Alim. Nutr., Araraquara
v. 21, n. 4, p. 509-517, out./dez. 2010
COMPOSTOS FENÓLICOS DA POLPA E SEMENTES DE
ROMÃ (P
UNICA
GRANATUM
, L.): ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E
PROTETORA EM CÉLULAS MDCK*
Fernanda Archilla JARDINI** Alessandro de LIMA** Rita Maria Zucatelli MENDONÇA*** Ricardo José PINTO*** Dalva Assunção Portari MANCINI*** Jorge MANCINI-FILHO****
* Trabalho realizado com apoio fi nanceiro do CNPq (Processo nº 5000875/2008-1) e da CAPES.
** Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos – Curso de Doutorado – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP – 05508-900 – São Paulo – SP – Brasil. E-mail: [email protected].
*** Laboratório de Virologia – Instituto Butantan – 05503-000 – São Paulo – SP – Brasil.
**** Laboratório de Lípides – Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP – 05508-900 – São Paulo – SP – Brasil.
RESUMO: Os radicais livres, dentre os quais as EROs e as ERNs, são espécies reativas envolvidas no início de re-ações como a peroxidação, que no sistema biológico pode dar início ao desenvolvimento de diversos processos pato-lógicos. Para conter o avanço da cadeia oxidativa iniciada pelos radicais livres e minimizar os seus efeitos deletérios ao organismo, algumas substâncias antioxidantes como compostos fenólicos, dentre os quais os ácidos fenólicos, podem ser encontrados em diversas fontes vegetais. As frutas são uma boa fonte de compostos antioxidantes, e a romã (Punica granatum, L.) apresenta expressiva quanti-dade de compostos fenólicos. Os objetivos deste trabalho foram identifi car os principais ácidos fenólicos, presentes na fruta (polpa e sementes), através de cromatografi a gaso-sa, a avaliação da capacidade antioxidante, utilizando dois métodos: o de co-oxidação de substratos (β- caroteno e áci-do linoléico) e o da redução áci-do radical 1,1- diphenyl- 2- picryl- hydrazyl (DPPH•). Ainda, foi verifi cado o efeito da
fração de ácidos fenólicos livres da polpa da romã (AFLp) sobre a proliferação e viabilidade em cultura de células MDCK. Pôde-se verifi car que a fração AFLp apresentou o maior conteúdo de compostos redutores (1.399,02μg/mL) enquanto que a de ácidos fenólicos ligados a compostos so-lúveis apresentou o maior conteúdo (770,58 μg/mL) nas se-mentes (AFESs). Todas as frações de ácidos fenólicos apre-sentaram resultados signifi cativamente (p<0,05) superiores aos do antioxidante sintético butil-hidroxitolueno, utilizado como padrão. Os principais ácidos fenólicos encontrados foram o salicílico, o protocatequínico e o gálico. As células tratadas com baixas concentrações da fração AFLp apre-sentaram aumento da proliferação celular e a viabilidade manteve-se alta.
PALAVRAS CHAVE: Punica granatum, L.; ácidos fenó-licos; cultura de células.
