Estudo imuno-histoquímico de Î²2-glicoproteína I em fígado e intestino de ratos submetidos à sepse pela via endovenosa ou associada à translocação bacteriana

Texto

(1)UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO. FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-Graduação em Farmácia Área de Análises Clínicas. Estudo imuno-histoquímico de Prglicoproteína I em. fígado e intestino de ratos submetidos à sepse pela via endovenosa ou associada à translocação bacteriana. Sheila Vieira da Cruz Augustinis. Dissertação para obtenção do grau de MESTRE Orientador: Prata. Ora. Lígia Ferreira Gomes. São Paulo 2005. /g?7"t!.

(2) DEDALUS - Acervo - CQ. 11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111. 30100011095. Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e Documentação do Conjunto das Químicas da USP.. A923e. August ini s, Sheila Vieira da Cruz Estudo imu no-histoq uím ico de p~-glicoproteína I em fígado e inte s tino de ratos submetidos à sepse pela via endovenosa ou associada à translocação bacteriana I Shei la Vieira da Cruz Augustinis. -- São Paulo, 2005. 79p . Dissertação (mes trado) - Faculdade de Ciências Farmacêuti cas da Universidade de São Paulo . Departamento de Análises C l ínicas e Toxicológicas. Orientador: Gomes, Lígia Ferreira I. lmunodiagnóstico : Medicina 2. Glicoproteína: Imunologia I. T . 11. Gomes, Lí g ia Ferreira , orientador. 616.0756 -9. CDD.

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(4) À Orientadora Lígia Ferreira Gomes "O saber a gente aprende com os mestres e com os livros. A sabedoria, se aprende é com a vida e com os humildes." Agradeço pela humildade com que me dedicou estes anos de estudo..

(5) Aos meus Pais A vocês, que me deram a vida e me ensinaram a vivê-Ia com dignidade, não bastaria um obrigada. A vocês, que me iluminaram os caminhos obscuros com afeto e dedicação, para que eu trilhasse sem medo e cheia de esperança, não bastaria um muito obrigada. A vocês, que se doaram inteiros e reuniram os seus sonhos, para que muitas vezes, pudesse realizar os meus, não bastaria um muitíssimo obrigada. A vocês pais, pais por natureza, por opção e amor, não bastaria dizer que não tenho palavras para agradecer tudo isso. Mas é o que me acontece agora, quando procuro uma forma verbal de expressar a emoção que sinto. Uma emoção que palavras dificilmente traduziriam..

(6) Ao meu marido André. "Sempre antes de realizar um sonho, Deus resolve testar tudo aquilo que foi. aprendido durante a caminhada. Ele faz isto não porque seja mau, mas para que. possamos, junto com o nosso sonho, conquistar também as lições que aprendemos seguindo em direção a ele.".

(7) DEDICATÓRIAS. A meus pais, Jacira e Valdomiro, que me apoiaram em todas as decisões e confiaram na minha capacidade, sem interrogar se este era o caminho certo;. Ao meu irmão Valdemir, minha cunhada Cristina e minha sobrinha Camille. que estiveram sempre ao meu lado e me deram a felicidade de compartilhar momentos agradáveis;. Aos meus falecidos avós, Maria e Benedito, que certamente torceram por mim em vida, para que alcançasse os meus objetivos;. Aos meus padrinhos, Maria Aparecida e Antonio , que nunca esqueceram de mim, mesmo quando eu estava distante;. Ao meu sogro João, minha sogra Vera e meu cunhado Allan , que me ajudaram a trilhar este caminho.. Em especial ,. Ao meu marido André, que me estendeu a mão nos momentos difíceis e enxugou minhas lágrimas para que eu pudesse continuar. ...

(8) AGRADECIMENTOS. À minha orientadora Lígia Ferreira Gomes, pelo apoio e dedicação na. pesquisa, e pela amizade, que é o mais importante neste caminho que escolhemos;. As docentes, funcionários e amigos do Departamento de Análises Clínicas. e Toxicológicas, principalmente do Laboratório de Patologia e Citologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP;. Ao. Dr.. Ivan. Koh. e. equipe. do. Laboratório. Experimental. em. Gastroenterologia Pediátrica da Escola Paulista de Medicina da UNIFESP;. À Ora. Virgínia Junqueira e equipe do Laboratório de Geriatria da Escola Paulista de Medicina da UNIFESP;. Ao Dr. Reinaldo Salomão e amigos do Laboratório de Imunologia e Virologia da Escola Paulista de Medicina da UNIFESP;. Ao Dr.. Esper Kallas e amigos do Laboratório de Imunologia do. CINTERGEN da Escola Paulista de Medicina da UNIFESP;.

(9) Aos Pesquisadores e amigos da Divisão de Patologia do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo;. Aos colegas e amigos de trabalho do Laboratório de Anatomia Patológica e Citologia, ANPACIT;. Às amigas Sandra, Elisângela e Clarissa, que sempre me ajudaram, tanto na vida profissional, quanto pessoal;. A todos os parentes e amigos de Tatuí que, de alguma forma, contribuíram para esta conquista.. Finalmente,. A Deus e à Nossa Senhora Aparecida, que sempre foram minhas fontes. inspiradoras, desde o início de tudo, pois a fé nos dá força para enfrentar os obstáculos e viver!.

(10) UQ farmacêutico faz misturas agradáveis,. compõe ungüentos úteis à saúde, e seu trabalho não terminará,. até que a paz divina se estenda sobre a face da terra. ". Eclo., 38: 7-8.

(11) RESUMO. AUGUSTINIS, S.v.C . Estudo imuno-histoquímico de fh-glicoproteína I em. fígado e intestino de ratos submetidos à sepse pela via endovenosa ou. associada à translocação bacteriana. 2005. 79 f. Tese (Mestrado), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 1995.. [32-glicoproteina I ([32GPI), uma proteína circulante produzida em fígado e intestino. foi estudada no fígado e íleo de ratos durante sepse controlada (S) ou. translocação bacteriana (TB) com E. calí R-6. A sepse foi induzida por inoculação endovenosa de 109 UFC/mLl100g. A TB, pelo confinamento de 10 mL 101. UFC/mL, no intestino. Grupos controle receberam veículo. Após 2h, os animais. foram sacrificados. [32GPI foi espressa nos tecidos de todos animais, em cortes. fixados em metacarn e impregnados com parafina , após reação com anti-[32GP. amplificada com Envision-AP. O fígado mostrou dois padrões citoplasmáticos. distintos. Um padrão difuso, atribuído à síntese protéica, aumentado somente no. grupo S e um padrão focal, invariável. No íleo, a mucosa foi negativa; a. submucosa, o endotélio sangüíneo e linfático, positivos. Esta marcação aumentou. somente no grupo TB. Os resultados sugerem a participação da [32GPI na regulação local da resposta hepática e intestinal de fase aguda.. Palavras-chave: [32-glicoproteina I, imuno-histoquímica, sepse.

