Universidade Federal do Pará Centro de Ciências Biológicas Departamento de Fisiologia Laboratório de Neuroquímica Molecular e Celular

Universidade Federal do Pará Centro de Ciências Biológicas Departamento de Fisiologia

Laboratório de Neuroquímica Molecular e Celular

Mecanismo de Toxicidade Induzido pelo Metilmercurio e Regulação do Sistema Nitrérgico em Culturas Celulares de

Retina

Anderson Manoel Herculano Oliveira da Silva

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Universidade Federal do Pará Centro de Ciências Biológicas Departamento de Fisiologia

Laboratório de Neuroquímica Molecular e Celular

Mecanismo de Toxicidade Induzido pelo Metilmercurio e Regulação do Sistema Nitrérgico em Culturas Celulares de

Retina

Tese de Doutorado Apresentada ao Programa de Pós Grauduação em Neurociências E Biologia Celular da Universidade Federal do Pará para Obtenção do Título de Doutor em Neurociências e Biologia Celular

Belém/2006

REUMO

O sistema visual representa um importante alvo da intoxicação mercurial. Neste contexto, o presente trabalho objetivou avaliar o efeito do mercúrio no sistema de neutransmissão glutamatérgica utilizando como modelo experimental culturas de retina de embrião de galinha. Nossos resultados demonstraram que a exposição a diferentes concentrações de MeHg induz uma diminuição da viabilidade celular de uma forma dependente da concentração e de tempo de exposição. Nossos dados também demonstraram que o MeHg promove diminuição da captação de [³H]-Glutamato e [³S]- Cisteína nas culturas expostas, assim como, diminuição dos níveis intracelulares de GSH. O bloqueio da toxicidade mercurial observado na presença de antagonistas glutamatérgicos do tipo NMDA, inibidores da atividade da NOS e precursores da síntese de GSH, demonstrou que a ativação via glutamato somado ao estresse oxidativo representam o principal mecanismo de toxicidade induzida pelo MeHg nas células da retina. Neste trabalho também avaliamos a regulação ad atividade da NOS ao longo do desenvolvimento in vitro, nossos dados demonstraram que a atividade da NOS aumenta gradativamente com evolução das culturas. Nossos dados demonstraram que no período C2 glutamato e NGF, mas não seu substrato, L- arginina, são capazes de elevar sigficativamente a atividade da NOS. Avaliamos a captação de L-arginina e observamos uma baixa atividade em C2, o tratamento com NGF induziu um aumento da captação de L-arginina, da mesma forma que o anti-NGF bloqueia esta captação em C2. Desta forma nosso trabalho sugere que a homeostasia do sistema nitrergico é regulada por NGF nos primeiros períodos do desenvolvimento retiniano.

ABSTRACT

Methylmercury (MeHg) is a potent environmental pollutant that affects the central nervous system and provokes serious damage in the visual system. The mechanisms of citotoxicity induced by MeHg in the retinal cells still remains unclear. Thus, the aim of this work was to evaluate the role of ionotropic glutamatergic receptors and nitrergic activation on the neurotoxicity induced by MeHg in retinal cell cultures. Decrease of viable cells in a time and concentration-dependent manner by MeHg exposure was detected. NOS activity monitoring revealed an increase with 4 and 6 hours of MeHg intoxication. NMDA-type receptor antagonist, MK-801, and the nitric oxide synthase (NOS) inhibitor, L-nitro-arginine was able to prevent partially the cellular death provoked by 4h of MeHg exposure. These results support that MeHg toxicity in retina is mediated by NMDA-type glutamate receptor and NOS activation.

INTRODUÇÃO:

Ao longo do processo evolutivo, o sistema visual apresentou-se como uma das mais importantes aquisições adaptativas para a manutenção de uma espécie em diferentes nichos ecológicos. Este sistema é responsável pela captação, transformação e processamento dos estímulos luminosos provenientes do meio, sendo a retina o seu primeiro nível de processamento. A retina caracteriza-se como uma fina camada de tecido nervoso localizado no interior do globo ocular, a partir da qual a informação visual é transmitida do nervo óptico para os núcleos mesencefálicos e talâmicos, cujos neurônios transmitem a informação ao córtex visual, onde ocorre o último nível de processamento desta informação (Ramón y Cajal, 1892).

Nos vertebrados em geral, a retina apresenta uma citoarquitetura laminar formada por cinco camadas, três de corpos celulares e duas de neurópila ou conexões.

Nas camadas de corpos celulares, podemos destacar: a camada nuclear externa (CNE), a qual contém os corpos celulares dos fotorreceptores (cones e bastonetes); a camada nuclear interna (CNI), com os corpos celulares das células bipolares, horizontais, amácrinas e a camada de células ganglionares (CCG), contendo os corpos celulares das células ganglionares. As camadas de neurópila ou de conexões, são constituídas pelas camadas plexiforme externa (CPE) e interna (CPI). Na primeira observamos conexões entre os terminais sinápticos dos fotorreceptores e células bipolares e horizontais e na segunda são formadas conexões entre as células bipolares, amácrinas e as células ganglionares (Ramón y Cajal, 1892) (Figura 1).

Figura 1. Diagrama esquemático da retina de vertebrados, mostrando a estrutura laminar da retina e seus elementos celulares. (CC) Camada Coroidal; (EP) Epitélio Pigmentar; (SE) Camada de Segmentos Externos; (SI) Camada de Segmentos Internos;

(MLE) Membrana Limitante Externa; (CNE) Camada Nnuclear Externa; (CPE) Camada Plexiforme Externa; (CNI) Camada Nuclear Interna; (CPI) Camada Plexiforme Interna; (CCG) Camada de Células Ganglionares; (CF) Camada de Fibras do Nervo Óptico; (MLI) Membrana Limitante Interna. (Modificado de Rodieck, 1998).

A complexa organização celular da retina, assim como a suas conexões, é resultante de refinados eventos moleculares e celulares que ocorrem no período embrionário dos vertebrados, sendo por isso, de extrema relevância os estudos direcionados aos eventos que ocorrem nos primeiros momentos de formação deste tecido, assim como o mecanismo de ação de agentes capazes de alterar ou inibir os mecanismos que regem a diferenciação retiniana (Kolb e cols, 2001).

Nos estudos relacionados à ontogenia ou toxicologia no tecido retiniano diversos modelos animais são utilizados, dentre estes o modelo aviário destaca-se pela facilidade de acompanhamento do desenvolvimento do animal, assim como pelo tamanho da estrutura ocular, a capacidade de manutenção de células retinianas por longo período em ambiente in vitro, além do baixo custo. Desta forma, neste trabalho utilizamos este modelo para avaliar os fatores que regulam a diferenciação do sistema nitrérgico durante o desenvolvimento embrionário e como a toxicidade de um reconhecido poluente ambiental, metilmercurio, interfere na diferenciação deste tecido e o papel do NO para o mecanismo de neurotoxicidade.

1.1. O DESENVOLVIMENTO DA RETINA DE AVES

Estudos sobre o desenvolvimento de aves demonstram que estes organismos apresentam períodos embrionários bem caracterizados, que varia do primeiro dia embrionário (E1) ao vigésimo primeiro dia (E21), sua organização celular é bastante semelhante à observada nos outros vertebrados, o que valida a generalização de inferências sobre os fenômenos embriogênicos que ocorrem nestes períodos (Aristotle, 1942; Hamburguer & Hamilton, 1951).

Em aves, após a caracterização do eixo rostro - caudal, observa-se a formação do tubo neural, o qual na porção anterior origina três vesículas cerebrais o

prosencéfalo (forebrain), mesencéfalo (midbrain) e rombencéfalo (hindbrain) a partir das quais desenvolver-se-ão diferentes componentes cerebrais, sendo o globo ocular originado da parte posterior do prosencéfalo, o diencéfalo (Hamburguer & Hamilton, 1951).

