DESENVOLVIMENTO DE MEMBRANAS DE CELULOSE BACTERIANA COM INCORPORAÇÃO DE EXTRATO VEGETAL
E.Z. Neves*; M.C.F. Garcia; G.P. Apati; A.P.T. Pezzin; A.L.S. Schneider Universidade da Região de Joinville - UNIVILLE
Rua Paulo Malschitzki,10. Universidade da Região de Joinville - UNIVILLE. Joinville/SC. dudazeni@hotmail.com*
RESUMO
As membranas de celulose bacteriana (CB) vêm ganhando espaço por apresentarem potencial para incorporação de substâncias naturais como a calêndula por possuir ação antimicrobiana e cicatrizante. Nesse sentido, o objetivo deste estudo envolveu a síntese de CB utilizando a bactéria K. hansenii em meios alternativos (milhocina e chá preto) e o estudo da incorporação de dois extratos de calêndula na CB de modo a desenvolver um novo biomaterial para tratar lesões na pele. As membranas de CB secas e úmidas foram incorporadas com extrato hidroglicólico (EH) e extrato glicólico concentrado (EG), sendo caracterizadas por análise termogravimétrica (TGA), espectroscopia na região do infravermelho (FTIR) e avaliadas quanto à atividade antimicrobiana utilizando a bactéria S. Aureus. Conclui-se então, que as CBs secas se destacaram, apresentando uma maior estabilidade térmica (CB/EGs) e melhor ação dos princípios ativos da calêndula (CB/EHs), indicando maior potencial para o uso como biomaterial que as CBs úmidas.
Palavras-chave: biocelulose, Calendula officinalis L., fitoterápico, Komagataeibacter
hansenii, resíduos agroindústriais.
INTRODUÇÃO
O impacto da crise ambiental no mundo inteiro tem feito repensar os métodos de utilização das fontes de recursos não renováveis. Neste contexto, estão sendo
desenvolvidos produtos com extratos vegetais por serem mais sustentáveis ao meio ambiente em comparação aos produtos sintéticos (1).
Uma das estratégias para minimizar a poluição provocada por materiais sintéticos é a substituição por materiais de base biológica, como os polímeros e os compósitos que são derivados de fontes renováveis, propiciando o desenvolvimento de materiais que podem ser facilmente degradados ou assimilados pela natureza (2).
Dentre esses materiais com grande potencial está a celulose (C6H10O5), que é um
biopolímero abundante na natureza e um dos principais constituintes das paredes celulares de plantas, com uma produção brasileira estimada em 19,527 milhões de toneladas no ano de 2017 (3), com um crescimento de 4% comparado ao ano
anterior, apresentando grande importância econômica e grande interesse tecnológico.
Além da celulose produzida por vegetais, existem outros micro-organismos que podem sintetiza-las como os fungos, bactérias e algas, dentre esses diferentes tipos de celulose destaca-se a celulose bacteriana (CB), a qual é produzida por diversos gêneros de bactérias, sendo o gênero Komagataeibacter uma das mais eficientes e a mais utilizada na sua produção (4,5). A CB é um biopolímero que possui a mesma
estrutura química da celulose vegetal, sendo bastante promissora como alternativa à produção tradicional de celulose, se diferenciando de seu semelhante vegetal, principalmente, por apresentar fibras de caráter nanométrico contra o micrométrico do vegetal (6). Apresentando maior pureza, maior cristalinidade, grande poder de
absorção de água, além de um baixo grau de polimerização e biocompatibilidade. Por essas características, o seu uso pode ser aplicado em vários segmentos, como na produção de papel, síntese de membranas compósitas, indústria alimentícia e, principalmente, na área farmacêutica e de biomedicina.
Uma das principais aplicações das membranas de celulose bacteriana é sobre o tecido cutâneo lesionado, por serem flexíveis, não tóxicas e possibilitarem a aplicação tópica de fármacos por meio da membrana (7). A incorporação dos
princípios ativos presentes nos extratos vegetais nestas membranas para fins terapêuticos permite a modulação de propriedades específicas como ação antimicrobiana e ainda estimuladora da regeneração tecidual.