INTRODUÇÃO
Os radicas livres e outras espécies reativas como as do oxigênio (EROs) ou do nitrogênio (ERNs) estão cons-tantemente presentes no organismo, geradas endogena-mente como produtos de vias metabólicas ou ainda podem vir exogenamente através da ingestão e da respiração. A peroxidação lipídica, por exemplo, é uma reação mediada por radicais em que há a degradação dos ácidos graxos da membrana celular e a diminuição de sua fl uidez, eventos que podem dar início a quadros patológicos como doenças cardíacas, alguns tipos de câncer, isquemias e quadros in-fl amatórios, entre outros. 12
Os efeitos deletérios causados ao organismo pelos radicais livres podem ser minimizados por alguns com-postos, como os fenólicos, que podem ser encontrados em diversas fontes vegetais. 10,13 A capacidade antioxidante
destes compostos é estudada in vitro através de diferentes métodos, como os descritos por Giada & Mancini-Filho. 15
Outros estudos evidenciam que o consumo de alimentos e bebidas ricos em polifenóis pode reduzir o risco do desen-volvimento de algumas doenças, com destaque para a ação dos fenólicos presentes no vinho tinto e capazes de inibir a oxidação da LDL in vitro. Este efeito sustenta a explicação para o “paradoxo francês”: apesar do alto consumo de lipí-deos, a população estudada apresenta boa equalização dos valores relativos às lipoproteínas, o que foi relacionado ao elevado teor de fl avonoides provenientes da dieta. Também o estudo epidemiológico Zupthen, realizado na Holanda, mostrou a correlação inversa entre a incidência de risco de doença coronariana e o consumo diário de fl avonóides. 16
Dentre os compostos acima citados, os ácidos fenó-licos pertencem a uma classe de compostos com estrutura simples, formados por um anel aromático e grupamentos (em geral hidroxilas) distribuídos em sua estrutura. São
ISSN 0103-4235 ISSN 2179-4448 on line
metabólitos secundários dos vegetais, formados a partir dos aminoácidos fenilalanina e tirosina através da via de sintetização do ácido shikímico. Os compostos fenólicos estão distribuídos por toda a planta de maneira não unifor-me, nas formas livre ou esterifi cados a compostos solúveis (compartimentabilizados nos vacúolos celulares) ou insolú-veis (na parede celular), formando uma mistura complexa juntamente a carboidratos, proteínas e outros componentes dos vegetais, de modo que os métodos de análise dependem da natureza da matriz. Por estas características, não há um modelo padrão para a extração e identifi cação destes com-postos. 23
As frutas são uma fonte em potencial de compostos antioxidantes e neste contexto, a romã (Punica granatum, L.) foi estudada com o intuito de visar a participação destes compostos sobre a inibição da oxidação das lipoproteínas, identifi cando que os mesmos são capazes de contribuir com a prevenção de doenças cardiovasculares. 4,5 Além destes
estudos, verifi cou-se o pó da casca da romã possui ativida-de estimulatória sobre a resposta imune humoral. 27 Ainda
pode-se observar também o extrato metanólico obtido da polpa foi capaz de inibir em até 74,21% a formação da úl-cera gástrica, em conjunto com uma diminuição da lipope-roxidação local e acréscimo dos níveis das enzimas gluta-tiona (GSH), glutagluta-tiona peroxidase (GPx), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD).1
Outros estudos têm demonstrado que os compostos fenólicos da romã são possíveis inibidores do crescimento de tumores de mama e de próstata. 2,19,24 A inibição do
cres-cimento das células foi verifi cado por Seeram et al.,31 em
linhagens tumorais cólon, próstata e oral, além da indução da apoptose e a inibição da lipoperoxidação induzida por Fe (II) em modelo lipossômico.
Diante das considerações aqui relatadas e levando-se em conta que a romã possui um potencial a levando-ser melhor explorado como fonte de compostos antioxidantes e seus benefícios na prevenção de doenças, o presente trabalho teve por objetivos identifi car os principais ácidos fenólicos presentes na polpa e sementes, avaliar a atividade antioxi-dante in vitro de suas frações fenólicas, e também verifi car a infl uência da fração de fenólicos livre da polpa na viabili-dade celular em cultura de células da linhagem MDCK. MATERIAL E MÉTODOS
Amostras
As romãs foram adquiridas junto ao CEAGESP (Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo) no mês de janeiro de 2006, em estado maduro. As frutas foram abertas e o conteúdo interno colocado sobre uma peneira e macerado com um pistilo à temperatura am-biente (± 23ºC), separando-se a polpa (coletada na forma de suco) e as sementes, que foram lavadas para a retirada de resquícios da polpa. A seguir ambas foram liofi lizadas, mantendo-se estocadas em congelamento a -20oC para
pos-terior utilização.
Reagentes
Solventes de extração: acetato de etila, acetona, éter etílico, hexano, álcool metílico e tetrahidrofurano (THF) (Synth®). Solventes para a cromatografi a gasosa: álcool
metílico e hexano ultra puros (Merck®). Reagentes: Folin-
Ciocalteau (Merck®). Padrões de ácidos fenólicos
(Sigma-Aldrich®). Ácido linoleico, β- caroteno, radical diphenyl-
(DPPH•) e corante Trypan blue (Sigma®). Meio de cultura
Leibovitz 15 (L15), Soro Fetal Bovino (SFB) (Culticel®).
