Programa de Pós-Graduação em Produtos Bioativos e Biociências
Ludmilla Carvalho do Espírito Santo Nery
Efeitos vasculares e no estado redox da administração prolongada de anticoncepcional combinado injetável em ratas Wistar em idade fértil
MACAÉ 2019
Programa de Pós-Graduação em Produtos Bioativos e Biociências
Ludmilla Carvalho do Espírito Santo Nery
Efeitos vasculares e no estado redox da administração prolongada de anticoncepcional combinado injetável em ratas Wistar em idade fértil
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências da Universidade Federal do Rio de Janeiro – Campus Macaé Professor Aloísio Teixeira como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Drª Juliana Montani Raimundo
Co-orientadora: Profa. Drª. Helene Nara Henriques Blanc
MACAÉ 2019
Ludmilla Carvalho do Espírito Santo Nery
Efeitos vasculares e no estado redox da administração prolongada de anticoncepcional combinado injetável em ratas Wistar em idade fértil
Banca de defesa da dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Produtos Bioativos e Biociências da Universidade Federal do Rio de Janeiro – Campus Macaé Professor Aloísio Teixeira como parte das exigências para obtenção do titulo de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Juliana Montani Raimundo
Co-orientadora: Profa. Dra. Helene Nara Henriques Blanc
Aprovada em 08 de fevereiro de 2019.
Comissão Examinadora:
____________________________________________
Profa. Dra. Kátia Calvi Lenzi de Almeida
____________________________________________
Profa. Dra. Rosane Aparecida Ribeiro
____________________________________________
Profa. Dra. Taís Fontoura Almeida
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Co-orientadora: Profa. Dra. Helene Nara Henriques Blanc
____________________________________________
Orientadora: Profa. Dra. Juliana Montani Raimundo
Dedico esse trabalho a Deus que me sustentou em todo tempo, ao meu esposo e família, assim como aos professores e amigos que foram como anjos na minha caminhada.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por tem me dado ânimo e forças para continuar e concluir a caminhada, especialmente nos momentos em que achei que não conseguiria.
Ao meu esposo Samuel, por todo seu amor e cumplicidade expressos em atitudes e palavras. Obrigada por me incentivar e apoiar sempre!
Aos meus pais Josué e Ma Aparecida, por estarem sempre perto, mesmo longe.
Obrigada por todo esforço e exemplo de determinação. Tudo de bom que eu tenho e sou devo a vocês. Ao meu irmão Ulisses, que mesmo na sua quietude e calmaria se mostra o melhor irmão que alguém poderia ter. Amo vocês!
Às minhas orientadoras Juliana Montani e Helene Blanc, que me aceitaram mesmo sem me conhecer, obrigada por confiarem em mim. Obrigada não só pelos ensinamentos, mas pela amizade e compreensão nos meus momentos difíceis.
Aos amigos que conquistei: Giovanna, Cinthya, Thalissa, Letícia, Valéria, Nanashara, Pedro e Cremilda. Em especial à Leslie, pela dedicação e companheirismo nas aventuras da descoberta do trabalho com animais. Obrigada por terem feito a trajetória ser mais leve e descontraída.
Aos professores, que colaboraram de tantas formas para o enriquecimento do meu trabalho, em especial ao Leandro Louback, por toda dedicação e prestatividade.
A toda equipe do Laboratório Integrado de Morfologia e Laboratório Integrado de Pesquisa, obrigada pela ajuda e parceria.
Aos técnicos, que foram braços e mãos em momentos de aprendizagem, muito obrigada. Em especial a Flávia e Roan, pela infinita paciência em me auxiliar com os animais no início da minha jornada.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo suporte financeiro a mim concedido, assim como às milhares de pesquisas e pesquisadores em todo país.
À UFRJ-Macaé, por me permitir trilhar caminhos em suas terras.
Aos animais, todo meu respeito e gratidão.
A todos que de alguma forma colaboraram para a conclusão desse trabalho.
“O êxito da vida não se mede pelo caminho que você conquistou, mas sim pelas dificuldades que superou no caminho.”
Abraham Lincoln
“Só se pode alcançar um grande êxito quando nos mantemos fiéis a nós mesmos.”
Friedrich Nietzsche
RESUMO
Os anticoncepcionais injetáveis combinados (AIC) são uma alternativa ao uso dos anticoncepcionais orais. Porém, os efeitos cardiovasculares relacionados ao uso prolongado dos AIC ainda não estão bem definidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos morfológicos e funcionais na aorta e no estado redox após uso prolongado de AIC contendo enantato de noretisterona (EN) e valerato de estradiol (VE). Ratas Wistar de 9 a 10 semanas foram aleatoriamente divididas em 2 grupos.
Os animais tratados (AIC) receberam injeção intramuscular uma vez por semana do anticoncepcional (1 mg EN + 0,1 mg VE em 0, 02 mL) por 8 semanas, e animais controle (CTL) receberam o mesmo volume (0,02 mL) de óleo de rícino (veículo) pela mesma via e mesmo período. O grupo AIC apresentou menor consumo alimentar e menor ganho de peso comparado ao grupo CTL. As ratas do grupo AIC apresentaram maior peso uterino e a citologia vaginal demonstrou características das fases proestro e metaestro, indicando ação hormonal do anticoncepcional. Não houve alteração na pressão arterial e na reatividade vascular da aorta frente à fenilefrina e acetilcolina, assim como na análise morfológica e morfométrica da aorta.
Os valores do estado oxidante total e peroxidação lipídica no plasma apresentaram- se reduzidos no grupo AIC, embora os valores para glutationa reduzida e peroxidação lipídica na aorta não sofreram alteração. Sendo assim, é possível sugerir que o AIC EN+VE quando administrado por 8 semanas não induz disfunção endotelial, alterações histomorfométricas ou estresse oxidativo.
Palavras-chave: estradiol, noretisterona, reatividade vascular, estresse oxidativo.
ABSTRACT
Combined injectable contraceptives (CIC) is an alternative to oral contraceptive use.
However, the cardiovascular effects related to prolonged use of CICs are still not well defined. The objective of this study was to evaluate the morphological and functional effects on aorta and redox effects after prolonged use of CIC containing norethisterone enanthate (NE) and estradiol valerate (EV). Wistar rats of 9 to 10 weeks were randomly divided into 2 groups, where treated (CIC) animals received once-weekly intramuscular injection of contraceptive (1 mg NE + 0.1 mg EV in 0.02 mL) for 8 weeks and control animals (CTL) received the same volume (0.02 mL) of castor oil (vehicle) for the same route and same period. The CIC group presented lower food intake and lower total weight gain compared to the CTL group. The CIC rats presented higher uterine weight and the vaginal cytology showed proestrus and metaestrus phases characteristics, indicating the hormonal action of the contraceptive. There was no change in blood pressure or aorta vascular reactivity to phenylephrine and acetylcholine as well as in morphological and morphometric analysis of the aorta. Plasma total oxidant status and lipid peroxidation values were reduced in the CIC group, although reduced glutathione and lipid peroxidation on aorta did not show alteration. Thus, it would be possible to suggest that CIC NE + VE when used for 8 weeks do not induce endothelial dysfunction, histomorphometric changes or oxidative stress.
