5. Possível envolvimento de EROs com MMPs
3.3.2. B - Eletroforese em gel de poliacrilamida 12%
As amostras foram previamente misturadas ao tampão de amostra (SDS 2%, Tris-HCl 125 mM, glicerol 10% e azul de bromofenol 0,001%) e aplicadas em géis de poliacrilamida a 12% contendo 1mg/mL de gelatina e separadas por eletroforese, conforme a técnica SDS-PAGE. Concluída a eletroforese, os géis foram submetidos a dois banhos de Triton X-100 a 2%, para remover o SDS e colocados em solução de Tris CaCl2 50 mM, por 48 horas, a 37 °C. Posteriormente, foram fixados e
corados em solução Coommassie Blue 0,05% por 4 horas. Para a visualização das bandas referentes às MMPs os géis foram descorados com metanol a 30% e ácido acético a 10%. Observa-se a formação de bandas claras contra o fundo azul do Coommassie devido à degradação da gelatina incorporada ao gel pelas MMPs.
Para cada gel, foi utilizado um padrão interno (soro fetal bovino a 2%), representado nas figuras como PAD. Por ele foi possível normalizar as eventuais variações nas bandas decorrentes de diferenças na intensidade de coloração dos géis.
Essa normalização é necessária para que se possa comparar resultados obtidos em diferentes géis. A quantificação das bandas da MMP-2 foi feita utilizando-se o sistema Kodak Eletrophoresis Documentation and Analisys System – EDAS 290 (Kodak, Rochester, NY). As formas da MMP-2 foram identificadas pelos seus pesos moleculares: 75, 72 e 64 KDa. Elas foram inibidas por fenantrolina, mas não por outros inibidores de proteases.
3.3.3 - Determinação da atividade gelatinolítica por zimografia In situ
Esse método reflete a atividade in situ das MMPs e não seus níveis como a zimografia convencional. Esse método permite a quantificação dessa atividade diretamente no tecido (Galis, Sukhova et al. 1995). Para essa análise utilizou-se DQ gelatin (E12055, Molecular Probes, Oregon, USA) na concentração de 1,0 µg/mL em tampão Tris-CaCl2 50 mM. Os tecidos foram congelados em OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), utilizando acetona e gelo seco. Eles foram cortados em criostato, a 5 µm de espessura, e incubados com o substrato DQ gelatin por 60 minutos em câmara úmida e escura. Após a incubação, os cortes foram lavados com PBS e fixados em PFA 4% v/v por 10 minutos. Com auxílio de um microscópio de
fluorescência (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, England) acoplado a câmera fotográfica, as imagens dos cortes foram fotografadas num aumento de 400x. A quantificação da atividade gelatinolítica in situ observada como intensidade de fluorescência verde emitida, foi realizada utilizando o programa ImageJ.
3.3.4 - Imunofluorescência para MMP-2
Método utilizado para determinar os níveis de MMP-2 e co-localizar a atividade gelatinolítica in situ com a expressão dessa enzima, uma vez que outras MMPs também possuem a capacidade de degradar a gelatina. Após a incubação com DQ gelatin e PFA 4%, os cortes de coração foram incubados com anticorpo primário anti-MMP-2 (MAB 3308, Chemicon, USA), na concentração de 0,1 µg/mL por uma hora, em câmara úmida e escura e em seguida os cortes foram lavados com PBS. Após esse período, os cortes foram incubados com anticorpo secundário rodamina (AP160P, Chemicon, USA) PA 5,0 µg/mL por uma hora nas mesmas condições citadas. Esse anticorpo emite fluorescência vermelha quando ligado ao antcorpo primário. Com auxílio de um microscópio de fluorescência (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, England) acoplado a câmera fotográfica, as imagens dos cortes foram fotografadas num aumento de 400x. A quantidade de MMP-2 foi determinada como intensidade de fluorescência vermelha emitida e a quantificação foi realizada utilizando o programa ImageJ. Para sobreposição da atividade gelatinolítica com a expressão da MMP-2 foi utilizado o programa aTube Catcher. A co-localização da MMP-2 e atividade gelatinolítica nas imagens sobrepostas apresenta coloração amarela.
4 - Análise estatística
Os resultados obtidos nesse estudo foram analisados com ANOVA de duas vias (análise de variância) ou ANOVA de uma via seguido de teste Tukey (SigmaStat for Windows, Jadel Scientific, USA). Foram considerados estatísticamente diferentes valores com p<0,05. Os gráficos foram representados como média ± erro padrão da média (EPM), com 4-10 animais por grupo.
RESULTADOS
RESULTADOS
1 - PROTOCOLO 1: Efeitos cardíacos do tratamento de ratos 2R1C com doxiciclina
1.1 - Efeito da doxiciclina sobre a pressão arterial sistólica e peso corporal:
Os valores basais de pressão arterial sistólica foram similares nos quatro grupos experimentais, antes da cirurgia. A elevação da pressão arterial sistólica foi observada nos grupos 2R1C a partir da segunda semana após a cirurgia (P<0,05 versus grupos sham; Figura 7A). O tratamento com doxiciclina não afetou a pressão arterial no grupo sham, mas atenuou significativamente o aumento na pressão arterial do grupo 2R1C de 220 ± 5,2 mmHg para 172 ± 4,8 mmHg (P<0,05; Figura 7A). Ao final da última semana de tratamento, esses resultados foram confirmados pelo registro da pressão arterial pelo método invasivo. O tratamento com doxiciclina atenuou o aumento das pressões arteriais sistólica (de 218 ± 12 mmHg para 185 ± 8 mmHg), diastólica (de 163 ± 6 mmHg para 140 ± 11 mmHg) e média (de 189 ± 7 mmHg para 160 ± 10 mmHg) nos animais 2R1C (P<0,05, Figura 7B, C e D).