Como exemplo de produtos de sucesso na área cosméticas no mercado externo, temos a NanoMasque®, que é uma máscara facial produzida a partir do hidrogel de CB pura, ou impregnadas com substâncias ativas como extratos de
plantas, extratos de algas, óleos essenciais, pantenol, etc (10). Além disso, temos
outros produtos no mercado como o curativo de feridas e queimaduras de difícil cicatrização Nexfill® (financiado com recursos brasileiros e internacionais), membranas hidratadas de biocelulose para o tratamento de feridas crônicas XCell® (Xylos Corporation U.S.A), um biomaterial tubular destinado a aplicações em microcirurgias de artérias e veias BASYC® (Bacterial Synthetised Cellulose (Alemanha)), etc (11-12-13-14). O Brasil ocupa atualmente o oitavo maior mercado
consumidor de produtos para pele e a estimativa para 2021 é passar para a quinta posição (15-16).
Visando então uma alternativa sustentável, de baixo custo e baixo impacto para a produção da celulose bacteriana as fontes de carbono escolhidas foram a frutose e a sacarose, as quais podem ser reaproveitadas de resíduos da agroindústria. Como fonte de nitrogênio avaliada foi a utilização da milhocina, a qual é resíduo da maceração de milho, podendo ser vantajosa economicamente. Outra alternativa para substituição da fonte de nitrogênio foi a cafeína, presente no chá preto (8-9).
Foi realizada uma busca para encontrar quais extratos vegetais têm características com ação antimicrobiana, anti-inflamatória ou cicatrizante para tratamentos na pele. Optou-se então, pelo uso da calêndula (Calendula officinalis L.) da família Asteraceae por possuir princípios ativos que tem efeitos anti-inflamatório, antisséptico, adstringente, calmante, regenerador de tecidos danificados, analgésico e cicatrizante (17). Suas flores apresentam como componentes químicos,
principalmente, saponinas, triterpenos e ésteres de ácidos graxos, carotenóides, flavonóides, cumarinas, óleos essenciais, ácido oleanólico, hidrocarbonetos e ácidos graxos (18-19-20).
A identificação de novas formas de aproveitamento da calêndula é uma alternativa interessante para agregar valor a um importante recurso natural, aumentando o uso desse extrato vegetal em processos biotecnológicos de grande importância. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho envolveu a síntese de CB utilizando a bactéria Komagataeibacter hansenii ATCC 23765 a partir de meios alternativos, tais como a substituição das fontes de nitrogênio por milhocina e chá preto, e o estudo da incorporação de dois extratos de calêndula nas membranas de modo a desenvolver um possível novo biomaterial com propriedades inovadoras e ecologicamente correto, contribuindo com a sustentabilidade da Terra, para utilização na área biomédica, em especial na área estética.
MATERIAIS E MÉTODOS
Micro-organismo e condição de cultivo
Para a produção das membranas de CB, o micro-organismo utilizado foi a bactéria Komagataeibacter hansenii ATCC 23769, armazenada em Eppendorf a 80 °C, contendo glicerol como agente crioprotetor. O meio de cultivo para ativação das células (pré-inóculo) foi cultivado em frascos de Erlenmeyer de 250 mL com 40 mL de meio contendo 0,8 g de manitol (20 g/L), 0,2 g de extrato de levedura (5 g/L) e 0,2 g de peptona (5 g/L) e, posteriormente, esterilizados em autoclave a 121 °C por 20 min. Foi adicionado o conteúdo de 1 Eppendorf contendo o micro-organismos K. hansenii. O tempo de cultivo para ativação foi de 48 h em condição estática, sob temperatura ambiente (30 ºC). O inóculo foi agitado por 2 min a 180 rpm e em câmara de Fluxo Laminar, as células foram transferidas a uma taxa de 20% de inóculo, para cada frasco contendo o meio de cultivo em diferentes composições, conforme a Tabela 1. O cultivo foi mantido estático em estufa a 30 ºC por 24 dias para a formação das membranas. O experimento foi conduzido em triplicata para todos os cultivos.