(12) ABSTRACT AUGUSTINIS,. S.v.C.. /32-glycoprotein. expression. in. sepsis:. an. immunohistochemical study of rat liver and intestine following endovenous. inoculation or bacterial translocation. 2005. 79 s. Thesis (Master degree). Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo 1995.. /32-glycoprotein I is a circulating protein (/32GPI) produced in liver and intestines. /32GPI was studied in liver and ileum in rats under controlled sepsis (S) or bacteria. translocation (BT) with E. colí R-6. Sepsis was induced by endovenous inoculation. with 109 CFU/mU100g . BT was induced by confining 10 mL 10 10 CFU/mL, to the. intestine. Control groups received vehicle. After 2h , animais were sacrificed. Metacarn fixed , paraffin embedded tissue slices were reacted with monoclona. anti-!32GPI, revealed with Envision-AP and hematoxylin counterstained. Ali animais. stained for !32GPI in the liver and ileum. Liver presented two distinct cytoplasm. staining patterns. The diffuse pattern, ascribed to protein synthesis, increased in. group S animais only. The spotted pattern was invariant. lIeum mucosa was. negative, while submucosa, blood and Iymphatic endothelium were positive. The. ileum staining increased after TB, only. Results underline the hypothesis for locally regulated liver and intestine contribution to acute phase response modulation.. Keywords: !32-glycoprotein I, immunohistochemical , sepsis.

(13) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Estrutura da B2GPI apresentando cinco domínios (I-V) , quatro deles. típicos da família Short Consensus Repeats e um domínio rico em aminoácidos. com carga positiva (V) ... ... ........ .. .. ....... .... ...... ... .. ... ........ ....... ... ...... ... .. .. ..... ............ .. 8. Figura 2. Esquema da ligação da B2GPI a superfícies carregadas negativamente. através do quinto domínio .. .... ..... ... ........ ... ..... ... .. ........ ....... .. ... ............ ...... ......... .... . 9. Figura 3. Padrão típico de migração da B2GPI em gel SDS-PAGE a 12,5% corado. pela prata (A) e imagem da densitometria (B). PM : padrão de peso molecular;. linha 1: B2GPI purificada de soro de rato ; linha 2: forma dimérica e linha 3: forma monomérica da B2GPI purificada de soro humano .. ..... ........ ........ ........................ 31. Figura 4.. Imunoblot para B2GPI. revelado com anticorpo anti-B2GPI. (A). monoclonal, clone 5F7 e (B) soro imune de coelho. PM: padrão de peso. molecular. Linha 1: B2GPI purificada de soro de rato. linha 2: amostra de B2GPI. humana contendo a forma dimérica. linha 3: B2GPI humana purificada (forma. monomérica). Sistema Trans-Blot (BioRad) ... ..... ....... ... ..... ....... .. .. ........ ......... .. ..... 32. Figura 5. Aspecto histológico típico do fígado de ratos submetidos ao modelo. experimental de sepse associada à translocação bacteriana e seus respectivos. controles. A : sepse (S). B: controle da sepse (CS). C: translocação bacteriana. (TB). D: controle da translocação bacteriana (CTB). Fotomicrografia de cortes de. 3 Jlm , HE, (400X) .. ... .. ... ...... .... ...... .... ... .... ....... ... .. ........ .......... ... .. ........ ... ... .. ....... .. .. 34.

(14) Figura 6. Aspecto histológico típico do intestino (íleo) de ratos submetidos ao. modelo experimental de sepse associada à translocação bacteriana e seus. respectivos controles. A: sepse (S). B: controle da sepse (CS). C: translocação. bacteriana (TB). D: controle da translocação bacteriana (CTB). Fotomicrografia de. cortes de 3 flm, HE, (400X) .................. ..... ............................................................ 35. Figura 7. Aspecto típico da marcação imuno-histoquímica para !32GPI com. anticorpo monoclonal, clone 5F7, em tecidos de rato. Fotomicrografia de fígado (A. e B) e íleo (C e D) de rato, mostrando (A e C) marcação e (B e D) respectivos. controles da reação. Cortes de 3 flm Revelação: Envision-AP®. Contracoloração: hematoxilina, (400X) ... .. ....... ... ....... .... .......... ..... .. .......... ....... ........ .... ....... ...... ........ 38. Figura 8. Aspecto típico da marcação imuno-histoquímica para !32GPI com soro. imune de coelho, em tecidos de rato. Fotomicrografia de fígado (A e B) e íleo (C e. D) de rato, mostrando (A e C) marcação e (B e D) respectivos controles da reação.. Cortes. de. 3. flm .. Revelação:. Envision-AP®.. Contracoloração:. hematoxilina, (200X) ......... .. ... ............ ........ ........ .......... .. ....................................... 39 Figura 9. Aspecto típico do fígado de ratos (A) inoculados com E. col; R-6 para. indução de sepse ou (C) injetados com solução salina pela via endovenosa, e respectivos controles negativos da reação (B e D). Fotomicrografia de cortes de. 3flm, reação imuno-histoquímica com anticorpo monoclonal anti-!32GPI, clone 5F7, revelada com Envision-AP®, (400x) ................................................ ........ .... ...... .. . 42.

(15) Figura 10. Aspecto típico do fígado de ratos (A) inoculados com E. colí R-6 para. indução de sepse ou (e) injetados com solução salina pela luz intestinal, e. respectivos controles negativos da reação (B e D). Fotomicrografia de cortes de. 3Jlm, reação imuno-histoquímica com anticorpo monoclonal anti-J32GPI, clone 5F7,. revelada com Envision-AP® , (400x) ......... ... .. ..... ... ...................... ..... ... ..... .... .. ...... 43. Figura 11. Aspecto típico do intestino (íleo) de ratos (A) inoculados com E. colí R-. 6 para indução de sepse ou (e) injetados com solução salina pela via. endovenosa, e respectivos controles negativos da reação (B e D). Fotomicrografia. de cortes de 3Jlm, reação imuno-histoquímica com anticorpo monoclonal anti-. J32GPI , clone 5F7, revelada com Envision-AP® , (400x) ....... ............ .. ... ...... .......... 48. Figura 12. Aspecto típico do intestino (íleo) de ratos (A) inoculados com E. coli R-. 6 para indução de sepse ou (e) injetados com solução salina pela luz intestinal, e. respectivos controles negativos da reação (B e D). Fotomicrografia de cortes de. 3Jlm , reação imuno-histoquímica com anticorpo monoclonal anti-J32GPI, clone 5F7, revelada com Envision-AP®, (400x) .... .......... .... .... ..... .... ... .. ....... ........... .... ... .. .. .... 49. Figura 13.. Estudo citoquímico das áreas de marcação focal para !32GPI em. fígado de rato. Fotomicrografias de cortes independentes de uma mesma. amostra , corados por A: reação imuno-histoquímica para !32GP1 com anticorpo. monoclonal clone 5F7, revelação com Envision-AP®, contracoloração com hematoxilina. B: Hematoxilina-eosina.. e:. Vermelho Congo para amilóide. com. espessura de 3Jlm , (400x) .. ........... ... ... ....... ....... ... ....... .. .... ....... ............ ... ... .. .. ... ... 50.