Cultura de células
Células da linhagem MDCK (epitélio renal sadio de cães) foram obtidas junto ao Laboratório de Cultura Celu-lar do Instituto Adolfo Lutz da cidade de São Paulo. As cé-lulas foram mantidas em estufa à 37ºC, em meio de cultura Leibovitz 15 (L-15) com 10% de soro fetal bovino. Obtenção das Frações de Ácidos Fenólicos
A partir da polpa e das sementes liofi lizadas da romã, foram extraídos os ácidos fenólicos, presentes na fru-ta, nas formas livre (AFL), esterifi cadas solúveis (AFES) e insolúveis (AFEI), seguindo a técnica descrita por Krygier et al. 20 Foi pesado 1g de cada amostra previamente
de-sengordurada, sucedendo-se cinco extrações em homoge-neizador com 20mL de tetrahidrofurano (THF)/ 1 minuto cada uma. O conjunto da extração foi fi ltrado em sulfato de sódio anidro e o solvente foi completamente excluído do material em rotaevaporador (40oC) para eliminação do
solvente THF e ressuspenso em 10mL de metanol obtendo-se a fração AFL. O resíduo das extrações foi submetido a seis extrações de 20mL/5 minutos cada uma com a mistura de solventes metanol/ acetona/ água (7:7:6), para obtenção da fração AFES. Ao fi nal das extrações, o material foi ro-taevaporado (40oC), eliminando-se os solventes metanol e
acetona, permanecendo a fase aquosa, da qual foi medido o volume e acrescentado igual quantidade NaOH 4N. O resí-duo da extração anterior foi empregado para a obtenção da fração AFEI, ao qual foram acrescentados 20mL de NaOH 4N. Ambas as frações (AFES e AFEI) contendo NaOH fo-ram submetidas ao processo de hidrólise durante 4 horas (sob agitação e atmosfera de nitrogênio) e o pH foi acertado para 2,0 (solução HCl 6N). A seguir, em distintos balões de separação, foram realizadas seis lavagens (30mL de hexa-no cada) das fases inferiores. Finalmente, cada fração foi colocada em balões de separação e extraídas com a mistura de solventes éter etílico/ acetato de etila/ THF (1:1:1), sen-do a fase inferior submetida a seis extrações consecutivas que, após fi ltradas em sulfato de sódio, foram submetidas a secagem completa do solvente em rotaevaporador (40oC) e
ressuspensas cada uma com 10mL de metanol. As frações obtidas foram estocadas em congelador a -20oC para
análi-ses posteriores.
Análise de Compostos Redutores Totais
Foi realizada a análise de compostos redutores to-tais nas frações obtidas da polpa e semente da romã,
base-ada no método espectrofotométrico (720ηm) com o uso do reagente Folin-Ciocalteau32 cuja intensidade da coloração
corresponde à quantidade de compostos com capacidade antioxidante. Os resultados foram expressos em μg equiva-lentes de ácido gálico mL de amostra.
Identifi cação dos Ácidos Fenólicos por Cromatografi a Gasosa
Os principais ácidos fenólicos presentes nas frações da polpa e sementes da romã foram identifi cados e quan-tifi cados em cromatógrafo a gás (Shimadzu® GC, modelo
17A) com detector de ionização de chama conectado a um integrador (Shimadzu®, modelo CBM 101), de acordo com
os parâmetros de análise descritos em Baggioet al. 6
Atividade Antioxidante pela Co-oxidação dos Substra-tos β-caroteno e Ácido linoleico
A atividade antioxidante foi avaliada pelo método original de co-oxidação dos substratos β-caroteno e ácido linoléico 25,26 com alterações. 17 As concentrações utilizadas
foram de 0,5; 1 e 2μg e empregou-se o ácido gálico como padrão positivo de comparação. Os resultados foram ex-pressos em % de inibição da oxidação.