Ao longo do desenvolvimento embrionário de aves (E3 a E7) ocorre a invaginação da vesícula óptica primária, o que leva a formação de uma estrutura bilaminar, a vesícula óptica secundária. A retina neural desenvolve-se a partir da camada mais interna deste olho primordial, enquanto a camada mais externa que está em contato com o mesênquima, formará a esclera e a coróide, originando também o epitélio pigmentar retiniano (Hamburguer & Hamilton, 1951). Nas primeiras semanas do desenvolvimento retiniano, observamos uma intensa atividade mitótica das células tronco (stem cell) em toda a superfície retiniana, sendo esta atividade regulada por fatores mitogênicos, como o fator de crescimento transformante alfa, beta 1 e beta 3 (TGF, TGF1 e TGF3) e o fator de crescimento de epiderme ( EGF) (Reh & Levine, 1998).

A atividade mitogênica na retina começa a sofrer um progressivo processo de diminuição que se inicia na área central em E5, sendo esta diminuição mitótica propagada para a periferia. Em E8, observamos eventos mitóticos restritos à região marginal denominada ora serrata ( Kahn, 1973). Entre E7 e E8, a taxa de auto- renovação as células tronco cai para menos que 50% (Dutting e cols, 1983) e progressivamente as células deixam o período de proliferação passando à fase de diferenciação e migração que se estende até a pós-eclosão (P) do animal.

As primeiras células a sofrerem diferenciação (E3), a partir dos neuroblastos retinianos, são as células da camada ganglionar. As células neuroblásticas

ganglionares já no período E7 (Meller, 1984). Os fotorreceptores começam a sofrer diferenciação a partir de E9, tendo sua primeira resposta elétrica detectada em E13, sendo seu desenvolvimento contínuo até o período pós-natal. A resposta elétrica a estímulos luminosos ocorre entre E17 e P3 onde as células já se encontram na camada nuclear externa e suas conexões na camada plexiforme externa. Depois dos fotorreceptores iniciarem a sua diferenciação, observa-se a formação das células amácrinas, horizontais e células bipolares respectivamente. Ao longo do período compreendido entre E12 a P7, ocorre o completo estabelecimento do seu sistema de neurotransmissão e posicionamento nas respectivas camadas que formam a retina (Mey

& Thanos, 2000).

Estes fenômenos celulares e histológicos são regidos por fatores de crescimento, como o fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator neurotrófico derivado de células ciliares (CNTF), fator de crescimento neuronal (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); ácido retinóico (RA); por elementos da matriz extracelular (ECM) e moléculas de adesão celular conhecidas como N-CAM (Mey & Thanos, 2000). Neurotransmissores como glutamato (Liets & Chalupa, 2001), dopamina (Guimarães e cols, 2001) e o ácido gama aminobutírico (GABA) também participam ativamente deste processo (Huang e cols 2000).

Dentro do conjunto de neurotransmissores que modulam o desenvolvimento do sistema nervoso, o óxido nítrico (NO) tem mostrado um importante papel nos processos de diferenciação celular e histológica ao longo do desenvolvimento do sistema nervoso de vertebrados. Como no período de desenvolvimento retiniano as sinalizações retrógradas e anterógradas desempenham um importante papel na diferenciação do tecido adulto (Burek & Oppenheim, 1996), o NO por ser um gás amplamente difusível, participa ativamente nestas duas vias de sinalização, podendo

atuar como um neuromodulador ao longo do desenvolvimento do tecido (Bruning e cols, 1994; Garthwaite, 1995).

O NO é uma molécula formada a partir do aminoácido L-arginina pela ação da enzima óxido nítico sintase (NOS), sendo a atividade desta enzima dependente dos níveis de NADPH. A NOS pode apresentar-se como três isoformas nos sistemas biológicos, duas delas constitutivas e dependentes do complexo cálcio-calmodulina (NOS-1 e NOS-3) e uma expressa somente quando induzida e independente de cálcio (NOS-2) (Bredt & Snyder, 1994).

1.2. NEURÔNIOS QUE PRODUZEM NO AO LONGO DO

DESENVOLVIMENTO DA RETINA

Uma propriedade que permite a identificação de células NO-Sintase positivas é a capacidade desta enzima de reduzir sais de tetrazoliuim a um composto de cor azulada, o formazam, sendo por isso denominada genericamente de NADPH- diaforase (Thomas & Pearse, 1964). A atividade da NO-Sintase pode ser inibida utilizando análogos da L-arginina, como L-nitro-arginina (L-NARG) e L-nitro-arginina- metil-éster (L-NAME) sendo estes compostos amplamente utilizados nas análises bioquímicas e histoquímicas como controles negativos da atividade NO-Sintase (Knowles e cols, 1989).

Paes de Carvalho e cols (1996) utilizaram este método histoquímico para a identificação de neurônios NADPH-diaforase positivos e demonstraram que nos primeiros períodos embrionários (E3- E8) é visualizada uma forte marcação da camada de células ganglionares até a camada de neuroblastos retinianos. Em E12 e E14 a marcação mostrou-se mais restrita à camada de células ganglionares e na recém formada

Rios e cols (2000) demonstraram em E16 um aumento na marcação na camada de células ganglionares, sendo neste período observada uma degeneração de aproximadamente 20% das células presentes nesta camada (Hughes & McLoon, 1979).

A partir de E17 constatou-se uma forte marcação no segmento interno dos fotorreceptores, em algumas células amácrinas e nas células ganglionares, sendo este padrão mantido até o período de eclosão (Paes de Carvalho e cols, 1996).

É importante salientar que embora o óxido nítrico desempenhe um papel significativo no desenvolvimento retiniano, diversos trabalhos demonstram que elevadas concentrações deste composto podem desencadear processos de toxicidade no sistema nervoso. Desta forma a ativação nitrérgica pode ser responsável como mediador de eventos citotóxicos induzidos por agentes exógenos no tecido retiniano, o que justifica a avaliação do comportamento daquele sistema frente à exposição a xenobióticos que reconhecidamente afetam a fisiologia do sistema visual.

Dentre os compostos cuja principal ação biológica está relacionada a alterações no sistema nervoso, principalmente nas funções visuais e motoras podemos destacar o mercúrio (Hg), cujas propriedades ambientais e biológicas serão descritas a seguir.

1.3. HISTÓRICO: MERCÚRIO E O HOMEM

Levantamentos históricos demonstram que o elemento químico mercúrio (Hg) é utilizado pela espécie humana desde o ano 2.700 antes de Cristo. Neste período já era conhecido sua capacidade de conjugação com o ouro, entretanto, somente após a revolução industrial o mercúrio passou a ser utilizado como matéria prima para diversos produtos industrializados, como na fabricação de celulose, lâmpadas e produtos farmacêuticos. Esta utilização levou ao aumento gradativo do despejo deste metal nos

diversos ecossistemas, sendo estimado que devido à atividade antropogênica é liberado no ambiente cerca de 4.000 toneladas de Hg/ano (tn/ano), o que intensifica a sua concentração nos diversos biomas (Lodenius & Malm, 1998).

O mercúrio do ambiente também pode ser de origem natural como conseqüência de emissões do córtex terrestre (3.000tn/ano) e de eventuais erupções vulcânicas (36.880tn/ano), sendo que este mercúrio, assim como o de origem antropogênica, precipita-se nos ambientes de águas doces (200tn/ano) e de águas oceânicas (1.000tn/ano), o que pode levar a contaminação da fauna e da flora (Lindströn e cols, 1991).