(16) LISTA DE GRÁFICOS. Gráfico 1. Área total de células (mm\ analisada para densidade de marcação. imuno-histoquímica para 132GPI em cortes de fígado de ratos em cada um dos. grupos experimentais: controle da translocação bacteriana (CTB) , translocação bacteriana (TB), controle da sepse (CS) e sepse (S) ........ ......... ........... ...... ..... .... 44. Gráfico 2 .. Densidade da marcação difusa para 132GPI (/J.m 2/campo), em fígado de. rato , segundo grupo experimental: controle da translocação bacteriana (CTB),. translocação bacteriana (TB), controle da sepse (CS) e sepse (S). Diferença. estatística calculada pelo método One-way ANOVA, seguido do teste de. Bonferroni .. ....................... .. ....... ... .. .. ..... .. ......... .. .......... .... ....... .. ... ..... ...... ... .... .... .. . 45. Gráfico 3. Densidade da marcação focal para 132GPI (/J.m 2/campo) em fígado de. rato, segundo o grupo experimental: controle da translocação bacteriana (CTB), translocação. bacteriana. (TB),. controle. da. sepse. (CS). e. sepse. (S) ..... ..... .. ... ......... .... .... ......... .. ........ .............. ..... ............. ............. ........... ..... ......... . 46.

(17) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. ABNT. Associação Brasileira de Normas Técnicas. AP. Fosfatase alcalina. APS. Persulfato de amônia. BSA. Albumina de soro bovino. CL. Cardiolipina. OAB. 3,3' -Diaminobenzidina. E. calí. Escheríchía calí. EDTA. Ácido etilenodiaminotetracético. HE. Hematoxilina-eosina. IgG. Imunoglobulina G. iNOS. Óxidonítrico sintase induzível. PAGE. Eletroforese em gel de poliacrilamida. PBS. Solução salina tamponada com fosfato. PS. Fosfatidil serina. RNAm. RNA mensageiro. SDS. Dodecilsulfato de sódio. Silana. 3-Aminopropiltrietoxi silano. TB. Translocação Bacteriana. TBS. Solução salina tamponada com Tris. TEMED. N, N, N, N - tetrametiletilenodiamina. UFC. Unidades formadoras de colônias.

(18) I eUJ alOJdo:>!18-l 9. Id8 l 9. ex!eq Ol!nW apep!suap ap eUJalOJdod!l. 101/\ dSn II\Id3/dS3.::1INn.

(19) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO..... ....... ....................... ............ ....................... ........... ........ .......... 1. Sepse e translocação bacteriana ........................................................................ 1. Resposta inflamatória à sepse e o circuito porta-hepático .............................. 5. f32-glicoproteína I (f32GPI) ............................................................. ................. ... ... .. 7. f32GPI e inflamação .............................................................................................. 10. 2. OBJETiVOS ......... .............. .. .. ................... ....... ................. ......... ...................... 13. 3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 14. 3.1. PURIFICAÇÃO DE !32-GLlCOPROTEíNA I DE RATO .................................. 14. 3.1 .1. Precipitação em ácido perclórico ............................................................ 15. 3.1.2. Cromatografia de afinidade em coluna de heparina Sepharose® ....... 15. Montagem da coluna de cromatografia ..................................... .... ........ ...... ......... 15. Separação da f32GPI de rato por cromatografia de afinidade .. .. ...... ... .............. .... .16. 3.2. ELETROFORESE EM SDS-PAGE ............................................................. ... 16. 3.3. IMUNOBLOT PARA !32GPI .. .... .................... ...... .. .. .. ............ .... ...................... 18. 3.3.1. Transferência das amostras do gel para a membrana .......................... 19. 3.3.2. Imunoblot ........................................................... .. ................................ .. .... 19. 3.4. MODELO EXPERIMENTAL DE TRANSLOCAÇÃO BACTERIANA E SEPSE. .. ........ ...................... ......... .. ...... ... ...... ......... .... ........................... .................... ... ...... 20 3.4.1. Amostras bacterianas ........................................ ......... ...... ................... .. .. 21. 3.4.2. Inoculação de bactérias nos animais para estudo da translocação bacteriana (TB) .................................................................................................... 21. 3.4.3. Inoculação das bactérias nos animais para indução da sepse ............. 22.

(20) 3.4.4. Coleta dos órgãos e do sangue ......... .. .. .. ...... ...... .... ... ........ .... .......... ..... .. 23. 3.4.5. Inclusão dos tecidos em parafina ..... .......... .... ........... ... ..... ..... ........... ... .. 23. 3.5. ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS TECIDOS .... ...... .. ........ ... ........ ... .. .. ...... ... .. . 24. 3.5.1. Hematoxilina-eosina (HE) ....... .. ... .... .. ... ..... ....... ... ..... ..... ...... ....... ... ..... ...... 24. 3.6. IMUNO-HISTOQuíMICA PARA f32GPI EM FíGADO E INTESTINO DE. RATO ..... .... .... .................. ....... ... ...... ... ... ...... ....... .... .. ... .. ..... ..... .... .... ...... ... .. ... ........ 25. 3.6.1. Preparação das lâminas .... ... ......... ............ .. ...... .............. ... .... .................. 25. 3.6.2. Imuno-histoquímica .. .. ... ..... ..... ...... ...... .. .. .. ... .... ... ....... ........ .. ...... ... ... .. .. ... . 26. 3.7. ESTUDO CITOQuíMICO ...... ... ....... ..... ........... ..... ..... .... ... ...... .. ....... ... .... .. .... .. 27. 3.7.1. Vermelho Congo .. ........ ..... .... .... ... .... ..... .. .... .... .... .... .... .. ...... ...... ... .. ........ ... 28. 3.8. ANÁLISE QUANTITATIVA DA MARCAÇÃO HEPÁTICA PARA f32GPI ... ..... . 28. 3.9. ESTATísTiCA .. ......... ........... .... .... ....... ...... .. ........ .... ....... .... ... ..... ... ... ............. . 29 4. RESULTADOS ...... .... ... .. ... ...... ... ... ....... ..... .... .......... ... .... ..... ... ........ ... ... .. ........ .. 30. 4.1. PURIFICAÇÃO DE f32-GLlCOPROTEíNA I DE RATO ...... ... ..... ... ..... ....... ..... 30 4.2. IMUNOBLOT .. .... .. ........... ... ... .... ... ... .. ... ... .. ... .. ... ........ ....... ... ..... ...... .... .. .. .. .. .... 31. 4.3. ANÁLISE MORFOLÓGICA DO FíGADO E INTESTINO DOS ANIMAIS. SUBMETIDOS À SEPSE .. ............. ....... ..... ... ...... .......... .. .. .. ..... ... ... .... .. .. ....... ..... ... 32. 4.4. IMUNO-HISTOQuíMICA PARA f32GPI EM FíGADO E INTESTINO DE RATO .... ... .. ... ..... .. ... .. ..... .. ........ ......... ... ...... ...... .. ... ..... ..... .. .... .. ..... .... ........ ...... .. ...... .... .. .... 36. 4.5. EFEITO DA VIA INFECÇÃO SOBRE A LOCALIZAÇÃO DE f32GPI NO FíGADO DE RATOS SUBMETIDOS À SEPSE ..... ...... .. .... ... ..... ......... .... ....... .. ... 40. 4.6. Efeitos da via de infecção sobre a localização de f3 2GPI no intestino de. ratos submetidos à sepse .... ...... .. ... ......... .. ...... ....... ... .. ........ ..... ..... ... ... ... ..... .... .. 47.