Não houve diferenças significativas no peso corporal e frequência cardíaca entre os grupos desse estudo, mas foi observado um aumento no peso cardíaco dos animais 2R1C não tratados (P<0,05 versus todos os outros grupos do estudo;
Tabela 1).
Figura 7 – A doxiciclina atenuou os aumentos na pressão arterial dos ratos 2R1C.
Aferição da pressão arterial pelo método não-invasivo (pletismografia de cauda) (A) e invasivo (B, C e D). Valores expressos como média± EPM (n= 8-10 por grupo)
*P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos. # P<0,05 para 2R-1C + doxi versus grupo sham.
Tabela 1. Valores de Freqüência cardíaca, Peso do coração, Peso corporal e Razão entre peso cardíaco e peso corporal.
Grupos Sham Sham + doxi 2R1C 2R1C + doxi
Freqüência cardíaca
(batimentos/min) 328.2 ± 16.7 345.3 ± 18.1 363.3 ± 19.2 329.0 ± 11.4 Peso do coração (g) 1,49 ± 0,05 1,55 ± 0,07 1,72 ± 0,20* 1,56 ± 0,07
Peso corporal (g) 533,1 ± 18,0 534,0± 27,1 446,0 ± 23.1 512,3 ± 23,7 Razão: Peso cardíaco
(mg)/Peso corporal (g) 2,81 ± 0,05 2,91 ± 0,11 3,82 ± 0,28* 3,05 ± 0,06
2R1C: 2 rins -1clipe. Valores expressos como média ± EPM (n= 7 por grupo)
*P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos.
1.2 – Efeito da doxiciclina sobre a contratilidade cardíaca em ratos 2R1C:
Os animais 2R1C apresentaram um aumento significativo na primeira derivada temporal de pressão ventricular positiva (+dP/dt: de 7965 ± 468 mmHg/s para 11170 ± 459 mmHg/s) e negativa (-dP/dt: de -5781 ± 375 mmHg/s para -7356 ± 171 mmHg/s), quando comparados com o grupo sham (P<0,05). O tratamento com doxiciclina reduziu em aproximadamente 50% os aumentos nas +dP/dt (9274 ± 412 mmHg/s) e –dP/dt (-6365 ± 247 mmHg/s) observados nos animais 2R1C (P<0,05).
Nenhuma diferença significativa foi observada entre os outros grupos do estudo (Figura 8).
Figura 8 – (A) Máxima +dP/dt e (B) máxima –dP/dt. Valores expressos como média
± EPM (n=8 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos.
1.3 – Efeito da doxiciclina sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R-1C:
Como mostrado na figura 9B e na tabela 1, os animais 2R1C apresentaram um aumento de aproximadamente 25% na razão peso cardíaco/peso corporal quando comparados com o grupo sham (P<0,05), indicando a presença de hipertrofia cardíaca, a qual foi confirmada pela histologia, caracterizando hipertrofia adaptativa, como observado na figura 9. Os animais 2R1C apresentaram aumento de 30% e 38%, respectivamente na espessura da parede ventricular esquerda e no septo, quando comparado com o grupo sham (P<0,05). Além disso, foi observada uma diminuição na área da câmara ventricular esquerda de 23% nos animais 2R1C (Sham: 19,4 ± 1 mm2 versus 2R1C: 15,0 ± 1 mm2 e, P<0,05). As alterações no VE foram associadas a um aumento no diâmetro dos miócitos nos ratos 2R1C de 12,6 ± 0,3 µm para 13,8 ± 0,1 µm (Figura 10; P<0,05 versus grupo sham). O tratamento com doxiciclina reverteu todas as alterações morfológicas encontradas nos animais 2R1C (P<0,05, Figuras 9 e 10).
Figura 9 – (A) Painel representativo dos cortes de coração para determinação dos parâmetros histológicos. (B) Razão peso cardíaco/peso corporal e (C, D e E) espessura da parede ventricular esquerda, espessura da parede do septo e medida da área da câmara ventricular esquerda. Valores expressos como média± EPM (n=8 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos do estudo.
Sham Sham + doxi 2R1C 2R1C + doxi 0
1 2 3
4
*
Espessura da parede do septo (mm)
Sham Sham + doxi 2R1C 2R1C + doxi 0
1 2 3
4
*
Espessura da parede ventricular esquerda (mm)
Figura 10 – (A) Fotomicrografias representativas de VE (x400, microscopia óptica convencional). (B) Valores do diâmetro dos miócitos. Valores expressos como média± EPM (n=6 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos do estudo.