Atividade Antioxidante pela Redução do Radical DPPH•
Avaliou-se a capacidade antioxidante das frações de ácidos fenólicos pela técnica de redução do radical DPPH•. 8,10 Para os testes foram utilizadas as amostras nas
con-centrações de 0,1; 0,25; 0,5; 1, 2, 4 e 8μg, empregando-se o ácido gálico como padrão positivo de comparação. Os resultados foram expressos em % de redução do radical DPPH•.
Toxicidade em Cultura de Células
Com a utilização de placas de 24 orifícios (TPP®),
colocou-se em cada cavidade 0,2mL de suspensão de célu-las da linhagem MDCK e 0,3mL de meio de cultura e soro fetal, permanecendo em estufa à 37ºC durante 24 horas. Após o período, retirou-se o meio e colocou-se a fração AFL da polpa e o padrão de comparação ácido gálico (am-bos, suspensos no meio de cultura e 10% de SFB e pre-viamente fi ltrados em membrana 22μm - Millipore®), nas
concentrações de 15, 75 e 150μg (0,3mL). As cavidades nas quais foram distribuídos apenas o meio de cultura e 10% de SFB foram consideradas como padrão (100%) do crescimento celular. As placas permaneceram 24 horas em estufa à 37ºC, quando então as células foram desprendidas e transferidas para tubos Eppendorfes® e centrifugadas à 1000rpm/5 minutos à 5ºC. A seguir procedeu-se a conta-gem celular utilizando o corante Trypan blue. Os resulta-dos foram expressos em porcentagem de viabilidade e de crescimento celular, comparadas ao padrão isento de tra-tamento.
Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas pelo pro-grama GraphPad Prism versão 3.02. Os resultados foram expressos em média e mais ou menos um desvio-padrão (ou em média e mais ou menos um erro-padrão). As aná-lises de variâncias foram realizadas pelos testes ANOVA one-way e teste t- student, fi xando-se o nível de diferença signifi cativa de p<0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
De acordo com os resultados, expressos na Figura 1, a fração de ácidos fenólicos livres da polpa (1.399,02μg/
FIGURA 1 – Conteúdo de compostos fenólicos redutores das frações de ácidos fenólicos da romã. Os resultados são expressos em ug equi-valentes de ácido gálico/mL de amostra.
mL) apresentou conteúdo de compostos com capacidade redutora superior às demais frações de ácidos fenólicos. Li et al.22 comparou o conteúdo de compostos fenólicos da
polpa e casca de romãs e observou que a parte interna da fruta apresentou 24,4mg/g de compostos fenólicos, contra 249,4mg/g encontrados na casca da romã e verifi cou que apesar da diferença, a parte interna da fruta apresentou boa atividade nos testes de capacidade antioxidante baseados na redução de radicais (FRAP, ORAC, radicais superóxi-do – O2-•- e hidroxila - •OH) e na inibição da oxidação da
LDL.
Os principais ácidos fenólicos identifi cados nas fra-ções da polpa e sementes da romã estão apresentados na Tabela 1, sendo a fração de ácidos livres proveniente das sementes (AFLs) a que apresentou maior variedade de áci-dos fenólicos.
O conteúdo de compostos fenólicos totais na com-posição de sete variedades de romã foi avaliado3 e
consta-tou-se que o conteúdo de compostos fenólicos variou de 1.864 a 3.803mg/L no suco da fruta, obtido por extração manual. Ainda no mesmo trabalho, a avaliação dos ácidos fenólicos foi realizada através da cromatografi a líquida de alta efi ciência (HPLC) e identifi cou os ácidos quínico, clorogênico e o ácido gálico. Tais resultados diferem dos apresentados neste trabalho, em que os principais ácidos fenólicos encontrados foram o salicílico, o p-cumárico, o protocatequínico e o quínico, presentes na fração de ácidos fenólicos livres da polpa da romã.