Key words: estradiol, norethisterone, vascular reactivity, oxidative stress.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química do 17β-estradiol ... 15
Figura 2. Estrutura química da progesterona ... 16
Figura 3. Estrutura química do valerato de estradiol ... 20
Figura 4. Estrutura química do enantato de noretisterona ... 21
Figura 5. Esquema histológico da parede arterial ... 22
Figura 6. Mecanismo de relaxamento por ação estrogênica ... 26
Figura 7. Via de sinalização da progesterona...27
Figura 8. Esquema da morfometria da aorta...36
Figura 9. Efeito do tratamento prolongado com AIC sobre o peso do útero dos animais...39
Figura 10. Fotomicrografia de citologia vaginal dos animais CTL e AIC...40
Figura 11. Fotomicrografia de citologia vaginal de animal AIC...41
Figura 12. Consumo de ração e evolução do peso corporal dos animais CTL e AIC durante período de tratamento ... 42
Figura 13. Avaliação da pressão arterial dos animais CTL e AIC durante administração do anticoncepcional ... 43
Figura 14. Curvas concentração-resposta para fenilefrina (A) e acetilcolina (B) em aortas isoladas de ratas CTL e AIC após período de tratamento ... 45
Figura 15. Fotomicrografias de aorta de animal CTL e AIC. ... 46
Figura 16. Morfometria da aorta ... 47
Figura 17. (A) Avaliação do estado oxidante total, (B) Avaliação da peroxidação lipídica no plasma, (C) Glutationa reduzida ... 48
Figura 18. Avaliação da peroxidação lipídica na aorta de animais CTL e AIC ... 49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais anticoncepcionais utilizados por mulheres entre 15 e 49 anos no Brasil em 2014...17 Tabela 2. Pressão arterial dos grupos CTL e AIC no início e término do tratamento...44
LISTA DE ABREVIATURAS
AC – adenilato ciclase ACh – acetilcolina
AIC – anticoncepcional injetável combinado Akt – proteína quinase B
AMPc – monofosfato cíclico de adenosina AOC – anticoncepcional oral combinado ASC – área sob a curva
AVE – acidente vascular encefálico CE50 – concentração eficaz média COX – cicloxigenase
DNA – ácido desoxirribonucleico DTNB – 5,5-dithio-bis-2-nitrobenzoico DRSP – drospirenona
E1 – estrona E2 – 17β-estradiol E3 – estriol
EDHF – fator hiperpolarizante derivado do endotélio EE – etinilestradiol
EGFR – receptor do fator de crescimento epitelial EN – enantato de noretisterona
eNOS – óxido nítrico sintase endotelial EOT – estado oxidante total
ER – receptor de estrogênio
ERK – quinase controlada por sinal extracelular ET-1 – endotelina 1
FDA – Food and Drug Administration FSH – hormônio folículo estimulante GCs – guanilato ciclase solúvel
GMPc – monofosfato cíclico de guanosina GnRH – hormônio liberador de gonadotrofina GPx – glutationa peroxidase
GSH – glutationa reduzida LH – hormônio luteinizante LNG – levonorgestrel
MAPK – proteína quinase ativada por mitogênio MDA – malondialdeído
MLV – músculo liso vascular
MPA – acetato de medroxiprogesterona
NADPH oxidase - dinucleotídeo adenina nicotinamida fosfato oxidase NET – noretisterona
NO – óxido nítrico O2- – ânion superóxido P4 – progesterona
PAD – pressão arterial diastólica PAM – pressão arterial média PAS – pressão arterial sistólica PBS – tampão salina-fosfato PI3K – fosfatidilinositol-3-quinase PGH2 – prostaglandina H2
PGI2 – prostacilcina Phe – fenilefrina
PKC – proteína quinase C PR – receptor de progestogênio ROS – espécies reativas de oxigênio SOD – superóxido dismutase
TBARS – substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TXA2 – tromboxano A2
VE – valerato de estradiol
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 15
1.1 HORMÔNIOS SEXUAIS FEMININOS ... 15
1.2 ANTICONCEPCIONAIS HORMONAIS ... 16
1.2.1 ANTICONCEPCIONAIS HORMONAIS INJETÁVEIS ... 19
1.3 MORFOLOGIA E REGULAÇÃO DO TÔNUS VASCULAR ... 21
1.4 IMPORTÂNCIA DO BALANÇO REDOX PARA A FUNÇÃO ENDOTELIAL ... 23
1.5 EFEITOS VASCULARES DOS HORMÔNIOS SEXUAIS FEMININOS ... 24
1.6 RISCOS CARDIOVASCULARES ASSOCIADOS AO USO DE ANTICONCEPCIONAIS HORMONAIS COMBINADOS ... 29
2. JUSTIFICATIVA ... 32
3. OBJETIVO...32
3.1 OBJETIVO GERAL ... 33
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 33
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 34
4.1 GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 34
4.2 AVALIAÇÃO INDIRETA DA AÇÃO HORMONAL ... 34
4.3 CONSUMO DE RAÇÃO E PESO CORPORAL ... 35
4.4 MEDIDA NÃO INVASIVA DA PRESSÃO ARTERIAL ... 35
4.5 AVALIAÇÃO DA REATIVIDADE VASCULAR ... 36
4.6 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DA AORTA ... 36
4.7 MEDIDA DO ESTADO OXIDANTE TOTAL NO PLASMA (EOT) ... 37
4.8 MEDIDA DA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA NO PLASMA ... 38
4.9 MEDIDA DA GLUTATIONA REDUZIDA NO SANGUE TOTAL ... 38
4.10 MEDIDA DA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA NA AORTA ... 39
4.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS ... 39
5. RESULTADOS ... 40
5.1 AVALIAÇÃO INDIRETA DA AÇÃO HORMONAL ... 40
5.2 CONSUMO DE RAÇÃO E PESO CORPORAL ... 43
5.3 MEDIDA NÃO INVASIVA DA PRESSÃO ARTERIAL ... 44
5.4 AVALIAÇÃO DA REATIVIDADE VASCULAR ... 45
5.5 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DA AORTA ... 46
5.6 MEDIDA DO ESTADO OXIDANTE TOTAL E PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA NO PLASMA E GLUTATIONA REDUZIDA NO SANGUE TOTAL ... 48
5.7 MEDIDA DA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA NA AORTA ... 49
6. DISCUSSÃO ... 51
6.1 AVALIAÇÃO DA AÇÃO HORMONAL ... 51
6.2 CONSUMO DE RAÇÃO E PESO CORPORAL ... 52
6.3 AVALIAÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL ... 53
6.4 AVALIAÇÃO DA REATIVIDADE VASCULAR ... 54
6.5 AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA E MORFOMETRIA DA AORTA ... 55
6.6 AVALIAÇÃO DO ESTADO REDOX NO SANGUE E NA AORTA ... 56
7. CONCLUSÃO ... 59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 60
ANEXO A – CÁLCULO ALOMÉTRICO E ESCOLHA DAS DOSES E FREQUÊNCIA DE ADMINISTRAÇÃO ... 73
ANEXO B – CARTA DE APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA) ... 76
1. INTRODUÇÃO
1.1 Hormônios sexuais femininos
Os estrogênios e progestogênios são hormônios endógenos femininos que, dentre as várias funções fisiológicas, são responsáveis principalmente pelo ciclo reprodutivo da mulher. A produção desses hormônios ocorre através da liberação pulsátil do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) produzido pelo hipotálamo.
O GnRH atua sobre a hipófise, desencadeando a liberação dos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), que atuam sobre os ovários, resultando na produção de estrogênio e progestogênio (Brunton et al., 2012).
Dentre os estrogênios naturais, podemos citar o 17 β-estradiol (E2) (Figura 1), o estriol (E3) e a estrona (E1), sendo todos derivados direta ou indiretamente da testosterona ou androstenediona através da ação da enzima aromatase (Meadows, 2018). O E2 é o mais potente, sendo produzido majoritariamente pelos ovários na fase proliferativa em mulheres no período fértil (Kumar et al., 2018). Já em mulheres pós-menopausa, E1 é a forma circulante mais encontrada, produzida a partir da desidroepiandrosterona secretada pelas glândulas adrenais (Morselli et al., 2017).