1.4 - Efeito da doxiciclina na expressão da MMP-2 e na atividade das MMPs:
Géis de zimografia com gelatina foram utilizados para detecção das concentrações de MMP-2 no extrato de VE dos animais. Como mostrado no zimograma representativo foram detectadas duas bandas de MMP-2 (72 kDA e 64 kDa) e nenhuma banda da MMP-9 (Figura 11A). Houve um aumento significativo, de aproximadamente 27%, na concentração de 72 kDa MMP-2 no VE dos animais 2R1C quando comparados com o grupo sham (em unidades arbitrárias (U.A.): de 0,25 ± 0,02 para 0,37 ± 0,04; P<0,05) (Figura 11B). O tratamento com doxiciclina não atenuou de maneira estatisticamente significativa as concentrações de MMP-2 no VE dos animais 2R1C (0,31 ± 0,04 U.A.; P>0,05). Nenhuma diferença estatística foi observada entre os animais controles, quando comparados com o grupo 2R1C tratado com doxiciclina. (Figura 11; P>0,05).
Figura 11 – (A) Gel representativo de zimografia SDS-PAGE de extrato de VE. P:
padrão interno. (B, C e D) Representação gráfica dos valores para o as bandas de peso molecular 72 kDa MMP-2, 64 kDa MMP-2 e para a MMP-2 total, respectivamente. Valores expressos como média± EPM. (n=10 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus grupo sham.
Durante o processamento das amostras para a zimografia, os inibidores de proteases são separados da proteína. Dessa maneira, a atividade gelatinolítica, observada no zimograma, não reflete a atividade gelatinolítica existente nos tecidos, reflete somente a expressão das proteínas.
Por esse motivo, foi realizado um ensaio de atividade gelatinolítica no VE dos animais (zimografia in situ), que reflete a atividade gelatinolítica total (Figura 12A e 12B). Como observado na figura 12B, os animais 2R1C apresentaram aumento de 32% na atividade gelatinolítica quando comparados com o grupo sham (de 43 ± 1,9 U.A. para 64 ± 5,7 U.A.; P<0,05). O tratamento com doxiciclina diminuiu a atividade gelatinolítica dos animais 2R1C para valores semelhantes aos encontrados no grupo sham (P<0,05, Figura 12B).
Para evidenciar além dos níveis, a localização da MMP-2 no VE, foi realizado o método de imunohistoquímica (Figura 12A). Os resultados adicionais confirmaram um aumento nas concentrações de MMP-2 no VE dos animais 2R1C (de 40 ± 3,2 para 52 ± 3,5; P<0,05) (Figura 12C), e mostraram que o tratamento com doxiciclina atenuou, mas não significativamente, as concentrações de MMP-2 (42,9 ± 4 U.A.;
P>0,05). Nenhuma diferença estatística foi observada entre os animais 2R1C tratados com doxiciclina e os grupos sham (Figura 12C; P>0,05)
Sham Sham + doxi 2R1C 2R1C + doxi 0
20 40
60 #
Expressão da MMP-2 (Unidades arbitrárias)
Sham Sham + doxi 2R1C 2R1C + doxi 0
10 20 30 40 50 60
70
*
Atividade gelatinolítica in situ (Unidades arbitrárias)
Figura 12- (A) Fotomicrografias representativas de VE incubadas com DQ gelatin e/ou anticorpo anti-MMP-2 (x400, microscopia de fluorescência). (B) Atividade gelatinolítica in situ e (B) níveis de MMP-2 nos ventrículos esquerdo. Valores expressos como média± EPM. (n=10 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os grupos do estudo. #P<0,05 versus grupo sham.
2 - PROTOCOLO 2: Efeitos cardíacos do tratamento de ratos 2R1C com antioxidantes
2.1 - Efeito dos tratamentos antioxidantes sobre a pressão arterial sistólica e peso corporal
Os valores basais de pressão arterial sistólica foram similares nos seis grupos experimentais, antes da cirurgia. A elevação da pressão arterial sistólica foi observada a partir da primeira semana após a cirurgia (P<0,05 versus grupos sham;
Figura 13A). Os tratamentos com tempol ou apocinina não afetaram a pressão arterial nos grupos sham, mas atenuaram em aproximadamente 33% o aumento da pressão arterial nos grupos 2R1C (Figura 13A, em mmHg: sham : 124 ± 11; 2R1C:
217 ± 8,8; 2R1C+tempol:184 ± 8,8 e 2R1C+ apocinina 182 ±8,5; P<0,05 versus 2R1C).
Ao final da última semana de tratamento, os resultados foram confirmados através da aferição da pressão arterial pelo método invasivo. Como observado nas figuras 13B, 13C e 13D, os tratamentos com os dois antioxidantes atenuaram a pressão arterial sistólica (em mmHg: 2R1C: 244 ± 11; 2R1C+tempol: 179 ± 12 e 2R1C+apocinina: 198 ± 13) e a pressão arterial média (em mmHg: 2R1C: 207 ± 8;
2R1C+tempol: 157 ± 11 e 2R1C+apocinina: 179 ± 11), quando comparado com os animais hipertensos não tratados (P<0,05). Porém, somente o tratamento com tempol reduziu o aumento na pressão arterial diastólica, quando comparado com animais hipertensos não tratados (em mmHg: 2R1C: 179 ± 7; 2R1C+tempol: 137 ± 11 e 2R1C+apocinina: 162 ± 11; P<0,05 para 2R1C versus 2R1C+tempol).