Os conteúdos de compostos fenólicos totais, expres-sos em mg equivalentes de ácido gálico/100g da fruta, fo-ram avaliados em diferentes frutas e bebidas e descritos na revisão realizada por Balasundram et al.,7 sendo os
resulta-dos mais expressivos alcançaresulta-dos pela framboesa (527,2),
maçã (296,3), blueberry (270) e goiaba branca (247,3), dentre outras. O suco de uva vermelha apresentou conteú-do de 172mg eq. áciconteú-do gálico/ L. O vinho, bebida fabricada a partir da uva, participa como importante fonte de com-postos fenólicos, cujos teores também foram excom-postos na revisão e variou entre 1018 a 4177mg eq. AC/L de bebida, de acordo com as diferentes regiões de origem.
Ao observar os resultados demonstrados na Figura 2, relativos ao teste de co-oxidação de substratos β- carote-no e ácido licarote-noleico, carote-nota-se que todas as frações de ácidos fenólicos (exceto AFESs) apresentaram inibição da oxida-ção lipídica estatisticamente superiores (p<0,05) em rela-ção ao controle positivo BHT. A maior atividade, na menor concentração (0,5μg/mL), foi alcançada pela fração AFLp (62,08%), e a mais acentuada atividade, na maior concen-tração (2,0μg/mL), foi detectada na fração AFEIs (87,51%). No mesmo experimento, foi possível verifi car a potencia-lização da atividade antioxidante quando as frações foram associadas ao BHT. O sinergismo foi acentuadamente ob-servado no resultado apresentado para a fração AFLs com o BHT, na concentração de 2,0μg/mL (75,16%).
A Figura 3 traz os resultados relativos ao teste de redução do radical DPPH•, onde verifi ca-se que as frações
de ácidos fenólicos (exceto a fração AFEIs) apresentaram inibição da oxidação lipídica estatisticamente signifi cati-va (p<0,05) em relação ao controle positivo BHT. Houve pouca variação nos valores obtidos para cada concentra-ção das amostras testadas; a fraconcentra-ção AFESs mostrou a maior atividade redutora do radical a 0,1μg/mL (9,52%) e a fra-ção AFESp a maior atividade, na concentrafra-ção de 8μg/mL (93,36%).
Na avaliação da capacidade antioxidante dos ácidos fenólicos clorogênico, salicílico, cafeico, protocatequínico Tabela 1– Principais ácidos fenólicos e respectivos conteúdos (mg/100g de amostra) encontrados nas frações fenólicas extraídas da romã, identifi cados por cromatografi a gasosa.
Ácido fenólico [mg/100g de amostra]
AFLp AFESp AFLs AFESs AFEIs
Benzóico 3,14 ± 0,05 1,33 ± 0,05 1,74 ± 0,15 Caféico 3,47 ± 0,6 0,73 ± 0,02 0,8 ± 0,08 Clorogênico 2,98 ± 0,02 2,06 ± 0,3 0,6 ± 0,01 o- cumárico 6,61 ± 1,89 1,96 ± 0,13 p- cumárico 28,76 ± 13,41 26,50 ± 0,5 11,85 ± 1,33 Elágico 3,3 ± 0,59 1,93 ± 0,17 0,83 ± 0,05 Gálico 0,63 ± 0,14 35,97 ± 0,33 3,52 ± 0,87 14,73 ± 0,56 Gentísico 5,05 ± 2,92 Propilgalato* 4,65 ± 2,07 44,24 ± 13,63 4,11 ± 0,77 4,5 ± 0,41 1,72 ± 0,61 Protocateq.** 34,07 ± 5 47,83 ± 0,43 52,43 ± 7,46 0,84 ± 0,06 Quínico 24,34 ± 7,02 5,62 ± 2,48 Salicílico 193,33 ± 57,41 57,12 ± 11,47 175,33 ± 6,94 51,72 ± 8,71 149 ± 28,18 Sináptico 6,76 ± 1,39 2,38 ± 0,15
Média ± Desvio- padrão; n= 3;
*propil éster do ácido gálico; **protocatequínico.
e gálico, verifi cou-se que na concentração de 0,11mg/mL, o ácido gálico alcançou 75% de capacidade de redução do radical DPPH●. 32 Esta informação pode apresentar relação
com o resultado obtido neste trabalho, no qual observou-se que a fração AFESp possui uma atividade antioxidante
mais efi ciente e cujo perfi l de ácidos fenólicos apresentou a maior quantidade do ácido gálico em relação às demais frações, e também quantidades consideráveis dos ácidos protocatequínico e propilgalato. A efi ciência dos compos-tos fenólicos na atividade antioxidante é diversa e um dos
FIGURA 2 – Porcentagens de inibição da oxidação, obtidas no teste de co-oxidação de substratos B- caroteno e ácido linoléico, pelas frações de ácidos fenólicos da romã, pelo antioxidante sintético BHT e pela associação das amostras e do BHT.
