UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
FRANCISCO RENAN ARAGÃO LINHARES
OTIMIZAÇÃO DA CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL E FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA EM Cyprinus carpio (ACTINOPTERYGII) NO SEMIÁRIDO
BRASILEIRO
FRANCISCO RENAN ARAGÃO LINHARES
OTIMIZAÇÃO DA CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL E FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA EM Cyprinus carpio (ACTINOPTERYGII) NO SEMIÁRIDO BRASILEIRO
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Reprodução e Sanidade Animal do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientador: Prof.a Dr.a Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley
FORTALEZA - CEARÁ
AGRADECIMENTOS
A Deus por toda a oportunidade que me foi concedida durante minha vida.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias - PPGCV, da Faculdade de Veterinária, da Universidade Estadual do Ceará, pela oportunidade de fazer parte do corpo discente.
Ao Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) e Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes (LBRP) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) que através do uso de suas instalações e equipamentos, tornou possível a conclusão do experimento.
Ao Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), pelo apoio de laboratórios e estruturas de pesquisa para realização do experimento.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de estudo durante o período de doutorado.
À minha avó materna Francisca Aragão que apesar das condições difíceis naquela época, sempre priorizou a educação de todos os filhos e netos e por fazer parte de minha educação em todos os sentidos lá na minha infância.
À família Aragão Linhares pelos exemplos de determinação para cumprir com eficiência minhas tarefas diárias.
À minha esposa Liliane Chagas Pascoal pela força de vontade para atingir os objetivos traçados e aguentar meus estresses de cada dia.
À família Chagas Pascoal por todo o acolhimento e apoio desde o momento em que adentrei na família.
Ao Professor Dr. José Ferreira Nunes, por toda a orientação que me foi passada e confiança de fazer parte de sua equipe do Núcleo Integrado de Biotecnologia desde o início de minha vida acadêmica.
À Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley por ter acreditado no meu trabalho desde o início da graduação e por sua orientação.
À Dra. Maria Audália Marques de Carvalho pelo apoio como coorientadora durante o período de desenvolvimento da pesquisa, contribuição intelectual e membro avaliador da tese.
À Dra. Caroline Vieira Feitosa pela contribuição intelectual como membro avaliador da referida Tese.
À Dra. Mônica Aline pela contribuição intelectual como membro avaliador da tese.
À Dra. Liliane Veras pelo apoio intelectual durante o período de desenvolvimento da pesquisa e apoio de suas experiências em campo.
Ao Dr. Francisco José Lopes Cajado pela contribuição intelectual como membro avaliador da referida tese.
Ao Dr. Cláudio Cabral e ao Me. Assis Montenegro pela realização da estatística.
À José Agenor Galvão pelos ensinamentos práticos durante a realização dos experimentos e pelo total apoio a minha pesquisa científica no DNOCS.
Aos pós-graduandos Júlia Trugílio Lopes, Larissa Teixeira Nunes, Mayara Setúbal Oliveira, Jordana Leite Sampaio, Priscila Silva de Almeida Monteiro, João Paulo Silva Pinheiro, Renata Vieira do Nascimento e Vanessa Alves Pereira por todo o apoio fornecido aos meus experimentos em Fortaleza e Pentecoste.
Aos alunos de iniciação científica, Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro, Thais Maia Torres, Yasmim Maia Ferreira, Edna Raquel Paiva Teodozia, Cibele Castro Monteiro, Eric Silva Antério, Filipe Oliveira Ferreira, Karen Emanuelly Pinheiro Gomes, Jéssica Uchôa Pinheiro, Francisco Yan Tavares Reis, José Pedro Vieira Arruda Júnior, Maria Mayara Aguiar Lima, Sayansk Queiroz da Silva, Vanessa Sayonara de Farias Monteiro e José de Souza Junior pela disponibilidade e disposição para cumprir com eficiência suas tarefas.
RESUMO
A carpa comum, introduzida no nordeste do Brasil pelo Departamento Nacional de Obras Contras às Secas (DNOCS) no ano de 1977, é uma das espécies mais cultivadas em todo o mundo. Por representar uma espécie com grande valor comercial, os objetivos desse trabalho foram: (1) avaliar o efeito da suplementação das vitaminas C (ácido ascórbico) ou E (α-tocoferol) ao meio ACP-104 sobre a qualidade do sêmen pós-descongelado da carpa comum; (2) definir a melhor proporção do número de espermatozoides por ovócito (dose inseminante) utilizando sêmen in natura da espécie. Para o experimento 1, foram formados oito pools a partir da coleta de sêmen de 15 machos. As amostras seminais coletadas foram avaliadas quanto à motilidade total, à velocidade, ao percentual de espermatozoides normais, à vitalidade espermática e a duração da motilidade antes e depois da criopreservação seminal. Esta foi realizada em meio ACP-104 acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO) ou etilenoglicol (EG), suplementados ou não com vitamina C ou E. As amostras foram então congeladas em vapor de nitrogênio líquido em dry shipper e estocadas em nitrogênio líquido (-196 °C) até a descongelação e análises. O experimento 2, utilizou-se de um pool de sêmen de 5 machos e um pool de ova de 2 fêmeas. Os gametas coletados foram então fertilizados nas seguintes proporções de espermatozoides/ovócito: D1-15.152, D2-60.491, D3-179.584, D4-238.072 e D5-298.563. Além disso, foi registrado em imagens o desenvolvimento embrionário da carpa comum. No que diz respeito aos resultados do experimento 1, foi observado que o EG suplementado com vitamina E produziu resultado significativamente superior de motilidade total, normalidade espermática e duração da motilidade em relação ao DMSO, concluindo-se que o EG deve ser, portanto, o crioprotetor de escolha a ser utilizado com o ACP-104 suplementado ou não com vitamina E. Para o experimento 2, verificou-se que a porcentagem de fertilização aumentou de forma linear, atingindo um platô em 45,5% na proporção de 208.295 espermatozoides/ovócito. Assim, recomenda-se o uso da dose inseminante de aproximadamente 200.000 espermatozoides/ovócito na rotina de fertilização assistida dessa espécie no nordeste brasileiro. Além disso, o desenvolvimento embrionário da carpa em latitude equatorial segue a cronologia semelhante ao relatado para a espécie em clima temperado.
