Nesse artigo de revisão, publicado no Jornal “O Embrião”, Ano: X / Número 38 / Novembro-Dezembro 2008, p.08 a 11, (http://www.sbte.org.br/oembriao), está uma revisão científica atualizada sobre a técnica de aspiração folicular em ovinos e os resultados obtidos pela In Vitro Brasil Ltda. na FIV de ovinos.
Biotecnologia da Reprodução na Espécie Ovina
Produção in vitro de Embriões Ovinos: Aspectos da Técnica de Aspiração Folicular e do Tratamento Hormonal de Doadoras
Resumo
Esse artigo tem o objetivo de revisar aspectos relativos aos protocolos superovulatórios, aos procedimentos de aspiração folicular e à técnica de fertilização in vitro na espécie ovina. Nesse contexto, são apresentados dados obtidos a partir de uma parceria empresa-universidade, a qual possibilitou oferecer o serviço de FIV em ovinos no Brasil com resultados consistentes.
Devido à expansão da ovinocultura brasileira e à difusão da raça ovina Santa Inês no país, há necessidade de intensificar a investigação científica envolvendo raças e condições presentes na ovinocultura nacional.
Andréa Cristina Basso1*; João Flávio Panattoni Martins2*; Christina Ramires Ferreira1; Alexandra Ereno1; Juliana Tannura1; Alexandre Tabet3; Cristiane Leite Figueiredo2; Priscila Carvalho de Oliveira2; José Henrique Fortes Pontes1
1 Empresa In Vitro Brasil Ltda, Mogi Mirim-SP.
2 Centro Universitário da Fundação de Ensino Octávio Bastos - UNIFEOB, São João da Boa Vista-SP.
3 Médico Veterinário autônomo.
* Os dois autores contribuíram igualmente para o artigo.
contato: andreabasso@invitrobrasil.com.br
Introdução
Atualmente observa-se intensa expansão da ovinocultura no Brasil e da demanda pela aplicação de biotecnologias da reprodução nessa espécie. Na região Sudeste, a atividade firma-se como alternativa promissora para o resgate da vocação agropecuária em várias regiões do estado de São Paulo.
No Sul do país, a ovinocultura se intensifica. Os estados da Bahia, Sergipe e Piauí possuem programas de investimento na ovinocultura como estratégia de desenvolvimento regional auto-sustentável e geração de divisas, tornando os estados nordestinos responsáveis por 54% deste promissor segmento do agronegócio (Bezerra, 2004).
Assim como na espécie bovina, os procedimentos de aspiração folicular, maturação in vitro (MIV) e fertilização in vitro (FIV) de oócitos permitem a exploração do potencial reprodutivo das fêmeas de maneira revolucionária. A produção in vitro (PIV) de embriões oferece ainda a possibilidade de aceleração do ganho genético por meio da redução do intervalo entre gerações e a maximização do número de nascimentos a partir de fêmeas de alto valor genético (Lohuis et al., 1995), principalmente, quando doadoras juvenis são utilizadas (Earl et al., 1995; Baldassare et al., 1996; Tervit et al., 1996). O rendimento dessas técnicas pode ainda ser potencializado com o uso de protocolos de superovulação (Driancourt, 2001; Berlinguer et al., 2004; Cognié et al., 2004) e criopreservação (Martinez et al., 1998; Cognié et al., 2003).
Em nosso conhecimento, o primeiro nascimento de um cordeiro produzido por FIV comercial no Brasil ocorreu em agosto de 2006 (Figura 1A) na Faculdade de Medicina Veterinária – UNIFEOB em São João da Boa Vista - SP, decorrente do desenvolvimento de um projeto científico liderado Prof. Dr.
João Flávio Panattoni Martins. O projeto foi uma parceria com a empresa In Vitro Brasil Ltda, para um curso de aspiração folicular em pequenos ruminantes destinado ao corpo técnico da Instituição e a um pequeno grupo de Médicos Veterinários autônomos. Esse curso contou com a colaboração do Dr. Hernan Baldassarre, reconhecida referência no assunto.
A partir dessa experiência, os profissionais capacitados iniciaram suas atividades de prestação de serviços no ano de 2006. Até o mês de setembro de 2008, cerca de 3.200 embriões ovinos produzidos por FIV pela empresa foram transferidos a fresco para receptoras.
Técnicas Utilizadas para Aspiração Folicular em Ovinos
A aspiração folicular em ovinos pode ser realizada por meio de laparotomia ou por laparoscopia.