FIGURA 3 – Porcentagens de inibição da oxidação, obtidas no teste de redução do radical DPPH, pelas frações de ácidos fenólicos da romã e pelo antioxidante sintético BHT.
fatores relevantes é a estrutura química de cada composto, contando o número e o posicionamento de grupamentos hidroxila ligados ao anel aromático. Logo, podemos consi-derar que, possivelmente para a fração - formada por uma mistura de ácidos fenólicos - o resultado foi potencializado na redução do radical DPPH● em relação aos resultados
ob-tidos pelos ácidos fenólicos quando avaliados isoladamen-te. Para os compostos dihidroxilados, a presença do grupo OH● na posição orto do anel favorece sua atividade
antio-xidante, enquanto que sua presença na posição meta parece não favorecer a atividade redutora de radicais. O ácido gáli-co, trihidroxilado, apresenta as hidroxilas presentes nas po-sições orto e para, que poderiam causar uma estabilização do radical, através da doação do átomo de hidrogênio e pela estabilização da estrutura que é formada pela ressonância de seus elétrons. 9
Pode-se observar, no teste de co-oxidação de subs-tratos, que a fração AFLp apresentou maior atividade antio-xidante na menor concentração, concordando com o índice do maior conteúdo de compostos fenólicos que esta fração mostrou em relação às demais. Entretanto, a maior quanti-dade de compostos não infl uenciou a ativiquanti-dade antioxidante no método de redução do radical DPPH●.
Brand-Williams et al.9 demonstraram
cineticamen-te que os ácidos fenólicos trihidroxilados têm poder de redução do radical DPPH● superior aos dihidroxilados, e
que aqueles cujas hidroxilas situam-se nas posições orto e
para apresentam maior capacidade de doação do átomo de
hidrogênio ou elétron ao radical, estabilizando-o ou ainda regenerando outra estrutura fenólica.
Nas determinações dos ácidos fenólicos das frações da romã, como apresentado na Tabela 1, pode-se observar a presença dos três ácidos fenólicos de grande capacidade antioxidante: o ácido gálico, presente em maiores quantida-des nas frações AFES da polpa (35,97mg/100g) e sementes (14,73mg/100mg), o ácido protocatequínico, encontrado na fração AFL (52,43mg/100g – sementes- e 34,07mg/100g – polpa) e AFES (47,83mg/100g – polpa e 0,84mg/100g – sementes) e o ácido cafeico, em menores quantidades, nas frações AFES da polpa (2,98mg/100g) e AFL das sementes
(2,06mg/100g). A presença destes três ácidos fenólicos tem infl uência na elevada atividade redutora do radical DPPH•,
sendo observado que a fração AFES da polpa apresentou 93,36% de atividade redutora. Também a fração AFES apresentou boa atividade antioxidante no teste de co-oxida-ção dos substratos β- caroteno e ácido linoleico (87,51%). Uma diversidade de frutos apresenta atividade an-tioxidante. Dentre alguns trabalhos envolvendo a mensura-ção através de testes in vitro como os realizados em nosso trabalho, Kuskoski et al.21 mediram a atividade antioxidante
através dos métodos DPPH, ABTS e DMPD. A acerola e a manga apresentaram os maiores valores para as três avalia-ções. O morango mostrou alta atividade nos dois primeiros testes, e o cupuaçu, o maracujá, o abacaxi, a graviola e o açaí superiores no terceiro método.