ABSTRACT
The common carp, introduced in northeastern Brazil by the National Department of Works Cons Drought (DNOCS) in 1977, is one of the most cultivated species in the world. To represent a species with high commercial value, the objectives of this study were: (1) evaluate the effect of supplementation of vitamins C (ascorbic acid) or vitamin E (α-tocoferol) with ACP-104 medium on the quality of post-thawed of common carp; (2) determine the best ratio of the number of sperm per oocyte using semen in natura. For the experiment 1, semen pools from 15 selected males were formed. Seminal samples were evaluated for total motility, velocity, percentage of normal sperm, sperm vitality and duration of total motility before and after the seminal cryopreservation. This was performed in extenders ACP-104 plus DMSO or EG supplemented or not with vitamin C or E. The samples were frozen in vapors of nitrogen into dry shipper and stored in liquid nitrogen (-196 °C) until thawing and analysis. The experiment 2, semen pool from 5 selected males and eggs pool from 2 selected female were formed. Gametes collected were then fertilized in the following proportions of sperm/oocyte D1-15.152, D2-60.491, D3-179.584, D4-238.072 and D5-298.563. Moreover, monitoring of embryonic development was done. For the results of experiment 1, EG supplemented with vitamin E, produced significantly better results overall motility, sperm normality and duration of motility relative to DMSO, it concluded that the EG should be the cryoprotectant of choice for use with the ACP-104 supplemented or not with vitamin E. For the experiment 2, it was found that the fertilization rate increased linearly up to the proportion of 208.295 spermatozoa/oocyte, and, from this point, the fertilization rate was maintained at 45,5%. Therefore, we recommend the use of the insemination dose of approximately 200.000 sperm/oocyte in the artificial fertilization routine of common carp in brazilian northeast. Furthermore, embryonic development of carp in equatorial latitude follows the chronology similar to that reported for the species in temperate zones.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
CAPÍTULO 1
Figura 1- Estágios do desenvolvimento embrionário de carpa comum (Cyprinus carpio). (A) formação de mórula, (B) formação de blástula e (C) gástrula...32
CAPÍTULO 4
LISTA DE TABELAS
REVISÃO DE LITERATURA
Tabela 1 - Taxas de fertilização e eclosão (%) após a realização de fertilização artificial utilizando diferentes doses inseminantes com sêmen descongelado de algumas espécies de ciprinídeos... ...21
CAPÍTULO 1
Tabela 1 - Médias dos valores físicos, químicos e microbiológicos da água do açude Pereira de Miranda nas unidades experimentais durante o experimento. Pentecoste, Ceará...32
CAPÍTULO 2
Tabela 1 - Taxas de fertilização e eclosão (%) após a realização de fertilização artificial utilizando diferentes doses inseminantes com sêmen descongelado de algumas espécies de ciprinídeos...46
CAPÍTULO 3
Tabela 1 - Efeito de diferentes tipos de crioprotetores sobre os parâmetros cinéticos de espermatozoides frescos (grupo controle) e descongelados de Cyprinus carpio criopreservados em ACP-104 sem vitaminas...58
Tabela 2 - Efeito de diferentes tipos de crioprotetores sobre o percentual de espermatozoides normais e vitalidade de espermatozoides frescos (grupo controle) e descongelados de Cyprinus carpio criopreservados em ACP-104 sem vitaminas...59
controle) e descongelados de Cyprinus carpio criopreservados em ACP-104...60
Tabela 4 - Efeito de diferentes tipos de crioprotetores acrescidos de vitaminas sobre a duração da motilidade (segundos) de espermatozoides frescos (grupo controle) e descongelados de Cyprinus carpio criopreservados em ACP-104...60
CAPÍTULO 4
LISTA DE ABREVIATURAS
ALH Deslocamento lateral da cabeça
ACP Água de coco em pó
BCF Frequência de batimento cruzado
CASA Análise espermática auxiliada por computador
CEUA Comitê de Ética para o Uso de Animais
CPAq Centro de Pesquisas em Aquicultura
DMSO Dimetilsulfóxido
DNOCS Departamento Nacional de Obras Contra às Secas
EG Etilenoglicol
EHC Extrato hipofisário de carpa
LBRP Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes
mOsm Miliosmole
NIB Núcleo Integrado de Biotecnologia
SCA Sperm Class Analyser
sptz Espermatozoide
STR Retilinearidade
LIN Linearidade
UECE Universidade Estadual do Ceará VAP – Velocidade média do percurso
VCL Velocidade do percurso curvilinear
VSL Velocidade em linha reta
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...13 2 REVISÃO DE LITERATURA...13 2.1 ESPÉCIE...13 2.2 TAXONOMIA...14 2.3 REPRODUÇÃO...14 2.4 CRIOPRESERVAÇÃO...15
2.4.1 Diluição seminal e armazenamento do sêmen...15
2.4.2 Adição de vitaminas C ou E aos meios de congelação...17
2.5 AVALIAÇÃO DO SÊMEN IN NATURA E PÓS-DESCONGELADO...19
2.6 FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA ARTIFICIAL...20
1 INTRODUÇÃO
O brasileiro Rodolfo von Ihering (1883-1939), diretor da Comissão Técnica de Piscicultura do Nordeste e pioneiro em fecundação artificial de peixes por meio da descoberta da inseminação artificial de peixes, colocou o Brasil em nível mundial em piscicultura. Porém, constatando a pobreza qualitativa e quantitativa da ictiofauna do semiárido nordestino, representada por apenas dez espécies de valor comercial, o brasileiro e a sua equipe passaram a estudar inúmeras espécies de outras bacias hidrográficas, a partir de 1935, com o objetivo de serem introduzidas e aclimatadas na região (DNOCS, 2009). Dentre as espécies, destaca-se a carpa comum (Cyprinus carpio vr hungaricus), trazida da Hungria em 1986. Este peixe é considerado de alto valor comercial, forte apelo culinário e esportivo, sendo uma das espécies mais cultivadas em todo o mundo, representando 6,14% do total da produção mundial aquícola (FAO, 2008) e 76,7% da produção de pescado do Brasil (ECHEVENGUÁ, 2006).
Nesse contexto, o desenvolvimento de biotécnicas como a criopreservação gamética vem contribuindo para o crescimento da piscicultura mundialmente. A criopreservação espermática destaca-se como uma ferramenta essencial para a reprodução artificial, possibilitando a preservação de espécies de peixes ameaçadas de extinção (VIVEIROS et al., 2012a), além da renovação e do aumento da variabilidade genética de peixes comerciais.
Estudos recentes realizados pela equipe do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes pertencente à Universidade Estadual do Ceará obtiveram resultados próximos e satisfatórios aos parâmetros seminais encontrados na literatura para carpa comum (LINHARES et al., 2015). No entanto, o protocolo de criopreservação seminal desenvolvido para a espécie citada acima utilizando o diluente ACP-104 acrescido de diferentes crioprotetores e suplementado com vitaminas C ou E ainda não foi empregado. Além disso, a literatura também não relata a caracterização do desenvolvimento embrionário e a determinação da dose inseminante da espécie no nordeste brasileiro.
Dessa forma, a realização destes procedimentos contribuirá para a introdução de novas linhagens de carpa comum nos açudes públicos e privados utilizando um protocolo padronizado de criopreservação seminal e fertilização artificial, fortalecendo a piscicultura comercial no estado do Ceará.
2 REVISÃO DE LITERATURA
A carpa comum, nativa do litoral do mar Cáspio e Aral, é considerada uma das espécies de peixes de água doce domesticadas mais antigas, cultivadas há mais de 2000 anos na China (BALON, 1995). Devido a sua tolerância e resistência a uma ampla variedade de habitats aquáticos, estes animais se espalharam por todo o mundo (BRITTON et al., 2007). São animais que vivem em grupo, apresentando hábito alimentar onívoro, com tendência à iliofagia (FROESE; PAULY, 2007). É uma espécie típica de ambientes lênticos, capaz de suportar baixos níveis de oxigênio dissolvido (3,2 mg/L) (MACÊDO et al., 2007). A temperatura ideal para seu bom desenvolvimento varia de 24 a 28 °C, porém, apresenta uma faixa tolerável de 8 a 30 °C, sendo assim, um peixe rústico e de fácil adaptação (GRAEFF; PRUNER, 1999). As carpas geralmente apresentam um comprimento variando entre 30 e 60 cm e pesam entre 0,5 e 4 kg (TOMELLERI; EBERLE, 1990).
2.2 TAXONOMIA Reino: Animalia Filo: Chordata Classe: Actinopterygii Ordem: Cypriniformes Família: Cyprinidae Gênero: Cyprinus
Espécie: Cyprinus carpio
2.3 REPRODUÇÃO
No ambiente natural, as fêmeas desovam em águas paradas com a presença de macrófitas, liberando cerca de 100 a 230 g de ovócitos por quilograma de peso corporal, uma média de 100.000 a 300.000 ovócitos.Kg-1 (LINHART et al., 1995). Sem o cuidado parental, os ovócitos são colocados sobre plantas aquáticas que, ao entrarem em contato com a água, adquirem adesividade e aumentam de três a quatro vezes seu volume. A fertilização ocorre externamente e ao final do desenvolvimento embrionário, os ovos eclodem. Os alevinos recém-eclodidos tornam-se capazes de se alimentar de minúsculos animais aquáticos após o desaparecimento do saco vitelínico (WOYNAROVICH, 1993).
2.4 CRIOPRESERVAÇÃO
Desde que Blaxter (1953) realizou os primeiros estudos de criopreservação de gametas de peixes, muitas pesquisas têm sido voltadas para a criopreservação do sêmen de várias espécies de pescado, incluindo a carpa comum (Cyprinus carpio). A introdução desta biotécnica na reprodução animal tem sido de grande importância para a aquicultura, contribuindo para aumentar a propagação de material genético de alto valor em menor espaço de tempo.