Figura 1. Estrutura química do 17β-estradiol (adaptado de Drug Bank, 2018).
A progesterona (P4) (Figura 2) é o progestogênio de ocorrência natural, derivado do colesterol, produzido em maior quantidade pelos ovários na fase lútea, e pela placenta durante a gravidez (Del Rio et al., 2018). Diferentemente das formas sintéticas, a P4 natural não possui afinidade por vários receptores esteroides, apenas pelos receptores de P4 e de glicocorticoide (Schindler et al., 2003; Vigo et al., 2011).
Figura 2. Estrutura química da progesterona (adaptado de Drug Bank, 2018).
O E2 e a P4, além de influenciarem no desenvolvimento das características sexuais femininas e na regulação neuroendócrina do ciclo menstrual, destacam-se também por suas ações sobre o sistema cardiovascular (Orshal & Khalil, 2004), sistema nervoso central (Morselli et al., 2017), além de influenciar o metabolismo mineral (Riggs et al., 2002) e de macronutrientes como carboidratos, lipídeos e proteínas (Shahnazi et al., 2016).
1.2 Anticoncepcionais hormonais
Os hormônios femininos, além de suas funções fisiológicas, possuem importante papel em formulações farmacêuticas, sendo amplamente utilizados a mais de 40 anos como contraceptivo e na terapia de reposição hormonal em mulheres no período da menopausa (Silveira et al., 2014; L’hermite, 2017). Os estrogênios e progestogênios também são indicados para o tratamento da endometriose, alterações no fluxo menstrual, sangramentos anormais, acne, hirsutismo (WHO, 2015) e síndrome do ovário policístico (Wei et al., 2017), além de diminuírem o risco de câncer de ovário e endométrio (Silveira et al., 2014).
Os anticoncepcionais hormonais são divididos em dois tipos: os combinados, que contém um estrogênio e um progestogênio, e os isolados, que contém somente progestogênio (Poli et al., 2009). As formas farmacêuticas de anticoncepcionais hormonais disponíveis no mercado são a oral, injetável, adesivo transdérmico e anel vaginal, sendo todas essas formas combinadas, além do implante subdérmico e dispositivo intrauterino (DIU) que são formas isoladas (Brito et al., 2011).
Adicionalmente, as formas oral e injetável também podem se apresentar na forma isolada (WHO, 2015).
Independente de qual seja a apresentação ou forma farmacêutica, todos os anticoncepcionais hormonais têm como objetivo principal evitar a gravidez, promovendo um controle da fertilidade pela mulher. Atuam basicamente inibindo a ovulação, espessando do muco cervical, alterando a receptividade endometrial, suprimem a ação dos hormônios folículo-estimulante e luteinizante e diminuem o peristaltismo das tubas uterinas (WHO, 2011; Pereira & Taquette, 2005).
Atualmente estima-se que cerca de 140 milhões de mulheres ao redor do mundo façam uso de algum método contraceptivo (Mørch et al., 2017), sendo que dentre os métodos mais utilizados o uso de injetáveis ocupa o quinto lugar, compreendendo 5% da população feminina mundial (ONU, 2015). No Brasil, cerca de 33% das mulheres em idade fértil também fazem uso de anticoncepcionais orais ou injetáveis para fins de contracepção, sendo que aproximadamente 72% delas fazem uso do anticoncepcional oral combinado (AOC) ou isolado e quase 13%
utilizam o anticoncepcional injetável combinado (AIC) (Farias et al., 2016). Fatores como a facilidade de uso e eficácia comprovada dos AOCs tornam estes a forma farmacêutica mais utilizada (Briggs et al., 2016).
Tabela 1. Principais anticoncepcionais utilizados por mulheres entre 15 e 49 anos no Brasil em 2014.
Principais anticoncepcionais % de uso
Oral combinado 71, 6
Etinilestradiol + levonorgestrel b, a 38,7
Etinilestradiol + ciproterona b 9,2
Etinilestradiol + gestodeno b 8,1
Etinilestradiol + drospirenona b 5,8
Etinilestradiol + levonorgestrel m 3,5
Etinilestradiol + gestodeno u 3,2
Etinilestradiol + desogestrel b 2,6
Oral combinado bi ou trifásico 3,2
Valerato de estradiol + dienogest 0,8
Oral isolado 5,0
Desogestrel 3,3
Acetato de noretisterona a 1,6
Injetável 12,6
Valerato de estradiol + enantato de noretisterona a 4,4
Acetato de medroxiprogesterona a 2,9
Não identificado 7,6
b= baixa dosagem; m= média e alta dosagem; u= ultrabaixa dosagem; a= medicamento disponível pelo SUS, conforme lista do RENAME (Adaptado de Farias et al., 2016).
Os derivados hormonais mais utilizados nos anticoncepcionais são sintéticos, sendo o etinilestradiol (EE) o derivado estrogênico mais utilizado na forma oral, embora haja outro pouco presente: o mestranol, um pró-fármaco que após metabolização hepática é convertido a EE (Poli et al., 2009). Na forma injetável, o derivado estrogênico mais utilizado é o E2, que hoje também vem sendo utilizado em formulações orais (Briggs et al., 2016). Em relação aos progestogênios há vários derivados disponíveis, sendo classificados de acordo com o composto de origem (17α-hidroxiprogesterona, 19-nortestosterona ou espironolactona) ou por geração, podendo ser subdivididos em primeira, segunda, terceira geração ou quarta geração (Schindler et al., 2003; WHO, 2015).
Dentre os progestogênios de 1a geração destaca-se a noretisterona (ou noretindrona, como também é conhecida) e o noretinodrel, sendo esses dois exemplos derivados da 19-nortestosterona; e o acetato de medroxiprogesterona (MPA), derivado da 17α-hidroxiprogesterona (Vigo et al., 2011). Devido à atividade androgênica dessas substâncias, foram observados efeitos adversos como acne, excesso de oleosidade, náuseas, cefaleia, diminuição de HDL, inchaço, sangramento irregular e persistência de cistos ovarianos (Sitruk-Ware & Nath, 2013).
Na tentativa de reduzir os efeitos adversos, foram desenvolvidos os progestogênios de 2ª geração. O levonorgestrel (LNG) e norgestrel são alguns dos exemplares e ambos são derivados da 19-nortestosterona. Assim como os progestogênios de 1ª geração, os exemplares de 2ª geração ainda possuem alta ligação androgênica, o que ainda ocasionou efeitos adversos como alteração do perfil lipídico, tendência a desenvolver resistência insulínica, além do aumento do risco de tromboembolismo (Vigo et al., 2011; Sitruk-Ware & Nath, 2013).
Os progestogênios sintéticos da 3ª geração podem ser representados pelo gestodeno e o desogestrel, ambos derivados da 19-nortestosterona, porém com menor ação androgênica. Mesmo apresentando menor afinidade pelos receptores androgênicos, observou-se um grande aumento nos quadros de tromboembolismo quando estes hormônios foram associados ao EE, se tornando um grave efeito adverso (Vigo et al., 2011, Sitruk-Ware & Nath, 2013). Os progestogênios de 4ª geração, tendo o dienogest (derivado da 19-nortestosterona), nomesgestrol (derivado da 17α-hidroxiprogesterona) e drospirenona (DRSP) (derivado da espironolactona) como exemplares, foram desenvolvidos no intuito de diminuir os efeitos adversos promovidos pelas gerações anteriores assim como reduzir a
interação com outros receptores (Sitruk-Ware & Nath, 2013). Porém, a DRSP demonstrou um elevado risco de trombose venosa (De Bastos et al., 2014).