Não houve diferença significativa no peso corporal e frequência cardíaca entre os grupos do estudo (Tabela 2). O peso do coração foi maior nos grupos 2R1C tratados ou não com tempol, quando comparado com os grupos sham (Tabela 2;
P<0,05).
Tabela 2. Valores de Frequência cardíaca, Peso do coração, Peso corporal Razão entre Peso Cardíaco e Corporal e Espessura da Câmera Ventricular Esquerda.
Valores expressos como média± EPM (n= 8 por grupo) *P<0,05 versus respectivo grupo sham. **P<0,05 versus 2R1C tratados com antioxidantes. .
Grupos Freqüência cardíaca
(batimentos/
min)
Peso do coração (g)
Peso corporal (g)
Razão:
peso cardíaco(mg)/
peso corporal (g)
Câmara ventricular
esquerda (mm2) sham 345,1 ± 14.1 1,56 ± 0,05 546,0 ± 16,2 2,87 ± 0,06 20,7 ± 0,78 sham+tempol 359,7 ± 13,7 1,55 ± 0,04 555,3 ± 17,9 2,81 ± 0,06 22,3 ± 1,05 sham+apocinina 373,3 ± 14,4 1,54 ± 0,06 543,6 ± 12,1 2,84 ± 0,12 20,7 ±1,18 2R1C 347,0 ± 10,9 1,91 ± 0,09* 499,3 ± 29,3 4,03 ± 0,38** 21,1 ± 1,3 2R1C+tempol 351,4 ± 12,6 1,80 ± 0,05* 538,4 ± 24,4 3,41 ± 0,14* 22,3 ± 1,6 2R1C+apocinina 373,7 ± 14,9 1,61 ± 0,08 496,0 ± 17,33 3,31 ± 0,22* 21,9 ± 1,8
Figura 13 – Tratamentos com tempol e apocinina atenuaram os aumentos na pressão arterial dos ratos 2R1C. Aferição da pressão arterial pelo método não-invasivo (pletismografia de cauda) (A) e não-invasivo (B, C e D). Valores expressos como média± EPM (n= 8-10 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos.
# P<0,05 para 2R1C+tempol ou 2R-1C+apocinina versus respectivos grupos sham.
2.2 – Efeitos dos antioxidantes sobre a contratilidade cardíaca em ratos 2R1C:
Os animais 2R1C apresentaram um aumento de aproximadamente 34%, na primeira derivada temporal de pressão ventricular (dP/dt) positiva (de 6735 ± 756 mmHg/s para 10497 ± 921) e negativa (de 5000 ± 526 para 7522 ± 707), quando comparado com o grupo sham (P<0,05). Os tratamentos com tempol ou apocinina reduziram os valores nas ±dP/dt observados nos animais 2R1C para valores próximos aos obtidos nos grupos sham (P<0,05). Os tratamentos não afetaram as
±dP/dt do grupo sham (Figura 14).
sham sham
+temp ol
sham+a pocinin
a 2R1
C
2R1 C+tempol
2R1C+a pocinin
a 0
2000 4000 6000 8000 10000 12000
*
+dP/dt (mmHg/min)
Figura 14 – (A) Máxima +dP/dt e (B) máxima –dP/dt. Valores expressos como média
± EPM (n=8 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos.
A B
-10000 -8000 -6000 -4000 -2000 0
*
-dP/dt (mmHg/min)
sha m
sham+tem pol
sham+apo cinina
2R1 C
2R1C+tem pol
2R1C+apoc inina
2.3 – Efeito dos antioxidantes sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R1C:
Foi observado um aumento significativo na razão peso cardíaco/peso corporal nos grupos de ratos hipertensos quando comparados com seus respectivos grupos sham (Figura 15A, 15B e tabela 2; P<0,05 para grupos 2R1C tratados ou não versus grupos sham). Porém, os animais 2R1C não tratados apresentaram um aumento de 30% na referida razão, a qual foi atenuada em 15% pelos tratamentos com tempol ou apocinina.
A presença de hipertrofia cardíaca foi confirmada pela histologia caracterizando hipertrofia adaptativa como observado na figura 15 C e D. Os animais 2R1C apresentaram aumento de 21% e 11% respectivamente, na espessura da parede ventricular esquerda e do septo, quando comparado com o grupo sham (P<0,05). Não foi observada nenhuma alteração na área da câmara ventricular esquerda entre os animais do estudo (Tabela 2, P>0,05 versus grupos sham). Como observado na figura 16, as alterações no VE foram associadas a um aumento no diâmetro dos miócitos nos ratos 2R1C (em µm: grupo sham: 6,5 ± 0,6 e grupos 2R1C: 9,2 ± 0,4, 2R1C+tempol: 7,6 ± 0,2 e 2R1C+apocinina: 7,2 ± 0,3;
P<0,05 versus grupo sham). Os tratamentos com antioxidantes atenuaram todas as alterações morfológicas encontradas nos animais 2R1C (P<0,05, Figuras 15 e16).
sham sham+t
empol sham+apocinina
2R1C 2R1
C+tempol 2R1
C+a pocinina 0
1 2 3 4 5
*
# #
Peso coração (mg)/ Peso corporal (g)
sham sham+te
mpol
sham+a poc
inina 2R1C
2R1C+temp ol
2R1C+apocinina 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
*
Espessura da parede do septo (mm)
Figura 15 – (A) Painel representativo dos cortes de coração para determinação dos parâmetros histológicos. (B) Razão peso cardíaco/peso corporal e (C e D) espessura da parede do septo e espessura da parede ventricular esquerda. Valores expressos como média± EPM (n=8 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos desse estudo, e #P<0,05 versus respectivos grupos sham.