A execução de um protocolo de criopreservação de sêmen incluem ajustes de taxas de diluição, escolhas de diluentes e diluidores, tempo de equilíbrio entre o crioprotetor e os espermatozoides, método de envase adequado, taxas de resfriamento e descongelamento das amostras e relação entre espermatozoides:ovócitos durante a realização de testes de fertilização. A presença de várias etapas dificulta a padronização de protocolos de congelação seminal devido às diferentes interações espécie-específicas do volume, composição seminal e suas características bioquímicas em cada etapa do processo (YANG; TIERSCH, 2009). Neste contexto, abordaremos as variações das etapas que abrange o processo de crioprervação seminal de carpa comum.
2.4.1 Diluição seminal e armazenamento do sêmen
resultante da adição de soluções protetoras capazes de minimizar os danos causados pelas crioinjúrias. Estas soluções são chamadas de crioprotetores, atuando na diminuição do ponto de congelação da água, reduzindo o estresse osmótico e os efeitos da cristalização sobre a estrutura celular (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012).
Devido à especificidade própria de cada grupo animal, torna-se fundamental a adequação da composição do diluidor as características seminais de cada espécie. Na literatura são relatadas soluções contendo apenas sais, apenas açucares ou uma combinação dos mesmos para a criopreservação seminal de peixes. A solução de Alsever, cuja composição é formada por NaCl e citrato de sódio, é considerado um dos diluidores mais conhecidos utilizado em ciprinídeos (NAHIDUZZAMAN et al., 2012). Além disso, muitos autores também utilizam um diluidor descrito por Kurokura et al. (1984) resultantes da combinação dos sais NaCl, KCl, CaCl2 e NaHCO3 (AKÇAY et al., 2004; RANI; MUNUSWAMY, 2014; YAVAS et al. 2014). Outro tipo de diluidor utilizado em ciprinídeos é a glicose (HORVÁTH et al., 2007). Esta age como substrato de energia, componente osmótico e agente crioprotetor em função do seu alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico e atuando como substituto de eletrólitos (HOLT, 2000). Em geral, os diluidores acrescidos de açucares são capazes de melhorar a motilidade espermática durante a criopreservação seminal de algumas espécies de ciprinídeos (URBÁNYI et al., 2006). A combinação de sais (NaCl, KCl) e açucares (frutose, glicose e sacarose) podem ser utilizados da mesma forma como diluidores de sêmen de carpa comum (IRAWAN et al., 2010).
Outra alternativa, é a utilização do diluidor água de coco em pó (ACP), considerada uma das inovações mais recentes da biotecnologia do sêmen de peixes desenvolvido por pesquisadores da Universidade Estadual do Ceará-Brasil. O ACP é composto por sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, além de indutores da divisão celular e diversos eletrólitos, proporcionando meio nutritivo completo para os espermatozoides. Estudos com a água de coco já foram realizados em várias espécies como caprinos (NUNES, 1995), ovinos (ARAÚJO, 1990) e suínos (TONIOLLI; MESQUITA, 1990). Estudos iniciais em peixes mostraram resultados satisfatórios na combinação do ACP com os crioprotetores DMSO (VELASQUEZ-MEDINA, 2008; VIEIRA, 2011) e metilglicol (VIVEIROS et al., 2008), podendo ser utilizado também como diluidor para a criopreservação seminal de carpa comum (LINHARES et al., 2015).
atuam na redução do ponto crioscópio da água intracelular evitando a formação de cristais de gelo e o comprometimento da integridade da membrana espermática interna durante as mudanças de temperatura.
Os crioprotetores internos mais comumente utilizados em ciprinídeos são dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, propilenoglicol, dimetilacetamida (DMA), glicerol e etanol (SULTANA et al., 2010; IRAWAN et al., 2010; AKÇAY et al., 2004). Na maioria dos estudos, o DMSO fornece os melhores resultados, provavelmente devido a sua rápida penetração em espermatozoides e sua interação com os fosfolipídios da membrana espermática (SUQUET et al., 2000). Os crioprotetores externos atuam na estabilização da membrana plasmática e restauração dos fosfolipídeos perdidos pelos espermatozoides durante o congelamento. No entanto, estes não são utilizados frequentemente em ciprinídeos, sendo relatadas na literatura à adição de gema de ovo-citrato ou somente gema de ovo as soluções diluidoras de sêmen de carpa comum (SULTANA et al., 2010; ÖĞRETMEN et al., 2014; YAVAS et al. 2014).
Outro ponto a ser levado em consideração é o ajuste das concentrações dos crioprotetores antes de serem misturados aos diluentes, pois os mesmos são tóxicos as células em temperatura ambiente. Comumente as concentrações dos crioprotetores são ajustados a 5 ou 10%, pois as pesquisas apontam que em altas concentrações alguns crioprotetores pode ser prejudicial à motilidade espermática (RANI; MUNUSWAMY, 2014).
Após a diluição o sêmen estará pronto para o armazenamento. Os equipamentos mais utilizados para congelar as amostras são as caixas térmicas de poliestireno, refrigeradores programáveis, dry shippers e botijões criogênicos (TAITSON et al., 2007; IRAWAN, et al., 2010; NAHIDUZZAMAN et al., 2012). Após o equilíbrio térmico, o sêmen congelado é transferido para um botijão de nitrogênio líquido, onde pode ser conservado por longos períodos à -196 °C sem efeitos deletérios (ASHWOOD-SMITH, 1980).
2.4.2 Adição de vitaminas C ou E aos meios de congelação
reativos continuamente produzidas pelo metabolismo aeróbio celular que podem comprometer a viabilidade e a função espermática (SŁOWIŃSKA et al., 2013).
Para combater a produção excessiva de ROS e o estresse oxidativo, o sêmen apresenta um sistema de defesa antioxidante intra e extracelular formado por componentes enzimáticos e não enzimáticos (SANOCKA; KURPISZ, 2004). Os antioxidantes enzimáticos são representados pelo superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e sistema glutatião peroxidase/glutatião redutase (GSH-Px/GSH-Red), enquanto os não-enzimáticos são α-tocoferol, ascorbato, urato, piruvato, glutatião, taurina e hipotaurina (SILVA; GUERRA, 2012).
No entanto, o sistema intracelular de defesa antioxidante do espermatozoide é mais susceptível a ação das ROS, devido à escassez de citoplasma que é perdido durante a maturação celular (CARVALHO et al., 2002). Além disso, Stradaioli et al. (2007) observaram que a crioproservação reduz os níveis dos antioxidantes presentes tanto na célula quanto no plasma seminal, fortalecendo a evidência de que, entre as causas da deterioração da qualidade do sêmen após um ciclo de congelação e descongelação, estão aquelas ligadas ao estresse oxidativo.
Dessa forma, pesquisas relacionadas à adição de antioxidantes aos diluidores seminais de peixes têm sido realizadas a fim de melhorar a qualidade do sêmen criopreservado por meio da prevenção ou redução do processo peroxidativo. Neste contexto, podem ser destacados entre os antioxidantes já estudados com esta finalidade a vitamina E e a vitamina C (NAVARRO et al., 2014; MARTINEZ-PÁRAMO et al., 2012).
A vitamina E (α-tocoferol e derivados) é um antioxidante não enzimático (MANEESH; JAYALEKSHMI, 2006), encontrada em quantidades baixas em membranas celulares de mamíferos e no plasma seminal que pode proteger os espermatozoides contra danos oxidativos do DNA e da membrana (SIKKA, 2004). Este antioxidante é capaz prevenir a peroxidação lipídica e suprimir, por conseguinte, a produção de malonaldeido (AITKEN; CLARKSON, 1988), o que é possível pelo fato de atuar como quelante das ROS produzidas durante a lipoperoxidação (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
tocoferol, reduzindo a produção de ROS e protegendo o espermatozoide contra danos no DNA (GUERRA et al., 2004).
