UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Élen Rizzi Sanchez
Efeito da inibição das metaloproteinases da matriz extracelular e do tratamento com antioxidantes sobre as
alterações cardíacas decorrentes da hipertensão renovascular
Ribeirão Preto – SP 2010
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Élen Rizzi Sanchez
Efeito da inibição das metaloproteinases da matriz extracelular e do tratamento com antioxidantes sobre as
alterações cardíacas decorrentes da hipertensão renovascular
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências.
Área de concentração: Farmacologia
Orientadora: Profa. Dra. Raquel Fernanda Gerlach
Ribeirão Preto 2010
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Sanchez, Élen Rizzi
Participação das metaloproteinases da matriz extracelular nas alterações cardíacas associada à hipertensão renovascular: efeitos de antioxidantes. Ribeirão Preto, 2010.
123 p. : il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Farmacologia.
Orientadora: Gerlach, Raquel Fernanda.
1. Metaloproteinases. 2.Hipertrofia cardíaca. 4. Estresse oxidativo. 5.
Hipertensão renovascular.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Élen Rizzi Sanchez
Efeito da inibição das metaloproteinases da matriz extracelular e do tratamento com antioxidantes sobre as alterações cardíacas decorrentes da hipertensão renovascular
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências.
Área de concentração: Farmacologia Aprovado em:______________________________________
Banca examinadora:
Profa. Dra.: Raquel Fernanda Gerlach
Instituição: FORP - USP Assinatura: _________________________
Profa. Dra.: Lusiane Maria Bendhack
Instituição: FCFRP - USP Assinatura: _________________________
Profo. Dro.: Marcus Vinicius Simões
Instituição: FMRP - USP Assinatura: _________________________
Profo. Dro.: Kleber Gomes Franchini
Instituição: FCM - UNICAMP Assinatura: _________________________
Profo. Dro.: Sérgio Roberto Peres Line
Instituição: FOP - UNICAMP Assinatura: _________________________
Dedico esse trabalho aos meus pais, meu marido e aos meus amigos, pela dedicação, amor e por acreditarem sempre em mim.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que me acompanhou em todos os momentos e abençoou os caminhos que percorri durante toda minha vida.
Ao meu marido e amigo Juliano que me compreende e ainda alegra os meus dias.
Obrigada por suportar todos os meus problemas com tanto carinho e paciência.
À minha família que nos momentos difíceis foram minha sustentação. Obrigada pelo carinho, respeito, amor e especialmente, pela educação e ensinamentos. Obrigada por existirem em minha vida!
À professora Raquel Fernanda Gerlach meus agradecimentos e respeito por tudo que me ensinou. Guardarei com muito carinho e gratidão todos os seus ensinamentos. Muitas vezes se importou comigo pessoalmente, me ajudando a enfrentar diversos problemas e se orgulhou comigo a cada conquista. Foi gratificante trabalhar no seu laboratório e aprender com você.
Ao professor José Eduardo Tanus dos Santos pela paciência, confiança, oportunidade e ensinamentos acadêmicos. Agradeço especialmente a orientação que contribuiu muito para meu crescimento profissional. Alguns conselhos e frases eu levarei comigo para sempre e praticarei diariamente.
Ao professor Marcos Antonio Rossi por todos os ensinamentos. Agradeço por todos os aprendizados que obtive em seu laboratório. Obrigada pela paciência, disposição, respeito e atenção de sempre. Sábias palavras quando ditas no momento certo, são muito bem aproveitadas e jamais serão esquecidas.
Agradeço aos professores Dra Lusiane Maria Bendhack, Dro. Marcus Vinicius Simões, Dro. Kleber Gomes Franchini e Dro. Sérgio Roberto Peres Line a disponibilidade de fazer parte desta banca e a atenção concedida. Agradeço também à Dra. Lusiane por todos os ensinamentos e agradável convivência durante estes anos.
À minha amiga Michele que fez parte deste trabalho, mas especialmente fez parte de minha vida e carreira. Sua amizade é fundamental para mim e me ajudou a superar diversos momentos. Agradeço a paciência e carinho, além do respeito que conquistamos dia a dia nessa amizade. "O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis" (Fernando Pessoa).
Ao apoio financeiro da CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico).
Ao professor Dr. Rubens Fazan Junior pela atenção e colaboração com este trabalho.
À professora Dra. Maria Cristina pela atenção, compreensão, incentivo e ensinamentos acadêmicos.
Ao excelente apoio dos amigos e técnicos Maria Helena, Beto, Elaine, Júnia, Mônica e Orlando. Sempre me ajudaram com muita dedicação, responsabilidade e com uma qualidade admirável. Foi um prazer e muito produtivo trabalhar com todos vocês.
Aos meus amigos queridos Carla, Bárbara e ao Evandro que se dedicaram muito seriamente a este trabalho.
À amiga Cibele por todos os ensinamentos e dedicação. Agradeço pela preocupação, prontidão e por toda ajuda. Foi um prazer trabalhar com você, especialmente por sua competência e seriedade profissional.
Aos amigos Carla, Danielle, Stefany e Alisson pela amizade, carinho e compreensão. Obrigada por tudo que fizeram por mim, por estarem ao meu lado nos momentos ruins e bons, me escutarem e se preocuparem comigo.
Ao grupo hipertensão pelos momentos que vivemos juntos, tão intensos quando ruins e tão imensos quando bons. É um privilégio trabalhar e conviver nesse grupo.
Obrigada pelo carinho, compreensão e preocupação. Agradeço especialmente pelo respeito e admiração que conquistamos uns com os outros, dia a dia.
Às minhas amigas Izabel, Glauce, Andréa, Andrezza, Ana Laura e ao amigo César pelo carinho e amizade de sempre. Obrigada pelas conversas, conselhos e por todos os momentos que convivemos juntas.
Aos amigos do laboratório da professora Raquel, do professor José Eduardo e do professor Marcos Antonio Rossi pela convivência, paciência, carinho e apoio de sempre.
Aos funcionários Ramon, Fátima e Sonia pelo excelente auxílio técnico, pela competência e prontidão para resolver meus problemas. Agradeço a amizade que colaboraram direta ou indiretamente para meu crescimento pessoal e profissional.
Aos funcionários do biotério da FORP, especialmente ao Sérgio, pela competência, profissionalismo e disposição. Agradeço também a todos os funcionários e amigos do departamento de Farmacologia pela amizade e serviços prestados.
“A sabedoria não nos é dada. É preciso descobri-la por nós mesmos, depois de uma viagem que ninguém nos pode poupar ou fazer por nós."