A B
C D
sham sham+tempol
sham+
apocinina 2R1
C
2R1 C+t
empo l
2R1C+apocina 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
3.0
*
Espessura da parede do ventrículo esquerdo (mm)
Figura 16 – (A) Fotomicrografias representativas de VE (x400, microscopia óptica convencional). (B) Valores do diâmetro dos miócitos expressos como média± EPM (n=6 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos do estudo, e
#P<0,05 versus respectivos grupos sham. Barra representa 200µm.
A
B
sham sham+tempol
sham+apo cinina
2R1C 2R1C+temp
ol
2R1 C+apoc
inina 0.0
2.5 5.0 7.5
10.0
*
#
Diâmetro do miócito (µm)
2.4 - Efeito dos antioxidantes sobre as concentrações de EROs em ratos 2R1C:
A hipertensão promoveu um aumento significativo de aproximadamente 23%
na formação de EROS comparado com o grupo controle (de 26,4 ± 1,5 U.A. para 34,4 ± 2,5 U.A., P<0,05, Figura 17). O aumento na formação de EROS foi revertido pelos tratamentos com tempol e apocinina (P<0,05, Figura 17).
Sham+tempol Sham+apocinina
2R1C+apocinina 2R1C+tempol
2R1C Sham
50 µm
sham sham+
tempol sham
+apoc
inina 2R1C
2R1C+tempol 2R1C+apoc
inina 0
10 20 30
40
*
Intensidade de fluorescência (Unidades arbitrárias)
Figura 17 - Efeito dos tratamentos sobre a produção cardíaca de EROs. Fotografias representativas de VE (x400) incubadas com DHE (A). Representação gráfica da intensidade de fluorescência vermelha dos produtos da reação do DHE com O2- (B).
Valores expressos como média± EPM (n=4/grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os grupos do estudo.
A
B
2.5 - Efeito dos antioxidantes sobre a expressão da MMP-2 e a atividade das MMPs:
Como observado no protocolo 1, pelo zimograma representativo, foram detectadas três bandas de MMP-2 (75 kDa, 72 kDa e 64 kDa) e nenhuma banda da MMP-9 (Figura18A). Os animais 2R1C apresentaram um aumento significativo nas concentrações de 72 kDa MMP-2 (de 5,3 ± 0,2 para 8,6 ± 0,7; P<0,05; Figura 18B).
Os tratamentos com os antioxidantes não afetaram as concentrações de 72 kDa MMP-2 no VE dos animais hipertensos ou sham (P>0,05 versus grupo 2R1C não tratado, Figura 18).
Figura 18 – (A) Gel representativo de zimografia SDS-PAGE de extrato de VE. P:
padrão interno. (B) Representação gráfica dos valores para as bandas de peso molecular 72 kDa MMP-2, 75 kDa MMP-2, 64kDa MMP-2 e para MMP-2 total.
Valores expressos como média± EPM. (n=10 por grupo) *P<0,05 versus grupo sham.
A
Sham Sham+tempol Sham+apocinina 2R1C 2R1C+tempol 2R1C+apocinina P
B
sha m
sham+tempol sham+apocinina
2R1C 2R1C+tempol
2R1 C+a
pocinina 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
64 kDa MMP-2 (Unidades arbitrárias)
sham sham
+tem pol
sham +apocinin
a 2R
1C
2R1C+tem pol
2R1C+ap oci
nina 0.0
0.1 0.2 0.3 0.4
75 kDa MMP-2 (Unidades arbitrárias)
sham sham+
tempol sham+
apo cinina
2R1C 2R1C+tempol
2R1C+
apocinina 0.0
2.5 5.0 7.5
10.0 * * *
72 kDa MMP-2 (Unidades arbitrárias)
sham sham
+tempol sham+apoc
inina 2R1
C
2R1C+tempol 2R1C+
apocinina 0
2 4 6 8 10 12
* * *
MMP-2 total (Unidades arbitrárias)
B
Para verificar se o tratamento com antioxidantes afetam a atividade das MMPs, foi realizado o ensaio de atividade gelatinolítica no VE dos animais (zimografia in situ). Como observado no protocolo 1, os animais 2R1C apresentaram aumento de 32% na atividade gelatinolítica, quando comparados com o grupo sham (de 11,5 ± 0,7 para 17,1 ± 1,0, P<0,05). Os tratamentos com antioxidantes reduziram a atividade gelatinolítica dos animais 2R1C para valores semelhantes aos encontrados no grupo sham. Como mostrado na figura 19 A e B, a atividade gelatinolítica no grupo 2R1C+tempol ou 2R1C+apocinina foi significativamente menor, quando comparada com o grupo 2R1C (P<0,05).