(21) 4.7. Estudo citoquímico das áreas de marcação focal para (32GPI em fígado. de rato ......... .......... ................................... ...... ........... ..... .. .. .. ....... ....... ............ ...... 50. 5. DISCUSSÃO ..... ............. .. ................................................................................. 51 Purificação das formas monoméricas e multiméricas da (32GPI de rato .... ... 51. Demosntração imuno-histoquímica de (32GPI em tecidos de rato ................. 53 (32GPI. e. modelo. experimental. de. sepse. associada. à. translocação. bacteriana ............... ...... .. .. ..................... ........... ..... ..... .............. ............ ..... ........... 56. 6. CONCLUSÃO .... .. ........ ..... .. ... .... ...... ........ .... ..... .... ... .... ...... ... .... ..... ... ..... ...... ... .. 60. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................... .... ...... 62. ANEXO ............ ............................. .. ........... .............. ... .. ................................... ... .. 79.

(22) 1. INTRODUÇÃO Sepse e translocação bacteriana A sepse vem sendo estudada por muitos pesquisadores devido ao fato de ser uma das causas mais comum de mortes em hospitais. A infecção seguida de sepse, frequentemente evolui para sepse grave e choque séptico, levando à falência de múltiplos órgãos. Sepse é uma manifestação do organismo desencadeada por uma infecção grave, relacionada à reação inflamatória do hospedeiro. O termo sepse significa putrefação, decomposição da matéria orgânica por um agente agressor (bactérias, fungos, parasitas, vírus). Os termos infecção e sepse são geralmente utilizados de forma independente, mas existe uma relação entre eles, devido ao fato de que, a infecção também está relacionada à presença de um agente agressor numa localização (tecido, cavidade ou fluído corporal) normalmente estéril (MATOS & VICTORINO, 2005). Em pacientes sépticos, especialmente quando o foco primário não é definido, o intestino representa um potencial reservatório de bactérias, que alcançariam os tecidos extra-intestinais pelo fenômeno denominado de translocação bacteriana (MEAKINS et aI., 1989; HOFFMAN et aI., 1996; DAVIES & HAGEN, 1997). O termo translocação bacteriana (TB) foi, inicialmente, empregado para descrever a passagem de bactérias através da parede intestinal (WOLOCHOW, 1966). Posteriormente, este conceito foi ampliado como sendo a passagem de bactérias viáveis, nativas do trato gastrointestinal, para sítios extra-intestinais como os linfonodos do mesentério, baço, fígado, rins, cavidade peritoneal e circulação sanguínea (BERG & GARLlNGTON,. 1979).. Este processo parece ser um processo ativo,.

(23) 2 dependente de compartimentalização, da patogenicidade das bactérias e da concentração bacteriana, mas sem correlação direta com o estado de imunodeficiência ou com lesão da mucosa intestinal no hospedeiro. O fenômeno translocação bacteriana não necessariamente leva à infecção sistêmica ou à mortalidade em ratos (KOH et aI., 1996a, 1998a e 1998b; SILVA et aI., 1996a e 1996b). Além disso, as bactérias translocadas mostram uma preferência pelos órgãos sólidos, linfonodo mesentério, baço e fígado em comparação ao compartimento sanguíneo (MENCHACA-DIAZ, 2003). Para a ocorrência da TB, ao menos uma das condições seguintes deve estar. presente:. sobrecrescimento. bacteriano. intestinal,. deficiência. na. imunidade do hospedeiro ou aumento da permeabilidade da barreira mucosa intestinal (DEITCH, 1990; BERG, 1992). Os principais agentes atualmente relacionados com a sepse em humanos são as bactérias gram-negativas, sendo a Escherichia coli o agente mais freqüente (MARSHALL et aI., 1988; O ' BOYLE et aI., 1998; MACFIE et aI., 1999). Como, freqüentemente, o agente isolado do sangue é identificado entre os componentes da flora intestinal do indivíduo, uma das principais hipóteses para a origem das infecções na sepse, considera que a etapa inicial seja o escape de bactérias da luz intestinal para a circulação sistêmica (hipótese intestinal da sepse) (MARSHALL et aI., 1988; MACFIE et aI., 1999). Segundo a hipótese intestinal da sepse, as bactérias translocadas induzem uma resposta sistêmica de ativação pró-inflamatória em células endoteliais. Como resultado, ativam-se o sistema complemento, o sistema de coagulação, fagócitos mononucleares e neutrófilos. Esta ativação em cascata pode causar dano, de.

(24) 3. intensidade e extensão variáveis, em órgãos parenquimatosos e culminar com. a morte do hospedeiro (DAVIES & HAGEN, 1997; DEITCH , 1992; HEUMANN et aI., 1998).. Segundo a literatura, as bactérias do intestino alcançam a circulação. sistêmica por duas vias: a via portal (hematogênica) e a via linfática. Culturas. de sangue positivas mostraram que as bactérias aderem-se ao endotélio dos. vasos sanguíneos (veia porta, veia cava inferior, renal e pulmonar) após a. translocação (DEITCH, 1992; KOH et aI., 1998a). Este fenômeno foi observado. com bactérias E. colí R-6 inoculadas no intestino de ratos , tanto em concentrações letais, quanto não letais (KOH et aI. , 1998a). Entretanto, a via. hematogênica da TB não foi consagrada como uma via habitual de TB, porque culturas do sangue portal em modelos experimentais de sepse mostraram. resultados divergentes (MAINOUS et aI. , 1991 ; MOORE et aI. , 1991 ; BRATHWAITHE et aI. , 1993; VAN GOOR et aI. , 1994; KOH et aI., 1996a). A via linfática tem sido reconhecida como sendo a principal via de TB, devido à demonstração clara de bactérias translocadas do intestino nos linfonodos mesentéricos (BERG & GARLlNGTON , 1979; DEITCH et aI. , 1986 e 1990;. WELLS et aI. , 1990; ALEXANDER et aI. , 1991; MAINOUS et aI., 1991 ;. BRATHWAITE et aI. , 1993; GAUTREAUX et aI., 1994; KOH et aI. , 1996c; WOLOCHOW et aI. , 1966; LJUNGDAHL et aI. , 2000). Entretanto, vários estudos sugerem que a via linfática de TB relacione-se à ativação da resposta imunológica do hospedeiro e não seja uma via importante para o tráfego de bactérias de origem intestinal para a circulação sistêmica (KOH et aI. , 1996b; NIEUWENHUIJZEN et aI., 1996; RUIZ-SILVA et aI., 2002)..