(Valentin-Louis-Georges-Eugène-Marcel Proust)
RESUMO
Sanchez, E. R. Efeito da inibição das metaloproteinases da matriz extracelular e do tratamento com antioxidantes sobre as alterações cardíacas decorrentes da hipertensão renovascular.2010. 123 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é frequentemente acompanhada por hipertrofia ventricular esquerda (HVE) que contribui para as altas taxas de mortalidade por doenças cardiovasculares associadas à HAS. As metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs), enzimas que degradam constituintes da matriz, estão aumentadas no miocárdio em diversos modelos experimentais de HVE, incluindo HAS. Recentemente, foi mostrado que a MMP-2 pode ser uma das principais proteases envolvidas nas alterações morfológicas e funcionais cardíacas. O estresse oxidativo é um dos fatores presentes na HAS e poderia ativar as MMPs devido à ativação da NADPH oxidase em resposta à angiotensina II. Devido ao aumento de angiotensina II e estresse oxidativo observado no modelo experimental 2 rins, 1 clipe (2R1C), estes animais foram escolhidos para a realização deste trabalho. Os objetivos deste trabalho foram (1) Verificar se aumentos nas concentrações e atividade das MMPs (especialmente MMP-2) podem contribuir para as alterações cardíacas associadas à hipertensão renovascular (2R-1C); e (2) verificar se o estresse oxidativo modula as concentrações e atividade da MMP-2 contribuindo para para as alterações cardíacas associadas à hipertensão 2R-1C. Para isso, foi utilizada a doxiciclina, um inibidor não seletivo de MMPs e drogas antioxidantes (tempol e apocinina). A HAS foi acompanhada durante todo o período do estudo por pletismografia de cauda e no final dos tratamentos, este parâmetro também foi avaliado através de uma análise invasiva. Todos os tratamentos atenuaram os
aumentos na pressão arterial nos animais 2R1C (P<0,05). Porém, a pressão arterial nos animais 2R1C tratados com doxiciclina ou antioxidantes permanceram elevadas no final do tratamento em comparação com seus respectivos controles (P<0,05). Os tratamentos com doxiciclina ou antioxidantes atenuaram as disfunções na contratilidade cardíaca nos animais 2R1C, avaliadas através da primeira derivada temporal de pressão ventricular (±dP/dt, P<0,05). A HVE foi verificada através de análises morfológicas e de um índice do peso cardíaco. Através destes parâmetros, foi encontrado que os animais 2R1C (sem tratamento) apresentaram HVE com características adaptativas. Os tratamentos com doxiciclina e antioxidantes atenuaram a HVE nos animais 2R1C (P<0,05). Além das disfunções morfofuncionais observadas nos animais 2R1C (não tratados), foram encontrados aumentos significativos nas concentrações de MMP-2 no miocárdio detectados por zimografia em gel, bem como por imunomarcação (P<0,05). Estes aumentos ocorreram em paralelo ao aumento na atividade gelatinolítica total observado por zimografia in situ no ventrículo esquerdo dos animais 2R1C (P<0,05). Os tratamentos com doxiciclina e antioxidantes não afetaram as concentrações de MMP-2 no miocárdio dos animais 2R1C (P>0,05). Porém, estes tratamentos reduziram a atividade gelatinolítica nos animais hipertensos (P<0,05). Os antioxidantes reduziram o estresse oxidativo presente no miocárdio dos animais 2R1C (P<0,05). Em conjunto, nossos resultados sugerem que as MMPs, especialmente a MMP-2, participem das alterações cardíacas associadas à hipertensão 2R1C. Além disso, o estresse oxidativo pode estar relacionado com a ativação das MMPs observada neste modelo de hipertensão. Palavras-chave: hipertrofia cardíaca, metaloproteinases, hipertensão renovascular, estresse oxidativo.
ABSTRACT
Sanchez, E. R. Effects of matrix metalloproteinases and antioxidant treatment on the cardiac alterations induced by renovascular hypertension. 2010. 123f.
Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.
Systemic arterial hypertension (SAH) is frequently followed by left ventricular hypertrophy (LVH) that contributes to higher mortality rates in hypertension induced- cardiovascular diseases. The matrix metalloproteinases (MMPs), enzymes responsible for extracellular matrix degradation, are increased in the myocardium of animals in various experimental models of left ventricular hypertrophy (LVH), including hypertension. It has been recently shown that MMP-2 may be one of the most important proteases involved in the structural and functional alterations of the heart. Oxidative stress described in SAH may activate MMPs, due to the angiotensin II induced-NADPH oxidase activation. Since angiotensin II and oxidative stress are increased in the 2 kidney, 1 clip (2K1C) hypertensive rats, this experimental model of hypertension was chosen for this study, whose aims were: (1) to evaluate whether the increase of MMPs (particularly MMP-2) levels and activity may contribute to cardiac alterations found in renovascular hypertension (2K1C), and (2) to assess whether oxidative stress modulates MMP-2 levels and activity, contributing for the cardiac alterations found in 2K1C rats. To test these hypotheses doxycycline and antioxidants drugs (tempol and apocyanin) were used as treatment. The hypertension was evaluated during all study by tail-cuff pletysmography; and at the end of the study the blood pressure was evaluated by invasive analysis. All treatments attenuated the increases in blood pressure from 2R1C animals (P<0.05).
However, the blood pressure of 2K1C rats treated with doxycycline or antioxidants
drugs was still higher than that of the respective control animals at the end of the experiment (P<0.05). The treatments with doxycycline or antioxidants attenuated the cardiac contractile dysfunction in 2K1C rats, assessed by the first derivative of left ventricular pressure (±dP/dt) analysis (P<0.05). The LVH was evaluated by morphological analysis and by cardiac weight and body weight ratio. The 2K1C untreated rats showed adaptive characteristics of LVH. The doxycycline or antioxidant treatments attenuated the LVH in 2K1C animals (P<0.05). In parallel to all these structural and functional alterations in the heart of 2K1C untreated rats, we found that cardiac MMP-2 levels were increased by gelatin zymography and by immunohistochemistry (P<0.05). The treatments with doxycycline and antioxidants did not affect the cardiac MMP-2 levels from 2K1C rats. However, these treatments did reduce the total gelatinolytic activity observed by in situ zymography (P<0.05).
The antioxidant treatments reduced oxidative stress present in 2K1C animals (P<0.05). In conclusion our results suggest that MMPs, particularly MMP-2, contribute to cardiac alterations associated to 2K1C hypertension. Furthermore, the oxidative stress may be associated with activation of MMPs present in this model of hypertension. Key words: Cardiac hypertrophy, metalloproteinases, Renovascular hypertension and oxidative stress.
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 2R1C – Dois-rins, um-clipe
ANOVA – Análise de Variância APS- Persulfato de amônio BH4 - Tetrahidrobiopterina BSA- Albumina do soro bovino CaCl2- Cloreto de cálcio
DHE- Dihidroetídeo DNA- Ácido ribonucleico
DQ gelatin- Substrato fluorescente para determinar a atividade gelatinolítica EPM- Erro padrão da média
EROS- Espécies reativas de oxigênio g- Gramas
µg- Microgramas H+- Hidrogênio
H2O2- Peróxido de hidrogênio i.p.- Intra peritoneal
HCl- Ácido clorídrico
HVE- Hipertrofia ventricular esquerda H&E- Hematoxilina e eosina
K+- Potássio
KCl- Cloreto de potássio KDa- Quilodaltons Kg- Quilograma
KH2PO4- Hidrogenofosfato de potássio
L- Litro
µL- Microlitros M- Molar mM- Milimolar µmol- Micromol mmol – Milimol mL- Mililitros mg- Miligramas
mmHg – Milímetros de mercúrio MMPs- Metaloproteinases MgSO4- Sulfato de magnésio MT-MMPs- MMP de membrana N- Número
nmol- Nanomol Na+- Sódio
NaCl- Cloreto de sódio
NADPH - β-Nicotinamida adenosina dinucleotído fosfato NEM – N-etilmaleimida
NaHCO3- Bicarbonato de sódio
.O2-Ânion superóxido
OCT- Composto para congelar tecidos OH-- Radical hidroxil
OONO-- Peroxinitrito PA- Pressão arterial PAD- Padrão interno
PBS- Tampão salina fosfato PFA- Paraformaldeído
pH- Potencial hidrogeniônico PMSF- Fenilmetilsulfonil
RLU- Unidades relativas de luminescência RNAm- Ácido ribonucleico mensageiro SDS- Dodecil sulfato de sódio
