núcleo - método de pré-encapsulamento.[10]
A escolha dos componentes utilizados, quer no núcleo quer no revestimento, necessita de ter em conta aspetos como a sua biocompatibilidade e a degradação no interior dos organismos vivos nos quais serão inseridas estas cápsulas.
1.1.1. Revestimento
A adsorção de polieletrólitos durante o processo de LBL é fortemente influenciada pelo pH e força iónica.[7] Para uma adsorção eficaz, a carga do substrato inicial bem como a de cada camada de PE deve ser tal que permita sucessivas adsorções sem desencadear uma remoção parcial da camada anterior. Pequenas mudanças no pH permitem fazer grandes alterações na espessura das camadas de PE.[11] A presença de sais afeta a conformação dos polímeros, graças ao efeito de proteção das cadeias de polieletrólitos perante repulsões eletrostáticas.[7]
Por um lado, um revestimento composto por componentes biodegradáveis, como poli-aminoácidos, polímeros sintéticos, quitosano, alginato, é bastante útil para a entrega de compostos ativos (genes, proteínas, fármacos, etc) no interior de organismos vivos. Por outro lado, para funções de deteção celular, como a determinação da concentração de um determinado ião em organelos celulares, o revestimento deve der de difícil degradação, o que é assegurado pela utilização de polieletrólitos sintéticos como o poliestirenosulfonato (PSS) e o hidrocloreto de polialilamina (PAH) (Figura 2).[10][12][13][14]
Figura 2 – Estrutura química dos polieletrólitos (A) poliestirenosulfonato, PSS, e (B) hidrocloreto de polialilamina, PAH.
1.1.2. Núcleo
Diversos compostos podem ser utilizados como partícula molde: orgânicos, como o poliestireno, melamina formaldeído e sílica; inorgânicos, como o carbonato de cálcio, manganês e cádmio; ou células biológicas.[12]
A dissolução da partícula molde, recorrendo a solventes como o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), dá lugar a uma cápsula de polieletrólitos oca (Figura 1). O tamanho e espessura da
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parede dessa cápsula podem ser controlados quer pelo tamanho da suspensão coloidal quer pelo número de cadeias de polieletrólito adsorvidas. As moléculas previamente incorporadas no núcleo permanecem no compartimento limitado pela rede de PE tirando partido do seu peso molecular e a interações eletrostáticas. [15]
Após a dissolução do núcleo podem permanecer adsorvidos nas camadas do revestimento determinados constituintes da partícula molde.[16] Deste modo, para fins biológicos, é preferível a utilização de partículas biocompatíveis, como é o caso de partículas de carbonato de cálcio[16], sílica[17] e polímeros de ácido láctico[18] (como o poliácido lático (PLA) ou lático-co-ácido glicólico (PLGA)). Entre estes tipos de partículas molde, um núcleo de carbonato de cálcio é o mais vantajoso [19], devido não só à sua biocompatibilidade e biodegradação, mas também à sua síntese economicamente viável e isenta de solventes orgânicos e à sua fácil destruição completa. Assim, um sistema de CaCO3 garante a manutenção das propriedades funcionais das moléculas encapsuladas no seu interior, revelando-se promissor para aplicações biomédicas. [7] [20]
As interações entre as cápsulas e as células vivas têm sido largamente estudadas quanto aos mecanismos e cinética de internalização, à toxicidade e à degradação intracelular. Sukhorukov et al. foram os primeiros a demonstrar a internalização de cápsulas de polieletrólitos em células biológicas, concluindo que células tumorais mamárias tinham a capacidade de captar cápsulas de PSS e PAH, sem significativas deformações, sofrendo apenas uma ligeira deformação em consequência do stress mecânico exercido pelas células.[21] Posteriormente, Parak et al. exploraram a questão da toxicidade das cápsulas de PE, demonstrando que apresentam atividade citotóxica em culturas celulares apenas quando funcionalizadas com nanopartículas de caráter citotóxico.[22]
1.2. Terapia Fotodinâmica e Bio imagem
A terapia fotodinâmica (Photodynamic Therapy – PDT) é um procedimento promissor para o tratamento de doenças oncológicas, cardiovasculares, dermatológicas e oftálmicas.[23] Comparativamente com outros tratamentos em vigor (quimioterapia, radioterapia e cirurgia) esta técnica revela-se mais vantajosa por induzir atividade citotóxica seletiva nos tecidos danificados, sem comprometer os saudáveis adjacentes, e atuar de uma forma menos invasiva, com menos efeitos secundários e sem desencadear no organismo mecanismos de resistência.[5]
Clinicamente a PDT pode ser utilizada como tratamento único ou combinado com outros métodos, como a cirurgia, radioterapia e quimioterapia, para a cura de lesões tumorais em fase inicial e a melhoria da qualidade de vida em tumores inoperáveis.[4][24]
Embora pouco eficiente no tratamento de metástases, devido à sua natureza localizada, a terapia fotodinâmica é considerada uma opção viável e tipicamente utilizada no tratamento de diversos tumores. Devido à limitada penetração da radiação nos tecidos ao comprimento de onda de absorção máxima dos fotossensibilizadores, a PDT com recurso ao uso de porfirinas é mais adequada para o
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tratamento de cancros de pele, pescoço e garganta.[25][26][27] Para além destes, a PDT é um potencial tratamento para o cancro do pulmão[28][26] e da mama[29].