A laparotomia permite a exposição dos ovários para aspiração por acesso cirúrgico da cavidade abdominal, facilitando o procedimento, principalmente quando fêmeas livres de tratamentos superovulatórios são utilizadas, já que o pequeno tamanho dos ovários dificulta a aspiração pela técnica laparoscópica. Também em fêmeas pré-púberes utiliza-se a técnica de aspiração folicular por laparotomia, devido ao espaço de acesso restrito para a cavidade abdominal. Durante o procedimento de aspiração, os ovários expostos e eventualmente porções uterinas devem ser constantemente umedecidos com solução fisiológica e lavados ao término da aspiração com a solução soro fisiológico com 1% de DMSO e 0,2% de Heparina, no intuito de se prevenir possíveis aderências.
Em 1974, Snyder e Dukelow descreveram a primeira aspiração folicular em ovelhas utilizando laparoscopia. Entretanto, a utilização desse procedimento para produzir um cordeiro por FIV só ocorreu 16 anos mais tarde (Czlonkowska et al.,1991). Desde então, com o aprimoramento das técnicas de aspiração folicular em ovelhas (Tervit et al., 1992; 1993; Smith et al., 1994;
Baldassare et al., 1996) e a evolução dos protocolos de MIV e FIV de oócitos (Cecconi et al., 1999; Guler et al., 2000; Cognié et al., 2003), vários pesquisadores reportaram nascimentos de cordeiros produzidos in vitro a partir de doadoras vivas (Tervit et al., 1992; 1993; 1995; Smith et al., 1994;
Baldassarre et al., 1994; 1996; Ptak et al., 1999).
A aspiração folicular por laparoscopia permite a realização de repetidas sessões de aspiração folicular com poucos riscos de prejuízo futuro da fertilidade da doadora (Stangl et al., 1999). Consagrada como procedimento pouco traumático, a aspiração folicular por laparoscopia em pequenos ruminantes, firma-se como técnica ideal para exploração eficiente do potencial reprodutivo das doadoras, principalmente quando associada à estimulação ovariana exógena (Baldassarre et al., 1996; Galli et al., 2001; Baldassarre e Karatzas et al., 2004).
Como desvantagens da técnica, estão os altos custos em equipamentos e a necessidade de treinamento, tanto do operador quanto do auxiliar para efetivamente minimizar trauma e tempo cirúrgico (Tabet, 2007).
Protocolos Hormonais para Doadoras
É possível recuperar de quatro a seis oócitos por sessão de aspiração folicular em doadoras ovinas não tratadas (Kuhholzer, 1997). Por essa razão, os protocolos de estimulação ovariana são amplamente estudados e difundidos como importante ferramenta para a melhoria dos índices de produção embrionária na espécie (Baldassarre et al., 1996; Driancourt, 2001; Berlinguer et al., 2004; Cognié et al., 2003).
Os regimes superovulatórios testados em ovelhas incluem tratamentos com doses constantes ou decrescentes de FSH ou eCG (Baldassarre et al, 1996; Ptak et al., 1999; Berlinguer et al., 2004), tratamentos de dose única utilizando-se eCG (Sevillano et al., 1997; Stangl et al., 1999) ou associação de eCG e FSH (Baldassarre et al., 2002; 2004).
Estudos revelam que a resposta ovariana aos preparados comerciais de FSH é prejudicada pela presença de grandes folículos no início do tratamento, havendo relação direta entre o número de pequenos folículos nos ovários (2- 3mm) e o número de embriões viáveis obtidos (Brebion et al., 1992; Gonzales- Bulnes et al., 2003). Por esta razão, a estimulação ovariana com gonadotrofina exógena é precedida pela sincronização do estro, resultando no recrutamento de uma nova onda folicular. Os protocolos de sincronização mais utilizados em ovelhas preconizam esponjas intravaginais com 60mg de acetato de medroxyprogesterona por 10 dias (Bartlewski et al., 1999; Baldassarre e Karatzas, 2004) ou 40mg de acetato de fluorogestona por 14 dias (Dattena et al., 2000; Gonzalez-Bulnes et al., 2003).
Protocolos de menor duração estão sendo propostos para pequenos ruminantes, baseados na hipótese de que os tratamentos longos resultariam em concentrações sub luteais de progesterona. Estes tratamentos favoreceriam a persistência e o crescimento excessivo do folículo dominante (Rubianes et al., 2003).
Alguns protocolos incluem ainda a utilização de agonistas ou antagonistas de GnRH associados ao tratamento com progestágenos, com a finalidade de
suprimir a produção de gonadotrofinas e evitar o crescimento de folículos acima de 1 a 2mm. Resultados utilizando-se como pré-tratamento agonista a buserelina por duas semanas (40μg/dia de Receptal® – Intervet), ou antagonista com antarelix por 10 dias (0,5mg/dia de Teverelix® – Europeptides), comprovaram a supressão dos grandes folículos ovarianos e a duplicação do número de pequenos folículos, aumentando em 50% a resposta dos ovários ao FSH (Brebion et al., 1992; Cognié, 1999).
