MATERIAL E MÉTODOS

2.1. CULTURAS PRIMÁRIAS DE RETINA DE EMBRIÕES DE GALINHA

Os ovos Leghorn fertilizados foram gentilmente cedidos pela empresa MAKARÚ LTDA, localizada na estrada da providência s/n- Ananindeua-PA. Os ovos foram retirados da incubadora, banhados em etanol absoluto e posteriormente levados para câmara de fluxo laminar onde foram abertos sob condições assépticas. Os embriões com oito ou nove dias de desenvolvimento, datados segundo os critérios descritos por Hamburguer e Hamilton (1951), foram colocados em placa de petri contendo meio livre de cálcio e magnésio (CMF- calcium media free) sendo decaptados e enucleados. Os globos oculares foram abertos em sua região anterior, de forma que possibilitou a retirada do cristalino, juntamente com o humor vítreo. A retina foi cirurgicamente retirada e passada para uma placa de petri contendo CMF gelado. O tecido retiniano foi transferido para tubos de ensaio de 15ml contendo uma solução de meio DMEM (Dulbeco’s modified Eagles’s medium) e tripsina 0,05%, sendo posteriormente incubado por cerca de 5 minutos a 37°C. Os experimentos relacionados ao estudo do sistema nitrérgico, o tecido retiniano não foi submetido a dissociação química com tripsina. O período de incubação foi sucedido pela dissociação mecânica do tecido, que consistiu de sucessivas aspirações com auxílio de uma pipeta de vidro. A suspensão celular foi centrifugada a 500g por 1 minuto e ressuspendida em meio DMEM com 10%

de soro fetal bovino (SFB). As células foram colocadas em placas de petri de 33mm e diluídas em DMEM com 10%SBF. A diluição foi feita para que se obtivesse cerca de 2-3 10⁶ células/placa. Após o plaqueamento as culturas foram mantidas em estufa a 37°C, com atmosfera constituída de 95% de ar e 5% de CO2.

2.2. CULTURAS PRIMÁRIAS DE CÉLULAS GLIAIS DE MÜLLER DE RETINA DE EMBRIÃO DE GALINHA.

As culturas de glia de embrião de galinha foram obtidas de ovos fertilizados com 10-11 dias de desenvolvimento. Os ovos foram banhados em etanol absoluto e posteriormente transferidos para uma câmara de fluxo laminar. Os olhos dos embriões foram retirados e colocados em uma placa de petri contendo meio DMEM sem soro. As retinas foram cirurgicamente retiradas e colocadas em tubos de 15ml contendo 2ml de uma solução de tripsina 0,05%, sendo posteriormente incubadas em banho-maria a 37^oC por 5 minutos. Após este processo, foi feita a dissociação mecânica do tecido, sendo as células mantidas em placas de petri de 35mm previamente tratadas com poli-L-ornitina. As culturas foram mantidas em estufa de CO2 a 37^oC por um período de 10 dias. Neste intervalo de tempo, observou-se uma confluência celular formada por  90% de células gliais e 10% de neurônios.

Para os experimentos de proteção, as células gliais com 15 dias de desenvolvimento in vitro, foram tratadas com 1mM de L-cisteína diluída em DMEM sem soro por 2h, após este período o meio foi retirado e adicionado 2ml de DMEM sem soro sendo este meio coletado 4h depois e utilizado como meio condicionado nos experimentos de proteção celular.

2.3. CAPTAÇÃO DE L-[H³]-ARGININA

Para avaliar o tranporte de L-arginina utilizaremos culturas com 2, 4,6 e 8 dias de desenvolvimento. Estas serão incubadas independentemente em solução contendo L-[H³]-arginina (2,65Ci/ml),, NaCl 140 mM, KCl , 5 mM, HEPES 20 mM,

lavadas e as células rompidas com TCA 5%, sendo o conteúdo interno de radiação determinado por cintilação líquida. Para se verificar o efeito do NGF as culturas foram previamente tratadas por 24h com 100ng/ml, sendo este processo seguido pela exposição das células à L-[H³]-arginina como descrito anteriomente.