A terapia fotodinâmica faz uso de fotossensibilizadores (Photosensitizers - PS) que, por injeção intravenosa, são capazes de se acumular preferencialmente nos tecidos danificados e de, sob ativação por irradiação local a comprimentos de onda e energia adequados, originar espécies citotóxicas de oxigénio responsáveis pela destruição irreversível desses tecidos.
A absorção de luz por parte do fotossensibilizador leva à sua migração do estado fundamental (PS0) para um estado excitado singuleto (1PS*), do qual pode decair diretamente de volta ao estado fundamental por emissão de fluorescência (útil para aplicações de fotodeteção) ou pode sofrer uma conversão de spin eletrónico até um estado excitado tripleto (3PS*) (Figura 3).[5]
O fotossensibilizador ao atingir o estado tripleto excitado (3PS*) pode transferir a sua energia por fosforescência ou por colisão com outras moléculas. Dessa colisão resultam espécies reativas através de dois tipos de reações, consoante a disponibilidade de oxigénio no tecido tumoral. Numa reação de tipo I, quando o oxigénio está presente em concentrações diminutas, o 3PS* reage com substratos do tecido tumoral por transferência de protões ou eletrões, originando radicais livres ou iónicos capazes de interagir com oxigénio molecular (3O
2) e formar espécies oxigenadas reativas (Reactive Oxygen
Species - ROS) (como o peróxido de hidrogénio H2O2). Numa reação de tipo II, para concentrações de oxigénio elevadas, o 3PS* transfere diretamente a sua energia para o oxigénio molecular formando-se oxigénio singuleto (1O
2), a espécie mais citotóxica formada durante a PDT (Figura 3) (Figura 4).[5][30]
Figura 3 – Diagrama de Jablonski modificado. (adaptado)[5]
Os radicais de oxigénio são moléculas prejudiciais ao normal funcionamento de um organismo que, embora produzidas durante certos processos fisiológicos como na respiração, são mais abundantes em contexto de doença, inflamações e infeções.[31] Para além destes fatores internos, existem fontes externas que contribuem para o desenvolvimento destas espécies, como é o caso da exposição a radiação e das práticas de alcoolismo e tabagismo.[32] Geralmente o organismo controla a quantidade destas espécies, reduzindo-as por ação de substâncias antioxidantes. No entanto, elevadas concentrações de radicais e reduzidas concentrações de antioxidantes originam situações de stress oxidativo que, por conseguinte, desencadeiam danificações celulares e mutações ao nível do DNA.[33]
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Assim, o composto fotossensibilizador pode atuar quer como agente terapêutico, participando em PDT, devido à formação de oxigénio singuleto, quer como agente de contraste em diagnóstico por bio imagem, devido à sua fluorescência.
Figura 4 – Reações de tipo I e II para produção das espécies oxidadas responsáveis por conferir citoxicidade às células tumorais. (adaptado)[34]
A PDT tem a capacidade de induzir direta e indiretamente a morte celular dos tecidos tumorais. Desencadeia processos de necrose, de apoptose e de autofagia. Danifica irreversivelmente a vasculatura do tumor bem como dos vasos adjacentes saudáveis, originando uma diminuição da circulação sanguínea e comprometendo a disponibilidade de oxigénio e de nutrientes necessários ao crescimento tumoral. Inicia uma resposta do sistema imunitário responsável por uma resposta inflamatória e imunitária contra as células tumorais.[30][4]
O oxigénio singuleto é extremamente reativo, com um tempo de vida da ordem dos 40 ns, e apresenta um raio máximo de atuação de 20 nm (menor que o diâmetro da maioria dos organelos celulares). Este raio de ação bastante reduzido e a sua ativação apenas por iluminação nos tecidos tumorais alvo conferem especificidade à PDT, indicando que a resposta celular às danificações induzidas por radiação é extremamente dependente da dose de PDT e da localização do PS.[4] Para elevadas doses de radiação e PS localizados em membranas citoplasmáticas o mecanismos de morte celular dominante é a necrose. Para doses intermédias de radiação e PS em ambiente mitocondrial prevalece a apoptose. Para reduzidas doses de PDT a autofagia é iniciada com o objetivo de reparar os danos nos organelos alvo dos PS, mas quando a capacidade protetiva da autofagia é comprometida por danificações ao nível dos lisossomas a autofagia pode induzir morte celular. [4]
Em suma, a eficiência da PDT depende do tipo, localização, concentração no tecido tumoral e sistema de transporte do fotossensibilizador, bem como da energia e tempo de fotoativação e da disponibilidade de oxigénio. [5]
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A deteção clínica do cancro recorre, numa primeira fase, a técnicas de imagem, como os raios X, ressonância magnética (MRI), tomografia computorizada (CT), endoscopia, ou de análise morfológica, tanto de células (citologia) como de tecidos (histopatologia) que se suspeita estarem danificados. Estas técnicas são demoradas, complexas, dispendiosas e não permitem a deteção eficiente de tumores em estado inicial. Pelo que o desenvolvimento de métodos para a deteção primária do cancro, antes desta doença se tornar sintomática, representa um problema da atualidade.[35] A bioimagem surge então como alternativa para monitorizar processos biológicos em tempo real e de forma não invasiva.