Os problemas relacionados a ação antropogênica do mercúrio no meio ambiente, assim como a sua interação com a espécie humana, se intensificaram a partir das décadas de 50 e 60, quando foi relatada a morte de cerca de quarenta e oito pessoas da cidade de Minamata no Japão, devido a ingestão de peixes intoxicados com mercúrio. Estudos posteriores demonstraram que este metal apresenta uma intensa capacidade de acúmulo biológico e nos ecossistemas marinhos peixes podem armazenar grandes quantidades de mercúrio e promover fenômenos de intoxicação nos indivíduos que os consomem (Cossa, 1996). A introdução do mercúrio no ambiente marinho, promove o acúmulo deste metal nos diversos níveis tróficos da cadeia alimentar, onde organismos que ocupam níveis mais elevados tendem a apresentar maior concentração de mercúrio em sua constituição (Wren, 1986). No caso de Minamata, a quantidade de mercúrio por unidade de peso dos peixes superava mil vezes a concentração de mercúrio presente na água (Cossa, 1996).

Uma característica importante do mercúrio no ambiente é a capacidade de apresentar-se em uma ampla variedade de formas químicas, podendo estas ser

estas formas. Jansen & Jernelöv (1969) demonstraram que o mercúrio inorgânico pode ser convertido a mercúrio orgânico pela ação de bactérias presentes no ambiente aquático.

Estas observações foram importantes para a caracterização do ciclo do mercúrio no ambiente (Figura 2). A origem antropogênica ou natural é emitido na forma de vapor de mercúrio (Hg°) e posteriormente convertido para forma iônica de Hg⁺² (solúvel em água). Essa forma é rapidamente arrastada pelo vento e pela chuva chegando aos rios e oceanos. No ambiente aquático o mercúrio pode ser novamente reduzido para a forma Hg° e ser devolvido a atmosfera, ou pode incorporar-se ao sedimento aquático ficando na forma inativa de cinábrio (HgS).

Uma via alternativa no ciclo biogeoquímico do mercúrio no ambiente ocorre quando a forma solúvel sofre um processo de metilação, tal processo é mediado pela ação de bactérias anaeróbias sulforredutoras, culminando na formação de um composto bastante estável denominado de metilmercúrio (Jansen & Jernelöv, 1969).

Figura 2: Ciclo do mercúrio no meio ambiente (modificado de Wasserman, e cols 2002)

Sedimento

O metilmercúrio (MeHg), assim como o dimetilmercúrio (Me2Hg), correspondem as formas que predominantemente são incorporadas na cadeia alimentar, principalmente devido a sua capacidade de penetração e acúmulo nos sistemas biológicos (EPA, 1980). A meia vida biológica do MeHg é de aproximadamente dois a três anos, esta propriedade é responsável pelos níveis elevados de MeHg observados em peixes carnívoros que são consumidos continuamente pela população, o que amplia os riscos de intoxicação por este metal pesado ( WHO, 1991).

A intoxicação pelo MeHg se dá predominantemente a partir da dieta e dependendo dos níveis de contaminação do ambiente a exposição pode ocorrer pelas vias aéreas ou pelo consumo de água. O consumo de peixes intoxicados representa a principal fonte de entrada do MeHg nos seres humanos (WHO, 1990). A Organização Mundial de Saúde (WHO, 1989) estabeleceu que o valor máximo de consumo humano admissível é de 0,5g de mercúrio por grama de peixe por dia e para exposições a vapores o limite é de 0,05mg de mercúrio/m³.

No que concerne à região amazônica, esta se tornou alvo de grandes eventos de contaminação pelo mercúrio, principalmente a partir dos processos desordenados de extrativismo mineral que se iniciaram nesta região nas décadas de 70 e 80.

O mercúrio foi amplamente utilizado nos processos de exploração e aproveitamento do ouro (garimpagem), onde aquele foi comumente adicionado ao ouro por processos gavimétricos para separá-lo dos outros minerais. O excesso de mercúrio deste processamento é liberado por procedimentos de lavagens ou por evaporação, fazendo que o mercúrio entre em contato direto com o ambiente, favorecendo o fenômeno de biotransformação na água e a sua dispersão na atmosfera ( Fernandes, 1989).

O mercúrio ao se estabelecer no ambiente aquático, principalmente na forma de MeHg, passa a representar um grande risco para a população ribeirinha local, visto que a principal fonte nutritiva protéica se dá pelo consumo de peixes presentes neste ecossistema (Harada e cols, 2001; Pinheiro e cols, 2005)

Análises feitas em amostras de cabelo da população ribeirinha da região amazônica têm demonstrado claras diferenças de concentrações entre os indivíduos analisados, sendo maior os valores encontrados naqueles que se alimentam de peixes carnívoros (Eve e cols, 1996). Outros resultados obtidos de pessoas expostas ao MeHg que vivem a margem do Rio Negro-AM, não demonstraram diferença significativa na quantidade de mercúrio presente no cabelo de crianças e adultos submetidos a mesma dieta, no entanto, o fenômeno de exposição sazonal ao mercúrio nesta região mostrou que homens apresentam sempre maiores concentrações que as mulheres (Barbosa e cols, 2001).

Em algumas áreas da região amazônica, estimou-se uma ingestão diária na ordem de 100g de MeHg/dia, uma quantidade muito maior que o limite máximo recomendado pela organização mundial de saúde (WHO, 1989). Apesar deste intenso processo de ingestão, nenhum caso claro de sintomas semelhantes aos observados nos indivíduos de Minamata foi descrito na região amazônica, contudo, Lebel e cols (1998), demonstraram alterações neurológicas em indivíduos que foram intoxicados com MeHg nesta região, sendo estas alterações proporcionais às concentrações de MeHg presentes no cabelo dos indivíduos ( >50g/g ).

Todas estas observações justificam os estudos relacionados à intoxicação mercurial em nossa região, visto que, devido o seu poder bioacumulativo e tóxico a presença deste elemento nos ecossistemas amazônicos, em médio e longo prazo, pode

elucidação dos mecanismos de toxicidade causada por este metal, assim como, aos possíveis mecanismos de proteção contra sua ação tóxica.

1.4. METILMERCÚRIO E O SISTEMA NERVOSO CENTRAL 1.4.1 Absorção e Incorporação

A intoxicação começa pela ingestão de peixes ou outros alimentos contaminados com MeHg que penetra no trato gastrointestinal, onde é facilmente absorvido devido a sua solubilidade em lipídeos. Na corrente sangüínea o mercúrio é amplamente distribuído para os diversos tecidos, sendo que em humanos esta distribuição ocorre após poucos dias de ingestão (WHO, 1990).

É bem descrito o poder de associação do MeHg a moléculas que contém grupamentos sulfidrila (-SH), esta propriedade faz do MeHg um composto com alta afinidade por proteínas, peptídeos e aminoácidos. Um fenômeno relacionado a esta característica é a sua forte associação com a glutationa (GSH) e o aminoácido L-cisteína presentes no sangue e em diversos outros tecidos, este processo intensifica o transporte do MeHg através da barreira hemato-encefálica para o sistema nervoso central (SNC).

Uma vez no SNC, o mercúrio pode se dissociar destes compostos e ali se acumular em grandes quantidades (Aschner e cols, 1990a; Aschner e cols 1990b). Mottet e cols (1994) descreveram que o MeHg no SNC sofre um gradual processo de demetilação transformando-se em mercúrio inorgânico (I-Hg) que é pouco solúvel, o que favorece o seu acúmulo dentro das células do SNC. O mecanismo que promove este processo de demetilação parece ser não enzimático e dependente de cádmio (Cd), sendo pouco conhecidos os mecanismos moleculares que regem o regem. Animais tratados previamente com as formas orgânicas do mercúrio (MeHg e Me2Hg) apresentam lesões irreversíveis no SNC, estes efeitos foram observados poucos dias após a intoxicação

(Chang, 1977). O grau de neurotoxicidade do MeHg depende da dose a qual o indivíduo é exposto, assim como do tempo de exposição (Hewett & Atchison, 1991).