(25) 4. Além de ser o reservatório dos agentes de infecção, o intestino é um órgão importante no desenvolvimento da sepse (CARRICO et aI., 1986; BERG, 1999). Em conseqüência da agressão à mucosa intestinal, sua permeabilidade aumenta, permitindo que mais bactérias presentes na luz ultrapassem a parede do intestino e invadam sítios extraintestinais do hospedeiro (OEITCH , 1987). Portanto, a ruptura da barreira epitelial do intestino normal, com subseqüente translocação bacteriana, pode não só gerar um estado de sepse, como também provocar o agravamento do estado de sepse pré-existente, amplificando a resposta inflamatória sistêmica (ANTONSSON & FIOOIANGREEN,1991)..

(26) 5. Resposta inflamatória à sepse e o circuito porta-hepático. A via hematogênica portal de infecção sistêmica implica o fígado e o baço como barreiras importantes na resistência à sepse (SILVA et aI., 1998; MENCHACA-DIAZ et aI., 2002). Entretanto, em ambas as vias (hematogênica e linfática) o fígado é um órgão importante da resposta inflamatória aguda. A circulação porta-hepática drena uma extensa região de mucosa intestinal não estéril. O intestino tem um sistema linfóide desenvolvido e é permanentemente estimulado pela flora normal, rica, presente na luz do órgão. A topografia e a intensidade da colonização pela flora normal são mantidas devido à contínua migração de leucócitos polimorfonucleares e monócitos do sangue, além da ação especializada de células epiteliais, imunoglobulinas e outras substâncias imunoprotetoras sintetizadas por células do sistema imune. Este conjunto de ações cooperativas mantém a integridade histológica e funcional do tecido (ANDERSON et aI., 1991; CARRERAS et aI., 1994; CONNELLY et aI., 2001) . Ao mesmo tempo, mucosas representam interfaces de troca com o ambiente externo, e requerem uma seleção precisa de antígenos a serem tolerados pelo sistema imune (MAYER et aI., 1996). A tolerância a antígenos da dieta e da flora normal também é regulada localmente de forma dinâmica (DIETER et aI., 1995a; MAYER et aI., 1996). Além da barreira local, o fígado desempenha um papel central na regulação da resposta imune (ROGOFF & LlPSKY, 1981). Nos sinusóides, as células de Kupffer interagem entre si e com o parênquima hepático para produzir mediadores inflamatórios que regulam o estado de ativação, a composição e o tamanho da população de leucócitos que migra do sangue para os tecidos (NAITO et aI., 1997; ROGOFF & LlPSKY, 1981; SHI et aI.,.

(27) 6. 2001). A ativação de fagócitos, entre eles as células de Kupffer, produz interleucinas,. derivados. do. ácido. araquidônico,. produtos. de. ativação. plaquetária, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, podendo levar à resolução da infecção ou à morte do hospedeiro pela falência de múltiplos órgãos (DIETER et aI. , 1995a, 1995b e 2000; RIGATO et aI., 2001). Durante a indução da inflamação, parte das interleucinas liberadas atua no sentido de inibir a progressão da resposta inflamatória. As células de Kupffer, endoteliais, musculares e outras células do sinusóide hepático regulam o fluxo e a distribuição do sangue pela rede capilar hepática (MCCUSKEY, 2000). Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, juntamente com a endotelina e as prostaglandinas modificam o tônus vascular, regulando a perfusão. Em condições inflamatórias, temos ainda a indução de iNOS nas células endoteliais e macrófagos e variações na atividade de heme-oxigenase-1 e na síntese de prostaglandinas (CANTONI et aI., 1991 ; MONCURE et aI. , 1999; DIETER et aI., 2000) ..

(28) 7 ~2-glicoproteína. A. I (P2GPI). ~2-glicoproteína. I é uma proteína de aproximadamente 50kDa, que. consiste de uma cadeia polipeptídica simples contendo 326 resíduos de aminoácidos, cinco deles ligados à oligossacarídeos, com cinco domínios (figura 1) de aproximadamente 60 resíduos de aminoácidos, quatro deles iguais e típicos da família shorl consensus repeats ou das proteínas de controle do complemento, e um quinto domínio, ligeiramente diferente (SCHULTZ et aI., 1961; LOZIER et aI., 1984; DAY et aI., 1989). A rato apresenta homologia em relação à. ~2GPI. ~2GPI. de. humana baseada na seqüência. de aminoácidos da proteína (AOYAMA et aI., 1989). É encontrada no plasma circulante de diversas espécies, inclusive de humanos, cerca de 60% na forma livre e 40% ligada à diversas frações de lipoproteínas, principalmente VLDL e quilomicrons, e também é denominada apolipoproteína H (POLZ et aI., 1980). Sua concentração no plasma de rato é de aproximadamente 200 !J.g/mL (HORBACK et aI., 1998; KANDIAH & KRILlS, 1994; BARSHACK et ai, 2003). A ~2GPI. também é encontrada na linfa, no líquido cefaloraquideano e no humor. aquoso de várias espécies..

(29) 8. v IV. 111. Figura 1. Estrutura da ~2GPI apresentando cinco domínios (I-V), quatro deles típicos da família Short Consensus Repeats e um domínio rico em aminoácidos com carga positiva (V) .. A P2GPI é produzida principalmente em hepatócitos, no fígado (DAY et aI. , 1992), e sua expressão (RNAm e proteína) tem sido demonstrada em astrócitos fetais, células do intestino e da placenta (AVERY et aI. , 1993; AVERNA et aI. , 1997; CHAMLEY et aI. , 1997), células endoteliais, linfócitos, rnonócitos, astrócitos e neurônios (CARONTI et aI. , 1998 e 1999; CONTI et aI., 2003; AVERNA et aI. , 2004), com reabsorção renal (KLAERKE et aI. , 1997). Sua função fisiológica ainda é desconhecida, mas ela tem sido implicada no metabolismo dos lipídeos e na regulação da hemostasia. A P2GPI liga-se. á. superfícies. contendo. lipídios. com. carga. negativa,. como. fosfatidilserina (PS) e cardiolipina (CL) , heparina, dextran sulfato e DNA (BRIGTHON et aI., 1994 e 1999; GOLDSMITH et aI. , 1994; AVERNA et aI. , 2004). A P2GPI liga-se a plaquetas ativadas com PS e CL e inibe a agregação plaquetária e a fase de contato da cascata de coagulação (BRIGTHON et aI. , 1994; GOLDSMITH et aI. , 1994). Pela sua capacidade em ligar-se a superfícies contendo lipídios negativamente carregados, foi proposta como um.