Conforme referido anteriormente, os fotossensibilizadores não participam apenas na formação de oxigénio singuleto necessário para efeitos terapêuticos. A grande maioria destes compostos são fluoróforos e, como tal, são capazes de emitir radiação na região próxima do infravermelho, tornando-os bastante úteis para efeittornando-os de bioimagem. Conjugando estas duas características, o fotossensiblizador pode atuar como ferramenta guia para a terapia fotodinâmica. Ao acumular-se preferencialmente nos tecidos tumorais, o fotossensibilizador fluorescente permite detetar as células cancerígenas, quantificar o nível de internalização do PS e acompanhar em tempo real a resposta à terapia, disponibilizando o efeito terapêutico máximo ao paciente .[36][37]
1.3. As porfirinas como fotossensibilizadores eficientes
Atualmente são conhecidos 400 fotossensibilizadores, a maioria com aplicabilidade nas áreas da medicina, cosmética e química. [34]
Um fotossensibilizador (PS) ideal deve ser: quimicamente puro; não tóxico, tal como nenhum dos seus metabolitos; facilmente removido do organismo; formulado de forma adequada à injeção intravenosa; e acumulável preferencialmente nos tecidos tumorais. Deve formar um longo estado excitado tripleto e deve ser ativado preferencialmente por luz visível na janela espetral dos tecidos biológicos, entre os 700 e 1350 nm [38], região onde a radiação consegue atingir em maior profundidade os tecidos graças à reduzida absorção da água, gordura e hemoglobina. Deve ser luminescente, apresentar um elevado rendimento quântico de fluorescência e emitir a elevados comprimentos de onda, para permitir a deteção por bioimagem. [5][30][39][37]
As porfirinas são conhecidas como moléculas da vida, devido à sua participação em diversos processos vitais, tais como o transporte e armazenamento de oxigénio, reações catalíticas e de transferência eletrónica, mecanismos de defesa [40] e à sua atuação como centros ativos (cofatores ou grupos prostéticos) para várias enzimas e biomoléculas. [41] Por exemplo, o complexo de ferro da protoporfirina IX, grupo heme, atua como grupo prostético de hemoproteínas responsáveis pelo transporte (hemoglobina) e armazenamento (mioglobina) de oxigénio nos organismos vivos. A clorofila, cujo centro ativo é uma clorina, atua em processos fotossintéticos interferindo na captação e transformação da energia solar. Para além destas funcionalidades, as porfirinas são PS com a capacidade de se acumular seletivamente nas células tumorais e exercer funções de bioimagem devido
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à sua fluorescência, de libertar substâncias citotóxicas e, consequentemente, destruir as células cancerígenas sem comprometer a viabilidade das células saudáveis adjacentes.[42]
A hematoporfirina (Hp), uma mistura complexa de compostos porfirínicos, foi a primeira porfirina utilizada como fotossensibilizador. Após purificação e modificação química a Hp deu origem à hematoporfirina derivada (HpD) que, comparativamente à forma anterior, é mais seletiva para os tecidos tumorais, diminuindo assim a fotossensibilidade da pele após irradiação (Figura 5). Outro passo de purificação resultou no desenvolvimento do porfímero sódico (Photofrin II ®) que, apesar de clinicamente aprovado pela U.S. Food and Drug Administration (FDA) e European Medicine Agency (EMA) e bastante utilizado no tratamento de cancro e pré-cancros, é uma mistura complexa de moléculas à semelhança da HpD. Este composto é, portanto, de baixa pureza, com reduzida seletividade para tecidos tumorais, reduzida capacidade de absorção de radiação e ativação a um comprimento de onda inadequado para penetração da luz nos tecidos biológicos, sendo necessário utilizar-se em elevadas dosagens para garantir os efeitos terapêuticos desejados, o que resulta numa prolongada fotossensibilidade dos tecidos após PDT. [43] [44]
Figura 5 – Estruturas moleculares da hematoporfirina (Hp) e sua derivada (HpD).[45]
Com o objetivo de alcançar uma melhor seletividade tumoral e reduzir a dose de PS necessária para um tratamento eficaz, desenvolveu-se uma nova geração de PS. Por funcionalização química do núcleo e/ou posições periféricas das estruturas tetrapirrólicas, sintetizaram-se os PS porfírinicos de 2ª geração: porfirinas, clorinas, ftalocianinas, texafirinas, feoforbídeos e bacteriofeoforbídeos (Figura 6). Outros, não porfirínicos, como antraquinonas, fenotiazinas, xantenos, cianinas e curcuminas são também descritos na literatura.[4][44]
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Figura 6 – Estrutura molecular de fotossensibilizadores porfirínicos.