Análise em animais intoxicados com MeHg mostram que este composto exerce maior neurotoxicidade nos sistemas motor e visual, sendo o cerebelo e a retina alvos potenciais de ação de MeHg (Mottet e cols, 1994; Goto e cols, 2001). Os mecanismos celulares relacionados a estes fenômenos neurotóxicos ainda não estão bem esclarecidos, no entanto, vários eventos celulares e moleculares são descritos a partir de modelos experimentais de intoxicação com MeHg.

1.4.2. O Mercúrio e o Sistema Visual

Como citado anteriormente, alterações motoras representam importantes características em eventos de intoxicação com mercúrio, da mesma forma que estruturas cerebrais envolvidas na atividade motora, como o cerebelo e o estriado acumulam grandes quantidades de mercúrio em indivíduos intoxicados (Feng e cols, 2004). É importante salientar que embora a toxicidade nestas estruturas neurais sejam bem descritos, os mecanismos responsáveis por este acúmulo ainda não estão totalmente elucidados.

Dentro deste contexto, uma série de trabalhos descreve que outras regiões do sistema nervoso central, como a retina, têm a propriedade de acumular mercúrio quando intoxicados (Warfvinge & Boom, 1996; 2000 ). Associado a estas observações, Urban e cols (2003) demonstraram que indivíduos expostos a níveis mercúrio, que estão abaixo do estipulado pela organização mundial de saúde, apresentam significativos déficits no processo de discriminação de cor, sendo este fenômeno diretamente proporcional à dose de mercúrio o qual foram expostos. A

e cols (2004) que utilizaram análises por eletroretinografia multifocal. Neste trabalho os autores demonstraram alterações visuais após fenômenos de exposição ocupacional ao mercúrio, estas alterações sugerem que a retina representa um importante alvo da toxicidade induzida pelo mercúrio no sistema nervoso central.

Uma outra importante característica da relação entre o mercúrio e o sistema nervoso é a maior sensibilidade deste no período que compreende o seu desenvolvimento (Sanfeliu e cols, 2003). No que concerne à retina, trabalhos anteriores mostraram que alterações visuais em crianças poderiam estar associadas à intoxicação pré-natal com mercúrio, entretanto estas alterações ainda são fruto de especulação (Altmann e cols, 1998). Warfvinge & Bruun (2000) utilizaram primatas não humanos como modelo experimental, para verificar um grande acúmulo de mercúrio no tecido retiniano em indivíduos expostos durante o período pré-natal. Neste mesmo trabalho os autores demonstraram que o processo de eliminação do mercúrio na retina em desenvolvimento é maior do que o observado em retinas mais diferenciadas, entretanto esta observação não descarta um possível efeito patológico deste metal na ontogênia do tecido retiniano, como já demonstrado em outros trabalhos. De fato, se alterações visuais estão associadas à exposição pré-natal ao mercúrio. Desta forma, é de grande relevância que se orientem estudos voltados à caracterização dos mecanismos de ação no tecido retiniano frente à exposição ao mercúrio, uma vez que na literatura poucos trabalhos fazem alusão aos mecanismos moleculares que regem a toxicidade do mercúrio neste tecido.

1.4.3. Ação nos Principais Sistemas de Neurotransmissão

Os fenômenos de biodistribuição e acúmulo do mercúrio no sistema nervoso fazem com que este metal influencie na homeostasia de diversos sistemas de

neurotransmissão, tal processo acentua significativamente os efeitos danosos induzidos pelo mercúrio, justificando desta forma os estudos sobre o efeito do mercúrio no sistema de neurotransmissão específico que gerencia as diferentes regiões do sistema nervoso.

1.4.3.1. Sistema Colinérgico

Os efeitos do mercúrio no sistema colinérgico estão intimamente relacionados a um dos principais sintomas observados em indivíduos intoxicados com aquele metal, a perda do controle motor. De fato os estudos de Kobayashi e cols (1981) demonstraram que camundongos intoxicados com diferentes concentrações de metilmercúrio apresentavam diminuição significativa da atividade motora, sendo os efeitos comportamentais semelhantes aqueles observados em camundongos tratados com drogas que inibem a atividade da acetilcolinesterase, enzima responsável pela síntese de acetilcolina. É importante salientar que este trabalho complementa outros trabalhos realizados pelo mesmo grupo. Em modelos in vitro, estes autores demonstraram que tratamento com metilmercúrio em células cerebelares promovia uma diminuição significativa da captação de colina, um dos substratos para síntese da acetilcolina (Kobayashi e cols, 1979).

De fato, estudos posteriores demonstraram que além do reconhecido efeito do mercúrio na síntese de acetilcolina, este metal tem a propriedade de inibir a atividade de receptores muscarínicos no sistema nervoso central e em linfócitos. Neste mesmo trabalho também foi demonstrado que ocorria uma regulação positiva para a expressão dos receptores muscarínicos. Coccini e cols, 2000, sugeriram que esta regulação positiva poderia estar relacionada à depleção de acetilcolina como

1.4.3.2. Sistema GABAérgico

O ácido gamaaminobutírico (GABA) representa no SNC um dos principais neurotrasmissores inibitório, já que a estimulação dos receptores GABAérgicos está associada ao influxo de íons cloreto (Cl^-). Este processo promove hiperpolarização da célula estimulada, dificultando assim o disparo do potencial de ação (Mody e cols, 1994). Uma série de estudos descreve que alterações no sistema GABAérgico pode está associada a quadros clínicos de epilepsia e esquizofrenia, sugerindo que este neurotransmissor tem importante papel no controle das funções cognitivas (Bausch, 2005).

Um dos estudos pioneiros sobre o efeito do mercúrio no funcionamento da sinapse GABAérgica demonstrou que no córtex de ratos intoxicados ocorre uma diminuição no sistema de captação de GABA (Araki e cols, 1981; O'Kusky and McGeer, 1989). Yuan and Atchison (1997) relatam que a intoxicação com metilmercúrio induz o bloqueio da estimulação por GABA no hipocampo de ratos, favorecendo assim um hiper estímulo nestas regiões. Estes resultados forma confirmados pelo trabalho de Fonfria e cols (2001), que utilizaram o modelo de cultura de células para demonstrarem que o metilmercúrio pode interagir com grupamentos sulfidrilas dos resíduos de cisteína presentes nos receptores GABAérgicos;

promovendo a alquilação destes últimos com conseqüente disfunção. Estes efeitos induzidos pela intoxicação mercurial podem estar associados aos danos cognitivos observados em indivíduos expostos ao mercúrio, embora estudos mais elaborados sejam necessários para confirmar esta hipótese.

1.4.3.3. Sistema Dopaminérgico

O sistema dopaminérgico de modo geral parece estar fundamentalmente relacionado aos sistemas motor e cognitivo, esta observação é sustentada por trabalhos que demonstram a relação entre a perda do controle motor e alterações de comportamento, observadas em doenças neurodegerativas como a doença de Parkinson, com a morte ou disfunção de neurônios dopaminérgicos no sistema nigro-estriatal (Moore e cols, 2005). Em eventos de intoxicação com mercúrio a perda motora e cognitiva são sintomas característicos. Trabalhos como de Cuomo e cols (1984) foram os primeiros a associar estes déficits induzidos pela intoxicação mercurial com alterações no sistema dopaminérgico. Posteriormente Rajanna e cols (1985) demonstraram que a intoxicação mercurial promove diminuição da captação de dopamina em ratos, este efeito parece relacionado à diminuição da atividade da Na⁺/K⁺ ATPase.