Tabela 1 - Fontes de nitrogênio e carbono avaliadas para os diferentes meios de cultivo alternativos
Fonte de nitrogênio Fonte de carbono Meio
Extrato de levedura (5 g/L) + Peptona (5 g/L) Manitol (100 g/L) CONTROLE
Milhocina (5 g/L) Frutose P.A. (20 g/L) MF1 Frutose P.A. (100 g/L) MF2 Sacarose P.A. (20 g/L) MS1 Sacarose P.A. (100 g/L) MS2 Milhocina (15 g/L) Frutose P.A. (20 g/L) MF3 Frutose P.A. (100 g/L) MF4 Sacarose P.A. (20 g/L) MS3 Sacarose P.A. (100 g/L) MS4
Chá preto (15 g/L) Frutose P.A. (100 g/L) CF Sacarose P.A. (100 g/L) CS
Purificação e secagem das membranas de CB
As membranas de CB foram lavadas com água destilada e transferidas para um frasco de Becker contendo 10 mL de solução de NaOH 0,1 M, mantido em banho-maria, a temperatura de 80 °C por 1 h para a remoção das células bacterianas. Após este tratamento foram lavadas com água destilada até atingir pH 7,0, armazenada em água destilada e autoclavada para evitar contaminação. Algumas membranas foram desidratadas antes da incorporação do extrato vegetal, sendo previamente secas em estufa a 60 ºC por 24 h.
Incorporação dos extratos vegetais
A incorporação dos extratos vegetais foi realizada pela técnica ex situ, onde as membranas (úmidas e desidratadas) foram imersas em 5 mL de extrato glicólico de calêndula a 10 % solução hidroglicólica (EH) ou 5 mL de extrato glicólico de calêndula concentrado (EG) em placas de Petri e deixadas por 24 h, sendo viradas a cada 2 h por 12 h. As membranas foram desidratadas em estufa a 30 °C por 24 h, tomando cuidado para que não ficassem aderidas nas placas de Petri.
Caracterização das membranas
As membranas de CB obtidas a partir dos diferentes cultivos de
Komagataeibacter hansenii e incorporadas com os extratos de calêndula foram
caracterizadas pelas técnicas de TGA, FTIR e realizada a atividade antimicrobiana. As análises de TGA foram realizadas em equipamento da TA Instruments modelo TGA-Q50, aquecidas de 25 a 500 °C a uma taxa de 10 °C/min, sob atmosfera inerte. Os parâmetros experimentais foram ajustados no software TA - Universal Analysis e representados graficamente para interpretação. A caracterização dos grupamentos funcionais das membranas foi realizada em equipamento da Perkin Elmer Frontier, com 16 varreduras por amostra, de 500 a 4000 cm-1, no modo de refletância total
atenuada (ATR – attenuated total reflectance). Os testes de atividade antimicrobiana foram realizados segundo a norma ASTM E2180 – 07 (2012) (21) somente para as
membranas incorporadas com o extrato hidroglicólico (EH). Para isso foi preparado meios de cultivo com caldo soja tripticaseína (TSB) + ágar, recomendado pela norma. As membranas (incorporadas e sem incorporação) foram cortadas em
quadrados de 3 x 3 cm e depositadas no fundo de placas de Petri estéreis, sendo este ensaio realizado em triplicada para cada amostra. A atividade antimicrobiana foi avaliada sobre os micro-organismos Staphylococcus aureus (Gram-positivo). As placas Petri foram mantidas em estufa a 30 ºC, tendo o seu crescimento analisado após 48 h através do % de redução na contagem celular (UFC) das membranas incorporadas com o extrato hidroglicólico (EH) comparadas com o controle.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biossíntese da membrana de CB
Os meios de cultivo inoculados com o micro-organismo Komagataeibacter
hansenii ATCC 23769 utilizando fontes alternativas de nitrogênio e carbono para a
formação das membranas de CB, foram incubadas em meio estático a 30 °C por um período de 24 dias. Para os meios de cultivos alternativos utilizando chá preto e sacarose, chá preto e frutose, milhocina e sacarose não obteve-se êxito na formação das membranas. Para as fontes alternativas testadas utilizando o chá preto e sacarose/frutose não houve formação de membrana na interface líquido-ar dos meios de cultivo, isto ocorreu, porque a cafeína presente no chá preto possuí na sua estrutura anéis heterocíclicos que tornam estável este composto, dificultando a ruptura do anel aromático para obter o nitrogênio. Já para as membranas de CB produzidas a partir de meio de cultivo de milhocina e sacarose (MS1, MS2, MS3 e MS4), houve a formação de uma fina película de CB, apresentando frações não homogêneas em diversos pontos das membranas.