O segundo PS a receber aprovação pela EMA foi o composto temoporfin (Foscan ® ou mTHPC) para o tratamento do carcinoma de células escamosas localizado na cabeça e pescoço que, por absorver luz a maiores comprimentos de onda e apresentar um reduzido tempo de circulação, reflete um perfil de segurança mais favorável que o Photofrin®.
Várias formulações de ácido aminolevulínico (ALA), o percursor para a protoporfirina IX, foram aprovadas para o tratamento de lesões dermatológicas. O 5-ALA (Levulan ®) é utilizado para o tratamento de queratoses actínicas enquanto que metilaminolevulinato, MAL, (Metvix® ou Metvixia®) é usado para tratar não só queratoses actínicas, mas também doença de Bowen e carcinomas de células basais. Apesar de apresentarem um perfil de segurança mais favorável que o do Photofrin® estão limitados pela sua reduzida seletividade para tecidos biológicos.
Apesar de superadas as limitações dos primeiros fotossensibilizadores, os PS de segunda geração apresentam uma baixa solubilidade em água, o que limita significativamente a sua administração intravenosa.[45] Surgiu então a necessidade de desenvolver uma nova geração de fotossensibilizadores, terceira geração, que se baseou na síntese de substâncias com maior afinidade para os tecidos tumorais em detrimento dos tecidos adjacentes, possibilitando reduzir danos em tecidos saudáveis, diminuir a quantidade de fármaco administrada garantindo os efeitos terapêuticos desejados, bem como diminuir os efeitos secundários. Para tal, têm sido introduzidas modificações na PDT como: a combinação de PS de segunda geração com moléculas biológicas direcionadas para a receção de um determinado composto alvo; a conjugação de PS com lipoproteínas de baixa densidade, dado que a proliferação de células tumorais requer colesterol para a construção de paredes celulares; a combinação de PS com anticorpos monoclonais direcionados para um antigénio especifico da célula
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tumoral; e a utilização de marcadores de superfície tumorais, tais como recetores de fatores de crescimento (hormonas, recetores de transferrina).[45][4]
1.3.1. Estrutura e propriedades
O composto ancestral a todas as porfirinas é a porfina, um macrociclo planar com simetria D2h que consiste em quatro anéis pirrólicos interligados nas posições α por pontes metino (=CH). O macrociclo porfirínico contém 22 eletrões π, dos quais 18 participam no sistema de deslocalização, o que obedece à regra de Hückel (4n+2 eletrões π) para a aromaticidade. Duas das ligações duplas periféricas (posições β, β’ 7-8 e 17-18) em anéis pirrólicos opostos não participam no caráter aromático do macrociclo e quando reduzidas dão origem a novos macrociclos tetrapirrólicos. A redução de ambas as ligações transforma-o a numa bacterioclorina, enquanto que a redução de apenas um origina uma clorina (Figura 7). Devido ao sistema conjugado de eletrões π as porfirinas apresentam, na região do visível, uma banda de absorção intensa, a banda Soret, a cerca de 400-450 nm, e quatro bandas de menor intensidade, as bandas Q, entre os 500 e 700 nm (Figura 8).Qualquer uma das bandas, Soret e Q, resulta de transições π - π* e a sua intensidade e posição é influenciada pela quantidade, tipo e posição relativa dos grupos substituintes presentes nas posições periféricas do macrociclo, bem como pela presença ou ausência de um ião metálico no núcleo do sistema.[41]
A emissão de fluorescência é facilmente detetável por excitação com radiação ao comprimento de onda correspondente à banda Soret (~400 nm), sendo composta por duas bandas na região do vermelho do espetro eletromagnético, a aproximadamente 650 nm e 720 nm.
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Figura 8 – Espetros de absorção (azul) e emissão (vermelho) de uma porfirina livre.
A porfirina tetra-catiónica 5,10,15,20-tetraquis (4-N-metil piridínio) porfirina, TMPyP, tem como substituintes quatro grupos piridínio em posições meso (Figura 9). Apresenta um elevado rendimento de produção de oxigénio singuleto após fotoativação (Φ=0,77), uma elevada absortividade molar (ε=1,09105 M-1 cm-1) e uma forte afinidade para o DNA, propriedades que a tornam um agente fotossensibilizador promissor para PDT. A sua banda Soret encontra-se localizada na região do azul, a cerca de 424 nm, e as quatro bandas Q nas regiões do verde e vermelho do espetro eletromagnético, a cerca de 518, 554, 585 e 630 nm.
Figura 9 – Estrutura molecular da TMPyP.