(30) 9. sinalizador de apoptose para macrófagos (CHONN et aI., 1995). A associação entre. ~2GPI. e membranas ocorre através do seu quinto domínio (SANGUERA,. 1997a e 1997b), como mostrado na figura 2. Após ancorar-se à membrana, a proteína sofre mudanças conformacionais e oligomerização (HAMMEL et aI. , 2001).. v N. ... .... .. ~. ~. Figura 2. Esquema da ligação da 132GP1 a superfícies carregadas negativamente através do quinto domínio.. Formas clivadas de. ~2GPI. foram detectadas no plasma de pacientes. com Coagulação Intravascular Disseminada, assim como em pacientes tratados com estreptoquinase, com leucemia e atividade do anticoagulante lúpico (HORBACH et aI., 1999; ITOH et aI., 2000) . Este processamento proteolítico da. ~hGPI. in vivo ocorre durante a ativação da fibrinólise mediado. pela plasmina. A clivagem in vitro da. ~2GPI. é causada por plasmina, tripsina e. elastase e é prevenida pelo pré-tratamento do plasma com precipitação em ácido perclórico (HORBACH et aI., 1999)..

(31) 10 rhGPI e inflamação. A ligação de rhGPI a superfícies lipídicas contendo fosfatidilserina levou à proposta por Chonn e colaboradores (1995) de que esta proteína pudesse servir como um sinalizador biológico para remoção de células apoptóticas e plaquetas ativadas. Esta proposta foi referendada pelos resultados de Barshack e colaboradores (2003), que demonstraram a presença de !32GPI associada a regiões de lesão em músculo cardíaco de ratos infartados. Foram demonstrados também, efeitos de !32GPI sobre a fagocitose e sobre o burst respiratório de fagócitos (BALASUBRAMANIAN et aI. , 1998; GOMES et aI., 2002). A !32GPI inibe o burst respiratório de células de Kupffer sem afetar na mesma intensidade o processamento de antígenos fagocitados, ao menos no caso de atividade fungicida contra Candida albicans (GOMES et aI., 2002 e 2004b). Em humanos, foi descrito o aumento da concentração de !32GPI em doenças. inflamatórias. com. hipercolesterolêmicos sem. componente. autoimune. e. em. idosos. história de doença cardiovascular (GOMES,. 2004a) . A associação entre trombose e inflamação é relevante no caso de doenças autoimunes que apresentam anticorpos com especificidade para !32GPI, por exemplo, no Lupus Eritematoso Sistêmico e na Síndrome do Anticorpo Antifosfolipídio Primário. Nestas patologias aumenta a concentração plasmática da proteína, sem que se conheça o significado clínico desta alteração (GEORGE et aI., 1999). Além dos leucócitos e das plaquetas, células endoteliais são alvos potenciais dos efeitos de !32GPI. A !32GPI liga-se às células endoteliais através do seu quinto domínio e a formação do complexo.

(32) 11. entre anticorpo autoimune e P2GPI ancorada às células endoteliais leva à ativação dessas células in vitro em pacientes com síndrome antifosfolipídica (DEL PAPA et aI., 1998). A ligação com o endotélio também se dá através de anexina A2 (ZHANG & MCCRAE, 2005). Em modelo murino, o efeito inibidor do burst respiratório de células de Kupffer é mais pronunciado no órgão inteiro perfundido in vitro do que em suspensões de células não parenquimatosas isoladas, indicando que a interação endotélio-macrófago possa participar da resposta à P2GPI (GOMES et aI., 2004b). Recentemente. foi. descrita,. em. modelo. murino,. a. indução. de. autoanticorpos reativos para P2GPI em modelos animais infectados com. Haemophilus influenzae e Neisseria gonorrhoeae entre outros patógenos. Autoanticorpos produzidos após administração de toxóide tetânico ou infecção por estas bactérias foram capazes de induzir a síndrome do anticorpo antifosfolipídio em animais sadios (BLANK et aI., 2002). Se considerados em conjunto, a presença de P2GPI na circulação sanguínea e linfática (VLDL e quilomicrons), a localização anatômica de sua produção (fígado e mucosa intestinal são os principais sítios de sua produção), seus efeitos anti inflamatórios, metabólicos e suas ações sobre a coagulação sanguínea e sobre as células endoteliais, sugere-se existência de um compartimento funcional para seu papel imunorregulador, associado ao circuito porta-hepático. A hipótese em estudo neste trabalho é de que a modulação da resposta imune por P2GPI no circuito da circulação porta-hepática seja relacionada à absorção de nutrientes e à condição da flora local, embora este sítio não se represente como um compartimento delimitado por barreiras anatômicas. A.

(33) 12. própria mucosa intestinal e o fígado poderiam regular esta função da proteína, alterando a sua concentração local e a sua disponibilidade, tanto no sangue portal, quanto na linfa mesenterial. Por isso, o estudo da localização de. ~2GPI. na mucosa intestinal e no tecido hepático, em modelo animal de sepse e translocação bacteriana, permitirá avançar no estudo do modo de ação da proteína sobre a regulação da resposta inflamatória aguda local..

(34) faculdade de CII'!nClél' Fa'fl1;}Cf-~llc.:J~ " Universidade de S;;o Paulo. 13. 2. OBJETIVOS. Estabelecer um método imuno-histoquímico para detecção de. ~2GPI. em. tecidos de rato.. Estudar, através de técnicas de marcação imuno-histoquímica, a presença de. ~2GPI. no tecido hepático e na mucosa intestinal de ratos.. Comparar a distribuição da indução. de. resposta. ~2GPI. in vivo em duas condições distintas de. inflamatória. aguda. à. sepse,. associadas. respectivamente à via de infecção por inoculação direta e à translocação bacteriana através da mucosa intestinal..

(35) 14. 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 . PURIFICAÇÃO DE P2-GLlCOPROTEíNA I DE RATO Para a purificação da P2GPI, foi utilizado um pool de soro de ratos Wistar, reunindo o soro dos animais controle utilizados nos ensaios de sepse e de animais utilizados da etapa de padronização da técnica imuno-histoquímica. Para os ensaios de sepse e translocação bacteriana, foram utilizados 24 ratos fêmeas, da linhagem Wistar, com idade aproximada de três meses e peso entre. 175 e 225 9 procedentes do. Biotério Central. do Centro de. Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e BiologiaCEDEME, da Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM). A !32GPI foi purificada a partir de 85 mL de soro de ratos por cromatografia em coluna de Heparina Sepharose® CL-6B (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ).. Tampões utilizados na purificação: Tris.HCI* 20 mM com NaCI 30 mM, pH 7,1. Tris.HC120 mM com NaCI150 mM, pH 7,0. Tris.HCI 20 mM com NaCI 350 mM, pH 8,5. Tris.HCI 20 mM com NaCI 500 mM, pH 8,5.. *Trizma.HCI® ou Trizma base® preparado com HCI (8igma-Aldrich Co., 8t. Louis, MO).