Sham- Rato controle
SHR- Ratos espontaneamente hipertensos SRAA- Sistema renina-angiotensina-aldosterona TBA- Ácido tiobarbitúrico
TBARS- Espécies reativas do ácido tiobarbitúrico TEMED- Tetrametil etilenodiamina
TIMPs- Inibidores endógenos de MMPs U.A.– unidades arbitrárias
VSMC- Células musculares lisas vasculares ZnCl2- Cloreto de zinco
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Carcterística morfológica do remodelamento cardíaco decorrente da
hipertensão arterial crônica ...24
Figura 2 – Aumento na deposição de colágeno em pacientes com hipertesão arterial crônica...26
Figura 3 – Principais MMPs e suas características estruturais...28
Figura 4 – Esquema ilustrativo da modulação na formação de espécies reativas do oxigênio ...35
Figura 5 – Esquema ilustarativo da importância da NADP(H) oxidase na hipertrofia cardíaca...36
Figura 6 – Esquema ilustarativo da ativação de MMPs por EROs ...39
Figura 7 – Efeitos da doxiciclina sobre a pressão arterial ...62
Figura 8 – Efeito da doxiciclina sobre a contratilidade cardíaca...65
Figura 9 – Efeito da doxiciclina sobre as alterações estruturais associadas à hipertensão 2R1C ...67
Figura 10 – Efeito da doxiciclina sobre a hipertrofia dos miócitos associadas à hipertensão 2R1C ...68
Figura 11 – Efeito da doxiciclina sobre as concentrações cardíacas de MMP-2...70
Figura 12 – Efeito da doxiciclina sobre a atividade gelatinolítica in situ e para expressão da MMP-2 por imunofluorescência ...72
Figura 13 – Efeito dos antioxidantes sobre a pressão arterial ...75
Figura 14 – Efeito da doxiciclina sobre a contratilidade cardíaca ...77
Figura 15 – Efeito dos antioxidantes sobre as alterações estruturais associadas à hipertensão 2R1C ...79
Figura 16 – Efeito dos antioxidantes sobre a hipertrofia dos miócitos associadas à hipertensão 2R1C ...80 Figura 17 – Efeito dos antioxidantes sobre as concentrações cardíaca de EROs ...82 Figura 18 – Efeito dos antioxidantes sobre as concentrações cardíaca de MMP-2 ...84 Figura 19 – Efeito dos antioxidantes sobre a atividade gelatinolítica in situ e para expressão da MMP-2 por imunofluorescência ...86
Tabelas
Tabela 1 – Valores de Freqüência cardíaca, Peso do coração, Peso corporal e Razão entre peso cardíaco e peso corporal...63 Tabela 2 – Valores de Frequência cardíaca, Peso do coração, Peso corporal Razão entre Peso Cardíaco e Corporal e Espessura da Câmera Ventricular Esquerda...74
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ...22
1 - Hipertensão arterial...22
2. Remodelamento cardíaco associado à HAS...23
2.1. Remodelamento da matriz extracelular cardíaca (MEC) associado à HAS .25 3. Metaloproteínases da matriz extracelular ...27
3.1. Importância da MMP-2 para as alterações morfofuncionais cardíacas associadas à hipertensão ...29
3.2. Mecanismos de ação da MMP-2 independentes da degradação da matriz extracelular cardíaca (MEC) ...31
3.3. Inibição da MMP-2 como estratégia terapêutica...32
4. Importância do estresse oxidativo para a hipertrofia cardíaca ...33
5. Possível envolvimento de EROs com MMPs ...38
HIPÓTESE ...43
OBJETIVOS...45
MATERIAIS E MÉTODOS ...47
1 - Considerações gerais ...47
1.1 - Hipertensão arterial induzida pela técnica de Goldblatt:...47
1.2 - Grupos experimentais...48
2 - Materiais ...49
2.1 - Soluções utilizadas nos experimentos:...49
2.2 - Drogas administradas diretamente nos animais:...51
2.3 - Equipamentos utilizados nos experimentos:...51
2.4 - Programas de aquisição de dados: ...51
3 - Métodos ...52
3.1 - Parâmetros hemodinâmicos ...52
3.1.1 - Avaliação da pressão arterial sistólica e peso corporal...52
3.1.2 - Avaliação da contratilidade cardíaca...52
3.2 - Parâmetros estruturais ...53
3.2.1 - Análise morfológica do coração ...53
3.3 - Parâmetros bioquímicos e moleculares...54
3.3.1 - Determinação de espécies reativas de oxigênio in situ...54
3.3.2 - Determinação dos níveis de MMP-2 por zimografia em gel ...55
3.3.2.A - Dosagem de proteína pelo método de Bradford ...55
3.3.2.B - Eletroforese em gel de poliacrilamida 12%...56
3.3.3 - Determinação da atividade gelatinolítica por zimografia In situ...57
3.3.4 - Imunofluorescência para MMP-2...58
4 - Análise estatística ...59
RESULTADOS...61
1 - PROTOCOLO 1: Efeitos cardíacos do tratamento de ratos 2R1C com doxiciclina ...61
1.1 - Efeito da doxiciclina sobre a pressão arterial sistólica e peso corporal: ...61
1.2 – Efeito da doxiciclina sobre a contratilidade cardíaca em ratos 2R1C: ...64
1.3 – Efeito da doxiciclina sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R-1C:...66
1.3 – Efeito da doxiciclina sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R-1C:...66
1.4 - Efeito da doxiciclina na expressão da MMP-2 e na atividade das MMPs: ..69
2 - PROTOCOLO 2: Efeitos cardíacos do tratamento de ratos 2R1C com antioxidantes...73
2.1 - Efeito dos tratamentos antioxidantes sobre a pressão arterial sistólica e peso corporal ...73
2.2 – Efeitos dos antioxidantes sobre a contratilidade cardíaca em ratos 2R1C:...76 2.3 – Efeito dos antioxidantes sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R1C:...78 2.4 - Efeito dos antioxidantes sobre as concentrações de EROs em ratos 2R1C:...81 2.5 - Efeito dos antioxidantes sobre a expressão da MMP-2 e a atividade das MMPs:...83
DISCUSSÃO ...88
CONCLUSÃO ...99
REFERÊNCIAS...101
ANEXOS ...114
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
1 - Hipertensão arterial
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é um crescente problema de saúde pública que afeta aproximadamente 25% da população mundial (Kearney, Whelton et al. 2005). No Brasil, de acordo com dados epidemiológicos, a hipertensão atinge aproximadamente 43,9% da população urbana adulta (Freitas, Resende de Carvalho et al. 2001) e sua incidência aumenta proporcionalmente com a idade (Chobanian, Bakris et al. 2003). A HAS é responsável por aproximadamente 7,1 milhões de mortes por ano (Chobanian, Bakris et al. 2003) decorrentes principalmente, das suas complicações no aparelho cardiovascular, tais como doença arterial coronariana, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca e insuficiência renal, dentre outras (Chobanian, Bakris et al. 2003).
A fisiopatologia da HAS é considerada poligênica e multifatorial envolvendo alterações morfológicas e funcionais no sistema cardiovascular. Neste contexto, é crescente o número de evidências sugerindo que o estresse oxidativo (Cai and Harrison 2000; Griendling, Sorescu et al. 2000; Lassegue and Griendling 2004;
Escobales and Crespo 2005) e o aumento de metaloproteinases da matriz extracelular (Galis and Khatri 2002; Lehoux, Lemarie et al. 2004; Raffetto and Khalil 2008) estão associados às disfunções morfofuncionais nos vasos e coração, presentes nesta doença.
Devido à importância dessa doença para a saúde pública, muitos estudos fazem uso de modelos experimentais para uma melhor compreensão e descrição dos mecanismos envolvidos na HAS. O modelo de hipertensão renovascular 2 rins,
1 clipe (2R1C) apresenta altas concentrações de angiotensina II e espécies reativas de oxigênio (EROs) (Lerman, Chade et al. 2005), que são fatores de fundamental interesse para este trabalho.
Harry Goldblatt, em 1934, desenvolveu o modelo de hipertensão renal 2R1C pela constrição da artéria renal de cães com auxílio de um clipe, sendo que o rim contra lateral permanece intacto. O clampeamento de um dos rins promove ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) que está envolvido na fisopatologia da hipertensão arterial devido à vasoconstrição acentuada e retenção de sódio e água. Observa-se um aumento progressivo na pressão arterial nesse modelo experimental, associado à hipertrofia cardíaca, hipertrofia vascular e disfunção endotelial, dentre outras alterações (Griendling, Lassegue et al. 1996;
Welch, Mendonca et al. 2003; Levy 2005). Angiotensina II tem sido descrita como um dos principais mediadores envolvidos nessas disfunções (Martinez-Maldonado 1991), principalmente devido à formação de EROs via ativação da β-nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH oxidase) (Seshiah, Weber et al. 2002; Touyz 2004). Estudos prévios em nosso laboratório, mostraram um aumento de MMP-2 e EROs na aorta de ratos 2R1C, porém nenhum estudo avaliou as concentrações de MMP-2 no coração desses animais (Castro, Rizzi et al. 2008; Martinez, Castro et al.
2008; Ceron, Castro et al. 2010).