Como referido anteriormente, a eficiência da PDT e consequentes mecanismos de morte celular dependem, entre outros fatores, da natureza, concentração e localização intracelular do PS. Posto isto, vários estudos têm sido efetuados com vista a analisar a localização da TMPyP, tendo-se concluído que esta porfirina se acumula preferencialmente em lisossomas e complexos de Golgi e que, em
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elevadas concentrações ou após fotoativação, se relocaliza rapidamente para o núcleo, onde interatua com ácidos nucleicos.[46]
Embora estudos de tratamentos de PDT com TMPyP in vivo sejam raros, in vitro existem diversos resultados reportados. O uso da TMPyP como PS para terapia fotodinâmica reside na sua habilidade para gerar ROS sob ativação por radiação, causando alterações intracelulares ao nível do citoesqueleto e do DNA, induzindo diferentes mecanismos de morte celular. Tada-Oikawa et al. estudaram o mecanismo através do qual esta porfirina causa oxidação nas cadeias de DNA, utilizando células cancerígenas de leucemia, concluindo que o oxigénio singuleto gerado após foto ativação da TMPyP era responsável por modificações nos resíduos de guanina.[46] Cenklocá et al. demonstraram a primeira evidência do papel da TMPyP após fotoativação na alteração da dinâmica do citoesqueleto, observando que esta porfirina atua na desorganização dos microtúbulos graças à afinidade com a tubulina e, consequentemente, provoca morte celular em células HeLa e G361.[47]
Face às propriedades supramencionadas, esta porfirina foi a escolhida para a realização deste trabalho.
1.4. Nanopartículas de ouro
As nanopartículas de ouro são: biocompatíveis, de reduzida citotoxicidade; de fácil síntese e, comparativamente aos PS convencionais, mais resistentes à degradação enzimática e fotoquímica; ativáveis por radiação NIR; e com coeficientes de absortividade molar cerca de 104-106 vezes superiores.[48] Para além disso, possuem propriedades óticas singulares devido ao fenómeno de plasmão de superfície localizado (Localized Surface Plasmon - LSP), que é responsável pela forte absorção e dispersão de luz que estas partículas podem exibir na região do visível ou NIR do espetro eletromagnético.
Quando as nanopartículas de ouro são expostas à luz, o campo eletromagnético da radiação induz um movimento coletivo e coerente dos eletrões de condução que é confinado pela superfície das partículas. Esta oscilação coerente dos eletrões livres do metal em ressonância com o campo eletromagnético ocorre a uma dada frequência que se designa por Ressonância de Plasmão de Superfície Localizado (Localized Surface Plasmon Resonance - LSPR) (Figura 10).[49][50]
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Figura 10 – Radiação eletromagnética interage com nanopartículas metálicas, provoca a oscilação dos seus eletrões de condução em relação ao núcleo.[51]
A LSPR está na origem de importantes propriedades radiativas e não radiativas das nanopartículas metálicas, oferecendo múltiplas modalidades para aplicações biológicas e biomédicas. [49][50][52] A capacidade de conversão da radiação absorvida pelas nanopartículas em energia térmica, resultando no seu próprio aquecimento, sendo útil para terapia fototérmica (PTT). [53]
Há muito que se sabe que a proximidade de uma superfície metálica induz alteração das propriedades de um fluoróforo [54] devido a campos elétricos locais muito intensos e transferência de energia entre o fluoróforo e o metal, com modificação das velocidades de decaimento radiativo/não radiativo.
As nanopartículas metálicas têm a capacidade atuar como nanoantenas óticas. Para um fluoróforo na proximidade de nanopartículas metálicas, a proximidade de campos elétricos intensos aumenta a probabilidade de absorção molecular. Desta forma, a moléculas são excitadas mais vezes aumentando a probabilidade de emissão de fotões por decaimento radiativo.[55]
Os metais aumentam também as taxas de decaimento radiativas e não radiativas, sendo que este último efeito pode provocar a supressão da fluorescência. O fator que determina se ocorre intensificação ou supressão é o balanço entre estes dois efeitos, que depende da posição exata e orientação da molécula fluorescente relativamente à nanopartícula.[55]
A maioria dos fotossensibilizadores orgânicos, como as porfirinas e as ftalocianinas, estão limitados pela sua reduzida foto-estabilidade e resistência à degradação enzimática, pela incapacidade de ativação por radiação na região NIR e pela sua fraca emissão, o que dificulta a sua aplicabilidade como agentes de diagnóstico e terapia.[48] Assim, surge a necessidade de aumentar o rendimento quântico de fluorescência destes compostos, a qual é conseguida, por exemplo, por conjugação com outros fluoróforos [56] ou com nanopartículas metálicas. Este efeito de intensificação plasmónico via nanopartículas, tem sido investigado no laboratório de acolhimento, especificamente com porfirinas e ftalocianinas na presença nanopartículas de ouro[57][58][59].