(36) 15. 3.1.1. Precipitação em ácido perclórico Inicialmente, o soro foi transferido para a membrana de diálise Spectra/Por® (Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez,. CA) e. dialisado em tampão Tris 20 mM / NaCI 30 mM sob agitação por 24 horas à 4°C. Em seguida, o soro foi adicionado de ácido perclórico a 70% , na proporção de 1,25 mL de ácido para cada 50 mL de soro, seguida de centrifugação a 10621 g por 30 minutos à 4°C (Hitachi Ltda., Chiyoda-ku, Tokio) . Este procedimento precipita uma grande quantidade das proteínas da solução e corresponde a uma etapa de pré-purificação do soro.. O. sobrenadante foi neutralizado com carbonato de sódio a pH 7,0 e dialisado em tampão Tris 20 mM / NaCI 30 mM sob agitação, por 12 horas, a 4°C.. 3.1.2. Cromatografia de afinidade em coluna de heparina Sepharose®. Montagem da coluna de cromatografia A resina de heparina Sepharose® CL-68 foi pesada (3,5 g), hidratada e lavada várias vezes em água destilada. O gel formado foi colocado, com excesso de água, em um erlenmeyer sem tampa, deixado dentro de um dessecador fechado e degaseado por cerca de 1 hora com o auxílio de uma bomba de vácuo para remoção do ar que fica aprisionado nas partículas hidratadas do gel. Em seguida, o gel hidratado foi colocado na coluna de vidro (7 x 18 cm) sobre uma fina camada de lã de vidro introduzida na base da coluna. A distribuição homogênea, em toda a altura da coluna de gel, foi conseguida ajustando-se as condições de fluxo durante esta etapa. A coluna.

(37) 16. foi equilibrada com a passagem de água destilada, seguida de tampão Tris 20 mM / NaCI 30 mM. Todo o procedimento foi realizado a 4°C .. Separação da B2 GPI de rato por cromatografia de afinidade Após o equilíbrio da coluna de cromatografia, a amostra foi passada pela coluna em fluxo de 10 mUh. Em seguida, as ligações inespecíficas foram removidas com o tampão Tris 20 mM / NaCI 150 mM em fluxo de 30 mUh, até que a absorbância fosse menor que 0,01. A proteína foi eluída em tampão Tris 20 mM / NaCI 350 mM em fluxo de 30 mUh e alíquotas foram colhidas e analisadas no espectrofotômetro. O perfil de eluição foi determinado a partir do gráfico das absorbâncias das alíquotas coletadas em função do volume eluído, em cada etapa. Foram recolhidas as amostras ricas em proteína de cada uma das etapas de purificação, reunidas em um volume único por etapa. As alíquotas foram armazenadas no freezer a -20°C para utilização dentro de 30 dias e no freezer -80°C para estoque por tempo prolongado. A coluna foi lavada com tampão Tris 20 mM / NaCI 500 mM e reequilibrada com tampão Tris 20 mM / NaCI 30 mM.. 3.2 . ELETROFORESE EM SDS-PAGE As amostras da r32-glicoproteína I de rato, colhidas na cromatografia, foram submetidas à eletroforese da proteína em gel SDS-poliacrilamida a 12,5%. Formas dimérica e monomérica da r32GPI humana serviram como controle positivo da separação. A concentração da proteína de rato foi.

(38) 17. estimada a partir de sua absorbância em 280 nm. (E280nm=. 1,00 mUmg.cm),. considerada por analogia com a proteína humana (AOYAMA et aI., 1989).. Soluções utilizadas: Tampão do compartimento inferior: Tris-HCI a 1,5 M pH 8,8 I dodecil sulfato de sódio (SOS) a 0,4%. Tampão do compartimento superior: Tris-HCI a 1 M pH 6,8 I SOS a 0,4%. Acrilamida SOS-PAGE: acrilamida a 30%; bisacrilamida a 0,8%. APS: 0,1 9 de persulfato de amônia; 1 mL de água destilada. Tampão de amostra: 4ml de Tris-HCI a 1 M pH 6,8; 5 mL de SOS a 20%; 5 mL de glicerol; 0,5 mL de azul de bromofenol® a 0,1% (Oifco Laboratories, Livonia, MI); 32,5 mL de água bidestilada; p-mercaptoetanol a 10%. Tampão de corrida: 12 9 de Tris; 57 9 de glicina® (Ajinomoto Company Inc., Chuo-ku, Tokyo) ; 4 9 de SOS; água destilada q.s.p. 1000 mL (4x concentrado) .. A eletroforese da proteína foi realizada com gel de separação a 12,5% (5,3 mL de água destilada; 4,0 mL de tampão do compartimento inferior; 6,7 mL de acrilamida; 40 J.!L de APS a 10%; 25 J.!L de TEMEO) e gel de empacotamento a 3,0% (2,95 mL de água destilada; 1,25 mL de tampão do compartimento superior; 0,8 mL de acrilamida, 25 J.!L de APS e 15 J.!L de TEMEO). utilizando o sistema Protean 3® (Bio-Rad. Philadelphia, PA).. Laboratories Inc.,.

(39) 18. o. sistema foi montado e colocado em cuba contendo o tampão de. eletroforese. Foi aplicado 0,5 )lg de cada amostra por poço e 3 )lL do padrão do padrão de peso molecular (Fermentas Internationallnc., Burlington, Ontario) por poço. A cuba foi ligada a uma fonte de 120 v e 100 mA por 80 minutos. Após a corrida, o gel foi corado pela prata e foi analisado por densitômetro de calibração GS-700 (BioRad) para medida dos pesos moleculares das bandas reveladas na eletroforese.. 3.3. IMUNOBLOT PARA. ~2GPI. Para o imunoblot, foram utilizadas amostras de 2 IJg da proteína purificada e submetida à eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5%. Para referência de calibração dos pesos moleculares das bandas obtidas, utilizamos 3 )lL do padrão de peso molecular. O imunoblot foi realizado num sistema Trans-Blot® (BioRad).. Soluções utilizadas: Tampão de transferência: 3 9 de Tris; 14,4 9 de glicina; 200 mL de metanol; água milli-Q q.s.p. 1000 mL. Solução Ponceau: 1 9 de Ponceau® (Merck & Co Inc., Whitehouse Station, NJ); 10 mL de ácido acético; água milli-Q q.s.p. 100 mL. Tampão de lavagem: PBS a 0,05 M com Tween 20 a 0,05% (PBST) . Solução de bloqueio: 5 9 de leite desnatado em pó Molico® (Nestlé Brasil Ltda, São Paulo, SP) e 100 mL de PBST. Solução de diluição: 1 9 de leite desnatado em pó e 100 mL de PBST..