2. Remodelamento cardíaco associado à HAS
A HAS é frequentemente acompanhada por hipertrofia ventricular esquerda (HVE) (Levy, Larson et al. 1996); (Kannel, Levy et al. 1987). A hipertrofia do miocárdio ocorre como resposta morfológica adaptativa, compensatória, cujo
objetivo é normalizar o aumento da tensão na parede do VE (Lorell and Carabello 2000). Essa hipertrofia caracteriza-se pelo aumento da massa cardíaca normal, devido ao aumento no volume dos miócitos, que pode ser decorrente da síntese e deposição de novos sarcômeros. Com a hipertrofia dos cardimiócitos, a espessura da parede ventricular esquerda fica aumentada e a câmara do VE diminuída, podendo apresentar disfunção diastólica e sistólica (Berk, Fujiwara et al. 2007) (Figura 1).
Figura 1. Característica morfológica do remodelamento cardíaco decorrente da hipertensão arterial crônica. Aumento crônico da pressão arterial (PA) promove inicialmente, aumento na espessura da parede do ventrículo esquerdo e diminuição da câmara ventricular esquerda. Aumento crônico e persitente da PA direciona a progressão do remodelamento adaptativo para o remodelamento mal-adaptativo. O coração se mantém hipertrofiado com diminuição na espessura da parede do VE e aumento na câmara ventricular esquerda. Imagens gentilmente cedidas pelo professor Marcos Antonio Rossi.
Embora a hipertrofia seja adaptativa, compensatória, o remodelamento do VE pode progredir para uma hipertrofia descompensada, mal-adaptativa. Nesta fase, os miócitos ainda se mantêm com aumento de volume. Entretanto, estas células se alongam e promovem dilatação da câmara ventricular esquerda. Normalmente nessas condições, ocorre diminuição na contratilidade cardíaca com disfunção
Coração normal Coração hipertrofiado (remodelamento adaptativo)
Coração hipertrofiado (remodelamento mal-adaptativo)
A B C
sistólica e diastólica (Opie, Commerford et al. 2006). Em função disso, a capacidade do coração de bombear o sangue fica prejudicada, insuficiente. Assim sendo, HVE é um importante fator de risco para insuficiência cardíaca (IC) e mortalidade por doenças cardiovasculares (Levy, Garrison et al. 1990) (Figura 1C).
2.1. Remodelamento da matriz extracelular cardíaca (MEC) associado à HAS Paralelamente às alterações celulares, na HVE ocorrem modificações na composição bioquímica da matriz extracelular, cujo principal componente é o colágeno. O estroma do coração mantém a estrutura do miocárdio assim, contribuindo para a função ventricular através da transmissão de força gerada pelos miócitos para as câmaras atrial e ventricular e para o realinhamento dos miócitos durante a diástole (Robinson, Cohen-Gould et al. 1983; Robinson, Factor et al. 1986;
Robinson, Factor et al. 1987). Em relação à hipertensão, Rossi e colaboradores mostraram que quanto mais severa for a HVE, maior é a deposição de colágeno na matriz extracelular do VE de pacientes hipertensos (Figura 2) (Rossi 1998). Outros autores sugerem que essa fibrose está associada à progressivas disfunções no enchimento ventricular diastólico e comprometimento no relaxamento dos miócitos.
Dessa maneira, na HVE inicialmente ocorre disfunção diastólica e finalmente, disfunção sistólica (Weber, Jalil et al. 1989; Weber, Pick et al. 1989; Pearson, Pasierski et al. 1991; Swynghedauw 1999).
Figura 2. Matriz extracelular de VE de humanos após digestão celular. Aumento na deposição de colágeno em pacientes com hipertesão arterial crônica. As setas indicam deposição de colágeno acentuada nos pacientes com hipertensão, quando comparados com pacientes controles. End: endomísio e Per: perimísio (Modificado de Rossi 1998).
Em condições normais, a síntese e degradação de colágeno é controlada por fibroblastos. Entretanto, em condições patológicas, fatores como angiotensina II, fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1) e aldosterona, estimulam o aumento da síntese de colágeno levando à formação de fibrose. Além do aumento na deposição de colágeno, também pode ocorrer aumento de sua degradação, promovendo alterações na integridade da MEC. (Opie, Commerford et al. 2006;
Berk, Fujiwara et al. 2007).
A degradação do colágeno pode estar envolvida na progressão do remodelamento hipertrófico adaptativo para mal-adaptivo (Bradham, Bozkurt et al.
2002; Iwanaga, Aoyama et al. 2002; Opie, Commerford et al. 2006; Takenaka, Kihara et al. 2006). Alguns autores sugerem que o aumento de proteínas que
Paciente Controle Paciente
degradam a matriz extracelular inicia-se na HVE adaptativa promovendo desestruturação da MEC (Peterson, Hallak et al. 2001; Iwanaga, Aoyama et al. 2002;
Takenaka, Kihara et al. 2006). Com isso, os miócitos se alongam e promovem dilatação da câmara ventricular esquerda (Opie, Commerford et al. 2006). Pelos motivos expostos, proteínas que degradam a matriz extracelular possuem fundamental importância no remodelamento cardíaco e muitos estudos evidenciam uma contribuição das metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs) para esse processo (Spinale 2007).
3. Metaloproteínases da matriz extracelular
Metaloproteinases da matriz extracelular são endopeptidases cálcio- dependentes responsáveis pela degradação da matriz extracelular. São expressas em várias células e tecidos, inclusive nas células do músculo liso vascular, músculo cardíaco, endotélio vascular, fibroblastos e células inflamatórias (Nagase and Woessner 1999; Schulz 2007). Atualmente, são conhecidas mais de 28 MMPs, que se subdividem em famílias como colagenases, estromelisinas, matrilisinas, MMPs de membrana (MT-MMPs) e gelatinases. As metaloproteinases apresentam domínios estruturais semelhantes (Figura 3), que se diferem pela especificidade em relação aos seus substratos (Nagase, Visse et al. 2006).
Seqüência Sinal
Pró-peptídeo Domínio contendo cisteína
Domínio Hemopexin Domínio
Domínios
“Fibronectin like”
Domínio Transmembrânico Domínio Citosólico Porção
Peptídeo de ligação Sítio de
clivagem por furinas MMPs de membrana
Matrilisinas MMP-7, -26 Colagenases (MMP-1,-8,-13)
Estromelisinas (MMP-3,-10)
Figura 3. Principais MMPs e suas características estruturais. As gelatinases MMP-2 e MMP-9 se diferem das demais, apresentando três domínios “fibronectin-like”
(Modificado de Chow, Cena et al. 2007).
Essas proteases são sintetizadas e secretadas como pró-forma latente (zimogênios), e sua atividade depende, na maioria das vezes, da ruptura dos seus domínios pró-peptídicos, do sítio ativo da enzima (Visse and Nagase 2003; Schulz 2007). Dessa forma, a regulação das MMPs pode ser feita por indução da expressão gênica e ativação do zimogênio. Além disso, a atividade das MMPs ainda pode ser regulada pelos inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs)(Donnelly, Collinson et al. 2003).
Uma vez em sua forma ativa, as MMPs participam do processo fisiológico de remodelamento da matriz extracelular (MEC) pela degradação de vários
componentes da matriz extracelular, incluindo componentes da membrana basal, colágeno intersticial, fibronectina e várias proteoglicanas (Ohbayashi 2002; Visse and Nagase 2003). Porém, a atividade excessiva ou desequilibrada de MMPs pode estar associada à patogênese de várias doenças como: doenças neoplásicas (Murphy and Nagase 2008; Kessenbrock, Plaks et al. 2010), doenças inflamatórias crônicas (Nagase and Woessner 1999) e doenças cardiovasculares (Spinale, Coker et al. 2000; Lynch, Blessing et al. 2004; Schulz 2007; Spinale 2007; Schulz 2009).
3.1. Importância da MMP-2 para as alterações morfofuncionais cardíacas associadas à hipertensão
A MMP-2, também conhecida como gelatinase A, é constitutivamente expressa em vários tecidos, inclusive no coração. Como observado na figura 3, a MMP-2 possui domínios “fibronectin like” que confere a ela a capacidade de clivar elastina, fibronectina e colágeno especialmente do tipo IV, que é o principal componente da lâmina basal (Murphy and Nagase 2008). Assim como outras MMPs, essa gelatinase contribui para o remodelamento tecidual.