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Os nanobastonetes de ouro (AuNR) são particularmente úteis para aplicações biológicas dado que as suas propriedades óticas podem ser ajustadas de forma controlável em torno da região NIR do espetro eletromagnético por variação da sua geometria. A razão largura/altura dos AuNR define duas frequências de ressonância plasmónica distintas associadas às dimensões longitudinal e transversal da nanoestrutura.[55]
No espetro de absorção UV-Vis-NIR apresentam duas bandas SPR: uma banda forte na região NIR que corresponde ao movimento oscilatório dos eletrões ao longo do eixo longitudinal, a banda longitudinal que aparece entre 600-900 nm; e uma banda fraca na região do visível, a banda transversal que aparece a aproximadamente 520-550 nm. Enquanto que a banda transversal praticamente não é sensível a variações de tamanho dos nanobastonetes, a banda longitudinal sofre grandes desvios da região visível para a região NIR, que são tanto maiores quanto mais elevada for a razão comprimento/largura do nanobastonete (Figura 11).[49]
Figura 11 – Nanobastonetes de ouro e variação do seu espetro de absorção UV-Vis consoante a razão largura/altura (AR) da nanopartícula. (adaptado) [49]
Para além destas vantagens conferidas pela LSPR, as nanopartículas de ouro podem funcionar como veículos de transporte de moléculas fluorescentes devido à sua elevada razão área superficial/volume, sendo úteis para aplicações em PDT. Consoante o papel que desempenham na foto sensibilização do tumor, as NP podem ser passivas ou ativas. NPs passivas não afetam significativamente a eficiência do PS na PDT, servindo principalmente para o seu transporte (como é o caso das nanoesferas). Ao contrário, as NP ativas são capazes de absorver radiação e assim contribuir para a ativação do PS, promovendo a formação de oxigénio singleto ou aumentando o rendimento do estado tripleto do PS (como os nanobastonetes).[60]
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2. Técnicas Experimentais
2.1. Fluorescência
Luminescência é a emissão de luz por uma espécie (átomo, molécula, nanopartícula, etc...) quando, após ter sido excitada por absorção de um fotão, regressa de um estado eletrónico excitado para o seu estado fundamental. Pode ser dividida em dois fenómenos: fluorescência e fosforescência.[61][62][63]
Quando um fluoróforo absorve luz, a energia de um fotão é transferida para a molécula com alteração nos seus estados eletrónico, vibracional e rotacional. A probabilidade de uma molécula absorver um fotão designa-se por coeficiente de extinção molar ou absortividade molar, ε, com unidades M-1cm-1, que mede a probabilidade do fluoróforo absorver luz a um determinado comprimento de onda. Quando excitada a molécula pode regressar ao seu estado fundamental através de processos que envolvam transições radiativas, como a fluorescência e a fosforescência, ou não radiativas, como o cruzamento intersistemas, a conversão interna ou a relaxação vibracional.
O diagrama de Jablonski permite visualizar de forma simplificada os possíveis processos para transições entre estados eletrónicos: absorção de fotão, conversão interna, fluorescência, cruzamento intersistemas, fosforescência, transições tripleto-tripleto. Os estados eletrónicos são dispostos verticalmente por nível de energia e agrupados horizontalmente por multiplicidade de spin. Os estados singuleto são representados do lado esquerdo do diagrama, onde se encontram o estado singuleto fundamental (S0) e os estados excitados singuleto (S1, S2, …). O nível S2 é mais energético que o S1 que, por sua vez, é mais energético que o S0. Do lado direito do diagrama encontram-se os estados tripleto (T1, T2, …). Cada nível eletrónico tem níveis vibracionais associados.
Figura 12 – Diagrama de Jablonski. Possíveis transições entre estados eletrónicos: absorção de fotão, conversão interna, relaxação vibracional, fluorescência, cruzamento intersistemas e fosforescência, e respetivos tempos.[61]
As transições entre estados eletrónicos de igual multiplicidade de spin são permitidas enquanto que as transições entre estados com multiplicidade de spin diferentes são proibidas, como é o caso das transições singuleto-tripleto e tripleto-singuleto. No entanto, apesar de proibidas, podem ocorrer graças ao acoplamento spin-orbital. A transição proibida para o estado excitado tripleto é possível pois,
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na maioria dos fluoróforos, os níveis vibracionais tripleto sobrepõem-se com o nível de menor energia no estado S1, o que favorece o cruzamento intersistemas seguido de conversão interna para o nível de menor energia do T1.
Uma molécula encontra-se geralmente no nível vibracional de menor energia do nível eletrónico S0 (S0,0), estado fundamental, e por absorção de um fotão com energia apropriada transita para um nível vibracional de maior energia do estado singuleto excitado (S1, S2, …). Após absorção do fotão a molécula decai, por relaxação vibracional e conversão interna, para o nível vibracional de menor energia do estado excitado singuleto S1 (S1,0). O que constitui o ponto de partida para a emissão de fluorescência, para o decaimento não radiativo por conversão interna e para a transição para o estado tripleto de mais baixa energia por interconversão de sistemas.
O decaimento do estado excitado para o nível fundamental, na ordem dos nanossegundos, é acompanhado pela emissão de um fotão, com energia correspondente à diferença de energias entre o estado vibracional de menor energia de S1 e um dos níveis vibracionais ou rotacionais do estado S0. Uma vez que a emissão tem início no nível de menor energia do S1, a energia do fotão emitido é tipicamente inferior à energia do fotão absorvido, pois a relaxação vibracional e a conversão interna removem a energia em excesso. A esta diferença entre os comprimentos de onda de excitação e emissão, para a mesma transição eletrónica, designamos desvio de Stokes.