2.5 AVALIAÇÃO DO SÊMEN IN NATURA E PÓS-DESCONGELADO
O método ideal para predizer a fertilidade dos machos reprodutores é pelo exame das características seminais à campo. Portanto, a qualidade espermática torna-se um pré-requisito para a seleção dos animais em programas de reprodução artificial. A avaliação do ejaculado deve ser rápida e eficiente, preservando a qualidade inicial e a capacidade fertilizante. Amostras seminais são avaliadas tendo em vista várias características físicas como o aspecto, a cor, o volume, o pH, a osmolaridade, a concentração, a morfologia e a motilidade espermática. A partir desses resultados qualquer desvio para os padrões de uma determinada espécie pode ser correlacionado com a fertilidade (HAFEZ, 1995).
O aspecto seminal pode ser facilmente classificado de forma subjetiva, podendo ser classificado em viscoso, líquido e indeterminado (SUQUET et al., 1992), enquanto o pH do sêmen de peixes de água doce varia de 6,5 a 8,5 e a osmolaridade em torno de 300 mOsm/Kg (TABARES et al., 2005; MORISAWA; SUSUKI, 1980).
A concentração espermática é uma das medidas quantitativas mais importantes utilizadas na pesquisa e rotina de avaliação do sêmen de peixes (SILVEIRA et al., 1987). A determinação da concentração espermática contribui para a padronização da taxa de diluição sêmen:diluidor apropriada para a criopreservação seminal e posterior utilização em programas de fertilização assistida.
A qualidade espermática está diretamente relacionada com a motilidade dos gametas masculinos, uma vez que esta característica constitui um pré-requisito para a fertilização dos ovócitos (RURANGWA et al., 2004). A técnica convencional, baseada na observação através de microscópio óptico, é utilizada pela maioria dos laboratórios para realizar análise seminal. Embora sujeita a distintos graus de imprecisão, devido à subjetividade da avaliação a partir de escalas arbitrárias (CHAMBEYRON; ZOHAR, 1990), este método é tão confiável quanto à análise objetiva desde que realizada por um técnico treinado.
que é realizada numa menor fração do tempo requerido pela avaliação subjetiva. A utilização deste equipamento contribuiu para a produção de trabalhos mais detalhados sobre a atividade dos espermatozoides, avaliando os parâmetros de rápidos, médios, lentos, estáticos, velocidade do percurso curvilinear (VCL), velocidade do percurso médio (VAP), velocidade em linha reta (VSL), retilinearidade (STR), linearidade (LIN), oscilação (WOB), frequência de batimento cruzado (BCF), e deslocamento lateral da cabeça (ALH). Os parâmetros de velocidade, VCL, VAP e VSL, descrevem o movimento do espermatozoide, enquanto, os parâmetros LIN, STR e WOB representam as relações entre estas velocidades VSL e VCL; VSL e VAP; VAP e VCL, respectivamente.
2.6 FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA ARTIFICIAL
O sucesso do protocolo de criopreservação é verificado através da descongelação do sêmen em banho de imersão térmica e avaliação da qualidade espermática. A fertilização artificial é a etapa final para a análise da qualidade dos gametas, sendo considerado um dos indicadores mais seguros e eficientes para se comprovar a condição do material criopreservado. A biotécnica pode ser realizada por dois métodos diferentes: o método úmido que se baseia na mistura de gametas masculinos e femininos coletados simultaneamente com água (SULTANA et al., 2010) e o método a seco que mistura primeiramente os gametas acrescentando-se água em seguida (AKÇAY et al., 2004).
A reprodução artificial em carpa é mais complexa porque o procedimento de inseminação requer uma solução específica para evitar a aderência entre os ovócitos que ocorre normalmente ao entrarem ao contato com a água. A aderência é oriunda do envelope vitelino que reveste os ovócitos e é formado por carboidratos desidratados (LINHART et al., 1995). Essas camadas acelulares envoltórias servem para proteção, nutrição e barreira pela qual os espermatozoides devem atravessar (MONTANARI, 2013). Entretanto, essa mesma aderência é responsável pela formação de uma massa de ova que dificulta o encontro da micrópila pelos espermatozoides, prejudicando o processo de fertilização.
que muitos autores relatam a utilização da solução contendo 3% de ureia (IRAWAN et al., 2010; HORVÁTH et al., 2007). No entanto, Billard et al. (1995) afirmam que a solução contendo 20% de ureia é uma solução melhorada, necessitando de menos tempo de agitação para a remoção da adesividade dos ovócitos. Além disso, pode-se utilizar também o leite em pó composto por 27,2% de gordura, 26,6g de albumina, 37,2g de açúcar do leite, 5,8g de íons, 0,2g de lecitina e 3g de água em 100g do mesmo para a preparação de uma solução de 40g de leite em pó por litro de água declorada ou limpa. A solução de leite em pó deve ser adicionada lentamente misturando-se um volume de 1L da solução por Kg de ovócitos. Após 60 minutos, adiciona-se lentamente mais água durante 10 minutos para substituição da solução de leite e em seguida ovócitos podem ser transferidos para as incubadoras (LINHART et al., 2003).
Durante os testes de fertilização necessita-se definir a dose inseminante ideal, ou seja, a proporção mínima de espermatozoides por ovócito capaz de produzir a máxima sobrevivência em termos de larvas eclodidas. Esta técnica conserva e economiza gametas, melhora a utilização do macho e contribui para um aumento da variabilidade genética. O sucesso de uma fertilização artificial utilizando uma dose inseminante é determinado por meio da taxa de fertilização, ou seja, a partir de uma coleta aproximada de 150 embriões contam-se aqueles em estágio de gástrula e divide-se pelo número de ovócitos fertilizados (HORVÁTH et al., 2003). Da mesma forma, também é calculada a taxa de eclosão por meio da contagem do número de larvas eclodidas dividida pelo número total de ovócitos fertilizados. A definição da dose inseminante utilizando sêmen criopreservado de ciprinídeos já foi estabelecida por alguns autores obtendo diferentes resultados de taxa de fertilização e eclosão (Quadro 1).
Tabela 1. Taxas de fertilização e eclosão (%) após a realização de fertilização artificial utilizando
diferentes doses inseminantes com sêmen descongelado de algumas espécies de ciprinídeos. Espécies Meios de congelação Dose
inseminante (sptzs:ovócito) Taxa de fertilização (%) Taxa de eclosão (%) Referências Diluidor Diluente Carpa comum (Cyprinus carpio)
Glicose Metanol 10% 2,6-3,4x104:1 74 ± 15 67 ± 17 Horváth et al. (2003) Carpa comum (Cyprinus carpio) Kurokura + própolis Dimetilsulfóxido 10% + gema de ovo 10% 1,0 x105:1 95,0 ± 0,6 60,3 ± 2,0 Öğretmen et al. (2014) Carpa comum (Cyprinus carpio) Kurokura + trealose Dimetilacetamida 20% 1,0 x105:1 98 80±2 Warnecke & Pluta (2003) Carpa comum (Cyprinus NaCl + Sacarose
carpio) Carpa espelho (Cyprinus carpio) NaCl + KCl + Tris Dimetilacetamida 15% 2,5x105:1 25,9 - Akçay et al. (2004) Carpa comum (Cyprinus carpio)
Kurokura DMSO 10% 1,8-2,4x105:1 56±10 52±9 Linhart et al. (2000) Carpa indiana (Labeo calbasu) Alsever DMSO 10% ou Metanol 10% 4,1x105:1 65±3 ou 63±4 45±2 ou 45±3 Nahiduzzama n et al. (2012)
3 JUSTIFICATIVA
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
O diluidor ACP-104 suplementado com vitamina C e combinado com 10% do crioprotetor DMSO apresentou melhor desempenho na qualidade seminal após a criopreservação de carpa comum quando comparado ao mesmo meio sem suplementação.