O desenvolvimento dos anticoncepcionais hormonais teve início em meados do século XX, quando o anticoncepcional oral combinado Enovid® (mestranol + noretinodrel) foi aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) em 1960 nos Estados Unidos da América (Calhoun, 2017). A dosagem hormonal era extremamente elevada (150 μg de mestranol e 9,85 mg de noretinodrel) (Sech &
Mishell, 2015) e pouco tempo depois foram observados casos graves de efeitos adversos como tromboembolismo, acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio, o que fez com que novas apresentações com menor dosagem hormonal fossem desenvolvidas (Baillargeon et al., 2005; Brito et al., 2011; Khader et al., 2003).
Criado no final da década de 60, mas aprovado para uso somente em 1992, o anticoncepcional injetável isolado Depo-Provera® foi lançado no mercado. Esse tipo de formulação possui apenas um progestogênio (150 mg de MPA), sendo por tanto um injetável isolado. Embora ainda seja utilizado por algumas mulheres, especialmente por aquelas que não podem fazer uso de estrogênio ou que optam por ser de uso trimestral, já que apresenta eficácia comprovada, efeitos adversos ainda são observados como sangramento uterino anormal e retenção hídrica (Haide
& Darney, 2007).
A fim de minimizar os efeitos adversos dos injetáveis isolados, surgiram os injetáveis combinados que são formas farmacêuticas compostas pelo estradiol associado a um progestogênio, ambos com menor dosagem hormonal comparado ao primeiro modelo injetável (Tiras et al., 2001). E por fim, os implantes subdérmicos, que contêm somente um progestogênio, foram incluídos no mercado na década de 90 (Manica & Nucci, 2017). Já nos anos 2000, foram colocados no mercado o anel vaginal (EE + etonogestrel) e o adesivo transdérmico (EE e norelgestromina) (Morotti et al., 2017; Cole et al., 2007).
1.2.1 Anticoncepcionais hormonais injetáveis
No Brasil temos disponíveis no mercado três AICs, sendo eles: cipionato de estradiol associado a MPA, enantato de estradiol associado a algestona acetofenido, e valerato de estradiol (VE) associado a enantato de noretisterona (EN). Os AICs, por apresentarem o estradiol em sua composição ao invés do EE presente nos
AOCs, podem apresentar menos impacto ao organismo (FEBRASGO, 2015).
Destaque especial para o AIC contendo VE (Figura 3) e EN (Figura 4), disponibilizado pelo sistema único de saúde (SUS) e que consta na relação nacional de medicamentos essenciais de 2018 (Ministério da Saúde, 2018), além de ser medicamento referência de utilização no guia dos critérios médicos de elegibilidade do uso de contraceptivos da Organização Mundial de Saúde (WHO, 2015). De acordo com o sistema nacional de auditoria do SUS, em 2005, antes mesmo do lançamento do medicamento genérico, mais de 1,5 milhão de mulheres já faziam uso do medicamento referência – o Mesigyna® (SNA, 2005).
Este AIC, que é a escolha de 4,4% das mulheres brasileiras (Farias et al., 2016) (Tabela 1), é de uso mensal e deve ser administrado por via intramuscular profunda no primeiro dia do ciclo menstrual, devendo ser administrado novamente a cada trinta dias, podendo ter uma margem de três dias para mais ou para menos (27-33 dias), independente do fluxo menstrual, sem que a eficácia seja comprometida (FEBRASGO, 2015).
Figura 3. Estrutura química do valerato de estradiol (adaptado de Drugbank, 2018).
Figura 4. Estrutura química do enantato de noretisterona (adaptado de Drugbank, 2018).
O AIC contendo EN+VE apresenta boa tolerabilidade pelas mulheres, relativa rapidez na reversibilidade na fertilidade, atuação relativamente longa (uso mensal), evita o efeito de primeira passagem, além de não influenciar na libido (Kim et al., 2017, FEBRASGO, 2015). Entre os efeitos adversos, pode ocorrer alteração do padrão menstrual que inclui menstruação irregular, prolongada ou até mesmo ausência de fluxo (amenorreia), cefaleia, vertigens, sensibilidade mamária e em poucos casos, ganho de peso (FEBRASGO, 2015; WHO, 2015).
Destaca-se que os anticoncepcionais hormonais, assim como os hormônios endógenos, apresentam importante ação no sistema cardiovascular, uma vez que os receptores de estrogênio e de progesterona estão presentes nos tecidos cardíaco e vascular (Orshal & Khalil, 2004). Estas ações podem estar relacionadas a efeitos benéficos, mas também serem responsáveis por importantes efeitos adversos relacionados ao uso dos anticoncepcionais.
1.3 Morfologia e regulação do tônus vascular
O tônus vascular, definido como o grau de contração do músculo liso vascular, é essencial para manutenção da pressão arterial e da perfusão tecidual. As células endoteliais e as células musculares lisas vasculares têm papel central na regulação do tônus vascular, onde a contração e o relaxamento vascular são controlados por diferentes mecanismos que modulam a concentração intracelular de Ca2+ (Brozovich et al., 2016). Desta forma, para a manutenção da estrutura e função contrátil vascular, os vasos são compostos por diferentes camadas denominadas
túnicas íntima, média e adventícia (Figura 5) (Junqueira & Carneiro, 2017).
A túnica íntima é composta por uma camada única de células endoteliais que recobre todos os vasos, e uma camada subendotelial composta de tecido conjuntivo frouxo. Essa túnica se estende desde as grandes artérias até os pequenos vasos como os capilares, estando próxima ao lúmen dos vasos, em contato direto com a circulação sanguínea. Em artérias, há uma lâmina elástica entre a íntima e a camada adjacente composta por elastina e possuindo fenestras, o que favorece a nutrição celular (Junqueira & Carneiro, 2017).
A túnica média é composta por células musculares lisas e é a principal responsável pela estabilidade, contração e relaxamento dos vasos sanguíneos.
Possui uma matriz extracelular rica em fibras elásticas (responsável pela elasticidade), colágeno tipo III (responsável pela resistência à tração) e proteínas (Junqueira & Carneiro, 2017).
A túnica adventícia é a mais externa e possui terminações nervosas, células adiposas e elementos conectivos como fibroblastos e colágeno tipo I, permitindo que haja aderência aos órgãos circundantes. Esta camada permite remodelamento, infiltração celular e comunicação entre o tecido adjacente e o vaso. Grandes vasos possuem ainda o que é denominado de vasa vasorum (vasos dos vasos) que são capilares e vênulas que se ramificam através da adventícia e média, a fim de prover nutrientes (Junqueira & Carneiro, 2017).
Figura 5. Esquema histológico da parede arterial (adaptado de Zhao et al., 2015).
Célula endotelial Célula muscular lisa Célula do tecido adiposo Fibroblasto
Fibra colágena Terminação nervosa Lúmen
Túnica íntima
Túnica média
Túnica adventícia
A presença do endotélio vascular íntegro é essencial para a manutenção do tônus vascular, uma vez que este libera diferentes fatores vasodilatadores e vasoconstritores (Godo & Shimokawa, 2017). O relaxamento vascular dependente de endotélio é mediado pelo fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF), prostaciclina (PGI2) e óxido nítrico (NO), os quais, por diferentes mecanismos, levam à redução da concentração intracelular de Ca2+ no músculo liso vascular (MLV) (He, 2005).
O NO, assim como a PGI2, também desempenha importante papel na proteção vascular, uma vez que inibe a agregação plaquetária e a adesão celular e possui efeito antiproliferativo, protegendo assim os vasos de lesões que possam levar a disfunção endotelial e ao desenvolvimento de aterosclerose (Förstermann &
Sessa, 2012; Zhao et al., 2015).