Uma molécula no estado tripleto ao decair para o estado fundamental pode emite luz num processo que se designa fosforescência, e que tipicamente ocorre na gama temporal dos microssegundos.
O rendimento quântico de fluorescência (Φ𝐹) de uma molécula traduz a fração de moléculas excitadas que retornam ao seu estado fundamental, S1 → S0, com emissão de fotões, ou seja, é o rácio entre o número de fotões emitidos e absorvidos. Considerando a taxas de decaimento radiativo (𝑘𝑟) e de decaimento não radiativo (𝑘𝑛𝑟), a qual corresponde à soma entre as taxas de cruzamento intersistemas (𝑘𝑖𝑠𝑐 ) e de conversão interna (𝑘𝑖𝑐) na ausência de outros processos fotoquímicos ou fotofísicos (equação (2)), o rendimento quântico é definido pela equação (1):
Φ𝐹 = 𝑘𝑟
𝑘𝑟+𝑘𝑛𝑟 (1)
𝑘𝑛𝑟 = 𝑘𝑖𝑐+ 𝑘𝑖𝑠𝑐 (2)
A intensidade de fluorescência, 𝐼(𝑡), é proporcional à população de estado excitado do fluoróforo e é dada pela equação (3):
𝐼(𝑡) = 𝐼0𝑒−(𝜏𝑡) (3)
O tempo de fluorescência (𝜏) é definido como o tempo médio que a molécula permanece no estado excitado e é dado pela equação (4):
𝜏 = 1
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Conjugando as duas equações é possível obter a relação entre o rendimento quântico e o tempo de vida de fluorescência, equação (5):
Φ𝐹 = 𝑘𝑟𝜏 (5)
2.2. Absorvância UV-VIS
A eficiência de absorção de um feixe de luz a um dado comprimento de onda, λ, por um determinado meio é caracterizada pela absorvância 𝐴(𝜆) ou transmitância 𝑇(𝜆), equações (7) e (8)
[62][63]:
𝐴(𝜆) = log𝐼𝜆0
𝐼𝜆= − log 𝑇(𝜆) (7)
𝑇(𝜆) =𝐼𝜆
𝐼𝜆0 (8)
onde 𝐼𝜆0 e 𝐼𝜆 representam a intensidade dos fotões que incidem e abandonam o meio de absorção, respetivamente.
Considerando a lei de Beer-Lambert a equação (7) dá origem a (9):
𝐴(𝜆) = log𝐼𝜆0
𝐼𝜆= 𝜀(𝜆)𝑙 𝑐 (9)
onde 𝜀(𝜆) representa o coeficiente de absorção molar (L mol-1 cm-1), 𝑐 a concentração (mol L-1) das espécies absorventes e 𝑙 a espessura do meio absorvente (cm).
A formação de agregados a elevadas concentrações e a presença de várias espécies capazes de absorver os fotões incidentes impedem a dependência linear entre a absorvância e a concentração dada pela lei de Beer-Lambert.
Cada molécula tem associada uma área de captura de fotões, denominada secção cruzada de absorção molecular e que depende do comprimento de onda. Assim, para uma camada de espessura 𝑑𝑙 existem 𝑑𝑁 moléculas, equação (10):
𝑑𝑁 = 𝑁𝑎 𝑐 𝑆 𝑑𝑙 (10)
onde 𝑆 representa a secção cruzada do feixe incidente, 𝑐 a concentração da solução e 𝑁𝑎 o número de Avogadro.
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Geralmente, a amostra utilizada é uma cuvete que contém a solução em estudo. Idealmente, a absorvância deve-se apenas às espécies absorventes, no entanto tal não se verifica. É de notar que I0 representa a intensidade do feixe de luz que incide na solução e não a intensidade do feixe que incide na cuvete, Ii, e que 𝐼 é a intensidade do feixe que abandona a solução e não do feixe que sai da cuvete, IS, uma vez que nas paredes da cuvete têm lugar fenómenos de reflexão e de absorção da luz incidente. Apesar de se assumir que o solvente não contribui para a absorvância medida, este pode ser parcialmente responsável pela diminuição da intensidade graças a absorção e dispersão da luz. Para ter em consideração estes desvios à lei de Beer-Lambert, a absorvência total da amostra e das paredes da cuvete é dada pela equação (15):
𝐴𝑆(𝜆) = 𝑙𝑜𝑔𝐼𝑖
𝐼𝑆 (15)
Caso a solução seja substituída pelo solvente, a intensidade da luz transmitida é 𝐼𝑅 e a absorvância é dada pela equação (16):
𝐴𝑅(𝜆) = 𝑙𝑜𝑔𝐼𝑖
𝐼𝑅 (16)
E a absorvância real da solução é, equação (17):
𝐴(𝜆) = 𝐴𝑆(𝜆) − 𝐴𝑅(𝜆) = 𝑙𝑜𝑔𝐼𝑅
𝐼𝑆 (17)