Um aumento significativo na expressão e atividade da MMP-2 no soro, tecidos vasculares e cardíacos tem sido evidenciado em estudos clínicos e em diferentes modelos de hipertensão experimental (Castro, Rizzi et al.; Peterson, Hallak et al. 2001; Yasmin, McEniery et al. 2005; Castro, Rizzi et al. 2008; Rizzi, Castro et al. 2009), o que indica que a MMP-2 pode participar da fisiopatologia da HAS.
Aumento da atividade da MMP-2 cardíaca foi associado à progressão da hipertrofia cardíaca em animais hipertensos, sugerindo que a MMP-2 aumentada,
pode contribuir para dilatação da câmara cardíaca (Iwanaga, Aoyama et al. 2002).
Camundongos transgênicos, que apresentam superexpressão de MMP-2 no miocárdio, sem apresentar quadro patológico, desenvolveram hipertrofia dos miócitos, fibrose e dilatação da câmara ventricular esquerda. Todas essas alterações associadas ao aumento de MMP-2 são características da HVE mal- adaptativa, sugerindo que esta gelatinase contribui para o remodelamento mal- adaptativo (Bergman, Teerlink et al. 2007).
Para avaliar se a diminuição da MMP-2 poderia contribuir para uma redução nas alterações cardíacas, foi realizado estudo com animais “knockouts” para MMP-2 em modelo experimental de coarctação de aorta (Matsusaka, Ide et al. 2006). Nesse estudo, os autores observaram qua a HVE foi reduzida nos animais “knockouts”
indicando a contribuição da MMP-2 para hipertrofia cardíaca. O modelo de coarctação de aorta, assim como a HAS, também induz HVE devido ao aumento na sobrecarga cardíaca, reforçando a hipótese de que a inibição da MMP-2 poderia contribuir para o tratamento da HVE associada à HAS.
Em conjunto, esses resultados sugerem uma relação causal entre aumento da MMP-2 e a progressão da HVE, o que poderia ser testado com inibidores desta enzima.
A participação da MMP-2 no remodelamento cardíaco envolve principalmente a síntese e degradação ( “turnover”) de colágeno. Como comentado anteriormente, a degradação de colágeno é um dos mecanismos propostos para dilatação da câmara ventricular esquerda que ocorre na progressão do remodelamento cardíaco associado à HAS (Peterson, Hallak et al. 2001; Iwanaga, Aoyama et al. 2002;
Takenaka, Kihara et al. 2006). A MMP-2 pode ativar vias de sinalização intracelular
que culminam em apoptose, que poderia estar envolvida com disfunções morfofuncionais da hipertrofia cardíaca (Schulz 2009). Além desses mecanismos, foi demonstrado que a MMP-2 pode contribuir para ativação do receptor para fator de crescimento epidermal (EGFr) (Wang, Zhao et al. 2006), ativação do fator de necrose tumoral-α (TNF- α ) (Manso, Elsherif et al. 2006) e ativação do fator de TGF- β1 que são fatores críticos envolvidos na via de sinalização da hipertrofia celular
(Manso, Elsherif et al. 2006; Wang, Chow et al. 2009). Sendo assim, a ativação da MMP-2 encontrada na HAS, pode estar envolvida tanto na hipertrofia da MEC, como na hipertrofia dos cardiomiócitos.
3.2. Mecanismos de ação da MMP-2 independentes da degradação da matriz extracelular cardíaca (MEC)
Recentemente, foi demonstrado que a MMP-2 está presente não somente na MEC, mas também no citoplasma dos cardiomiócitos, interage com troponina I e a miosina de cadeia leve, prejudicando o funcionamento da maquinaria contrátil do coração (Wang, Schulze et al. 2002; Sawicki, Leon et al. 2005). Nesses trabalhos, os autores mostram que a inibição da MMP-2 melhora a disfunção ventricular associada à isquemia cardíaca. Assim, além da função de degradação da MEC, a MMP-2 também pode ser importante para a contração cardíaca (Wang, Schulze et al. 2002; Sawicki, Leon et al. 2005). Outros autores mostram que a MMP-2 pode estar localizada dentro do núcleo de cardiomiócitos, podendo degradar proteínas envolvidas na reparação do DNA (poli (ADP-ribose) polimerase – PARP) (Kwan, Schulze et al. 2004). Até o momento, a MMP-2 é a única MMP descrita no interior dos cardiomiócitos.
3.3. Inibição da MMP-2 como estratégia terapêutica
Não existem inibidores seletivos para MMP-2 comercialmente disponíveis. Por isso, muitos trabalhos fazem uso do inibidor não seletivo de MMPs, doxiciclina (Schulz 2007; Spinale 2007). Doxicilina é um antibiótico da classe das tetraciclinas que quando administrado em doses subantimicrobianas atua como um potente inibidor de MMPs (Golub, Lee et al. 1998). Atualmente, a doxiciclina é um medicamento aprovado pelo FDA (Food and Drugs Administration) chamado Periostat®, utilizado como inibidor de MMPs para o tratamento de doença periodontal. Por ser medicamento em uso e pelo seu baixo custo, a doxicicilina é particularmente interessante como ferramenta farmacológica.
A inibição não seletiva de MMPs por doxiciclina promoveu efeitos benéficos em modelos animais de remodelamento e disfunção cardíaca, como por exemplo, infarto do miocárdio e isquemia/reperfusão (Griffin, Jinno et al. 2005; Garcia, Go et al. 2007). Não existem estudos que avaliaram os efeitos da doxiciclina no coração de animais hipertensos. Porém, um outro inibidor não-seletivo de MMPs (PD166793) foi avaliado em ratos espontaneamente hipertensos (SHR, do inglês spontaneous hypertensive rats), que é um modelo animal de progressão de insuficiência cardíaca (Peterson, Hallak et al. 2001). O inibidor de MMPs foi administrado nos animais por 4 meses, iniciando o tratamento após 9 meses de HAS, período no qual os animais apresentaram hipertrofia adaptativa, confirmada pelo aumento na espessura do VE e da força de contração cardíaca. Os resultados mostraram que a inibição de MMPs (por 4 meses) impediu a progressão da hipertrofia adaptativa para insuficiência cardiaca nos animais SHR, após 13 meses de HAS (Peterson, Hallak et al. 2001).
Embora alguns estudos tenham mostrado aumento da atividade da MMP-2 na hipertensão arterial (Yasmin, McEniery et al. 2005; Castro, Rizzi et al. 2008) e no remodelamento cardíaco (Spinale, Coker et al. 2000), nenhum estudo até o momento, mostrou se a MMP-2 pode participar das alterações cardíacas, tanto estruturais quanto funcionais, associadas ao modelo de hipertensão renovascular 2R-1C. Neste modelo experimental de HAS, ocorre aumento na produção de angiotensina II e estresse oxidativo, relacionados com a ativação das MMPs. Dessa maneira, é altamente sugestivo que a ativação das MMPs ocorra nestes animais e possa contribuir para alterações cardíacas neste modelo de HAS (Donnelly, Collinson et al. 2003; Tsuruda, Costello-Boerrigter et al. 2004; Luchtefeld, Grote et al. 2005).
4. Importância do estresse oxidativo para a hipertrofia cardíaca
Espécies reativas de oxigênio (EROs) são derivados reativos do metabolismo do oxigênio que em condições fisiológicas são produzidas de maneira controlada, em baixas concentrações, participando da sinalização e regulação intracelular envolvidas nos processos de transcrição gênica e síntese protéica (Freeman and Crapo 1982). O aumento na formação de EROs é denominado de estresse oxidativo, que ocorre devido ao aumento da expressão ou atividade de enzimas responsáveis pela formação de EROS e/ou uma diminuição de enzimas responsáveis pela inativação de EROS (Touyz and Schiffrin 2004).
As EROs mais importantes são o anion superóxido (.O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxil (OH-) e peroxinitrito (OONO-). O ânion superóxido é o precursor de outras EROs (Lassegue and Griendling 2004; Cai 2005; Zimmet
and Hare 2006), e sua produção é predominantemente catalisada pela enzima NADPH oxidase (Griendling, Sorescu et al. 2000; Touyz and Schiffrin 2004) (Figura 4). A xantina oxidase e enzima óxido nítrico sintase (na ausência de seu cofator tetrahidrobiopterina, BH4) são enzimas presentes no miocárdio e capazes de produzir EROs (Touyz and Schiffrin 2004).