Entre os fatores vasoconstritores derivados do endotélio destacam-se prostaglandina H2 (PGH2), tromboxano A2 (TXA2) e endotelina-1 (ET-1). A ET-1 é o mais potente vasoconstritor derivado do endotélio e promove a contração vascular ao ativar os receptores ET-A e ET-B presentes no MLV. A ativação da via Rho/Rho quinase promove a inibição da via fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K)/proteína quinase B (Akt), com consequente menor produção de NO. Adicionalmente, a ativação da proteína quinase C (PKC) leva ao aumento de Ca2+ intracelular (Rameshrad et al., 2016; Silva & Zanesco, 2010).
1.4 Importância do balanço redox para a função endotelial
A disfunção endotelial, condição onde a vasodilatação dependente do endotélio está comprometida, está associada a eventos cardiovasculares, sendo reconhecida como o evento inicial no desenvolvimento da aterosclerose e da hipertensão arterial (Gimbrone & García-Cardeña, 2016; Tousoulis et al., 2015).
Neste contexto, o balanço redox tem papel essencial na fisiopatologia da disfunção endotelial, uma vez que o estresse oxidativo leva a diminuição da biosdiposnibilidade do NO e ao desacoplamento da NO sintase endotelial (eNOS) (Farah et al., 2018).
As espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas produzidas em pequenas quantidades pelo organismo em condições fisiológicas pelas mitocôndrias na cadeia respiratória, e por enzimas como dinucleotídeo adenina nicotinamida
fosfato oxidase (NADPH oxidase), xantina oxidase, mieloperoxidase, lipoxigenase e ciclooxigenase (COX). Em condições patológicas ou por exposição a agentes externos como a radiação ultravioleta, essa produção se encontra aumentada (Erel, 2005; Silva et al., 2011).
As ROS são neutralizadas por vias enzimáticas, que incluem enzimas como a superóxido dismutase (SOD), catalase e glutationa peroxidase (GPx), e não enzimáticas, devido à ação de substâncias antioxidantes como as vitaminas A (retinol), C (ácido ascórbico), E (α-tocoferol) e a glutationa reduzida (GSH) (Barbosa et al., 2010; Groote et al., 2009).
Em condições onde há o desbalanço entre a produção e a eliminação das ROS estabelece-se o quadro de estresse oxidativo, um processo que promove a peroxidação de proteínas, ácido desoxirribonucleico (DNA) e também a peroxidação de lipídeos (Valko et al., 2007). Um dos produtos finais da peroxidação dos ácidos graxos presentes nas membranas celulares é o malondialdeído (MDA), considerado um biomarcardor de risco cardiovascular (Ho et al., 2013). O estresse oxidativo está relacionado ao envelhecimento e a patogênese das doenças cardiovasculares (Barbosa et al., 2010), e fatores de risco como diabetes, hipertensão arterial e hipercolesterolemia estão associados ao aumento de ROS (Li et al., 2014).
O aumento de ROS no tecido vascular, gerados principalmente pelas NADPH oxidades (Li & Pagano, 2017), reduzem a biodisponibilidade de NO, o qual reage com o ânion superóxido (O2-
) formando peroxinitrito. Este leva à nitração de proteínas e pode provocar a morte das células endoteliais (Incalza et al., 2018).
Além disso, o desacoplamento da eNOS gerado pela oxidação do seu cofator BH4 leva à produção de O2-
ao invés de NO, amplificando o estresse oxidativo e, portanto, a disfunção endotelial (Farah et al., 2018).
1.5 Efeitos vasculares dos hormônios sexuais femininos
O tecido vascular é um importante alvo do E2 e P4. Os efeitos vasculares dos estrogênios são mediados pela ativação dos receptores de estrogênio (ER), que incluem os receptores nucleares ER e ERβ, e o mais recentemente descoberto receptor de estrogênio acoplado à proteína G - GPER (Prossnitz & Arterburn, 2015).
Tanto as células endoteliais quanto o MLV expressam esses receptores, permitindo ao estrogênio exercer efeitos rápidos (efeitos não genômicos) e a longo prazo
(efeitos genômicos), que contribuem para manutenção da função vascular (Prossnitz
& Arterburn, 2015; Thomas & Dong, 2006; Edwards, 2005).
Os efeitos genômicos ocorrem quando há a ligação do estrogênio aos receptores localizados no núcleo e alguns poucos no citoplasma, favorecendo a transcrição gênica de fatores que regulam a proliferação das células endoteliais e do MLV, assim como a regulação da expressão da eNOS (Orshal & Khalil, 2004). Os efeitos não genômicos são desencadeados predominantemente pelo receptor ERα presente na membrana, em domínios de membrana denominadas cavéolas (Wu et al., 2011), embora recentemente foi demonstrado que o receptor GPER pode sozinho mediar uma substancial ativação da eNOS (Fredette et al., 2018).
Quando ativados pelo estrogênio, os receptores de membrana ERα estimulam a vasodilatação através da sinalização rápida via PI3K / Akt e proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK), além do aumento intracelular de Ca+2, que culmina na ativação da eNOS e consequente produção de NO (Prossnitz & Arterburn, 2015).
O ERα também favorece a ação da COX, resultando na produção de PGI2, e consequentemente na ativação da adenilato ciclase. Esta ativação promove o aumento de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) intracelular e resulta no relaxamento do MLV. A vasodilatação também pode ocorrer pela ativação do EDHF via ERα. Esse fator promove a hiperpolarização do MLV por ativar canais de K+ (Cahill & Redmond, 2016) (Figura 6).
O GPER, presente na membrana endotelial, também promove a vasodilatação uma vez que sua ativação é capaz de fosforilar a eNOS e consequentemente produzir NO que irá atuar no MLV adjacente. O NO atua sobre a guanilato ciclase solúvel (GCs) e resulta no relaxamento do vaso. Para tal processo, há ativação de várias vias como proteína tirosina quinase proto oncogene (c-Src), transativação do fator de crescimento epitelial (EGFR), via quinase controlada por sinal extracelular (ERK) e PI3K / Akt (Fredette et al., 2018).
Figura 6. Mecanismo de relaxamento por ação estrogênica. Na via genômica, o estrogênio se liga aos receptores de estrogênio (ER) localizados no citoplasma ou no núcleo culminando na ativação da MAPK, influenciando na transcrição gênica, proliferação celular e síntese da eNOS. Na via não genômica, o estrogênio se liga ao ER presente na membrana do endotélio, favorecendo um aumento do nível intracelular de Ca2+ a partir do retículo endoplasmático, além de ativar vias PI3K/Akt e MAPK, culminando na ativação da eNOS e consequente produção de NO. Este se difunde para célula muscular lisa e ativa a guanilato ciclase solúvel, aumentando os níveis de cGMP e diminuindo assim os níveis de Ca2+, favorecendo o relaxamento. Há também ação inibitória sobre NADPH, de forma a impedir a formação de peroxinitritos (ONOO-); assim como a ativação de COX, aumentando a produção de PGI2, que ativa a AC e forma cAMP, o que resulta em relaxamento vascular.
Adicionalmente, a via não genômica pode promover aumento da produção de EDHF, que ativa canais de K+ e resulta em hiperpolarização celular e redução do influxo de Ca2+. Ativação: , Inibição: - - -> L-arg, L-arginina; L-cit, L-citrulina; AA, ácido araquidônico (adaptado de Orshal & Khalil, 2004).