Assim como alterações no padrão normal de captação de dopamina, outros trabalhos demonstraram in vitro que o mercúrio promove aumento da liberação de dopamina no SNC (Kalisch e cols, 1996). Em modelo de intoxicação in vivo, Faro e cols (1997) ratificaram estes resultados e demonstraram que além do aumento da liberação de dopamina, em um fenômeno independente de Ca⁺, a exposição mercurial também induz um aumento na fenda sináptica dos principais produtos do metabolismo da dopamina o ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovalínico (HVA).

Este mesmo grupo propôs que alterações na atividade do transportador dopaminérgico, induzidas pelo mercúrio e ativação de receptores glutamatérgicos, representam um importante mecanismo de indução da liberação de dopamina nos animais intoxicados (Faro e cols, 2000; 2002a, 2002b).

Na retina pouco é conhecido sobre a ação especifica da dopamina, entretanto é sabido que ela exerce, assim como muitos neurotransmissores, um papel importante na via de processamento da informação visual (Masson e cols, 1993).

Baseado nisso o trabalho eletrofisiológico de Herba e cols (2004) demonstraram que a intoxicação mercurial alterava o papel da dopamina no controle das respostas celulares, podendo este efeito estar relacionado a uma possível alteração dos receptores dopaminérgicos presentes na retina.

1.4.3.4.Sistemas Glutamatérgico e Nitrérgico

O glutamato é o principal neurotransmissor no SNC e sua concentração neste tecido é muito maior que a observada em outros tecidos. O glutamato é encontrado em baixa concentração no meio extracelular em relação ao meio intracelular, sendo este fenômeno mais evidente nos terminais nervosos (Danbolt, 2001).

Nas células do sistema nervoso, o glutamato provém principalmente da glicose, do ciclo de Krebs ou da glutamina (ciclo glutamato-glutamina) uma vez que o mesmo não apresenta a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica (Westergaard et al., 1995). De modo semelhante a outros neurotransmissores, o glutamato é armazenado em vesículas sinápticas e liberado por exocitose em um processo dependente de Ca⁺² (Augustine et al., 1996). Uma vez no meio extracelular, este aminoácido pode ser captado pelos neurônios pré-sinápticos, pós-sinápticos e, principalmente pelas células gliais.

Na célula da glia, o glutamato captado é convertido em glutamina pela ação da enzima glutamina sintetase, e uma vez liberada no meio extracelular, a glutamina é captada pelos neurônios, para ser então reconvertida a de glutamato,

sendo este fenômeno mediado pela ação enzimática da glutaminase (Ottersen, 1996) (Figura 3).

O glutamato desempenha importante papel em diversos processos fisiológicos, tais como, na transmissão sináptica e na plasticidade neuronal envolvida em processos cognitivos relacionados à memória e aprendizado. O glutamato também desempenha importante papel nos processos relacionados ao desenvolvimento do sistema nervoso central, como na indução sináptica (Quinlan, 1999), migração (Rossi &

Slater, 1993), diferenciação e morte celular (Rabachi, 1992).

As principais vias eferentes e aferentes corticais utilizam o glutamato como neurotransmissor, assim como os numerosos circuitos excitatórios locais no córtex, hipocampo, cerebelo e retina (Miller & Slaughter, 1986; Salt & Herrling, 1991).

A ação glutamatérgica é atribuída a sua capacidade de ativar uma variedade de proteínas receptoras localizadas na membrana plasmática dos neurônios pós-sinápticos. Estas proteínas foram classificadas como receptores ionotrópicos e metabotrópicos, sendo aqueles ionotrópicos passivos de ativação pelo N-metil-D- aspartato denominados tipo NMDA. Os receptores ionotrópicos passivos de ativação pelo ácido propiônico--amino-4-hidroxi-5-metil-4-isoxazol] (AMPA) ou ao ácido caínico são denominados receptores tipo AMPA e Cainato respectivamente.

É importante salientar a existência de oito tipos de receptores glutamatérgicos chamados metabotrópicos pois estão associados a proteína G, sendo estes do tipo mGluR1 à mGluR8 (Conn & Pin, 1997; Ozawa et al., 1998; Yang, 2004).

Figura 3: Representação do ciclo glutamato-glutamina responsável pelo metabolismo do neurotransmissor glutamato no sistema nervoso central. Fonte: Danbolt, 2001.

Glutamato Glutamato

Glutamina

Glutamina sintetase

Glutamina

Glutamato Glutaminase

Glutamina

Célula Glial

Neurônio

No tecido retiniano o glutamato é armazenado e liberado pelas células fotorreceptoras, bipolares, amácrinas e ganglionares, apresentando-se como o principal neurotransmissor excitatório responsável pelo processo de fototransdução (Kalloniatis

& Napper, 1996). Na camada externa da retina, os fotorreceptores liberam continuamente glutamato, sendo essa liberação modulada pela emissão de luz. No meio extracelular, o glutamato ativa diferentes receptores glutamatérgicos expressos na membrana das células bipolares e horizontais. Na camada plexiforme interna, o glutamato é liberado por dois tipos de células bipolares: células bipolares-ON, que liberam o neurotransmissor na presença de luminosidade e células bipolares-OFF, que liberam o glutamato no escuro. As células amácrinas e ganglionares são alvos da liberação de glutamato pela camada plexiforme interna (Copenhagen & Jahr, 1989;

Rauen et al., 1996) (Figura 1).

Na retina e nas demais regiões do SNC, os receptores glutamatérgicos são responsáveis pela transmissão sináptica excitatória rápida, estando envolvidos em eventos adaptativos e fisiopatológicos como plasticidade neuronal e excitotoxicidade (Ozawa et al., 1998). De fato esta ultima propriedade da ação glutamatérgica está fortemente associada à hiper-estimulação de receptores ionotrópicos de glutamato.

A excessiva ativação dos receptores de membrana levaria a despolarização prolongada da célula neuronal, sendo este fenômeno relacionado ao constante in fluxo de íons positivos como o Ca⁺² e Na⁺. A despolarização se iniciaria com a ativação de receptores AMPA com subseqüente ativação dos canais de sódio dependentes de voltagem. No entanto, quando a célula torna-se permanentemente despolarizada, os receptores NMDA são desbloqueados com a liberação do magnésio

(Mg⁺²), ficando, assim, disponíveis para ativação (Yang, 2004). Os receptores NMDA apresentam-se como os principais responsáveis pela entrada de cálcio na célula.

O aumento da concentração interna de íons como o Ca⁺² do neurônio ativa permanentemente, uma cadeia de eventos bioquímicos potencialmente destrutivos que poderiam resultar em morte neuronal. Os principais eventos envolvidos na neurotoxicidade incluem: o aumento da liberação de glutamato; a ativação de proteases, lipases e cinases que causam lesões na membrana; estimulação de cascatas inflamatórias; ativação gênica e ativação da enzima óxido nítrico sintase (NOS) responsável pela produção do radical livre óxido nítrico (NO) (Trotti, 1998) (Figura 4).

Figura 4: Efeitos excitotóxicos do glutamato no sistema nervoso central desencadeado pelo aumento da concentração intracelular de cálcio (Ca⁺⁺). Fonte: Doble, 1999.

cinas

Dano mitocondrial

Dano na membrana

Dano nuclear

Peroxidação lipídica Radicais

Livres

Perda de Energia

despolarização

Receptor NMDA

Receptor AMPA

Canal de Sódio dependente de

Voltagem

Canal de Cálcio dependente de

Voltagem

1.4.3.5.Sistema Nitrérgico

O mecanismo pelo qual o MeHg altera a atividade da NO-Sintase provavelmente ocorre pela estimulação dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, o que elevaria os níveis intracelulares de cálcio, com a conseqüente estimulação da NO- Sintase via o complexo Ca⁺²-calmodulina. Shinyashiki e cols (1998) demonstraram que no cerebelo de ratos intoxicados com MeHg há um aumento na atividade da NO- Sintase, assim como dos principais produtos do metabolismo do NO, nitrito e nitrato (NO2-/NO3-). Estes resultados sugerem que a neurotoxicidade causada pelo MeHg no cerebelo pode estar relacionada com a produção de NO em virtude do aumento da atividade da NO-Sintase no córtex e no cerebelo. A intoxicação com MeHg aumenta a atividade da NO-Sintase sem alterar os mecanismos pré-transcripcionais de nenhuma das suas isoformas (Himi, e cols 1996; Yamashita e cols 1997)..