Apesar da maior praticidade dos protocolos de dose única, a aspiração folicular realizada após tratamento com dose única de 150UI de eCG, proporcionou menor número de oócitos comparado com fêmeas não tratadas, mas houve diferenças na qualidade dos complexos de oócitos e células granulosas obtidos (Stangl et al., 1999). Além disso, foi constatado em programas de inseminação artificial, que o uso repetido de estimulações com eCG favorece o desenvolvimento de anticorpos anti-eCG devido à resposta imunológica do animal aos primeiros tratamentos, resultando na redução da taxa de fertilidade (Roy et al., 1999; Drion et al., 2001).
A associação de FSH e eCG também foi utilizada no tratamento superovulatório de fêmeas ovinas juvenis com cinco a nove semanas de idade, resultando na recuperação de um alto número de oócitos, que submetidos a cultura e fertilização in Vitro. Houve taxa de clivagem de 19%, frente a 65% de blastocistos obtidos a partir de oócitos aspirados de fêmeas adultas (Ledda et al., 1999).
Dentre os protocolos disponíveis de estimulação ovariana em ovelhas, merece destaque a associação de FSH (80IU de Folltropin-V®) e eCG (300 UI), administrados em dose única 36hs antes da aspiração folicular, o qual vem sendo utilizado há quatro anos pelo grupo do pesquisador Baldassarre. Esse grupo que realizou 1580 procedimentos de aspiração folicular por laparoscopia, recuperando em média 13,4 oócitos por doadora (Baldassarre et al., 2004).
Nos dados de veterinários parceiros da empresa In Vitro Brasil Ltda, houve média de 14,3 oócitos/ovelha (6613 oócitos obtidos a partir da aspiração de 587 ovelhas).
Produção in vitro de Embriões Ovinos
Existem vários relatos de evolução dos protocolos de PIV de embriões ovinos, como, por exemplo, a suplementação do meio usualmente utilizado para MIV de oócitos nesta espécie, com 1μg/mL de 17β estradiol (Guler et al., 2000) e glutationa (Dematos et al., 1999), promovendo melhora da maturação citoplasmática e nuclear dos oócitos. Da mesma maneira, a suplementação do meio de cultura após fertilização in vitro, com 5 a 10% de soro fetal bovino, demonstra melhor viabilidade embrionária após a transferência (Cognié, 1999).
Em média, obtém-se 47% de taxa de sobrevivência para embriões de PIV, e 71% obtidos para embriões produzidos in vivo, quando são transferidos a fresco em doadoras sincronizadas (Ptak et al., 1999), não sendo encontrado na literatura dados desta natureza envolvendo raças e condições nacionais. Na empresa In Vitro Brasil Ltda, em média 55% dos oócitos submetidos às FIV foram transferidos (3.312 embriões a partir de 6.048 oócitos submetidos à FIV e cultivados). Imagens de um oócito maturado, um embrião no estádio de 4-6 células e de um blastocisto produzido in vitro encontram-se na Figura 1B-D.
Dessa forma, obteve-se 6,1 embriões e 1,2 prenhezes por ovelha aspirada (44% de prenhez positiva com 2,3 embriões transferidos/receptora). Tanto os relatos científicos como a experiência comercial tornam evidente que a produção de embriões in vitro a partir de doadoras ovinas vivas é uma prática viável. Existem, porém, variação em decorrência da aptidão genética, idade e condição corporal das fêmeas.
Conclusão
A utilização da biotecnologia envolvendo a produção e comercialização de embriões ovinos produzidos em laboratório a partir de doadoras vivas é realidade na ovinocultura brasileira, demonstrando rápida evolução.
Considerando a ampla difusão da raça ovina Santa Inês no país, evidencia-se um importante campo de investigação científica a ser desenvolvido, envolvendo raças e condições presentes na ovinocultura nacional.
Figura 1. A) Primeiro cordeiro nascido por FIV comercial; B) Oócito ovino maturado; C) Embrião ovino no estádio de 4-8 células; D) Blastocisto ovino no dia 7 do cultivo in vitro.
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A Dra. Andréa Cristina Basso coordena o laboratório de PIV da empresa In Vitro Brasil Ltda. Possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho-UNESP (1998), Mestrado em Reprodução Animal pela Universidade de São Paulo-USP (2001) e Doutorado em Reprodução Animal pela Universidade de São Paulo-USP (2005).
O Dr. João Flávio Panattoni Martins é coordenador do Curso de Medicina Veterinária e pesquisador do Centro Universitário da Fundação de Ensino Octávio Bastos - UNIFEOB em São João da Boa Vista – SP. Possui graduação em Medicina Veterinária, Mestrado em Biologia Celular pela Universidade Estadual de Campinas UNICAMP (1997) e Doutorado em Reprodução Animal pela Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo - USP (2003).