2.4. INTOXICAÇÃO DAS CULTURAS DE CÉLULAS DE RETINA COM MeHg O metil-mercúrio foi diluído em meio DMEM sem SBF para que se evitasse eventuais conjugações deste elemento com as proteínas presentes no soro. As culturas retinianas com oito dias de desenvolvimento in vitro foram expostas a diferentes concentrações de MeHg (1M, 10M, 100M e 1mM) por intervalos de 2h, 4h e 6h. O controle dos experimentos foi feito com culturas no mesmo estágio de desenvolvimento, sendo estas expostas a meio DMEM sem SBF por intervalos de 2h, 4h e 6h. Utilizamos também culturas controles com DMEM e 10% de SBF, no entanto, não foi observada diferença bioquímica no comportamento destas células em relação àquelas tratadas com meio sem SBF (dados não mostrados).

2.5. MEDIDA DA VIABILIDADE CELULAR PELO MÉTODO MTT

Para avaliar a viabilidade e a neurotoxicidade celular nas culturas de células de retina após a intoxicação com diferentes concentrações de MeHg, foi utilizada a análise colorimétrica com o corante MTT (thiazolil blue). O princípio da técnica baseia-se na capacidade que células viáveis apresentam de reduzir a forma oxidada do MTT a um composto de cor azulada, sendo o monitoramento desta redução feito por espectrofotometria como descrito por Mosman (1983).

Em placas controles e tratadas com MeHg, após a remoção do meio, foi feita uma lavagem com PBS estéril e posteriormente adicionado 550µl de PBS e 55μl

de MTT . As amostras foram incubadas por 4 horas, a partir das quais, foram homogeneizadas no mesmo meio para posterior leituras da absorvância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 570 nm. O branco da reação foi feito com a solução de PBS e MTT.

2.6. AVALIAÇÃO DO TRANSPORTE DE ³H-GLUTAMATO e ³H-CISTEÍNA EM CULTURAS RETINIANAS

Para avaliar a captação de ³H-glutamato e ³H-cisteína, as culturas mistas de células da retina controles e expostas ao MeHg serão lavadas com solução de Hank contendo 128mM de NaCl, 4mM de KCl, 1mM de MgCl2, 2mM de CaCl2, 12mM de glicose e 20mM de HEPES, e posteriormente, incubadas durante 5 minutos com ³ H-glutamato ou ³H-cisteína (1Ci/mL 0.2µCi/mL) e solução de Hank, de acordo com o método descrito por do Nascimento et al. (1998). Após os cinco minutos de incubação, as culturas serão lavadas com solução de Hank para retirada do excesso de ³ H-glutamato presente no meio. Em seguida as células serão rompidas com TCA (ácido tricloroacético) 5%. A quantidade de ³H-glutamato presente no interior da célula será determinada por cintilação líquida, sendo os valores expressos em percentagem da captação do controle.

2.7. HISTOQUÍMICA PARA NADPH-DIAFORASE

Culturas de retina controles e tratadas foram feitas em lamínulas previamente tratadas com poli-L-ornitina e fixadas com paraformadeído 5% por 30 minutos. Nos experimentos no qual utilizamos 10µM, 100µM e 1mM de MeHg por 4 horas o processo de fixação foi realizado após a intoxicação com MeHg. Após a fixação

preparadas duas soluções, sendo a primeira constituída de 300mg de ácido málico em tampão TRIS pH 8.0 NaOH 5M e a segunda com 15mg de nitro blue tetrazolium (NBT) diluído em 0,5ml de dimetil-sulfóxido (DMSO). Ambas as soluções foram misturadas, sendo nestas adicionadas posteriormente 50mg de -NADP, 20mg de cloreto de manganês (Mn2Cl) e 15ml de triton X-100 e o recipiente protegido da luz.

As culturas previamente fixadas, foram retiradas da geladeira e após 10 minutos incubadas por 3-4 horas a 37^oC com a solução acima descrita. Após o aparecimento da coloração nas células, a reação foi interrompida com 3 lavagens com TRIS-HCl pH 8.0. As lamínulas foram montadas em lâminas e fotografadas posteriormente em microscópio de luz comum.

2.8. MEDIDA DA ATIVIDADE DA NOS EM CULTURAS DE RETINA

A atividade da NOS foi medida de acordo com o método descrito por Bredt e Snyder (1990) com pequenas modificações. O princípio do ensaio baseia-se na capacidade da NOS de catalisar a formação equimolar de óxido nítrico e L-[H³ ]-citrulina a partir da L-[H³]-arginina, em um processo dependente de NADPH e cálcio-calmodulina.