Entretanto, a NADPH oxidase, que é expressa nos fibroblastos e cardiomiócitos, é considerada a principal fonte cardíaca de EROs no miocárdio (Li, Gall et al. 2002; Borchi, Bargelli et al. 2010), sendo composta de várias subunidades essenciais para sua atividade (Griendling, Sorescu et al. 2000; Landmesser, Cai et al. 2002; Modlinger, Chabrashvili et al. 2006; Murdoch, Grieve et al. 2006; Murdoch, Zhang et al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009). As isoformas Nox2 e Nox4, que são associadas à membrana celular, são encontradas nos cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos e parecem contribuir para as alterações cardíacas associadas com a hipertensão (Murdoch, Zhang et al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009).
Estas isoformas são ativadas quando associadas às outras subunidades (por exemplo, p22phox e p47phox dentre outras) (Touyz and Schiffrin 2004; Murdoch, Zhang et al. 2006)(Figura 4).
A enzima NADPH oxidase é constitutivamente ativa, produzindo O2-. em baixas concentrações de forma lenta e contínua (Touyz and Schiffrin 2004).
Entretanto, vários estímulos de fundamental relevância para fisiopatologia da hipertensão arterial e insuficiência cardíaca podem estar associados com a ativação da NADPH oxidase. Por exemplo, estresse cíclico, endotelina-1 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) (Touyz and Schiffrin 2004). Além desses fatores, a angiotensina II é considerada um potente ativador de NADP(H) oxidase, sendo essa enzima oxidante sugerida como um dos mecanismos responsáveis pela hipertensão e
alterações cardiovasculares induzidas pela angiotensina II (Griendling, Sorescu et al.
2000; Landmesser, Cai et al. 2002; Modlinger, Chabrashvili et al. 2006; Murdoch, Grieve et al. 2006; Murdoch, Zhang et al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009)
Figura 4. Esquema ilustrativo da modulação na formação de EROs. Um desequilíbrio nesses fatores que favorece a formação de EROs leva a formação do estresse oxidativo (Modificado de Touyz and Schiffrin 2004).
O aumento na formação de EROs via ativação da NADPH oxidase, especialmente pela angiotensina II e sobrecarga cardíaca, está associado à disfunção na contratilidade de cardiomiócitos, ativação de fibroblastos, fibrose e hipertrofia cardíaca (Murdoch, Zhang et al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009) (Figura 5).
Consistente com os resultados acima, muitas evidências mostram um importante envolvimento de EROs nas alterações morfofuncionais cardíacas presentes na
Fibrose Hipertrofia
Fibrose Disfunção na
contratilidade Sobrecarga cardíaca Ativação do
sistema renina- angiotensina
insuficiência cardíaca (Giordano 2005; Sirker, Zhang et al. 2007; Takimoto and Kass 2007; Liu, Zhou et al. 2010), que pode envolver a ativação da NADPH oxidase. Essa enzima parece acompanhar a evolução desta insuficiência em ratos indicando sua participação na fisiopatologia dessa doença (Li, Gall et al. 2002).
Figura 5. Esquema ilustrativo da importância da NADP(H) oxidase na hipertrofia cardíaca induzida pela ativação do sistema renina-angiotensina ou HAS (sobrecarga cardíaca. Observa-se que quando a enzima está ativada, as subunidades citosólica estão associadas à subunidade Nox2 (de membrana). Modificado de Murdoch EC e colaboradores (Murdoch, Zhang et al. 2006).
Como na HAS e na insuficiência cardíaca, um aumento na formação de EROs também é observado na isquemia/reperfusão (Wang, Sawicki et al. 2002; Schulz 2009) e aterosclerose (Warnholtz, Nickenig et al. 1999; Rueckschloss, Duerrschmidt et al. 2003) podendo estar associado com alterações cardiovasculares como:
disfunção endotelial, alterações na contralidade dos miócitos, hipertrofia celular e
ativação de MMPs e outros mediadores envolvidos com a fisiopatologia dessas doenças (Sirker, Zhang et al. 2007; Akki, Zhang et al. 2009; Castro, Rizzi et al.
2009).
A constante formação de EROs pode ser controlada por enzimas antioxidantes como, por exemplo, superóxido dismutase (SOD), catalase e glutationa peroxidase entre outras (Touyz and Schiffrin 2004) (Figura 4). Além do aumento da atividade de enzimas prooxidantes, como NADPH oxidase, uma redução das enzimas antioxidantes pode estar associada ao aumento de EROs, contribuindo para as alterações cardiovasculares. Por exemplo, camundongos
“knockout” para a SOD, quando sujeitos à sobrecarga cardíaca, apresentam hipertrofia ventricular esquerda mais severa do que animais controle, também sujeitos à mesma sobrecarga cardíaca (Lu, Xu et al. 2008). A sobrecarga cardíaca promove aumento da hipertrofia de miócitos, na deposição de colágeno e redução na contralidade cardíaca mais severa nos animais “knockouts” do que nos animais controle (Lu, Xu et al. 2008). Os efeitos foram associados com aumento de EROs e MMPs no miocárdio dos animais “knockouts” e indicam a importância da enzima antioxidante SOD nas alterações presentes na hipertrofia cardíaca (Lu, Xu et al.
2008).
Alguns estudos avaliam o uso de drogas na tentativa de reduzir o estresse oxidativo de maneira farmacológica. As vitaminas C e E foram as primeiras drogas a serem utilizadas em modelos animais de hipertensão, por diminuírem as concentrações de EROs (Chen, Touyz et al. 2001; Ulker, McKeown et al. 2003;
Lassegue and Griendling 2004; Escobales and Crespo 2005). Outros estudos mostraram que o tratamento com apocinina, inibidor da NADPH oxidase, atenuou a hipertrofia cardíaca em associação com a diminuição na formação de EROs na
hipertensão induzida por angiotensina II (Rugale, Delbosc et al. 2007; Liu, Zhou et al. 2010). O tratamento com tempol (mimético da SOD) foi efetivo em reduzir o estresse oxidativo e atenuar a hipertrofia e a disfunção cardíaca, em modelos animais de hipertrofia cardíaca pela administração de isoproterenol ou sobrecarga cardíaca (Zhang, Kimura et al. 2005; Chess, Xu et al. 2008).
Algumas evidências têm mostrado a eficácia de drogas como captopril e estatinas para o tratamento da hipertrofia cardíaca (Khattab, Mostafa et al. 2005;
Mollnau, Oelze et al. 2005; Rugale, Delbosc et al. 2007; Kassan, Montero et al.
2009). Esses trabalhos associam os benefícios encontrados com os efeitos pleiotrópicos das drogas como, por exemplo, a redução do estresse oxidativo. A redução na formação de EROs está geralmente associada com a diminuição do peso cardíaco, da deposição de colágeno e melhora da contratilidade cardíaca (Sorescu and Griendling 2002).
Alguns trabalhos associam a contribuição de EROs para disfunções morfofuncionais do coração com a ativação de diversos fatores (Beswick, Dorrance et al. 2001; Akki, Zhang et al. 2009), incluindo ativação de enzimas como MMPs (Sorescu and Griendling 2002).
5. Possível envolvimento de EROs com MMPs
Como descrito anteriormente, as MMPs são sintetizadas e secretadas como pró-formas latentes, chamadas de zimogênios, que precisam ser ativados (Visse and Nagase 2003; Schulz 2007). O sítio catalítico contém o zinco que interage com a cisteína da região do propeptídeo e a manutenção dessa conformação é requerida para que a enzima continue inativa. EROs, especialmente H2O2 e OONO-, podem
interagir com o resíduo de cisteína do propeptídeo, promovendo a ruptura da interação do grupo tiol com o zinco. Essas alterações levam à exposição do sítio catalítico, resultando na sua ativação mesmo com a presença do propetídeo. (Van Wart and Birkedal-Hansen 1990; Nelson and Melendez 2004; Schulz 2007;
Kandasamy, Chow et al. 2009) (Figura 6).
Baseado no exposto acima, alguns estudos avaliaram a participação de EROs no aumento da atividade das MMPs. Por exemplo, nos estudos realizados em animais com isquemia e reperfusão cardíaca foi evidenciado que a disfunção cardíaca induzida por EROs, direcionando a degradação de troponina I e miosina de cadeia leve, pode ser devido à ativação de MMP-2 (Wang, Sawicki et al. 2002).