A P4 também apresenta papel importante na proteção cardiovascular, atuando sobre receptores de progestogênio nucleares (nPR), também sobre os receptores de membrana (mPR α, β, γ, δ, e ε) (Pang et al., 2015) e PGRMC (Kowalik et al., 2013). Porém, a relação protetora vascular assim como ação sobre o tônus vascular, está intimamente ligada à via não genômica, por meio da ativação dos receptores mPR, em especial o mPR α (Pang & Thomas, 2017), uma vez que a via genômica está relacionada com ativação dos receptores nPR e promovem a
Célula endotelial
Célula muscular lisa
Genômica Não genômica
Núcleo
Núcleo
Miofilamentos
expressão de proteínas ao interagir com os elementos responsivos ao hormônio no núcleo (Kowalik et al., 2013).
Quando os mPR são ativados, há subsequente ativação da via de sinalização rápida via PI3K/Akt e MAPK que favorecem a ativação da eNOS e culminam com a produção de NO, que promove o efeito de vasodilatação. Alguns estudos ainda relacionam que a progesterona possui efeito modulador sobre canais de Ca+2 além de atuar por meio da ativação da PKC, de forma a desencadear os efeitos não genômicos (Figura 7) (Minshall et al., 2002; Selles et al., 2002; Edwards, 2005;
Kowalik et al., 2013).
Figura 7. Vias de sinalização da progesterona (P4). Via genômica: (1) P4 liga-se ao nPR e ativa a expressão do gene PGR, que regula a síntese proteica. Via não genômica: (2) P4 pode ativar o componente 1 da membrana do receptor de progesterona (PGRMC1), e eles juntos podem formar um complexo com a proteína de ligação mRNA 1 serpina (SERBP1) e ativar PKG para diminuir o nível de Ca+2 celular. (3) P4 também pode se ligar a mPR e ativar a via MAPK via AMPc. Além disso, o mPR pode estimular a PLC/ (PKC) levando a um aumento na mobilização de Ca+2 na célula (adaptado de Kowalik et al., 2013).
A vasodilatação produzida por ambos os hormônios é resultado da ação do NO sobre o MLV adjacentes ao endotélio. Em resposta a ativação da eNOS, que
utiliza de L-arginina como substrato, o NO é produzido. Sendo um gás lipofílico, ele difunde-se para o MLV ativando a GCs, favorecendo a produção de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) e ativação da PKG. A PKG ativada atua sobre o retículo sarcoplasmático, levando a uma diminuição da concentração de cálcio citosólico, tanto pelo impedimento do influxo de Ca2+ pelos canais de cálcio dependente de voltagem além da inibição da saída de Ca2+ pelos receptores IP3. Esta redução de Ca2+ intracelular dificulta a fosforilação das cadeias de miosina e dessa forma o relaxamento vascular é concluído (Förstermann & Sessa, 2012; Zhao et al., 2015).
Além dos efeitos diretos no tônus vascular, o E2 e a P4 promovem efeitos no balanço redox do organismo, impactando diretamente na função vascular (Ishihara et al., 2015). No entanto, enquanto os dois hormônios atuam de forma sinérgica na modulação da função contrátil vascular, apresentam efeitos antagônicos na modulação do balanço redox (Wassmann et al., 2005).
O E2 inibe a expressão da enzima NADPH oxidase, diminuindo assim a formação de O2-
, além de promover o aumento da expressão e da atividade da enzima SOD, tanto intracelular quanto extracelular, o que favorece a neutralização das ROS. Além disso, o E2 promove o aumento da atividade da GPx e dos níveis de GSH (Orshal & Khalil, 2004; Groote et al., 2009; Bokov et al., 2009). A própria molécula do E2 favorece a inativação das ROS, pois o anel fenólico presente na estrutura do hormônio interage com os radicais livres de forma a neutralizá-los, resultando na diminuição do estresse oxidativo (Escalante et al., 2017; Unfer et al., 2014).
Por outro lado, a P4 promove a ativação da NADPH oxidase e a inibição da expressão e da atividade da SOD (Wassmann et al., 2005), favorecendo o estresse oxidativo (Itagaki et al., 2005) e o desenvolvimento da reação de peroxidação lipídica plasmática (Massart et al., 2012). A P4 ainda pode promover uma inibição da proliferação das células endoteliais, o que leva à diminuição da reparação do vaso quando exposto ao estresse oxidativo, além de inibir a síntese de GSH e diminuir a atividade da GPx (Yuan et al., 2016).
1.6 Riscos cardiovasculares associados ao uso de anticoncepcionais hormonais combinados
Apesar da ampla utilização e da eficácia contraceptiva, os anticoncepcionais hormonais combinados estão associados, de forma geral, ao aumento do risco cardiovascular. Este risco é especialmente importante para as mulheres que fumam, e/ou têm diabetes, problemas prévios ou histórico familiar de tromboembolismo, doenças cardíacas, hipertensão arterial, obesidade e hiperlipidemia, assim como mulheres acima de 40 anos. Nestes casos, os riscos e benefícios do uso do anticoncepcional hormonal combinado deve ser avaliado pelo médico (FEBRASGO, 2015; WHO, 2015).
A maior parte dos estudos relacionados às alterações cardiovasculares associadas ao uso de anticoncepcionais hormonais são realizados com os AOC, visto que estão no mercado há bastante tempo e são os mais usados pelas mulheres (WHO, 2015).
Diversos estudos comprovaram que um dos efeitos adversos na utilização de AOC é o aumento da pressão arterial (Lubianca et al., 2003; WHO, 2015; Olantunji et al., 2016). Este aumento da pressão arterial parece estar relacionado a um aumento da síntese de angiotensinogênio hepático que favorece retenção hídrica e de minerais em resposta à ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (Cagnacci, 2017). O efeito na pressão arterial está intimamente ligado à potência do estrogênio sintético utilizado nos AOC, o EE, assim como à sua dosagem, uma vez que o VE está não está associado a efeito significativo na pressão arterial (Andrade
& Lima, 2016; Cagnacci, 2017). Embora a P4 possua efeito natriurético e ação antimineralocorticóide que contribui para manutenção da pressão arterial (Oelkers, 1996), progestogênios como LNG e desogestrel utilizados em AOC além de atuarem como agonistas mineralocorticoides, favorecem o aumento dos fatores ligados ao sistema renina-angiotensina-aldosterona como a atividade da renina plasmática e angiotensina II, contribuindo para o aumento da pressão arterial (Davis et al., 2017).
Os progestogênios androgênicos, como a MPA, podem provocar aumento da pressão arterial devido à retenção de Na+ (Arias-Loza et al., 2009). No entanto, a administração oral do acetato de noretisterona associado ao E2, demonstrou não alterar ou aumentar o efeito hipotensor do estradiol (Dubey et al., 2002). Ainda, os progestogênios com ação antimineralocorticóides, como a DRSP, favorecem uma
diminuição da pressão arterial (Shufelt & Merz, 2009) tanto através da redução da retenção hídrica quanto de de Na+ (Cagnacci et al., 2013).
Os AOC provocam um estado de hipercoagulabilidade e um aumento de duas a seis vezes no risco de trombose venosa (Farmer et al., 2000; Gourdy et al., 2012;
De Bastos et al., 2014). O efeito do EE na coagulação ocorre através do aumento de trombina, fatores VIII, IX e X, e diminuição dos fatores anticoagulantes como proteína S e antitrombina (Stegeman et al., 2013; Rott, 2012; Vieira et al., 2007;
Ferreira et al., 2000; Gourdy et al., 2012). Essas alterações estão associadas ao impacto do EE sobre o fígado, uma vez que sua estrutura química favorece um metabolismo lento e uma permanência tecidual prolongada. Já a utilização do VE, provoca menor alteração hemodinâmica, uma vez que é mais rapidamente metabolizado (Sitruk-Ware, 2016).