Para as membranas de CB sintetizadas com milhocina e frutose em diferentes concentrações e para o meio controle formaram-se na superfície do cultivo líquido. Após a purificação, as membranas apresentaram um aspecto gelatinoso, translúcido e homogêneo em relação aos meios de milhocina e sacarose. A concentração de milhocina e frutose influenciou na espessura das películas, como podem ser visto na Figura 1, demonstrando que o meio de MF4 foi a que obteve a maior espessura dos meios de milhocina e frutose e ser qual chegou mais perto da espessura do meio de cultivo controle, por este motivo o meio MF4 foi escolhido para aplicar os demais testes deste projeto.
Figura 1 – Membranas de CB produzidas com os meios de cultivo (a) CONTROLE, (b) MF1: 5g/L de milhocina e 20 g/L de frutose, (c) MF2: 5g/L de milhocina e 100 g/L de frutose, (d) MF3: 15g/L de milhocina e 20 g/L de frutose e (e)
MF4: 15g/L de milhocina e 100 g/L de frutose.
Incorporação dos extratos de calêndulas na membrana
Após 24 h de imersão, a tonalidade das membranas tomou-se um tom âmbar, em decorrência da coloração do extrato adsorvido na CB, sendo mais intenso nas membranas incorporadas com o EG.
Análise Termogravimétrica (TGA)
Com o intuito de conhecer o comportamento térmico da membrana de CB pura e das membranas de CB incorporadas com os extratos glicólicos de calêndula nas CB secas e úmidas (CB/EHu, CB/EHs, CB/EGu e CB/EGs), elas foram comparadas utilizando as curvas de TGA da CB pura e das membranas de CB incorporadas. As propriedades térmicas dos materiais, determinadas a partir destas curvas, encontram-se reunidas na Tabela 2.
Figura 2 - Curvas obtidas por TGA para as amostras de CB e CB incorporadas com extrato de calêndula: a) curvas TG e b) curvas da primeira derivada.
Tabela 2 – Dados obtidos das análises de TGA das membranas de CB pura e incorporadas com extrato de calêndula.
Amostras Perda de massa 1 (%) Tonset2 (°C) Perda de massa 2 (%) Tmax2 (°C) Tonset3 (°C) Perda de massa 3 (%) Tmax3 (°C) Tonset4 (°C) Perda de massa 4 (%) Tmax 4 (°C) Resíduo (%) CB pura 5,22 - - - 310 78,18 344 Nd 9,66 Nd 6,94 CB/EHu 8,47 117 15,86 146 271 55,84 304 Nd 18,13 Nd 1,58 CB/EHs 3,8 107 12,73 143 265 56,92 302 447 24,85 510 1,58 CB/EGu 5,01 118 18,39 147 279 57,37 311 Nd 5,34* Nd 15,15* CB/EGs 11,58 139 63,45 165 281 15,79 312 Nd 3,32* Nd 5,83* nd = não determinado.
*As curvas das membranas CB/EGu e CB/EGs foram realizadas somente até 500 °C, por isso os valores de % de perda de massa 4 deveriam ser superiores e os valores de % de resíduo deveriam ser inferiores.
As membranas preparadas pelo método ex situ incorporaram os extratos hidroglicólico (EH) e glicólico concentrado (EG) em diferentes percentuais. Para as membranas com o EH observa-se pelos percentuais de perda de massa 2 que as membranas úmidas incorporaram um teor 3,13% superior de extrato que as secas. Isso é devido a estrutura porosa das membranas de CB, porém, após a secagem em estufa, os poros se colapsam, acarretando provavelmente, numa absorção de extrato mais localizada na superfície da membrana. Já nas membranas úmidas, a água age como um veículo que facilita a entrada do extrato para o interior da membrana. O % de perda de massa 2, bem como a tonalidade mais escura das membranas, indicam que as membranas com o EG incorporaram maior teor de extrato quando comparada ao EH, devido ao aspecto oleoso do EG. As análises de TGA também permitem concluir que a adição dos extratos diminuem a estabilidade térmica da CB. A membrana de CB/EGs se destacou, pois houve a incorporação da calêndula com menor diminuição da estabilidade térmica da CB que as demais.
Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
Na Figura 3 é ilustrada a comparação entre a FTIR de amostras de CB, CB incorporada e dos extratos, afim de identificar compostos químicos presentes na estrutura.
Figura 3 – Espectros de FTIR obtidos para as membranas e extratos a) CB, CB/EHu, CB/EHs, EH; b) CB, CB/EGu, CB/EGs, EG.
O espectro de FTIR da membrana de CB pura apresenta o perfil característico da CB reportada na literatura, como a banda na região de 3345 cm-1 é característica
do estiramento dos grupos OH presentes na CB; a banda de 2902 cm-1 é do
estiramento CH e estiramento assimétrico em; a banda em 1424 cm-1 é da
deformação CH2; a banda em 1314 cm-1 deformação OH; uma banda localizada ao
redor de 400 a 700 cm-1, é característica da torção dos grupos OH (22). As
membranas de CB/EHu e CB/EHs, apresenta uma banda parecida que está presente no espectro do EH em 1638 cm-1, indicando que houve incorporação do
EH. Para as membranas de CB/EGu e CB/EGs, apresentaram picos parecidos, sendo que o pico em 2942 cm-1, estava presente também no extrato EG,
confirmando incorporação da calêndula.
Teste antimicrobiano
Para avaliar a eficácia antimicrobiana das membranas incorporadas, foi utilizado S. aureus como micro-organismos (MO) alvo. Os resultados do teste de atividade antimicrobiana mostraram uma redução de 64,22% na colonização de
Staphylococcus aureus para o CB/EHs devida às propriedades anti-inflamatórias e
antibacterianas do extrato de calêndula, pois o MO age na superfície da membrana, onde está presente os princípios ativos da calêndula da membrana seca.
Entre as membranas de milhocina e frutose com diferentes concentrações, observou-se que o meio de cultivo com a maior concentração de substrato (15 g/L de milhocina e 100 g/L de frutose) e maior tempo de cultivo (24 dias comparado com o tempo usual da literatura de 12 dias) apresentou um tamanho viável para incorporação na película de CB. Os resultados de TGA indicam que a CB/EGs se destacou entre as demais membranas incorporadas, por apresentar menor diminuição da estabilidade térmica. Conclui-se que todas as membranas incorporaram os extratos em diferentes percentuais, porém as CB úmidas incorporaram mais que as secas devido aos poros não estarem colapsados, comprovado no FTIR. Por meio da análise microbiológica, conclui-se que a calêndula demonstra ação antimicrobiana sobre as células de S. aureus na membrana seca. Assim, a incorporação de extrato de calêndula em membranas de CB, mostraram-se promissoras para aplicações na área médica, considerando que a CB é biodegradável, não tóxica, biocompatível e sua síntese pode ser realizada a partir de resíduos agroindustriais como alternativa de cultivo.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Governo do Estado de SC pela bolsa de Iniciação Científica Art. 170.
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DEVELOPMENT OF BACTERIAL CELLULOSE MEMBRANES WITH INCORPORATION OF VEGETABLE EXTRACT
E. Z. Neves*; M. C. F. Garcia; G. P. Apati; A. P. T. Pezzin; A. L. S. Schneider Universidade da Região de Joinville - UNIVILLE
Rua Paulo Malschitzki,10. Universidade da Região de Joinville - UNIVILLE. Joinville/SC. dudazeni@hotmail.com*
ABSTRACT
The membranes of bacterial cellulose (BC) have been gaining space because they present the potential for the incorporation of natural substances such as marigold because it has antimicrobial and cicatrizant action. In this context, the objective of this study was to synthesize BC using the K. hansenii bacteria in alternative media (steep liquor and black tea) and to study of the incorporation of two marigold extracts into BC in order to develop a new biomaterial to treat lesions in the skin. The membranes of dry and moist BC were incorporated with hydroglicolic extract (HE) and concentrated glycolic extract (GE), and were characterized by thermogravimetric analysis (TGA), infrared spectroscopy (FTIR) and evaluated for antimicrobial activity using S Aureus. It was concluded that the dry BCs showed a higher thermal stability (BC / GEs) and a better action of the active principles of the calendula (BC / HEs), indicating a greater potential for biomaterial use than the BCs wet.
Keywords: biocellulose, Calendula officinalis L., phytotherapist, Komagataeibacter