A dose inseminante de 200.000 espermatozoides/ovócito utilizando sêmen in natura produziu uma taxa aceitável de alevinos de carpa comum pós-fertilização no Nordeste do Brasil.
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito de diferentes antioxidantes e crioprotetores sobre a qualidade do sêmen criopreservado de carpa comum (Cyprinus carpio) e definir a melhor proporção do número de espermatozoides por ovócito (dose inseminante) utilizando sêmen in natura;
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Otimizar o protocolo existente definindo inicialmente o crioprotetor que deve ser usado em associação com o meio ACP-104 para a criopreservação seminal de carpa comum;
6 CAPÍTULO 1
Influência da qualidade da água sobre o desenvolvimento embrionário de carpa comum (Cyprinus carpio)
Water quality influence on the embryonic development of common carp
Periódico: Ciência Animal (ISSN: 0104-3773)
RESUMO
O estado do Ceará se destaca pela presença de açudes que auxiliam a piscicultura. Dentre estes reservatórios de água, destaca-se o açude Pereira de Miranda, que se encontra atualmente em estado de eutrofização. Dessa forma, a presente pesquisa objetivou avaliar a influência da qualidade da água do açude Pereira de Miranda sobre o desenvolvimento embrionário de carpa comum. Para tanto, os gametas obtidos foram fertilizados e o acompanhamento do desenvolvimento embrionário foi realizado até a eclosão dos ovos para se estimar as taxas de fertilização e eclosão. O tipo de clivagem foi meroblástica discoidal, típica de ovos telolécitos. A taxa de fertilização média encontrada foi de 17,25 ± 1,19%. Porém, a taxa de eclosão foi nula, observando-se embriões degenerados na sua totalidade. A baixa taxa de fertilização e não eclosão pode estar relacionada as alterações da maioria dos parâmetros de qualidade de água analisados tais como: temperatura (28,63 ± 0,67 ºC), oxigênio dissolvido (4,38 ± 0,41 mg/L O2), dureza (216,6 mg/L de CaCO3), alcalinidade (156 mg/L de CaCO3), pH (7,5 a 10,9), amônia (1,09 mg/L) e nitrito (0,104 mg/L) que permaneceram fora da faixa ideal para o desenvolvimento inicial desta espécie. Assim, conclui-se que a eutrofização do açude Pereira de Miranda pode prejudicar a reprodução de carpa comum nas estações de piscicultura abastecidas pelo açude, o que torna urgente a definição de uma série de ações para melhoria de suas águas.
Influência da qualidade da água sobre o desenvolvimento embrionário de carpa comum (cyprinus carpio)
Francisco Renan Aragão LINHARES1*, Larissa Teixeira NUNES1, Júlia Trugilio LOPES1, José Agenor Soares GALVÃO2, José Ferreira NUNES1, Carminda Sandra Brito SALMITO-VANDERLEY1
1Universidade Estadual do Ceará. 4Departamento Nacional de Obras Contra as Secas - DNOCS
Abstract
The state of Ceará is highlighted by the presence of dams that help fish farming. Among these water reservoirs, there is the dam Pereira de Miranda, which is currently suffer from eutrophication. Thus, the present study aimed to evaluate the influence of the reservoir water quality Pereira de Miranda on the embryonic development of common carp. Therefore, the obtained gametes were fertilized and monitoring of embryonic development was carried out until the eggs hatch to estimate the fertilization and hatching rates. The type of cleavage was meroblastic discoidal typical of telolecithal eggs. The average fertilization rate was found to be 17.25 ± 1.19%. However, the hatching rate was zero, observing degenerate embryos in its entirety. The low rate of fertilization and not hatch may be related changes in most water quality parameters analyzed such as temperature (28.63 ± 0.67 ºC), dissolved oxygen (4.38 ± 0.41 mg/L O2), hardness (216.6 mg/L CaCO3), alkalinity (156 mg/L CaCO3), pH (7.5 to 10.9), ammonia (1.09 mg/L) and nitrite (0.104 mg/L) which have remained outside the optimal range for the initial development of this species. Thus, it is concluded that the eutrophication of the dam Pereira de Miranda can impair reproduction of common carp in fish culture stations supplied by the dam, which makes it urgent to design a series of actions to improve their waters.
Keywords: assisted fertilization, fish farming, reproduction
Introdução
nacionais. A espécie foi introduzida no final do século XIX com a chegada dos primeiros imigrantes (Silva, 2005) e no Nordeste, através do Departamento Nacional de Obras Contras às Secas (DNOCS) no ano de 1977 (DNOCS, 2009).
Neste contexto, os açudes construídos no Ceará apresentam grande importância para a piscicultura do estado. Dentre estes reservatórios de água, destaca-se o açude Pereira de Miranda, com barragem localizada no município de Pentecoste, Ceará e distante 85 km de Fortaleza. O mesmo, foi construído pelo DNOCS entre os anos de 1950 e 1957, visando o abastecimento de água, a irrigação, a geração de energia elétrica e a piscicultura. No entanto, o açude citado encontra-se em estado de eutrofização, podendo prejudicar entre outras utilidades a piscicultura da região (COGERH, 2015). Diante deste quadro, a avaliação dos parâmetros físicos, químicos e microbiológicos da água do açude em questão, será fundamental para se monitorar a sobrevivência e reprodução dos peixes no ambiente em que vivem.
Dessa forma, a presente pesquisa objetivou avaliar a influência da qualidade da água, por meio de análises de parâmetros fiscos, químicos e microbiológicos do açude em estado de eutrofização Pereira de Miranda sobre o desenvolvimento embrionário de carpa comum.
Material e métodos
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará (11516665-3/63). O trabalho foi realizado no Centro de Pesquisas em Aquicultura (CPAq) do Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS) em Pentecoste - Ceará, situando-se a 3° 45' 00" de latitude sul e 39° 10' 24" de longitude oeste, local onde o abastecimento de água é realizada pelo açude Pereira de Miranda.
As amostras foram conservadas sobre gelo em escamas em caixas térmicas a uma temperatura de aproximadamente 5 °C até a realização da fertilização artificial assistida. Para a seleção das amostras, foi estimada a análise subjetiva da motilidade utilizando um microscópio óptico (Nikon Eclipse E200 – ampliação de x400) após a mistura de uma alíquota de 2 µL de sêmen e 100 µL de água do tanque, considerando-se como 0% (zero) nenhum espermatozoide móvel e 100% (cem) todos os espermatozoides móveis. Somente as amostras com o valor superior a 80% de motilidade foram utilizadas, enquanto aquelas contaminadas com água, fezes, urina ou sangue foram descartadas.
Para a coleta de ovócitos, foram utilizadas duas fêmeas, de comprimento médio de 46 ± 5,7 cm e peso médio de 2,38 ± 0,6 kg, submetidas à indução da desova pela aplicação de duas doses de 0,5 e 5,0 mg/kg de peso vivo de EHC, num intervalo de doze horas entre elas. A partir do material coletado, formou-se um pool de ova do qual foram retiradas cinco amostras de 25 g (aproximadamente 21.800 ovócitos) de ovócitos para fertilização a seco de cada amostra com 157,5 µL de sêmen fresco. Essa dose de sêmen correspondia à proporção aproximada de 200.000 espermatozoides por ovócito (Irawan et al., 2010). Os gametas foram então misturados suavemente durante dois minutos a fim de evitar injúrias nos ovócitos.
Para a remoção da adesividade dos ovócitos, cada amostra foi imersa durante uma hora em 100 mL de solução de ureia, sob homogeneização constante. Completado os 60 minutos, as amostras foram lavadas com 100 mL de solução de ácido tânico puríssimo (0,5 g/L) (Vetec Ltda., Brasil) durante 20 segundos (Billard et al., 1995). Para a remoção desta última solução, todas as amostras (n=5) foram então lavadas três vezes com 100 mL de água do tanque. Posteriormente, cada uma das amostras foram transferidas para incubadoras confeccionadas a partir de canos de PVC (policloreto) teladas no fundo de volume aproximado de 1 L.