Culturas com dois, quatro, seis e oito dias de desenvolvimento, assim como culturas controles e intoxicadas com 10M, 100M e 1mM de MeHg por intervalos de 2h, 4h e 6h, foram independentemente homogenadas em 1ml de tampão da NOS ( HEPES 50mM, Valina 1mM, DTT 0,1mM e CaCl2 2mM). Foram adicionados 50l deste homogenado em tubos de ensaio bioquímico contendo: 15l de calmodulina, 10l de NADPH 1mM e 25l de L-[H³]- arginina 5.8Ci/ml. O controle negativo da reação foi feito utilizando 15l de L-nitroarginina, que corresponde a um inibidor irreversível da NOS. A reação foi paralisada após 30 minutos com 2ml de ácido

triclórico (TCA 5%), sendo este processo sucedido por três lavagens consecutivas com 2ml de éter etílico absoluto. Para separação da L-[H³]-citrulina formada e a eventual L-[H³]-arginina não convertida pela NOS, as amostras foram eluídas através de colunas cromatográficas de trocas iônicas. Estas colunas consistem de um cilindro de vidro contendo a resina AG50-WX8 (SIGMA) que foram previamente ativadas com NaOH 1N. Esta ativação favorece a retenção da L-[H³]-arginina e a passagem da L-[H³ ]-citrulina formada pela NOS. Após a eluição, cerca de 200l das amostras individuais foram adicionadas em filtros de cintilação os quais foram secos a 100°C por 30 minutos.

O nível de radioatividade presente em cada experimento foi determinado utilizando espectrofotometria por cintilação líquida e os resultados expressos em fmoles de L-[H³ ]-citrulina/mg de proteína/minuto.

2.9. MEDIDA DOS NÍVEIS DE GLUTATIONA EM CULTURAS DE CÉLULAS DE RETINA INTOXICADAS COM MeHg

A determinação dos níveis intracelulares da forma reduzida de glutationa (GSH) foi feita baseada no método descrito por Anderson (1969) com pequenas modificações. O princípio desta técnica baseia-se na capacidade da GSH em reduzir o ácido-5,5-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) para ácido nitrobenzóico (TNB), o qual pode ser medido por espectrofotometria.

Inicialmente foi produzida uma curva de sensibilidade do DTNB para concentrações conhecidas de GSH (0 a 15g/ml), sendo que a linearidade observada neste intervalo de concentração nos permitiu determinar a função para o cálculo dos níveis de GSH presente nas amostras.

As culturas controles e intoxicadas com MeHg (1M, 10M, 50M,

ensaio, sendo 1ml deste volume separado para dosagem dos níveis totais de proteínas.

No volume restante foi adicionado 1ml de TCA 10%. As amostras foram centrifugadas a 5000rpm (rotações por minuto) por 10 minutos a 4°C, sendo o sobrenadante retirado para outro tubo e neste adicionado 2ml de éter etílico absoluto. O éter foi posteriormente retirado e cerca de 300l do volume restante foi adicionado em um tubo de ensaio contendo: 600l de PBS/EDTA 1mM, 100l de GSH redutase 100u/ml e 50l de NADPH 4mM. Após 15 minutos de reação, foi adicionado 50l de DTNB e a formação do TNB monitorada por espectrofotometria (comprimento de onda 412nm).

Os resultados foram expressos em mol de GSH/mg de proteína por minuto.

2.10. DOSAGEM DE PROTEÍNA

Para dosagem da proteína foram utilizados 200µl da amostra diluída 10X em NaOH 0,1N, foi adicionada em 2ml do reativo cupro-alcalino (RCA) (NaOH 0,1N;

carbonato de sódio 2%; sulfato de cobre 0,1%; e tartarato duplo de sódio e potássio 0,2%). Após 10 minutos foi adicionado o reativo fenólico Folin 2N, realizando-se a leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda de 750nm após 30 minutos, como descrito por Lowry (1951).

2.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes e cada grupo experimental foi formado por n=4-6. Para comparação entre os grupos adotamos Análise de Variância (ANOVA) utilizando o teste TUKEY post hoc do programa INSTAT3.0