É importante ressaltar que a alteração da coagulação varia de acordo com a androgenicidade do progestogênio associado ao EE. Quanto mais androgênico, menor o impacto sobre o sistema hemostático e menor resistência da proteína C (Brito et al., 2011). Um exemplo é a noretisterona (NET), um progestogênio com alta ação androgênica que é utilizada em AOC, que consegue modular o desequilíbrio hemostático causado pelo EE, e quando é utilizada de forma isolada ou associada ao estradiol natural, como o VE no AIC, não promove alterações no sistema de coagulação (Sitruk-Ware & Nath, 2013; Mueck et al., 2002).
A trombose está intimamente relacionada a alterações da parede vascular, onde o processo aterosclerótico e a disfunção endotelial têm papel crucial (Lizarelli et al., 2009). Assim, a utilização de AOC aumenta o risco de acidente vascular encefálico (AVE) e de infarto agudo do miocárdio (Lubianca et al., 2005; Margolis et al., 2007; WHO, 2015).
O risco de AVE está relacionado à dosagem de EE utilizada (Sech & Mishell, 2015), uma vez que este provoca o aumento de proteína C reativa, proteína amiloide A sérica e enzimas disruptivas de placas aterosclerótica, que podem aumentar o incidente da doença (Meadows, 2018). Se considerarmos os progestogênios isolados como o acetato de noretisterona por exemplo, o risco de desenvolver um AVE é baixo. (Cagacci, 2017). Essa informação é confirmada por alguns autores, que reportam que o tipo ou geração do progestogênio não promove alterações de forma a resultar no AVE (Weill et al., 2016; Nettleton & King, 2016).
Há na literatura poucos dados sobre os efeitos cardiovasculares dos AIC.
Devido às diferenças nos hormônios utilizados, não se pode transpor os efeitos cardiovasculares descritos para os AOC para os AIC, indicando a necessidade de mais estudos que possam estabelecer os riscos associados a utilização destes anticoncepcionais.
2. JUSTIFICATIVA
Atualmente, muitas mulheres fazem uso de anticoncepcionais hormonais com o objetivo principal de controlar a natalidade, seja em virtude de planejamento pessoal devido a iniciação precoce da vida sexual, ou profissional. Além disso, há vários fatores que levam a população feminina a fazer uso dos anticoncepcionais hormonais com outros objetivos que não a contracepção, como promoção do alívio das cólicas e da tensão pré-menstrual, regularização do ciclo menstrual e até mesmo como prevenção de doenças como doença inflamatória pélvica (Almeida &
Assis, 2017; FEBRASGO, 2015). No entanto, os anticoncepcionais hormonais também estão associados a efeitos adversos, como cefaleia, aumento de peso, sangramento irregular e acne (Bahamondes et al., 2011).
Embora a grande maioria das mulheres utilize o AOC, o AIC tem se mostrado um método contraceptivo alternativo à utilização dos orais, e da mesma forma que alguns AOC, os injetáveis também são disponibilizados pelo Sistema Único de Saúde (Portal Brasil, 2015). Os AIC são de utilização mensal e além de apresentar as vantagens do AOC, também incluem outros benefícios como ausência do risco do esquecimento da administração diária e eliminação do efeito de primeira passagem, uma vez que a administração é parenteral (WHO, 2015).
O AIC EN+VE é um dos anticoncepcionais injetáveis mais utilizados no Brasil (Farias et al., 2016) e contêm em sua formulação o estrogênio natural E2, que é menos potente, tem menor duração do efeito e possui metabolização mais rápida.
Sendo assim, há diferenças farmacocinéticas e farmacodinâmicas em relação aos anticoncepcionais orais, o que não nos permite assumir os mesmos riscos para ambos contraceptivos (WHO, 2015). Estudos de curta duração com AIC EN+VE mostraram menor efeito na pressão arterial, coagulação, metabolismo lipídico e função hepática quando comparado aos AOC disponíveis (Haiba et al., 1989;
Kesseru et al., 1991; Meng et al.,1990). No entanto, os efeitos vasculares e oxidantes relacionados ao uso prolongado do AIC EN+VE ainda não estão bem definidos, se fazendo importante realizar estudos que avaliem o surgimento de possíveis alterações fisiológicas.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos vasculares e no estado redox do uso prolongado do anticoncepcional injetável combinado enantato de noretisterona e valerato de estradiol em ratas Wistar.
3.2 Objetivos específicos
Verificar as alterações de peso e consumo alimentar durante o período de tratamento;
Verificar a pressão arterial durante o tratamento com anticoncepcional injetável combinado;
Investigar as alterações na reatividade vascular da aorta isolada dos animais tratados indicativas de disfunção endotelial;
Verificar os parâmetros morfológicos e morfométricos da aorta isolada dos animais tratados.
Investigar alterações no estado redox, através da medida do estado oxidante total, GSH e peroxidação lipídica, e através da medida da peroxidação lipídica na aorta.
4. MATERIAL E MÉTODOS
Para realização dos experimentos, foram utilizadas 30 ratas Wistar com idade de 9 a 10 semanas provenientes do Biotério de Reprodução de Roedores do Campus UFRJ-Macaé e mantidos no biotério do Polo Universitário. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Campus UFRJ-Macaé, sob licença MAC037 (Anexo B). Os animais foram alimentados com ração para ratos e água ad libitum e mantidos em ciclo 12/12h claro e escuro, em ambiente com condições de temperatura e umidade controladas, sendo acondicionados de 2 a 3 animais por caixa.
4.1 Grupos experimentais
Trinta animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos. No grupo controle (CTL) (n = 12) os animais foram tratados com injeções semanais intramusculares de 0,02 mL de óleo de rícino (veículo). No grupo tratado (AIC) (n = 18), os animais receberam injeções semanais intramusculares de 0,02 mL de AIC contendo 1 mg de EN e 0,1 mg VE. O cálculo da dosagem hormonal e da frequência de aplicação de AIC foram calculados por alometria, de acordo com Felippe, 2008 (Anexo A). As administrações semanais, que foram realizadas alternadamente entre as coxas direita e esquerda do animal, ocorreram em um período de 60 dias, o que corresponde ao uso durante aproximadamente cinco anos por uma mulher (Andreollo et al., 2012). Esse período de administração nos animais referenciando cinco anos de uso em humano foi considerado como uso prolongado, uma vez que a utilização de medicamentos ao longo de três meses ou mais é considerado uso crônico (ANVISA, 2013).
4.2 Avaliação indireta da ação hormonal
A avaliação indireta do efeito hormonal foi realizada mediante citologia vaginal e pesagem do útero dos animais, sendo este último, realizado após o período de tratamento e eutanásia dos animais para coleta e pesagem do tecido. Para identificar a fase do ciclo estral das ratas foi realizado esfregaço vaginal imediatamente antes e durante todo o período de administração, realizado
semanalmente para acompanhamento do status hormonal, totalizando 108 lâminas para o grupo CTL e 162 lâminas para o grupo AIC.
Para realizar o esfregaço vaginal, foi utilizada espátula embebida em solução salina. Em seguida, o instrumento foi introduzido na vagina do animal, com realização de movimento de rotação com objetivo de coletar as células do canal vaginal. O material coletado foi então aplicado em lâminas para microscopia e posteriormente fixado em álcool 95%. Para visualizar as células, as lâminas foram coradas pelo método Papanicolaou e analisadas em microscópio óptico para determinação da fase do ciclo estral.