Paralelamente ao experimento, foram analisados parâmetros físicos, químicos e microbiológicos da água utilizada na incubação dos embriões. A temperatura, o oxigênio dissolvido (OD) e o pH foram medidos in loco de três em três horas desde o início da fertilização assistida até as fases finais do desenvolvimento embrionário, no qual utilizou-se um medidor de oxigênio dissolvido e temperatura (Phtek, modelo DO-100) e pHmetro (KASVI, modelo K39-0014P). Para os parâmetros alcalinidade, dureza, amônia e nitrito foram coletadas amostras de água das incubadoras de embriões do CPAq – DNOCS e refrigeradas a 4°C conforme recomendações do Guia da CETESB (Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental) até serem processadas em Fortaleza pela Superintendência Estadual do Meio Ambiente do Ceará (SEMACE).
Para os parâmetros microbiológicos, foi analisada o número mais provável de coliformes termotolerantes e o número mais provável de Pseudomonas. Para tanto, as amostras também foram processadas no mesmo dia pelo LABOMAR: Instituto de Ciências do Mar – UFC. No local, as amostras foram serialmente diluídas em solução salina estéril até 10-5. O Número Mais Provável (NMP) de coliformes termotolerantes foi determinado segundo a técnica dos tubos múltiplos usando meio de cultura Caldo Lauryl MUG (Difco). Para se obter o NMP de coliformes termotolerantes, consultou-se a tabela de Mc Crady (APHA, 2005). O NMP de Pseudomonas spp. foi obtido através da técnica de tubos múltiplos usando caldo asparagina, como citado por Cabrini & Gallo (2001). Dos tubos positivos (com turvação) foram repicadas alçadas para placas de ágar cetrimide e incubadas a 35 °C por 48 h. O surgimento de coloração esverdeada em toda a placa ou de colônias com luminescência verde indicou resultado positivo para a presença de Pseudomonas spp. Para a contagem de bactérias heterotróficas cultiváveis foi utilizada a técnica de plaqueamento pour plate onde uma alíquota de 1 mL de cada diluição sucessiva foi colocado em placa de Petri e coberto com o meio de cultivo Plate Count Agar (PCA), misturado e incubadas em estufa a 35–37 ºC por 48 h de acordo com o Standard Methods (APHA, 2005).
Resultados e discussão
Figura 1. Estágios do desenvolvimento embrionário de carpa comum (Cyprinus carpio). (A) formação de mórula, (B) formação de blástula e (C) gástrula.
A taxa de fertilização média encontrada foi de 17,25 ± 1,19%, sendo considerada baixa quando comparada a 75,6 ± 7,5% observada por Irawan et al. (2010) para sêmen fresco. A taxa de eclosão foi nula, observando-se embriões degenerados na sua totalidade.
A temperatura é considerada um fator importante para se monitorar a má formação nas larvas, pois segundo Moreira et al. (2001), a temperatura ótima da água para se realizar a reprodução induzida das carpas comuns, situa-se entre 22 a 28 ºC. Assim, a temperatura média de 28,63 ± 0,67 ºC (Tab. 1) encontrada no presente trabalho está no limite para os padrões de outros estudos na área de desenvolvimento inicial de carpas, podendo ter ocasionado má formação dos embriões e não eclosão.
Tabela 1. Médias dos valores físicos, químicos e microbiológicos da água do açude Pereira de Miranda nas unidades experimentais durante o experimento. Pentecoste, Ceará.
Parâmetros Média ± D. P.
Temperatura (°C) 28,63 ± 0,67
Oxigênio dissolvido (mg/L O2) 4,38 ± 0,41
Dureza (mg/L CaCO3) 216,6 Alcalinidade (mg/L CaCO3) 156 pH (0-14) 7,5 a 10,9 Amônia (mg/L) 1,09 Nitrito (mg/L) 0,104 Coliformes termotolerantes (100 mL-1) 17 x 102 Pseudomonas sp. (100 mL-1) 4,5 x 102
A concentração de oxigênio dissolvido para um desenvolvimento embrionário ideal em carpa comum encontra-se entre 6 a 9 mg L-1 O2, sendo considerada uma das espécies mais exigentes (Boryshpolets et al., 2009). No entanto, o valor médio encontrado para o oxigênio dissolvido nas incubadoras dos embriões foi de 4,38 ± 0,41 mg/L O2 (Tab. 1), sendo inferior ao relatado na literatura para a espécie.
(GRAEFF; MONDARDO, 2006). Além disso, esses dois parâmetros podem ter ocasionando uma grande oscilação do pH de 7,5 a 10,9 (Tab. 1).
A concentração de amônia encontrada de 1,09 mg/L (Tab. 1) foi considerada alta, apesar de permanecer dentro da tolerância de 0,6 e 2 mg/L usualmente reportados. O nível de nitrito foi de 0,104 mg/L, estando fora das concentrações letais para a espécie estudada (Golombieski et al., 2005).
No que diz respeito às análises bacteriológicas, verificou-se a ocorrência de coliformes termotolerantes (17 x 102 100 mL-1) (Tab.1) indicando presença de efluentes de esgotos domésticos, assim como também a ocorrência de Pseudomonas sp. (4,5 x 102 100 mL-1) (Tab.1), consideradas patógenos oportunistas na infecção de ovos de peixes. De fato, Sorensen et al. (2014) verificou que a interferência microbriana em ovos fertilizados de enguia (Anguilla anguilla) afetou significativamente a taxa de eclosão e a longevidade larval. Além disso, observou-se na água a presença de uma grande quantidade de zooplâncton, podendo ser responsável também pela degeneração de embriões em desenvolvimento.
Podemos concluir que a eutrofização do açude Pereira de Miranda pode prejudicar a reprodução de carpa comum nas estações de piscicultura abastecidas pelo açude, o que torna urgente a definição de uma série de ações para melhoria de suas águas.
Agradecimentos
Agradecemos ao Departamento Nacional de Obras Contra Secas (DNOCS) e Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes (LBRP), por fornecer as instalações e as amostras utilizadas nos experimentos. A Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) pelo apoio financeiro e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão de bolsa de estudos.
Referências bibliográficas
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BILLARD, R.; COSSON, J.; PERCHEC, G.; LINHART, O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture, v. 129, p. 95-l 12, 1995.
BORYSHPOLETS, S.; DZYUBA, B.; RODINA, M.; LI, P.; HULAK, M.; GELA, D.;
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IRAWAN, H.; VUTHIPHANDCHAI, V.; NIMRAT, S. The effect of extenders,
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7 CAPÍTULO 2
Biotécnicas aplicadas a reprodução de ciprinídeos
Biotechs applied the reproduction of cyprinids
Periódico: Acta Veterinaria Brasilica (ISSN: 1981-5484)
RESUMO
Esta revisão relata as variações de cada etapa que abrange o processo de crioprervação seminal e fertilização assistida artificial em ciprinídeos. Os diluidores mais utilizados para a criopreservação do sêmen de carpa são uma combinação de sais e açucares associados aos crioprotetores DMSO ou metanol. Para o armazenamento em nitrogênio líquido as amostras podem ser envasadas em palhetas de diferentes volumes e congeladas em caixas térmicas de poliestireno, refrigeradores programáveis, dry shippers ou botijões criogênicos. Após o descongelamento, uma alíquota do sêmen criopreservado é retirada para o cálculo da dose inseminante e realização da fertilização assistida artificial. Em seguida, os ovos fertilizados são tratados com uréia, NaCl e ácido tânico e transferidos para um sistema de incubação. Diante de uma variedade de protocolos relatados pela literatura, ainda é fundamental o aperfeiçoamento continuado destas biotécnicas para permitir o aprimoramento dos programas de reprodução de ciprinídeos.