Espetrofotómetros de feixe duplo registam automaticamente a absorvância real da solução, por medição de log (𝐼𝑅/𝐼𝑆), graças à existência de dois compartimentos para duas cuvetes, uma contendo a solução e outra o solvente. Para colmatar os desvios acima mencionados, este aparelho regista primeiro uma linha de base com as cuvetes preenchidas pelo solvente para que, de seguida, a amostra de uma das cuvetes seja substituída pela solução a estudar e se registe o seu espetro de absorção.[62][63]
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2.3. Emissão de fluorescência
A intensidade de fluorescência em estado estacionário, 𝐼𝐹(𝜆𝐹), é proporcional à intensidade de absorção dos fotões ao comprimento de onda de excitação 𝜆𝐸, 𝐼𝐴(𝜆𝐸), e à função distribuição de probabilidade das transmissões eletrónicas ocorrerem entre os níveis vibracionais S1 e S0, 𝐹𝜆(𝜆𝐹), através de um parâmetro instrumental 𝑘, equação (18). Esse parâmetro é dependente de diversos fatores, tais como a geometria da medição (ângulo através do qual a luz é recolhida), a eficiência de transmissão, a largura dos monocromadores e a diferença de potencial do fotomultiplicador.[62][63]
𝐼𝐹(𝜆𝐸, 𝜆𝐹) = 𝑘𝐹𝜆(𝜆𝐹) 𝐼𝐴(𝜆𝐸) (18)
A intensidade de absorção dos fotões é definida como a diferença entre as intensidades da luz incidente, 𝐼0, e transmitida, 𝐼𝑇, ao comprimento de onda de excitação, equação (19).
𝐼𝐴(𝜆𝐸) = 𝐼0(𝜆𝐸) − 𝐼𝑇(𝜆𝐸) (19)
A intensidade de luz transmitida pode ser expressa recorrendo à lei de Beer-Lambert, equação (20):
𝐼𝑇(𝜆𝐸) = 𝐼0(𝜆𝐸) exp [−2,3𝜀(𝜆𝐸)𝑙𝑐] (20)
onde 𝜀(𝜆𝐸) representa o coeficiente de absorção molar ao comprimento de onda de excitação (L mol-1 cm-1), 𝑙 o percurso ótico (cm), 𝑐 a concentração (mol L-1) e 𝜀(𝜆
𝐸)𝑙𝑐 representa a absorvância ao comprimento de onda de excitação, A(𝜆𝐸).
Relacionando as equações (18), (19) e (20) obtém-se a equação (21):
𝐼𝐹(𝜆𝐸, 𝜆𝐹) = 𝑘𝐹𝜆(𝜆𝐹)𝐼0(𝜆𝐸){1 − exp[−2,3𝜀(𝜆𝐸)𝑙𝑐] (21)
Para soluções diluídas, 𝐴(𝜆𝐸) < 0,05, a equação (21) fica reduzida à equação (22):
𝐼𝐹(𝜆𝐸, 𝜆𝐹) = 2,3𝑘𝐹(𝜆𝐹)𝐼0(𝜆𝐸)𝜀(𝜆𝐸)𝑙𝑐 (22)
O valor numérico da intensidade de fluorescência medida não tem significado e o espetro de fluorescência é traçado com base em unidades arbitrárias.
O espetro de emissão corresponde a variações de 𝐼𝐹 em função de 𝜆𝐹, a 𝜆𝐸 fixos.
A medição da fluorescência de emissão de uma molécula requer a utilização de um espetrofluorímetro. Num espetrofluorímetro convencional, a fonte de luz, geralmente uma lâmpada de
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xénon de elevada pressão, possibilita a emissão contínua a comprimentos de onda desde ~250 nm até à região do infravermelho. Um monocromador é utilizado para selecionar o comprimento de onda de excitação. A fluorescência é recolhida a um determinado ângulo relativamente ao feixe de luz incidente e é detetada através de um monocromador graças a um fotomultiplicador. O scan automático dos comprimentos de onda é alcançado por monocromadores motorizados que são controlados por dispositivos eletrónicos e pelo computador a ele associado.
O módulo ótico é composto por um reservatório para a amostra, obturadores, polarizadores e, se necessário, um divisor de feixe que consiste numa placa de quartzo capaz de refletir uma pequena percentagem do feixe de luz em direção a um fotodiodo.[62][63]
Figura 14 – Medição da emissão de fluorescência num espetrofluorímetro convencional. (adaptado)[62]
2.4. Potencial Zeta
O potencial zeta é o parâmetro chave no controlo das interações eletrostáticas em dispersões de partículas.[64][65]
O potencial elétrico de uma superfície é a quantidade de trabalho que necessita de ser feito para trazer uma carga positiva unitária do infinito para essa superfície sem qualquer aceleração.
Quando uma partícula é dispersa numa solução, uma dupla camada elétrica (EDL) é adsorvida à sua superfície. A camada interna, camada de Stern, é constituída predominantemente por iões com carga contrária à da partícula. A camada externa, ou camada difusa, é dinâmica variando consoante diversos fatores, tais como pH, força iónica e concentração. No interior da camada difusa existe um