Estes mecanismos de ação do MeHg sob a atividade da NO-Sintase são bem esclarecidos nas regiões corticais e cerebelares, no entanto, não é bem claro se estes eventos celulares, assim como os outros descritos anteriormente ocorrem em outras regiões do sistema nervoso como na retina.

Como descrito acima a excitoxicidade induzida pelo excessivo estímulo de receptores glutamatérgicos pode estar associada à ativação de diferentes vias, desta forma o mercúrio pode induzir indiretamente diferentes mecanismos de excitotoxicidade nas diferentes regiões do SNC. Em cada caso, é importante a caracterização do mecanismo de toxicidade do mercúrio. Estudos na retina são de grande importância e podem servir de subsídios para prevenção e tratamento, tendo em vista que alterações visuais são comuns em indivíduos expostos ao mercúrio em períodos pré ou pós-natais. Como o sistema nitrérgico apresenta-se como um protagonista, tantos em eventos relacionados ao desenvolvimento retinianao, quanto em

mecanismos de toxicidade, torna-se interessante avaliar a relação entre a toxicidade induzida pelo mercúrio com a ativação nitrérgica nas células retinianas.

1.5. RESISTÊNCIA CELULAR AO MeHg

Os processos patológicos e bioquímicos causados pelo MeHg são amplamente estudados a partir do momento que este composto apresentou-se como um importante agente neurotóxico. Outro importante ponto a ser abordado são os mecanismos de defesa que a maquinaria celular apresenta contra o estresse causado pelo mercúrio. Estas estratégias podem ser agrupadas dentro de três categorias gerais: (1) modificações químicas do mercúrio para neutralizar sua toxicidade, (2) excreção por um transporte ativo minimizando sua concentração ou (3) modificação ou expressão de proteínas que minimizem o estresse oxidativo causado por este metal.

Uma forma elegante de proteção é adotada por bactérias que vivem em ambientes com grandes concentrações de mercúrio. Estes organismos são dotados de famílias gênicas organizadas em operons, ou seja, genes codificam proteínas que atuam em uma mesma via metabólica (Figura 5).

Quando o mercúrio penetra nestas células ele é rapidamente conjugado a uma proteína denominada de merR, sendo que esta proteína, associada com o mercúrio, ativa a região promotora de outros cincos genes que se encontram lado a lado no cromossomo bacteriano ( merP, merT, merA, merD e merB). A partir de sua expressão, a proteína merP é transportada para o espaço periplasmático e conjuga-se ao mercúrio presente neste local; uma vez conjugada, esta proteína transfere este mercúrio para uma

proteína transportadora (merT) que transporta o mercúrio para o citoplasma da célula.

No citoplasma, este mercúrio sofre a ação da proteína merB, que retira grupamentos alkil (metil, etil), promovendo a formação da forma inorgânica de mercúrio (Hg⁺²), sendo este utilizado pela proteína mercúrio redutase (merA) que reduz a forma inorgânica para forma de Hg°. Esta forma caracteriza-se por ser extremamente volátil, o que promove sua saída da célula (Sarafian e cols, 1996). A introdução deste conjunto de genes em algas é bastante utilizado em processos de descontaminação de ambientes cuja concentração de mercúrio é elevada. (Bizily e cols, 1999).

Figura 5: Ativação e regulação do operon Mer em bactérias ( Modificado de Serafian e cols, 1996).

MeHg

Mer R RP Mer T Mer P Mer A Mer D Mer B

MER R

MeH MER B

MeH

Hg⁺²

MER A

Hg⁰

MER T

MeHg MeHg

MeHg MER P

DNA

Citoplasma

MP

Periplasma Extracelular

Organismos eucariotos não dispõem deste coordenado mecanismo de proteção contra o mercúrio, com isso, uma estratégia alternativa é a utilização das chamadas metalotioneínas (Figura 6A) que correspondem a proteínas de baixo peso molecular e ricas em grupamentos de cisteína (Hemer, 1986). Estas proteínas ligam-se fortemente a metais pesados e a radicais livres, equilibrando com isso o ambiente celular e diminuindo os efeitos neurotóxicos destes compostos. Rising e cols (1995) demonstraram que astrócitos em cultura expressam metalotioneínas após intoxicação com mercúrio e cádmio, sendo que esta expressão diminui a ação tóxica causada por estes metais. Existem três isoformas conhecidas de metalotioneínas, sendo todas elas expressas no SNC (Bauman & Klassen, 1993, Stankovic e cols, 2003). Apesar das metalotioneínas representarem um importante mecanismo de defesa celular contra a ação de metais pesados, o principal mecanismo que a célula eucariótica utiliza para este fim é a glutationa (Meister, 1994).

1.6. O SISTEMA GSH

A Glutationa é um tripeptídeo (-glutamicilcisteinilglicina) que é sintetizado em dois passos bioquímicos, o primeiro pela ação da -glutamicilcisteína sintetase, que promove a ligação entre cisteína e glutamato, formando - glutamicilcisteína (-GluCys), e um segundo que é catalisado pela ação da glutationa sintetase, que une a este dipeptídeo o aminoácido glicina formando a glutationa (- glutamicilcisteínaglicina) (Figura 6B).

No SNC, a síntese de glutationa é dependente dos níveis de cisteína presentes no meio (Figura 7). Outros estudos também demonstraram que a síntese de glutationa em neurônios é em sua grande maioria dependente da síntese do precursor - glutamicilcisteína por astócitos, sendo este captado pelo neurônio onde ocorre o passo final para formação do tripeptídeo (-glutamicilcisteínaglicina) (Bannai e cols, 1984, Patrick, 2002). A partir de sua síntese podemos encontrar a glutationa no meio intracelular na sua forma oxidada (GSSG) ou na sua forma reduzida (GSH) como mostrado na figura 3B e 3C, sendo a conversão de GSSG a GSH catalisada pela enzima glutationa redutase (GR). Uma outra enzima relacionada com a formação de glutationa, a glutationa peroxidase (GPx), atua no SNC como o principal agente de transformação do superóxido de hidrogênio (H2O2) em água, sendo esta atividade depende da quantidade de GSH no meio. Neste processo a forma GSH é transformada em GSSG.

Figura 6: Representação da metalotioneína em A, sendo mostrado no centro colorido a região rica em grupamentos cisteína. Em B e C temos representado a forma de Glutationa reduzida e glutationa oxidada respectivamente.

C

A B

Figura 7: Participação das células neuronais e gliais no metabolismo da glutationa (GSH). Fonte: Dringen, 2000.

Célula da Glia Neurôni o

Todas estas considerações sobre sistema GSH demonstram que seu funcionamento é fundamental para a manutenção da homeostasia celular, desta forma é importante o conhecimento do papel dos principais transportadores em células neuronais e gliais que promovem a síntese de GSH assim como sua relação com o sistema glutamatérgico.

No SNC, o transporte de glutamato é realizado, principalmente, pelos transportadores de aminoácidos excitatórios (EAATs), no entanto, outros mecanismos pelos quais pode ocorrer a entrada de glutamato na célula já estão sendo descritos. Uma grande variedade de transportadores transmembrana foram identificados e caracterizados pelos diferentes sistemas que os mesmos utilizam para realizar o transporte de diversos aminoácidos. Esses sistemas, por sua vez diferenciam-se pela dependência ou não a determinados íons.