Biotécnicas aplicadas a reprodução de ciprinídeos
Carminda Sandra Brito Salmito-Vanderley1*, Francisco Renan Aragão Linhares 2, Maria Audália Marques de Carvalho 3, Mayara Setúbal Oliveira 4, José Ferreira Nunes5
1 Profa. Doutora Adjunta da Universidade Estadual do Ceará (UECE) e Pesquisadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV). * Autor para
correspondência: E-mail: sandra.salmito@uece.br.
2 Doutorando em Reprodução e Sanidade Animal pelo PPGCV – UECE. 3 Doutora em Biotecnologia pela Rede Nordeste de Biotecnologia – UECE. 4 Mestranda em Reprodução e Sanidade Animal pelo PPGCV – UECE.
5 Prof. Doutor Titular da Universidade Estadual do Ceará e Pesquisador do PPGCV.
Abstract
This review reports the variations of each stage which covers the process of sperm cryopreservation and artificial fertilization in cyprinids. The most commonly used extenders for sperm cryopreservation of carp are a combination of salts and sugars associated with DMSO or methanol. The samples can be packaged in straws of different volumes for storage in liquid nitrogen and frozen in styrofoam boxes, computer-controlled freezer, dry shippers or cryogenic vessel. After thawing an aliquot of cryopreserved semen is taken for the calculation of insemination dose and realization of artificial assisted fertilization. Then fertilized eggs are treated with urea, NaCl and tannic acid and transferred to incubation system. Faced with a variety of protocols reported in the literature, it is still essential to continued improvement of these biotechnologies to enable the improvement of breeding programs for cyprinids.
Keywords: Cyprinus sp; sperm cryopreservation; artificial fertilization.
Introdução
introduzidas na região. Dentre as espécies de alto valor comercial, destaca-se a carpa comum (Cyprinus carpio vr hungaricus), trazida da Hungria em 1986 (DNOCS, 2009).
Nesse contexto, o desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas de base como a indução hormonal e a reprodução artificial em cativeiro vem contribuindo para aumentar a produção de pescado, permitindo o crescimento deste setor mundialmente. Outra biotécnica reprodutiva bastante difundida em peixes é a criopreservação seminal. Em todo o mundo, já foram desenvolvidos protocolos de criopreservação de sêmen para mais de 200 espécies de pescado (Tiersch et al., 2007). Na carpa comum, são inúmeros os protocolos de criopreservação e fertilização assistida que visam a sua produção.
Assim, diante da importância da aplicação destas biotécnicas, este artigo apresentará uma revisão sobre o conhecimento atual das técnicas de criopreservação seminal e fertilização assistida utilizadas na produção de ciprinídeos.
Criopreservação
Desde que Blaxter (1953) realizou os primeiros estudos de criopreservação de gametas de peixes, muitas pesquisas têm sido voltadas para a criopreservação do sêmen de várias espécies de pescado, incluindo a carpa comum (Cyprinus carpio). A introdução desta biotécnica na reprodução animal contribui para aumentar a propagação de material genético de alto valor em menor espaço de tempo.
A execução de um protocolo de criopreservação de sêmen inclue ajustes de taxas de diluição, escolhas de diluentes e crioprotetores, tempo de equilíbrio entre o crioprotetor e os espermatozoides, método de envase adequado, taxas de resfriamento e taxas de descongelação das amostras. Diante da presença de várias etapas e suas interações surgem dificuldades para a padronização de protocolos de congelação seminal (Yang & Tiersch, 2009). Nesse contexto, abordaremos as variações de cada etapa que abrange o processo de crioprervação seminal de carpa comum encontradas na literatura nos últimos anos.
Os espermatozoides, quando submetidos às alterações rigorosas de temperaturas, estão sujeitos à danos ocasionados pelo frio, denominados crionjúrias (Silva & Guerra, 2011). Estes danos podem levar a um decréscimo nas características espermáticas, como a velocidade, motilidade, capacidade de fertilização e subsequente redução das taxas de eclosão (Li et al., 2010). Dessa forma, após a coleta, o sêmen é submetido à etapa de diluição resultante da adição de soluções protetoras capazes de minimizar os danos causados pelas crioinjúrias. Estas soluções são chamadas de crioprotetores, atuando na diminuição do ponto de congelação da água, reduzindo o estresse osmótico e os efeitos da cristalização sobre a estrutura celular (Salmito-Vanderley et al., 2012).
Devido à especificidade própria de cada grupo animal, torna-se fundamental a adequação da composição do diluidor as características seminais de cada espécie. Na literatura são relatadas soluções contendo apenas sais, apenas açucares ou uma combinação dos mesmos para a criopreservação seminal de peixes. A solução de Alsever, cuja composição é formada por NaCl e citrato de sódio, é considerado um dos diluidores mais conhecidos utilizados em ciprinídeos (Nahiduzzaman et al., 2012). Além disso, muitos autores também utilizam um diluidor descrito por Kurokura et al. (1984) resultantes da combinação dos sais NaCl, KCl, CaCl2 e NaHCO3 (Akçay et al., 2004; Rani & Munuswamy, 2014). Outro tipo de diluidor utilizado em ciprinídeos é a glicose (Horváth et al., 2007). Esta age como substrato de energia, componente osmótico e agente crioprotetor em função do seu alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico e atuando como substituto de eletrólitos (Holt, 2000).
Em geral, os diluidores acrescidos de açucares são capazes de melhorar a motilidade espermática durante a criopreservação seminal de algumas espécies de ciprinídeos (Urbányi et al., 2006). A combinação de sais (NaCl, KCl) e açucares (frutose, glicose e sacarose) podem ser utilizados da mesma forma como diluidores de sêmen de carpa comum (Irawan et al., 2010).
sendo identificado compostos fenólicos, terpenóides, flavonoides, ácidos graxos, açucares e outros componentes.
Os diluentes seminais também atuam como carreadores de crioprotetores, agindo em conjunto para proteger os espermatozoides contra os efeitos deletérios da congelação. Os crioprotetores podem ser classificados como internos ou externos. Os crioprotetores internos atuam na redução do ponto crioscópio da água intracelular evitando a formação de cristais de gelo e o comprometimento da integridade da membrana espermática interna durante as mudanças de temperatura. Os crioprotetores internos comumente utilizados em ciprinídeos são dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, propilenoglicol, dimetilacetamida (DMA), glicerol e etanol (Akçay et al., 2004; Irawan et al., 2010; Sultana et al., 2010). Na maioria dos estudos, o DMSO fornece os melhores resultados, provavelmente devido a sua rápida penetração em espermatozoides e sua interação com os fosfolipídios da membrana espermática (Suquet et al., 2000). Os crioprotetores externos atuam na estabilização da membrana plasmática e restauração dos fosfolipídeos perdidos pelos espermatozoides durante a congelação. No entanto, estes não são utilizados frequentemente em ciprinídeos, sendo relatadas na literatura à adição de gema de ovo-citrato ou somente gema de ovo as soluções diluidoras de sêmen de carpa comum (Sultana et al., 2010; Öğretmen et al., 2014).
Portanto, a variedade dos tempos de equilíbrio relatadas na literatura é esperada devido a grande quantidade de diluidores utilizados para a família dos ciprinídeos. Além disso, a taxa de diluição é um fator a ser considerado.
Taxas de diluição e armazenamento do sêmen
As concentrações dos diluentes precisam ser ajustadas antes de serem misturados aos diluidores, pois os mesmos são tóxicos as células em temperatura ambiente. Comumente as concentrações dos crioprotetores são ajustados a 5 ou 10%, pois as pesquisas apontam que em altas concentrações alguns crioprotetores pode ser prejudicial à motilidade espermática. Rani & Munuswamy (2014) observaram menores taxas de viabilidade espermática (35%) utilizando 20% de DMSO, viabilidade mediana (61,5%, 62,3%, 60,8%) utilizando glicerol (10% e 20%) e DMSO 15% e viabilidade máxima (75,8%) utilizando 10% de DMSO em amostras de sêmen de carpa comum conservadas a 4 °C. Após a verificação da melhor concentração do crioprotetor e formação do diluente, o sêmen é submetido a diferentes taxas de diluição para se verificar a melhor proporção entre as quantidades de diluente e sêmen. A literatura relata a utilização de diferentes taxas de diluição para a criopreservação do sêmen de carpa comum tais como 1:1, 1:3, 1:5, 1:6, 1:7 e 1:9 (Linhart et al., 2000; Warnecke & Pluta, 2003; Sultana et al., 2010; Linhares, 2012).