A fração de ácidos fenólicos esterifi cados a compos-tos solúveis (AFS) obtidos do pedúnculo e do bagaço do caju10 apresentam alta atividade antioxidante. No teste de
co-oxidação do β-caroteno e ácido linoleico na concentra-ção de 250μg/mL, os resultados alcançados foram de 90% para a fração extraída do bagaço e 89% para aquela do pe-dúnculo. Já para o teste do radical DPPH, na concentração de 50μg/mL, os resultados foram de 93% para o bagaço e 82% do pedúnculo. As frações fenólicas livres (AFL) e de fenólicos ligados a compostos solúveis (AFS) extraídas do fruto do pequi23 apresentaram uma atividade antioxidante
na concentração de 50ug/mL, de 72,9 e 93,5%, respectiva-mente, quando avaliadas pelo método de co-oxidação men-cionado no trabalho anterior. O teor de compostos redutores totais no pequi foi de 209mg/100g de fruto. Já o trabalho realizado por Soares et al.33 observou uma inibição do
radi-cal DPPH de 39,15% (em relação ao antioxidante sintético Trolox) quando realizou a análise da atividade antioxidan-te dos fenólicos extraídos do bagaço da maçã, utilizando a acetona para a obtenção do extrato estudado.
Devido à diversidade de estruturas dos ácidos fenó-licos, cada composto pode contribuir de maneira peculiar na atividade antioxidante, que, por sua vez, é uma reação complexa, envolvendo etapas de iniciação, propagação e estabilização dos radicais formados. Devido às complexi-Tabela 2 – Quantidade de células totais e porcentagens de células viáveis e do crescimento celular,
para as células submetidas a tratamento de 24 horas com o ácido gálico e com a fração de ácidos fenólicos livres da polpa (AFLp) nas concentrações de 150, 75 e 15ug.
Cels. totais % cels viáveis % crescto. celular* Controle 8,85 x 104 ± 5,79 x 104 75,99 ± 12,72
Ácido gálico 150ug 2,20 x 104 ±1,52 x 104 a,b 31,37 ± 21,02 a 6,65 ± 3,56 b
Ácido gálico 75ug 2,6 x 104 ± 2,26 x 104 a,b 70,05 ± 37,88 35,29 ± 32,98
Ácido gálico 15ug 6,75 x 103 ± 2,22 x 103 a 50,77 ± 19,06 a 5,56 ± 2,9
Fração AFLp 150ug 2,76 x 104 ±1,39 x 04 a 50,91 ± 23,73 a 21,4 ±12,93 b
Fração AFLp 75ug 7,22 x 104 ± 4,29 x 104 b 60,18 ± 24,47 53,99 ± 17,43
Fração AFLp 15ug 1,51 x 105 ± 1,26 x 105 b 78,56 ± 26,26 196,58 ±174,83
*porcentagem de crescimento celular em relação ao grupo controle; Resultados expressos em média ± desvio-padrão;
Signifi cância: p<0,05: a = diferença do grupo tratamento com o grupo controle e b = diferença entre trata-mentos com a mesma concentração.
dades envolvidas na atividade antioxidante, é importante que sua avaliação seja realizada por diferentes métodos, como a realizada neste trabalho.
De acordo com os dados expostos na Tabela 2, hou-ve um decréscimo do número de células MDCK que rece-beram os tratamentos, com exceção do grupo tratado com a fração AFLp de 15ug. No grupo tratado com a fração, notou-se uma diminuição da viabilidade celular com o au-mento da dose.
Em estudo realizado com o extrato hidroalcoólico da polpa da romã em células da linhagem Caco-2, verifi cou-se uma inibição do crescimento de 6 a 4% para concentrações de 100 a 400ppm, respectivamente. 18
Uma das propriedades desejáveis no estudo de no-vos compostos para fi ns de quimioprevenção é a ausência ou minimização de efeitos tóxicos em células saudáveis. 13
Para os dados acima apresentados e realizados em células da linhagem MDCK (epitélio renal sadio), observa-se que o grupo tratado com a fração AFLp apresentou crescimento celular acima do grupo controle na menor concentração tes-tada (15μg) e grande viabilidade celular (78,56%). E que, estatisticamente, não houve diferença entre a viabilidade do grupo AFLp15 e do grupo controle.