Para evidenciar além dos níveis, a localização da MMP-2 no VE, foi realizado o método de imunohistoquímica (Figura19A). Os resultados adicionais confirmam um aumento nas concentrações de MMP-2 no VE dos animais 2R1C (de 8,0 ± 0,4 U.A.
para 14,7 ± 1,5 U.A.; P<0,05), e mostram que o tratamento com antioxidantes não diminuem as concentrações de MMP-2 no VE dos animais hipertensos (2R1C+tempol: 13,2 ± 1,3 U.A.e 2R1C+apocinina: 13,7 ± 0,9 U.A; P>0,05. versus grupo 2R1C; Figura 19C)
Atividade gelatinolítica
MMP-2
Sobreposição
Sham Sham+tempol Sham+apocinina 2R1C 2R1C+tempol 2R1C+apocinina
50
sham sham
+tempol sham+
apocini
na 2R1C
2R1C+tempol 2R1C+apocini
na 0
5 10 15
20
*
Atividade gelatinolíticaIn situ (Unidades arbitrárias)
sham sham
+tempol sham+apoci
nina 2R1C 2R1C+tempol
2R1C+apoci nina 0
5 10 15 20
# # #
Expressão da MMP-2 (Unidades arbitrárias)
Figura 19- (A) Fotomicrografias representativas de VE incubadas com DQ gelatin e/ou anticorpo anti-MMP-2 (x400, microscopia de fluorescência). (B) Atividade gelatinolítica in situ e (C) níveis de MMP-2 nos ventrículos esquerdo. Valores expressos como média± EPM. (n=5 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os grupos do estudo. #P<0,05 versus respectivos grupos sham.
A
B C
DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
Há um crescente número de estudos evidenciando que as MMPs, responsáveis pela degradação de colágeno e outros componentes da MEC, podem contribuir para as alterações na estrutura e função presentes na hipertrofia cardíaca (Wang, Bergman et al. 2006; Bergman, Teerlink et al. 2007; Schulz 2007; Spinale 2007). Porém, o envolvimento das MMPs, especialmente MMP-2, no remodelamento cardíaco associado ao modelo experimental 2R1C ainda não foi avaliado em nenhum estudo prévio.
Neste sentido, esse foi o primeiro trabalho a mostrar um aumento nas concentrações e na atividade da MMP-2 paralelamente às alterações morfológicas e funcionais no remodelamento cardíaco em ratos 2R1C. O presente estudo, mostra que a doxiciclina (um inibidor não-seletivo de MMPs) normalizou o aumento da atividade gelatinolítica total, atenuou o aumento na pressão arterial e preveniu as alteração morfofuncionais cardíacas associadas à hipertensão. Além disso, foi encontrado que o tratamento com antioxidantes reduziram a formação de EROs e a atividade gelatinolítica cardíaca nos animais hipertensos, sugerindo que a ativação das MMPs associadas à hipertensão 2R1C podem ser moduladas via EROs.
A degradação da matriz extracelular é fundamental para o remodelamento cardíaco, por isso a contribuição de várias MMPs foi relatada em diversos estudos experimentais de HVE (Lopez, Gonzalez et al. 2006; Manso, Elsherif et al. 2006;
Wang, Chow et al. 2009). Entretanto, evidências sugerem que a MMP-2 pode estar mais amplamente relacionada às alterações morfofuncionais cardíacas (Wang, Bergman et al. 2006; Bergman, Teerlink et al. 2007; Schulz 2007). Foi mostrado que
animais transgênicos que superexpressam esta gelatinase, sem a indução de nenhuma doença, desenvolveram HVE e disfunção na contratilidade cardíaca (Bergman, Teerlink et al. 2007). Com isso, é altamente sugestivo que o aumento da MMP-2 e da atividade gelatinolítica total encontradas no miocárdio dos ratos 2R1C, pode estar associada às disfunções morfofuncionais cardíacas secundárias à hipertensão.
Para avaliar se o aumento da MMP-2 contribuiu para a hipertrofia cardíaca nos animais 2R1C, foi administrada doxiciclina (inibidor não seletivo de MMPs).
Estudos mostraram que a dose de 30mg/kg/dia diminui a atividade das MMPs de forma independente de seus efeitos antibióticos (Golub, Lee et al. 1998).
O tratamento com doxiciclina inibiu o aumento da atividade gelatinolítica total e reverteu as alterações estruturais associadas à hipertensão 2R1C. Os efeitos benéficos ocorreram apesar da persistência da sobrecarga cardíaca, pois mesmo atenuando a hipertensão nos animais 2R1C, a pressão arterial sistólica se manteve elevada após o tratamento com doxiciclina. O aumento da expressão da MMP-2 (por imunomarcação) coincide com o aumento da atividade gelatinolítica observada nos ratos 2R1C, sugerindo a possível contribuição desta gelatinase no aumento da proteólise observada nestes animais. Dessa maneira, a doxiciclina pode não atenuar significativamente as concentrações da MMP-2 no tecido, mas pode ter inibido sua atividade sugerindo a contribuição desta protease nas alterações morfofuncionais associadas à hipertensão 2R1C.