Figura 6. Esquema ilustarativo da ativação de MMPs por EROs (Modificado de Nelson and Melendez 2004).
O estresse oxidativo está envolvido com a ativação de fibroblastos, que são células responsáveis pela produção de MMPs e produtos da MEC (Sorescu and
Griendling 2002). Assim sendo, quando fibroblastos cardíacos foram estimulados com EROs, as células apresentaram aumento na atividade de MMPs-2, -9 e -13, além de uma diminuição na síntese de colágeno (Siwik, Pagano et al. 2001). Outro estudo realizado com camundongos, mostrou que o aumento de fibrose e hipertrofia ventricular pode ser consequência do aumento de EROs e MMPs no miocárdio, devido à supressão da enzima SOD (Lu, Xu et al. 2008). Esses resultados indicam uma possível participação das MMPs nos efeitos de EROs sobre o remodelamento cardíaco.
Estudos in vitro mostram que o aumento da expressão (RNAm) e atividade da MMP-2 induzido pelo estiramento mecânico pode ser devido à formação de EROs.
Esses efeitos parecem ser devido ao aumento da atividade da NADPH oxidase (Grote, Flach et al. 2003). Sendo assim, muitos estudos evidenciam um aumento de EROs paralelamente ao aumento na expressão de MMPs, o que levaria a disfunções cardiovasculares maiores, inclusive na hipertensão (Takenaka, Kihara et al. 2006).
Resultados obtidos em nosso laboratório mostraram que o aumento da atividade da NADP(H) oxidase e altas concentrações de EROs em aorta de ratos com hipertensão 2R1C ocorreu paralelamente à hipertrofia e disfunção endotelial na aorta dos animais (Ceron, Castro et al. 2010). Em outro estudo, também realizado em nosso laboratório, foi mostrado que apocinina ou tempol promoveram significativa melhora das disfunções na aorta dos ratos, possivelmente devido à redução da atividade das MMPs (Castro, Rizzi et al. 2009).
Em conjunto, esses estudos sugerem que o aumento de EROs poderia ser um mecanismo para ativação das MMPs na hipertensão, contribuindo para as
alterações presentes na hipertrofia cardíaca. Alguns trabalhos evidenciaram que drogas antioxidantes, como tempol e apocinina, podem reduzir as alterações presentes na hipertrofia cardíaca (Rugale, Delbosc et al. 2007; Chess, Xu et al.
2008; Liu, Zhou et al. 2010). Porém, ainda é incerto se a ativação das MMPs por EROs pode contribuir para hipertrofia cardíaca em modelos animais de hipertensão;
e se esta ativação pode estar relacionada às alterações cardíacas associadas à hipertensão.
HIPÓTESE
HIPÓTESE
Levando-se em consideração que:
1. A MMP-2 pode contribuir para remodelamento cardíaco e disfunções na contratilidade cardíaca em modelos experimentais não relacionados à HAS;
2. A MMP-2 e EROs estão aumentadas em situações de HAS;
3. As EROs podem contribuir para alterações morfofuncionais na hipertrofia cardíaca;
4. Aumentos nas concentrações EROs promovem ativação de MMPs;
a hipótese deste trabalho é de que aumentos na concentração e atividade de MMPs, especialmente da MMP-2, participem da fisiopatologia da hipertrofia cardíaca associada à hipertensão 2R1C e de que aumentos de EROs estejam envolvidos nesse processo.
OBJETIVOS
OBJETIVOS
1- Verificar a expressão e atividade das MMPs (especialmente MMP-2) e sua possível contribuição para as alterações morfofuncionais cardíacas, associadas à hipertensão renovascular (2R-1C).
2- Verificar se as EROs modulam a expressão e atividade da MMP-2, contribuindo para as alterações morfofuncionais cardíacas associadas à hipertensão renovascular (2R-1C).
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS E MÉTODOS
1 - Considerações gerais
Os experimentos foram realizados utilizando ratos machos Wistar (180 a 200 gramas), provenientes do Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Odontologia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, em salas com ciclo claro/escuro de 12 horas, temperatura controlada (22-25 °C) e livre acesso à ração e água. Esse estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética Animal dessa universidade. (Protocolo número 122-2006)
1.1 - Hipertensão arterial induzida pela técnica de Goldblatt:
A indução da hipertensão arterial foi realizada através da colocação de um clipe de prata com abertura de 0,2 milímetros sobre a artéria renal esquerda, levando à estenose da artéria. Esse procedimento leva a ativação do sistema renina- angiotensina, com conseqüente aumento da pressão arterial (Goldblatt, 1958). Os animais controle foram submetidos à laparotomia, sem introdução do clipe. Como anestésicos, foram utilizados ketamina (100mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), por via intra-peritoneal (i.p.).
1.2 - Grupos experimentais
Protocolo 1
Sham: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam água;
Sham + doxi: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam doxiciclina na dose de 30 mg/kg/dia;
2R1C: animais submetidos à estenose da artéria renal, que receberam água;
2R1C + doxi: animais submetidos à estenose da artéria renal que receberam doxiciclina na dose de 30 mg/kg/dia
Protocolo 2
Sham: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam água;
Sham+tempol: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam tempol (antioxidante, mimético da SOD) na dose de 18 mg/kg/dia;
Sham+apocinina: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam apocinina (antioxidante, inibidor da NADP(H) oxidase) na dose de 25 mg/kg/dia;
2R1C: animais submetidos à estenose da artéria renal, que receberam água;
2R1C+tempol: animais submetidos à estenose da artéria renal e que receberam tempol (antioxidante, mimético da SOD) na dose de 18 mg/kg/dia;
2R1C+apocinina: animais submetidos à estenose da artéria renal e que receberam apocinina (antioxidante, inibidor da NADP(H) oxidase) na dose de 25 mg/kg/dia;
Observações
As doses de doxiciclina, tempol e apocinina foram escolhidas de acordo com trabalhos prévios realizados em nosso laboratório, que mostram que estas doses inibiram a atividade das MMPs e EROs nas aortas de ratos 2R1C (Castro, Rizzi et al.
2008; Castro, Rizzi et al. 2009).
Somente os animais que apresentaram pressão arterial sistólica acima de 160 mmHg foram utilizados no estudo. Os tratamentos tiveram início duas semanas após a indução da hipertensão arterial renovascular. Os animais que ficaram hipertensos foram distribuídos aleatoriamente em cada um dos grupos experimentais citados acima. Os tratamentos foram realizados por gavagem, por um período de oito semanas, seguido da coleta de tecidos para análises estruturais, bioquímicas e moleculares.
2 - Materiais
2.1 - Soluções utilizadas nos experimentos:
- Solução de Krebs modificada (em mmol/L: NaCl 130; CaCl2 1,6; MgSO4 1,2;
KH2PO4 1,2; KCl 4,7; NaHCO3 14,9 e glicose 5,5);
- Paraformaldeído (PFA) 4% v/v tamponado;
- Hematoxilina e Eosina (H&E);
- Tampão de extração de proteínas: 20mmol/L de Tris-HCl, 1 mmol/L de 1,10- fenantrolina, 1 mmol/L de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 1 mmol/L de NEM e 10 mmol/L de CaCl2.
- Albumina sérica bovina (BSA), 8 mg/mL;
- Reagente de Bradford;
- Dodecil sulfato de sódio (SDS) 12%, co-polimerizado com gelatina (1 mg/mL);
- Tampão utilizado no gel de separação: Tris-HCl/SDS, pH 8,8;
- Tampão utilizado no gel de largada: Tris-HCl/SDS, pH 6,8;
- Tampão de amostra não-redutor: SDS2%, Tris-HCl 125 mmol/L, glicerol 10% e azul de bromofenol 0,001%; ph 6,8;
- Solução de TritonX-100 a 2%;
- Solução de Agarose 3%;
- Persulfato de Amônio (APS) 10%;
- TEMED (tetrametil etilenodiamina);
- Solução de acrilamida 30% e bisacrilamida (0,8%);
- Solução de coloração: Coomassie Brilliant Blue G-250 0,05%;
- Solução fixadora e de descoloração: Metanol 30% e Ácido acético 10%;
- Solução tampão de Tris-CaCl2 (Tris 50 mmol/L, CaCl2 10 mmol/L, ZnCl2 1 µmol/L );
- Solução de DQ Gelatin 5 µg/mL (Molecular Probes, Oregon, USA) - DHE (dihidroetídio) 10 µmol/L
- PBS (tampão salina fosfato);
- Anticorpos monoclonais: anti-MMP-2 (MAB 3308), anti-TIMP-2 (MAB 13446);
diluição 1:1000 em PBS, a partir da solução inicial de 1 mg/mL (Chemicon, Termecula, CA USA);
- Anticorpo secundário rodamina (AP 160P), diluição 1:200 em PBS, a partir da solução inicial de 1 mg/mL (Chemicon, Termecula, CA USA);
Os demais reagentes não especificados foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, USA).