4.3 Consumo de ração e peso corporal
Os animais de ambos os grupos (AIC e CTL) tiveram o consumo alimentar e peso corporal acompanhados desde o início até o fim do tratamento, sendo este último realizado semanalmente antes das administrações semanais do AIC. Para mensurar o consumo alimentar, a ração dos animais era pesada duas vezes na semana e realizado o seguinte cálculo:
Consumo alimentar: Quantidade inicial de ração (g) - Quantidade final de ração (g) (no animais x quantidade de dias)
4.4 Medida não invasiva da pressão arterial
A pressão arterial dos animais foi verificada uma vez por semana antes das administrações e ao longo de todo o tratamento através do método não invasivo utilizando o equipamento pletismógrafo de cauda (LE5001; Panlab). Os animais foram aclimatizados previamente no recipiente de contenção por aproximadamente 15 minutos na temperatura de 30-32º C, conforme manual do fabricante, a fim de promover vasodilatação e possibilitar a medida da pressão arterial dos animais.
Após o tempo determinado, foram realizadas medidas da pressão sistólica, diastólica e pressão arterial média, cujos valores foram fornecidos pelo equipamento em mmHg.
4.5 Avaliação da reatividade vascular
A avaliação da reatividade vascular foi realizada após os 60 dias de tratamento, onde a porção torácica da artéria aorta das ratas dos grupos experimentais foram coletadas após eutanásia. Os animais CTL foram eutanasiados na fase proestro ou metaestro do ciclo estral. As aortas foram então dissecadas e limpas, e seccionadas em anéis de 2-3 milímetros para registro de tensão isométrica. Os anéis de aorta foram colocados em cubas contendo 10 mL de solução de Krebs-Henseilet (em mM: NaCl 118; KCl 4,7; KH2PO4 1,2; MgSO4 1,2;
CaCl2 2,5; NaHCO3 25; C6H12O6 11, pH 7,4) constantemente oxigenada com mistura carbogênica (95% O2 / 5% CO2) e sob temperatura controlada em 37,0 ± 0,5º C.
Cada anel foi fixado em haste experimental, sendo uma das extremidades conectada a um transdutor de tensão isométrica (MLT0201; ADInstruments), e estabilizados previamente durante 90 minutos, com troca da solução a cada 20 minutos sob tensão de 1 g. Os sinais emitidos foram digitalizados (Power Lab 4/30;
ADInstruments) e armazenados para análise utilizando o programa LabChart Pro (ADInstruments). Foram realizadas curvas de concentração-resposta primeiramente para fenilefrina (Phe; 10-9 a 10-5 M) e posteriormente para acetilcolina (ACh; 10-9 a 10-5 M), com o objetivo de verificar a presença de disfunção endotelial (Raimundo et al., 2006).
4.6 Avaliação morfológica e morfométrica da aorta
Após a eutanásia, a aorta dos animais de ambos grupos foi coletada, seccionada em anéis de aproximadamente 4mm e em seguida fixada em formol de Carson 10% (10% de formaldeído na concentração de 37%; 1,5% de álcool metílico e tampão salina-fosfato (PBS), pH 7,4) por 48h. Em sequência, o tecido foi processado com soluções de álcool etílico nas concentrações de 70% por 24 horas, 80% por 15 minutos, 90% por 30 minutos, 100%, sendo este último três repetições de 20 minutos. Em seguida, imerso em solução de álcool etílico 100% e xilol (proporção 1:1) por 8 minutos e por fim em xilol, três repetições de 15 minutos. Para emblocar, foi realizado previamente três banhos de parafina (Biotec®) por 20 minutos e ao final, inclusão de parafina para confecção dos blocos, que foram cortados a 5 μm com auxílio de micrótomo. As lâminas resultantes foram coradas com
hematoxilina e eosina (HE). Para a análise morfométrica, as imagens das lâminas histológicas obtidas foram fotografadas com microscópio Olympus (Olympus DP71, Olympus Optical) acoplado ao sistema de captura de imagens (Olympus BX51, Olympus Optical do Brasil) em aumento final de 200x. Foram obtidas 16 fotos por animal e sobre cada fotografia, realizadas 5 medidas da espessura das túnicas íntima e média associadas (Zaki & Youssef, 2013), e da túnica adventícia, utilizando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html), conforme representação abaixo (Figura 8). Ao final, obtivemos também a espessura total das aortas de ambos grupos.
(A) (B)
Figura 8. Esquema da morfometria da aorta. Medição das túnicas da aorta dos animais utilizando o programa Image J, sendo em (A), medida da túnica adventícia e em (B), medida das túnicas média e íntima associadas.
4.7 Medida do estado oxidante total no plasma (EOT)
Ao final do tratamento, os animais foram anestesiados com isoflurano para coleta de sangue em tubo heparinizado (diluição 1:1000) através de punção cardíaca. Para determinar o EOT, seguimos protocolo de análise conforme Erel (2005), que se baseia em método colorimétrico onde é observada a ação de sustâncias oxidantes na amostra capaz de promover a oxidação do complexo íon-o- dianisidina ferroso em íon férrico em meio ácido. Em microplaca de 96 poços foi adicionado 35 μL da amostra, seguido de 225 μL do reagente 1 (laranja de xilenol 150 μM, NaCl 140 mM e glicerol 1,35 M a um pH 1,75, em solução H2SO4 25 mM) e realizada leitura em 560/800 nm. Sequencialmente foi adicionado 11 μL do reagente 2 (sulfato de amônio e ferro 5 mM e dicloridrato de o-dianisidina 10 mM, em solução
H2SO4 25 mM) e efetuado novas leituras em período de aproximadamente 5 minutos. O íon férrico forma um complexo colorido com laranja de xilenol presente no reagente 1 em meio ácido e a intensidade da cor foi medida em leitor de microplaca (Biochrom Asys UVM 340), sendo os valores encontrados expressos em equivalente de peróxido de hidrogênio por miligrama de proteína.
4.8 Medida da peroxidação lipídica no plasma
A medida da peroxidação lipídica foi realizada pela determinação de MDA.
Para a análise, realizamos um método colorimétrico, cujo ensaio se baseia detecção de um cromóforo formado a partir da união do MDA com o ácido 2-tiobarbitúrico (reagente cromogênico). Uma molécula de MDA reage com duas moléculas do reagente cromogênico e o cromóforo resultante possui absorbância máxima em 532nm. Os valores encontrados são reportados picomol de MDA por miligrama de proteína.
Em eppendorf foi adicionado 50 μL de amostra, 50 μL de água destilada e 100 μL de solução indicadora (1g de ácido 2-tiobarbitúrico, 1 mL de ácido acético e 9 mL de dimetilsulfóxido). Em seguida, os tubos foram aquecidos em banho-maria à 70º C por trinta minutos, e após resfriamento a amostra foi transferida para microplaca de 96 poços de cor preta e realizada leitura em espectrofotômetro de fluorescência (SpectraMax i3, Molecular Devices) em 532/585 nm. Para realizar a calibração, foi preparada uma curva padrão a partir de solução de MDA 20 nM e solução indicadora (adaptado de Oxford Biomedical Research, 2012).
4.9 Medida da glutationa reduzida no sangue total
A glutationa reduzida possui grupo tiol em sua estrutura, que quando em contato com ácido 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic) (também conhecido como reagente de Ellman ou DTNB) promove a clivagem da ponte sulfeto do reagente, formando o ácido 2-nitro-5-mercapto-benzóico (TNB) de coloração amarela.
Amostra de sangue total foi utilizada para realizar a determinação de GSH.
Em 500μL de sangue total foi adicionado 40 μL de ácido tricloroacético 10% e centrifugado por 10 minutos a 4º C. O sobrenadante foi então coletado. Em placa de 96 poços, foi adicionado 20 μL do sobrenadante; 200 μL de tampão fosfato pH 8,0 e 20 μL de DTNB. A leitura foi realizada em espectrofotômetro (Biochrom Asys UVM