Aumento de MMP-2 cardíaca foi observado em outros estudos com diferentes modelos de hipertensão como, ratos Dahl sensíveis ao sal e SHR (Mujumdar, Smiley et al. 2001; Iwanaga, Aoyama et al. 2002). Esses estudos encontraram resultados
semelhantes ao nosso mostrando que a MMP-2 aumentada pode estar associada ao remodelamento cardíaco (Iwanaga, Aoyama et al. 2002) e na disfunção da contratilidade cardíaca (Mujumdar, Smiley et al. 2001). Além disso, em animais
“knockouts” para MMP-2 foi mostrado que a supressão desta gelatinase atenuou a hipertrofia cardíaca associada à coarctação de aorta (Matsusaka, Ide et al. 2006), sugerindo a participação da MMP-2 para a HVE.
Existem evidências da contribuição das MMPs, incluindo MMP-2, na progressão da hipertrofia cardíaca. Foi mostrado que a MMP-2, dentre outras MMPs, aumentam progressivamente acompanhando a evolução do remodelamento cardíaco para insuficiência cardíaca em animais hipertensos (Mujumdar and Tyagi 1999; Peterson, Hallak et al. 2001; Iwanaga, Aoyama et al. 2002). Um outro estudo avaliou os efeitos de um inibidor de MMPs não seletivo (PD166793), em animais SHR. Os autores observaram que a inibição das MMPs, incluindo MMP-2, impediu a progressão do remodelamento cardíaco, mas não reverteu as alterações cardíacas encontradas antes do tratamento nos animais SHR (Peterson, Hallak et al. 2001).
No nosso estudo, os animais 2R1C apresentaram características de hipertrofia adaptativa devido ao aumento na espessura da parede ventricular esquerda e aumento na contratilidade cardíaca. Por isso, nosso resultados mostram que o aumento da MMP-2 está presente desde a hipertrofia cardíaca adaptativa e que a inibição das MMPs na fase adaptativa do remodelamento favorece a regressão ou atenuação deste remodelamento cardíaco.
Em conjunto aos nossos resultados, as evidências sugerem que a inibição das MMPs pode ser uma possível estratégia terapêutica para tratar da hipertrofia cardíaca secundária à HAS.
Os efeitos associados ao tratamento com doxiciclina são semelhantes à recentes resultados obtidos em nosso laboratório em aortas de animais 2R1C (Castro, Rizzi et al. 2009). Foi observado que esse inibidor de MMPs preveniu completamente as alterações na aorta de ratos associadas a um aumento de MMP-2 em animais 2R1C, mesmo a pressão arterial sendo parcialmente reduzida (Castro, Rizzi et al. 2009). Em conjunto aos resultados do presente estudo, estes achados sugerem que as MMPs, especialmente MMP-2, participam do remodelamento cardiovascular associado à hipertensão renovascular 2R1C.
Como comentado anteriormente, a doxiciclina é uma ferramenta farmacológica de grande interesse para o tratamento de doenças cardiovasculares, pois seu uso como inibidor de MMPs já é aprovado pelo FDA. Neste sentido, vários estudos foram realizados com doxiciclina avaliando seus efeitos sobre o aparelho cardiovascular (Griffin, Jinno et al. 2005; Tessone, Feinberg et al. 2005; Garcia, Go et al. 2007; Schulz 2007; Spinale 2007). Este inibidor (30 mg/Kg/dia, v.o.) reduziu a área de infarto associado a uma melhora na disfunção sistólica de animais (Griffin, Jinno et al. 2005; Garcia, Go et al. 2007). Em oposição a estes resultados, doxiciclina (100 mg/Kg/dia, subcutânea) não preveniu o remodelamento ventricular e prejudicou a hipertrofia adaptativa depois do infarto (Tessone, Feinberg et al. 2005).
Além disso, em outro estudos, doxiciclina (160 mg/Kg/dia, v.o.) acelerou a progressão para insuficiência cardíaca em ratos sujeitos à coarctação de aorta (Vinet, Rouet-Benzineb et al. 2008). As discrepâncias encontradas nestes estudos podem ser devido à dose de doxiciclina administrada. Doses menores (30 mg/Kg/dia) mostram efeitos benéficos, enquanto doses maiores (>100 mg/Kg/dia) mostram efeitos deletérios. Consistente com esta sugestão, no presente estudo a doxiciclina (30 mg/Kg/dia) foi efetiva em reduzir as alterações morfofuncionais
cardíacas associadas a hipertensão. Devido a importância desta droga para inibição de MMPs, estes resultados reforçam a necessidade de mais estudos dose-resposta para avaliar melhor os efeitos produzidos pela doxiciclina.
Existem evidências sugerindo que além de inibir as MMPs, a doxiciclina pode atuar como anti-inflamatório, anti-apoptótico e antioxidante (Lai, Yeh et al.; Golub, Lee et al. 1998; Webster and Del Rosso 2007). Um aumento na formação de ROS, inflamação e apoptose estão envolvidos na fisiopatologia da hipertensão, e podem direcionar a disfunções cardíacas (Grieve and Shah 2003; Touyz and Schiffrin 2004;
Opie, Commerford et al. 2006; Savoia and Schiffrin 2006; Berk, Fujiwara et al. 2007;
Sirker, Zhang et al. 2007). Dessa maneira, estes efeitos adicionais associados à doxiciclina podem estar envolvidos com os efeitos benéficos desta droga observados neste estudo.