2.2 - Drogas administradas diretamente nos animais:
- Doxiciclina 30 mg/kg/dia, Tempol 18/mg/kg/dia e apocinina 25/mg/kg/dia (Sigma Aldrich) foram diluídas em água e administradas por gavagem (1mL);
- Ketamina (100 mk/kg) e xilazina (10 mg/kg) foram administradas por via intra peritoneal.
2.3 - Equipamentos utilizados nos experimentos:
- Balança de precisão (Shimadzu AY220), pHmetro (Incibrás) e centrífuga refrigerada (CELM – 3 plus);
- Transdutor de pressão acoplado a um manguito (MTL125R pulse transducer/pressure cuff; Castle Hill, Austrália);
- Transdutor de pressão IBM/PC equipado com uma interface digital (DI-220; Dataq Instruments, Akron, OH)
- Micrótomo (Leica RM2025) e criostato (CM 1900; Leica, Alemanha);
- Microscópio de luz branca e fluorescência (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, England) acoplado a câmara fotográfica;
- Espectrofotômetro;
- Fonte de eletroforese (Eletrophoresis Power Supply – EPS 301);
- Sistema de documentação de eletroforese Kodak (Kodak, Rochester, NY);
2.4 - Programas de aquisição de dados:
- Advanced CODAS; Dataq Instruments;
- ImageJ Program (NIH – National Institutes of Health);
- Analysis System (EDAS) 290 (Kodak, Rochester, NY);
- KCJunior (Molecular Devices, Sunyale, CA);
- SigmaStat for Windows (Jadel Scientific, USA).
3 - Métodos
3.1 - Parâmetros hemodinâmicos
3.1.1 - Avaliação da pressão arterial sistólica e peso corporal
A pressão arterial sistólica foi verificada pelo método de pletismografia de cauda. Para isso, um manguito acoplado a um transdutor de pressão foi colocado em torno da cauda dos animais acordados, previamente aquecidos (em gabinetes a 37 °C). As variações da pressão foram capturadas por um programa específico de aquisição de dados: PowerLab 4/S analog-to-digital converter (AD Instruments Ltd., Csdtle Hill, Australia) e os resultados representados pela média de três medidas consecutivas para cada animal. A pressão arterial e o peso corporal foram avaliados semanalmente, durante as 10 semanas do estudo.
3.1.2 - Avaliação da contratilidade cardíaca
Os animais foram anestesiados com tribromoetanol (250mg/Kg, i.p.) após a oitava semana de tratamento com doxiciclina, tempol ou apocinina. No protoclo 1, a medida de pressão arterial invasiva foi avaliada através de catéter de polietileno inserido na artéria femoral direita. No protoclo 2, a medida de pressão arterial invasiva foi
avaliada através de catéter de polietileno inserido na carótida. Para as medidas das pressões no VE, foi inserido um catéter na artéria carótida que posteriormente, foi cuidadosamente avançado até o VE. Os catéteres foram conectados a um transdutor (P23Gb; Statham, Hato Rey, Brazil) e os sinais forma amplificados apropriadamente. As pressões arterial e ventriculares foram amostradas continuamente (1kHz) em um equipamento IBM/PC equipado com uma interface digital (DI-220; Dataq Instruments, Akron, OH). Um programa de computador (Advanced CODAS; Dataq Instruments) foi utilizado para analisar os dados e extrair séries de tempos de batimento-por-batimento (FC) e a pressão arterial média. A primeira derivada da pressão ventricular (dP/dt) foi calculada e os valores da freqüência máxima de desenvolvimento de pressão isovolumétrica (+dP/dt) e de decaimento de pressão isovolumétrica (-dP/dt) foram utilizados como índices de função cardíaca da fase sistólica e diastólica, respectivamente (Salgado, Simoes et al. 2007). Ao final dos experimentos, os corações foram coletados, lavados em solução salina e estocados a -80ºC até o momento do uso para as avaliações bioquímicas.
3.2 - Parâmetros estruturais
3.2.1 - Análise morfológica do coração
Ao final da décima semana do estudo, os animais foram anestesiados, e sua cavidade torácica foi aberta para expor o coração ainda batendo. Os corações foram rapidamente removidos, lavados em solução em solução salina gelada, secados, pesados e colocados em formol tamponado a 10% (pH7,3) por 2 horas. A seguir, com auxílio de uma gilete, os ventrículos foram cortados transversalmente na porção
médio ventricular, equidistante entre o ápice e a base, e devolvidos ao fixador por mais 20 horas. Após este período, o fixador foi trocado por álcool 70% v/v e desidratados em diferentes concentrações de álcool para serem inseridos em parafina com as duas metades de cada coração voltadas para cima. Os corações foram cortados transversalmente, sempre na mesma direção, em um micrótomo (Leica RM2025), a uma espessura de quatro micrômetros. Esses cortes foram colocados em um banho Maria com temperatura 37-39 °C para promover a abertura dos cortes em parafina para posterior aderência em lâminas de vidro. As lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para determinação dos parâmetros estruturais correspondentes à área da câmara ventricular esquerda e espessura da parede do VE e septo. As análises morfométricas foram realizadas com ajuda do software Image J, disponível na internet (http,//rsb.info.nih.gov/nih-image/). O diâmetro dos miócitos foi determinado pela média de 30 medidas em cada ventrículo, em aumento de 400X nas fibras orientadas longitudinalmente. As medidas foram realizadas sem o conhecimento de qual grupo de animal a lâmina pertencia, com um software Leica Qwin (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, UK) em conjunto a um microscópio (Leica DMR, Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Wetzlar, Germany), uma câmera e um computador.
3.3 - Parâmetros bioquímicos e moleculares
3.3.1 - Determinação de espécies reativas de oxigênio in situ
As concentrações cardíacas de EROs foram analisadas, in situ, no VE, utilizando dihidroetídeo (DHE) na concentração de 10 µg/mL(Hao, Nishimura et al.
2006; Viel, Benkirane et al. 2008). Esse “probe” reage com o O2- presente nos tecidos, resultando na formação de 2-hidroxietídeo e de etídeo, produtos que emitem fluorescência vermelha no local. Os tecidos foram congelados em OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), utilizando acetona e gelo seco. Eles foram cortados em criostato, a 5 µm de espessura, e incubados com DHE por 30 minutos em câmara úmida e escura. Após a incubação, os cortes foram lavados com tampão salina fosfato (PBS) e fixados em PFA 4%. Com auxílio de um microscópio de fluorescência (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, England) acoplado à câmera fotográfica, as imagens dos cortes foram fotografadas com aumento de 400x. A quantificação da intensidade de fluorescência vermelha emitida foi realizada utilizando o programa ImageJ.
3.3.2 - Determinação dos níveis de MMP-2 por zimografia em gel
Método muito utilizado para determinação dos níveis de MMPs no plasma e amostras de tecidos biológicos (Gerlach, Uzuelli et al. 2005; Gerlach, Demacq et al.
2007; Castro, Rizzi et al. 2008). No caso de zimografia de tecidos, é preciso determinar a quantidade de proteína presente em cada amostra, para aplicar no gel a mesma quantidade de proteína por amostra, pois variações protéicas entre uma e outra podem interferir nos resultados finais desse método.
3.3.2.A - Dosagem de proteína pelo método de Bradford
Para a quantificação de proteínas, foi utilizado o método de Bradford, que consiste em um ensaio colorimétrico quantitativo, em que ao se ligar às proteínas do