Em trabalho utilizando linhagens de células tumo-rais de boca, próstata e cólon31, foi possível verifi car que
uma fração de elagiotaninos purifi cados da casca da romã inibiu de 30 a 100% a proliferação celular, em concen-trações de 12,5; 25; 50 e 100μg/mL. Apesar de usar uma fração purifi cada, o autor também utilizou o suco da fruta, pelo qual obteve os resultados mais signifi cativos.
Porém, em células de origem tumoral é desejável que o composto apresente os resultados que levem à morte celular. Alguns mecanismos dos compostos fenólicos que teriam ação anticancer incluem a atividade antioxidante, anti-infl amatórias e antiproliferativas, assim como efeitos de sinalização e no atraso do ciclo celular e a apoptose. 31
O ácido gálico é um ácido fenólico conhecido pela sua capacidade na indução da morte celular. Em cultura de células de linhagens tumorais que foram tratadas com dis-tintas frações de compostos fenólicos extraídas da semente da Oenothera biennis,28 foi possível verifi car que aquela
que continha 55% de ácido gálico foi a mais efi ciente em diminuir a proliferação e a viabilidade celular. Porém, o grupo tratado com o ácido gálico puro causou uma redução acentuada destes itens, em concentrações de 0,1 a 1mM, demonstrando com os resultados a participação do ácido gálico nestes efeitos.
CONCLUSÕES
A presença de compostos mono, di e trihidroxila-dos nas diferentes frações de ácitrihidroxila-dos fenólicos (presentes nas formas livre ou complexadas a compostos solúveis ou insolúveis) da polpa e sementes da romã resultou em uma expressiva atividade antioxidante, mesmo em baixas concentrações. Ainda, em células provenientes de epitélio sadio, a fração de ácidos fenólicos livres extraídos da
pol-pa apresentou aumento signifi cativo, tanto na proliferação quanto na viabilidade das células MDCK.
Diante dos resultados apresentados, a romã mos-trou-se uma fonte de compostos bioativos cujo potencial antioxidante pode vir a ser melhor explorado em estudos futuros visando a utilização da fruta como alimento auxiliar na manutenção da saúde do organismo.
JARDINI, F. A.; LIMA, A.; MENDONÇA, R. M. Z.; PINTO, R. J.; MANCINI, D. A. P.; MANCINI-FILHO, J. Phenolic compounds from pulp and seeds of pomegranate
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ABSTRACT: The free radicals, amongst which the EROs and the ERNs, are reactive species that are involved in the beginning of some reactions, as the lipoperoxidation. Once this process is iniciated in the biologic system, it could start the development of some diseases. To hold back the advance of the oxidative chain that was initiated by the free radicals and to minimize their deleterious effects to the organism, some antioxidants´substances as the phenolic compounds (amongst which the phenolic acids), can be found in some vegetal sources. The fruits are good source of antioxidants compounds and the pomegranate (Punica granatum, L.) has an expressive amount of phenolic compounds. The aims of this work were to identify the main phenolic acids of the pulp and seeds of the pomegranate by the gas chromatography and the evaluation of the antioxidant capacity by two methods: the co-oxidation of the substrates (β- carotene and linoleic acid) and the radical 1,1- diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH●) reduction methods. The effect
of the free phenolic fraction of the pulp on the proliferation and viability of the MDCK cell culture was evaluated too. It was observed that the free phenolic fraction of the pulp had the major content of reductor compounds (1.399,02 μg/ mL) whereas the phenolics bounded to soluble compounds fraction had the major content (770,58μg/mL) when the seeds were analyzed. All the phenolic fractions have superiors signifi ctives results (p<0,05) when compared to the synthetic antioxidant butyl- hidroxytoluene (BHT), used as standard for the experiment. The main phenolic acids found were the salicylic, the protocatechuic and the gallic ones. The cells treated with the lowest concentrations of the free phenolic fraction of the pulp showed an increase in their proliferation, and the viability remained high. KEYWORDS: Punica granatum, L.; phenolic acids; cell culture.
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Recebido em 27/10/2009 Aprovado em 03/09/2010