De maneira geral, nossos resultados sugerem que as MMPs estão envolvidas no desenvolvimento das alterações cardíacas estruturais e funcionais na hipertrofia induzida pela hipertensão 2R1C. Assim sendo, fatores responsáveis pela ativação dessas proteases poderiam contribuir para fisiopatologia da hipertrofia cardíaca nestes animais.
As MMPs podem ser reguladas em três níveis: (i) expressão do RNAm, (ii) atividade: através da remoção do propeptídeo inibitório e (iii) inibição por TIMPs (Visse and Nagase 2003). Entretanto, o mecanismo responsável pelo aumento da MMP-2 e atividade gelatinolítica nos animais 2R1C ainda não está claro. Como já comentado na introdução, o estresse oxidativo pode aumentar a atividade das MMPs indiretamente (aumentando as concentrações de MMPs) e diretamente (ativando MMPs) (Rajagopalan, Meng et al. 1996; Siwik, Pagano et al. 2001;
Martinez, Lopes et al. 2006; Lu, Xu et al. 2008; Castro, Rizzi et al. 2009; Schulz 2009). Isso sugere que EROs poderia contribuir para a ativação das MMPs e as disfunções cardíacas associadas à hipertensão 2R1C.
Já foi mostrado in vitro (Viappiani, Nicolescu et al. 2009) que a incubação de MMP-2 recombinante com diferentes concentrações de OONO- leva ao aumento da atividade da MMP-2 nas doses de 0,3 -10 µM e à diminuição da atividade desta na concentração de 100 µM. Quando a glutationa é adicionada, esta parece proteger a MMP-2 da oxidação. Esse estudo também caracterizou o efeito do OONO- e da glutationa em um peptídeo de 17 aminoácidos que corresponde à seqüência do propeptídeo da MMP-2 que contém o sulfidril, e mostrou que este se oxida e também sofre glutationação. Essas formas da MMP-2 modificada por OONO- e glutationa não foram ainda descritas na hipertensão, e se encontrados nessa doença podem talvez, ser marcadores do estresse oxidativo no tecido. Nossos resultados mostraram apenas o estresse oxidativo no coração e sua associação com o aumento da atividade gelatinolítica, mas futuros estudos do nosso grupo abordarão a caracterização das formas da MMP-2 encontradas no coração e aortas de animais hipertensos.
Em relação ao exposto acima, nosso estudo foi o primeiro a mostrar que os tratamentos com tempol e apocinina atenuaram as alterações cardíacas associadas à hipertensão, em paralelo a uma redução da atividade gelatinolitica total.
Tratamentos com tempol e apocinina têm sido amplamente utilizados para avaliar a contribuição de EROs na hipertrofia cardíaca em diversos modelos experimentais (Liu, Zhou et al.; Rugale, Delbosc et al. 2007; Alvarez, Caldiz et al. 2008; Chess, Xu et al. 2008), e assim como observado em nossos resultados, muitos estudos sugerem importante participação de EROS na fisiopatologia da hipertrofia ventricular
esquerda (Liu, Zhou et al.; Zhang, Kimura et al. 2005; Rugale, Delbosc et al. 2007;
Alvarez, Caldiz et al. 2008; Chess, Xu et al. 2008; Stefanska and Pawliczak 2008;
Wang, Shimosawa et al. 2008; Wilcox 2010).
Como descrito anteriormente, um aumento das concentrações de EROs pode levar a várias das alterações cardíacas observadas na hipertensão. Dentre elas, podem ser destacadas: a disfunção endotelial, disfunção na contratilidade cardíaca, a peroxidação lipídica e o aumento da atividade de algumas MMPs (Cai and Harrison 2000; Griendling, Sorescu et al. 2000; Akki, Zhang et al. 2009; Ceron, Castro et al. 2010). De acordo com isso, nossos resultados mostraram que os tratamentos crônicos com antioxidantes reduziram a formação de EROs e preveniram as alterações estruturais e funcionais, encontradas nos animais hipertensos, sugerindo, assim, a contribuição de EROs nas disfunções morfofuncionais cardíacas.
Nossos resultados mostram que os dois tratamentos antioxidantes, com tempol e apocinina foram igualmente benéficos. Muitos trabalhos descrevem apocinina como inibidor de NADPH oxidase, e que os efeitos do tempol podem ser atribuídos à redução de anion O2-., que é o primeiro EROS a ser formado após ativação da NADPH oxidase, como comentado anteriormente (Touyz and Schiffrin 2004). Embora a atividade de NADPH oxidase e a quantidade específica de cada EROs formado não foram avaliados neste estudo, nossos resultados sugerem uma importante contribuição da ativação da ativação de NADPH oxidase para a hipertrofia cardíaca nos animais 2R1C. Essa sugestão está de acordo com outros trabalhos em outros modelos de hipertrofia cardíaca (Landmesser, Cai et al. 2002;
Modlinger, Chabrashvili et al. 2006; Murdoch, Grieve et al. 2006; Murdoch, Zhang et al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009)