Todos os cincos transportadores de glutamato citados anteriormente são conhecidos como transportadores sódio-dependente de alta-afinidade (Bridges et al., 2005). Essas proteínas transmembrana realizam a captação de aminoácidos dicarboxilados, como glutamato e aspartato por um sistema denominado de XAG-

, caracterizado como o principal responsável pelo transporte de glutamato no sistema nervoso central (Danbolt, 2001). Por esse sistema também são transportados aminoácidos como a cisteína e cistina (Bukowski et al., 1995; Knickelbein et al., 1997).

Um outro mecanismo para transporte de aminoácidos neutros foi descrito e apresenta-se, também, como um transportador dependente de Na⁺. Por esse sistema, conhecido como ASC (ASCT1 e ASCT2), são transportados, preferencialmente, aminoácidos como a serina, alanina, treonina e cisteína. Esse transportador pode realizar a captação de glutamato na sua forma neutra, apesar de apresentar baixa afinidade por esse substrato (Utsunomiya-Tate et al., 1996). Bannai (1986) descreveu um mecanismo

de transporte do aminoácido cistina, em fibroblastos humanos que é feito independente de íons, apenas com a atividade de um canal de cloreto. Por esse sistema, o transporte de cistina é acoplado a saída de uma molécula de glutamato, e devido a esta característica, alguns autores o denominam de “trocador glutamato-cistina”. Esse transportador apresenta afinidade por substratos como L-homocisteato, L-- aminoadípico e quisqualato (McBean, 2002).

Esse modelo de transporte, denominado de sistema XCG-

, também, foi descrito em hepatócitos, células alveolares do tipo II, macrófagos peritoniais e células endoteliais humanas (Ishii et al., 1992). No SNC, o sistema XCG-

foi identificado em culturas primárias de neurônios (Sagara et al., 1993) e astrócitos (Allen et al., 2001;

Gochenauer & Robinson, 2001), células de glioma C6 (Cho & Bannai, 1990), gliomas humanos (Ye et al., 1999) e microglia (Piani & Fontana, 1994).

O transporte de cistina para dentro da célula, tanto pelo mecanismo dependente de sódio como pelo independente de sódio é, particularmente importante, uma vez que a cistina captada é convertida em duas moléculas de cisteína, o principal aminoácido precursor da molécula de glutationa (Bender et al., 2000).

Estudos in vivo e in vitro demonstraram que os níveis de glutationa são maiores nos astrócitos que nos neurônios, variando, ainda, em função da região do sistema nervoso a ser estudada (Langeveld et al., 1996; Cooper et al., 1997).

Normalmente, a taxa de liberação da glutationa pelas células gliais depende da sua concentração intracelular e segue, aparentemente, a cinética de Michaelis-Menten (Dringen et al., 2000). Simultaneamente a sua liberação, a glutationa é resintetizada na tentativa de compensar a quantidade liberada e de manter constante a sua concentração intracelular. Cho & Bannai (1990) mostraram que em células de glioma C6, a cistina

transporte pelo sistema XCG-

. No entanto, ainda não está claro qual dos sistemas, XAG-

ou XCG-

, é o principal responsável pelos níveis de glutationa no SNC (McBean, 2002).

Os severos danos resultantes do intenso processo de estresse oxidativo acometem diversas regiões do SNC, entre elas, o tecido retiniano, um dos constituintes do sistema visual. A retina apresenta uma série de características que a torna, especialmente, vulnerável a essa condição, como: a elevada taxa de consumo de oxigênio, alta concentração de ácidos graxos poliinsaturados na camada de células fotorreceptoras e constante exposição à luminosidade responsável pela peroxidação lipídica. Processos isquêmicos, muito comuns nesse tecido, podem ainda contribuir para condições de estresse oxidativo (Huster et al., 2000).

O sistema GSH constitui o principal mecanismo de defesa celular da retina frente a processos oxidativos, portanto, defeitos no metabolismo desse antioxidante podem ser prejudiciais para o tecido retiniano (Schütte & Werner, 1998;

Drigen et al., 1999). No entanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos responsáveis pela síntese e liberação de GSH pelas células gliais de Müller na retina; e do possível envolvimento dos sistemas XCG-

e XAG-

nesses processos, assim como se eventos de intoxicação mercurial afetam o funcionamento destes sistemas.

Todos estes fenômenos bioquímicos que envolvem a GSH são importantes na prevenção contra processos de estresse oxidativo que geralmente são produzidos frente à intoxicação com metais pesados (Sarafian e cols, 1996).

Fisiologicamente quando há intoxicação por metais pesados, como MeHg, a glutationa na sua forma reduzida atua inicialmente conjugando-se com este metal, por meio do seu resíduo de cisteína, facilitando o transporte do mercúrio para fora da célula. A GSH também tem a propriedade de ligar-se a radicais livres e promover a manutenção dos grupamentos - SH das proteínas. Este tripeptídeo representa um importante marcador de

eventos de estresse oxidativo, assim como de intoxicação por metais pesados, sendo que a debilitação deste sistema implica em uma maior predisposição a fenômenos de neurotoxicidade, com isso, torna-se importante nos estudos relacionados à intoxicação com MeHg a avaliação dos níveis de glutationa presentes antes e depois do evento tóxico (Dringen, 2000).

A toxicidade causada pelo MeHg no SNC, principalmente durante o período de desenvolvimento, justifica os estudos relacionados aos mecanismos celulares que regem sua ação em sítios nervosos como a retina (Clarkson, e cols, 1997). Um dos principais alvos da neurotoxicidade causada pelo mercúrio, como citado anteriormente, é o sistema visual e apesar da variedade de estudos relacionados à toxicidade deste elemento em outras regiões do sistema nervoso, pouco é conhecido sobre a ação do mercúrio nas células que compõem a retina.

Dentro deste contexto, utilizaremos um modelo de estudo in vitro para avaliar alguns fenômenos celulares e moleculares, como alterações nos sistemas nitrérgico, glutamatérgico e de GSH, que podem estar envolvidos na neurotoxicidade causada pelo MeHg nas células de retina, já que culturas celulares de retina nos possibilitam visualizar com bastante clareza as respostas celulares frente a intoxicação sem que haja a interferência de outros fatores externos presentes nos modelos in vivo.

É importante salientar que para relacionar a ativação nitrérgica com a toxicologia do mercúrio nas células de retina em cultura, é necessário caracterizar inicialmente em que momento do desenvolvimento in vitro este sistema apresenta-se estabelecido, pois como citado anterirmente o sistema nitrérgico tem diferente padrão de expresão em diferentes períodos do desenvolvimento.

1.7. OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi estudar o mecanismo de toxicidade induzido pelo MeHg na retina, assim como a diferenciação do sistema nitrérgico durante o desenvolvimento embrionário utilizando como modelo experimental cultura de células retinianas de embrião de galinha. Verificou-se também o papel do sistema anti-oxidante como possível proteção à intoxicação mercurial.

Os objetivos específicos:

1- Avaliar o padrão de atividade e expressão da NOS em diferentes períodos do desenvolvimento em culturas de células de retina.

2- Avaliar o papel do NGF na ativação da NOS em períodos precoces do desenvolvimento de células retinianas mantidas in vitro.

3- Avaliar o curso temporal de captação de L-Arginina ao longo do desenvolvimento de células retinianas mantidas in vitro

4- Avaliar a ação do NGF e anti-NGF no transporte de L-arginina ao longo do desenvolvimento retiniano in vitro

5- Avaliar a viabilidade das culturas celulares de retina de embrião de galinha após a intoxicação com diferentes concentrações de MeHg por diferentes intervalos de tempo 6- Avaliar o efeito da exposição ao MeHg na captação de ³H-glutamato em culturas celulares de retina de embrião de galinha.

7- Determinar o padrão de atividade da NO-Sintase em culturas celulares de retina de embrião de galinha intoxicadas com diferentes concentrações de MeHg por diferentes intervalos de tempo.