Para o armazenamento em nitrogênio líquido a mistura (sêmen:diluente) deve ser envasada em recipientes padronizados para uniformizar o processo de resfrigeração e evitar variações de transferência de calor. Para tal finalidade, podem ser utilizados palhetas de 0,25 mL, 0,5 mL, 1,2 mL, 2 mL e 5 mL (Linhart et al., 2000; Akçay et al., 2004; Horváth et al., 2007; Irawan et al., 2010). Em seguida, o sêmen é submetido a uma queda gradual de temperatura que influenciará o equilíbrio osmótico e o pH de soluções intra e extracelulares durante a congelação. O ideal é que a taxa de resfrigeração seja rápida o suficiente para minimizar o tempo de exposição às soluções concentradas e lenta o suficiente para minimizar a quantidade de formação de gelo intracelular (Yang & Tiersch, 2009). Essa taxa de resfriamento varia de acordo com o equipamento utilizado para fazê-lo.
Os equipamentos utilizados para congelar as amostras de sêmen são as caixas térmicas de poliestireno, refrigeradores programáveis, dry shippers e botijões criogênicos. A caixa térmica de isopor é formada por poliestireno, dentro da qual é adaptada uma bandeja metálica distante do fundo alguns centímetros acima da superfície do nitrogênio líquido. As dimensões (comprimento x largura x altura) das caixas utilizadas podem variar de 27-40 cm x 18-24 cm x 28-33 cm (Lahnsteiner et al., 2000; Linhares, 2012). A altura ideal para a congelação de sêmen acima da superfície do nitrogênio líquido varia entre as espécies de ciprinídeos, sendo utilizadas 2, 3, 4 e 6 cm (Irawan et al., 2010; Linhares, 2012). A temperatura na caixa pode variar de -100 a -130 °C dependendo da quantidade de nitrogênio líquido despejado. As amostras são suspensas sob a bandeja e congeladas por um período específico em vapor de nitrogênio líquido podendo ser deixadas no interior da caixa por 3, 10, 20 ou 25 min (Alvarez et al., 2003; Urbányi et al., 2006; Boryshpolets et al., 2009; Irawan et al., 2010). Dependendo da espécie de peixe e da velocidade de resfriamento, o método de congelação de sêmen em caixa térmica de poliestireno pode ser tão eficaz quanto à utilização de um refrigerador programável.
Este último equipamento citado anteriormente é programado para controlar o resfriamento gradual de amostras biológicas antes de serem imersas em nitrogênio líquido. A redução da temperatura é realizada durante um período determinado pelo programador estabelecendo-se um intervalo de temperatura inicial e final para o término do resfriamento. Este processo é chamado de curva de resfriamento e pode variar entre as taxas de resfriamento e intervalos de temperatura inicial e final. Nahiduzzaman et al. (2012), em apenas uma etapa, resfriou as amostras de 5°C a -80°C numa taxa de resfriamento de 10°C/min enquanto Irawan et al. (2010) utilizou a mesma taxa de resfriamento porém um intervalo de temperatura diferente de 25°C a -40°C. Sultana et al. (2010), utilizando duas etapas, primeiramente resfriou as amostras de 5°C a -4°C numa taxa de resfriamento de 4°C/min e em seguida prosseguiu o resfriamento de -4°C a -80°C sob uma taxa de 10°C/min. No entanto, Linhart et al. (2000) utilizou um protocolo diferente resfriando primeiramente as amostras de 4°C a -9°C numa taxa de resfriamento de 4°C/min e em seguida continuou de -11°C a -80°C sob uma taxa de 11°C/min.
estabilização gradual de -181 °C em 3 min (Taitson et al., 2007). O equipamento foi utilizado com sucesso para carpa comum, obtendo boas taxas de motilidade espermática quando comparado à caixa de poliestireno comumente utilizada para a espécie (Linhares, 2012). No entanto, são escassas as pesquisas que relatam a utilização do dry shipper para criopreservar sêmen de carpa comum. O dry shipper é utilizado com frequência para as espécies nativas brasileiras tais como Brycon insignis e Brycon opalinus obtendo resultados positivos de motilidade, fertilização e eclosão (Viveiros et al., 2012a,b).
Após o equilíbrio térmico, o sêmen congelado é transferido para um botijão de nitrogênio líquido, onde pode ser conservado por longos períodos (Li et al., 2010) até ser utilizado para fertilização.
Fertilização
O sucesso do protocolo de criopreservação é verificado através da descongelação do sêmen em banho de imersão térmica e avaliação da qualidade espermática, sendo a fertilização artificial a etapa final para a análise da qualidade dos gametas. A biotécnica pode ser realizada por dois métodos diferentes: o método úmido que se baseia na mistura de gametas masculinos e femininos coletados simultaneamente com água (Sultana et al., 2010) e o método a seco que mistura primeiramente os gametas acrescentando-se água em seguida (Akçay et al., 2004).
A reprodução artificial em carpa é mais complexa porque o procedimento de inseminação requer uma solução específica para evitar a aderência entre os ovócitos que ocorre normalmente na água doce. A aderência é oriunda do envelope vitelino que reveste os ovócitos e é formado por carboidratos desidratados (Linhart et al., 1995). Essas camadas acelulares envoltórias servem para proteção, nutrição e barreira pela qual os espermatozoides devem atravessar (Montanari, 2013). Entretanto, essa mesma aderência é responsável pela formação de uma massa de ova que dificulta o encontro da micrópila pelos espermatozoides, prejudicando o processo de fertilização.
hora a 1 hora e 30 minutos. Após esse período adiciona-se uma solução de ácido tânico (0,5g/L) por 20 segundos, removendo-a em seguida (Billard et al., 1995). Vale ressaltar que muitos autores relatam a utilização da solução contendo 3% de ureia (Horváth et al., 2007; Irawan et al., 2010). No entanto, Billard et al. (1995) afirmam que a solução contendo 20% de ureia é uma solução melhorada, necessitando de menos tempo de agitação para a remoção da adesividade dos ovócitos. Além disso, pode-se utilizar também o leite em pó composto por 27,2% de gordura, 26,6g de albumina, 37,2g de açúcar do leite, 5,8g de íons, 0,2g de lecitina e 3g de água em 100g do mesmo para a preparação de uma solução de 40g de leite em pó por litro de água declorada ou limpa. A solução de leite em pó deve ser adicionada lentamente misturando-se um volume de 1 L da solução por Kg de ovócitos. Após 60 minutos, adiciona-se lentamente mais água durante 10 minutos para substituição da solução de leite e em seguida ovócitos podem ser transferidos para as incubadoras (Linhart et al., 2003).
Durante os testes de fertilização necessita-se definir a dose inseminante ideal, ou seja, a proporção mínima de espermatozoides por ovócito capaz de produzir a máxima sobrevivência em termos de larvas eclodidas. Esta técnica conserva e economiza gametas, melhora a utilização do macho e contribui para um aumento da variabilidade genética. O sucesso de uma fertilização artificial utilizando uma dose inseminante é determinado por meio da taxa de fertilização, ou seja, a partir de uma coleta aproximada de 150 embriões contam-se aqueles em estágio de gástrula e divide-se pelo número de ovócitos fertilizados (Horváth et al., 2003). Da mesma forma, também é calculada a taxa de eclosão por meio da contagem do número de larvas eclodidas dividida pelo número total de ovócitos fertilizados. A definição da dose inseminante utilizando sêmen criopreservado de ciprinídeos já foi estabelecida por alguns autores obtendo diferentes resultados de taxa de fertilização e eclosão (Quadro 1).