8- Avaliar o efeito da exposição ao MeHg na captação de ³H-cisteína em culturas celulares de retina de embrião de galinha.

9- Determinar os níveis totais de GSH em culturas celulares de retina de embrião de galinha intoxicadas com diferentes concentrações de MeHg por diferentes intervalos de tempo.

10- Estudar o possível efeito protetor de substâncias antioxidantes (GSH e Cisteína), meio condicionado por células gliais nas culturas celulares de retina intoxicadas com diferentes concentrações de MeHg

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. CULTURAS PRIMÁRIAS DE RETINA DE EMBRIÕES DE GALINHA

Os ovos Leghorn fertilizados foram gentilmente cedidos pela empresa MAKARÚ LTDA, localizada na estrada da providência s/n- Ananindeua-PA. Os ovos foram retirados da incubadora, banhados em etanol absoluto e posteriormente levados para câmara de fluxo laminar onde foram abertos sob condições assépticas. Os embriões com oito ou nove dias de desenvolvimento, datados segundo os critérios descritos por Hamburguer e Hamilton (1951), foram colocados em placa de petri contendo meio livre de cálcio e magnésio (CMF- calcium media free) sendo decaptados e enucleados. Os globos oculares foram abertos em sua região anterior, de forma que possibilitou a retirada do cristalino, juntamente com o humor vítreo. A retina foi cirurgicamente retirada e passada para uma placa de petri contendo CMF gelado. O tecido retiniano foi transferido para tubos de ensaio de 15ml contendo uma solução de meio DMEM (Dulbeco’s modified Eagles’s medium) e tripsina 0,05%, sendo posteriormente incubado por cerca de 5 minutos a 37°C. Os experimentos relacionados ao estudo do sistema nitrérgico, o tecido retiniano não foi submetido a dissociação química com tripsina. O período de incubação foi sucedido pela dissociação mecânica do tecido, que consistiu de sucessivas aspirações com auxílio de uma pipeta de vidro. A suspensão celular foi centrifugada a 500g por 1 minuto e ressuspendida em meio DMEM com 10%

de soro fetal bovino (SFB). As células foram colocadas em placas de petri de 33mm e diluídas em DMEM com 10%SBF. A diluição foi feita para que se obtivesse cerca de 2- 3 10⁶ células/placa. Após o plaqueamento as culturas foram mantidas em estufa a 37°C, com atmosfera constituída de 95% de ar e 5% de CO2.

2.2. CULTURAS PRIMÁRIAS DE CÉLULAS GLIAIS DE MÜLLER DE RETINA DE EMBRIÃO DE GALINHA.

As culturas de glia de embrião de galinha foram obtidas de ovos fertilizados com 10-11 dias de desenvolvimento. Os ovos foram banhados em etanol absoluto e posteriormente transferidos para uma câmara de fluxo laminar. Os olhos dos embriões foram retirados e colocados em uma placa de petri contendo meio DMEM sem soro. As retinas foram cirurgicamente retiradas e colocadas em tubos de 15ml contendo 2ml de uma solução de tripsina 0,05%, sendo posteriormente incubadas em banho-maria a 37^oC por 5 minutos. Após este processo, foi feita a dissociação mecânica do tecido, sendo as células mantidas em placas de petri de 35mm previamente tratadas com poli-L-ornitina. As culturas foram mantidas em estufa de CO2 a 37^oC por um período de 10 dias. Neste intervalo de tempo, observou-se uma confluência celular formada por  90% de células gliais e 10% de neurônios.

Para os experimentos de proteção, as células gliais com 15 dias de desenvolvimento in vitro, foram tratadas com 1mM de L-cisteína diluída em DMEM sem soro por 2h, após este período o meio foi retirado e adicionado 2ml de DMEM sem soro sendo este meio coletado 4h depois e utilizado como meio condicionado nos experimentos de proteção celular.

2.3. CAPTAÇÃO DE L-[H³]-ARGININA

Para avaliar o tranporte de L-arginina utilizaremos culturas com 2, 4,6 e 8 dias de desenvolvimento. Estas serão incubadas independentemente em solução contendo L-[H³]-arginina (2,65Ci/ml),, NaCl 140 mM, KCl , 5 mM, HEPES 20 mM,

lavadas e as células rompidas com TCA 5%, sendo o conteúdo interno de radiação determinado por cintilação líquida. Para se verificar o efeito do NGF as culturas foram previamente tratadas por 24h com 100ng/ml, sendo este processo seguido pela exposição das células à L-[H³]-arginina como descrito anteriomente.

2.4. INTOXICAÇÃO DAS CULTURAS DE CÉLULAS DE RETINA COM MeHg O metil-mercúrio foi diluído em meio DMEM sem SBF para que se evitasse eventuais conjugações deste elemento com as proteínas presentes no soro. As culturas retinianas com oito dias de desenvolvimento in vitro foram expostas a diferentes concentrações de MeHg (1M, 10M, 100M e 1mM) por intervalos de 2h, 4h e 6h. O controle dos experimentos foi feito com culturas no mesmo estágio de desenvolvimento, sendo estas expostas a meio DMEM sem SBF por intervalos de 2h, 4h e 6h. Utilizamos também culturas controles com DMEM e 10% de SBF, no entanto, não foi observada diferença bioquímica no comportamento destas células em relação àquelas tratadas com meio sem SBF (dados não mostrados).

2.5. MEDIDA DA VIABILIDADE CELULAR PELO MÉTODO MTT

Para avaliar a viabilidade e a neurotoxicidade celular nas culturas de células de retina após a intoxicação com diferentes concentrações de MeHg, foi utilizada a análise colorimétrica com o corante MTT (thiazolil blue). O princípio da técnica baseia-se na capacidade que células viáveis apresentam de reduzir a forma oxidada do MTT a um composto de cor azulada, sendo o monitoramento desta redução feito por espectrofotometria como descrito por Mosman (1983).

Em placas controles e tratadas com MeHg, após a remoção do meio, foi feita uma lavagem com PBS estéril e posteriormente adicionado 550µl de PBS e 55μl

de MTT . As amostras foram incubadas por 4 horas, a partir das quais, foram homogeneizadas no mesmo meio para posterior leituras da absorvância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 570 nm. O branco da reação foi feito com a solução de PBS e MTT.

2.6. AVALIAÇÃO DO TRANSPORTE DE ³H-GLUTAMATO e ³H-CISTEÍNA EM CULTURAS RETINIANAS

Para avaliar a captação de ³H-glutamato e ³H-cisteína, as culturas mistas de células da retina controles e expostas ao MeHg serão lavadas com solução de Hank contendo 128mM de NaCl, 4mM de KCl, 1mM de MgCl2, 2mM de CaCl2, 12mM de glicose e 20mM de HEPES, e posteriormente, incubadas durante 5 minutos com ³H- glutamato ou ³H-cisteína (1Ci/mL 0.2µCi/mL) e solução de Hank, de acordo com o método descrito por do Nascimento et al. (1998). Após os cinco minutos de incubação, as culturas serão lavadas com solução de Hank para retirada do excesso de ³H- glutamato presente no meio. Em seguida as células serão rompidas com TCA (ácido tricloroacético) 5%. A quantidade de ³H-glutamato presente no interior da célula será determinada por cintilação líquida, sendo os valores expressos em percentagem da captação do controle.

2.7. HISTOQUÍMICA PARA NADPH-DIAFORASE

Culturas de retina controles e tratadas foram feitas em lamínulas previamente tratadas com poli-L-ornitina e fixadas com paraformadeído 5% por 30 minutos. Nos experimentos no qual utilizamos 10µM, 100µM e 1mM de MeHg por 4 horas o processo de fixação foi realizado após a intoxicação com MeHg. Após a fixação