(40) 19. Solução reveladora: 2,5 mg de 3,3' -diaminobenzidina® (OAB) (Sigma) ; 15 mL de PBS; 75 IJL de peróxido de hidrogênio a 30% (Merck).. 3.3.1. Transferência das amostras do gel para a membrana O gel retirado da eletroforese foi colocado em um recipiente contendo o tampão de transferência. Uma membrana de nitrocelulose (Pharmacia) e papéis de filtro (Whatman Inc., Florham Park, NJ) de 1 e 3 mm de espessura foram cortados nas dimensões do gel. A membrana foi colocada em água milli-Q por 2 minutos e no tampão de transferência por 10 minutos. Em seguida, o gel e a membrana foram fechados entre os papéis de filtro, previamente embebidos no mesmo tampão, e colocados em uma cuba de transferência. A cuba foi preenchida com o tampão de transferência e ligada a uma fonte de 50 v, 400 mA e 100 w de potência na geladeira à 4°C por 18 horas. Após a transferência, a membrana foi colocada na solução corante Ponceau para visualização das bandas. Em seguida, foi lavada em água destilada e seca ao ar.. 3.3.2. Imunoblot A membrana foi cortada em tiras separando as bandas, numeradas segundo um esquema pré-estabelecido. As tiras foram colocadas na solução de bloqueio sob agitação por 2 horas, exceto as referentes ao padrão de peso molecular, que foram colocadas na geladeira entre papéis de filtro, para posterior comparação com as bandas reveladas no imunoblot. Após o bloqueio.

(41) 20 das ligações inespecíficas, as tiras passaram por três banhos de 10 minutos cada, em tampão de lavagem. Em seguida, foram incubadas com o anticorpo monoclonal anti-132GPI (1 :1000), clone 5F7 (ICN Pharmaceuticals Inc., Costa Mesa, CA) e soro imune de coelho anti-132GPI (1 :1000) (produzido no laboratório), sob agitação, a 4°C por 12 horas. Após este período, passaram por três banhos em tampão de lavagem e foram incubadas com o anticorpo secundário anti-lgG de rato (1 :200) conjugado com peroxidase (Sigma) sob agitação a 4°C por 1 hora. Finalmente, passaram por três banhos em tampão de lavagem e foram colocadas em solução reveladora até a visualização das bandas. A reação foi bloqueada com banhos de água milli-Q.. 3.4. MODELO EXPERIMENTAL DE TRANSLOCAÇÃO BACTERIANA E SEPSE Os. modelos experimentais de translocação. bacteriana e sepse. utilizados foram os desenvolvidos no laboratório do Dr. Ivan Koh (KOH et aI., 1996a; SILVA et aI. , 1998) da Disciplina de Técnica operatória e Cirurgia experimental da UNIFESP/EPM. Os procedimentos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em experimentação animal da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo (FCF/USP) sob o número 11 (Anexo). Os animais foram mantidos em jejum por 24 horas antes do experimento em gaiolas plásticas, medindo 40x34x17 cm, com cinco animais em cada uma..

(42) 21. Para o experimento, os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos de estudo: Grupo de Controle de Translocação Bacteriana (CTB): Injeção de 10 mL de soro fisiológico no intestino delgado. (n=6). Grupo de Translocação Bacteriana (TB) : Inoculação de 10 mL de bactérias E. coli R-6 (10 10 UFC/mL) no intestino delgado. (n=6). Grupo de Controle de Sepse (CS): Injeção de soro fisiológico (1 mU100 g de peso corporal) na veia cava inferior. (n=6). Grupo de Sepse (S): Inoculação de bactérias E. coli R-6 (10 9 UFC/mU100 g de peso corporal) na veia cava inferior. (n=6).. 3.4.1 . Amostras bacterianas Foram utilizadas cepas de bactérias Gram-negativas resistentes à Tetraciclina (Tet R) , caracterizadas como Escherichia coli R-6, previamente. isoladas de rato submetido a experimentos de translocação in vivo (KOH & SILVA, 1996c; SILVA et aI. , 1996a e 1996b).. 3.4.2. Inoculação de bactérias nos animais para estudo da translocação bacteriana (T8) Para estudo do perfil da translocação bacteriana, foi escolhido um método em que, a condição de sobrecrescimento bacteriano (10 10 UFC/mL) na luz intestinal foi o único fator estímulo para promover a translocação, ou seja , com a manutenção da integridade da barreira intestinal e com aparente normalidade da condição imunológica do hospedeiro (KOH & SILVA, 1996c)..

(43) 22 Os animais foram anestesiados com Ketamina (Agribrands do Brasil Ltda, Brasil) + Xilasina (Agribrands) na diluição de 2:8, dose de 0,1 mU100 g de peso corporal, intraperitoneal. Em seguida, foi realizada anti-sepsia do abdome com álcool a 70%; laparotomia mediana por planos anatômicos; ligadura do íleo terminal, a aproximadamente 1 cm do ceco; introdução de uma sonda oroduodenal na primeira porção do duodeno; e inoculação de 10 mL de bactérias E. colí R-6 (10 10 U FC/mL) ou de soro fisiológico, no grupo controle de TB, no duodeno. Após a inoculação, efetuou-se a ligadura obstrutiva do duodeno e remoção da sonda com subseqüente fechamento da parede abdominal em dois planos com sutura contínua.. 3.4.3. Inoculação das bactérias nos animais para indução da sepse. Para indução da sepse, foi empregado o modelo experimental utilizando bactérias na concentração não letal de 109 UFC/mU1 00 g de peso corporal , o que representa aproximadamente 100 milhões de bactérias por mililitro de sangue circulante (SI LVA et aI., 1998). Os animais foram anestesiados com Ketamina + Xilasina na diluição de 2:8, dose de 0,1 mU100 g de peso corporal, intraperitoneal. Em seguida, foi realizada anti-sepsia do abdome com álcool a 70%; laparotomia mediana por planos anatômicos; e inoculação de bactérias E. colí R-6 (10 9 UFC/mU100 g de peso corporal), dose semi-letal , ou de soro fisiológico, no grupo controle de sepse (1 mU100 g de peso), na veia cava inferior por punção com agulha número 27 ,5 G; hemostasia do local da punção com subseqüente fechamento da parede abdominal em dois planos com sutura contínua..

(44) 23. 3.4.4. Coleta dos órgãos e do sangue A coleta dos órgãos e do sangue foi realizada após 2 horas da inoculação bacteriana, tempo suficiente para que o fenômeno da TB aconteça. Todos os animais sofreram nova laparotomia abdominal sob anestesia obtendo-se o material na seguinte ordem: sangue da veia porta (1 mL) coletado em seringa contendo 0,1 mL de EDTA, fígado e intestino delgado (í1eo). Os fragmentos de tecidos foram lavados com solução fisiológica e imediatamente fixados em metacarn (BEHMER, 1976) a 4°C durante 3 a 4 horas e, posteriormente, em etanol absoluto a 4°C durante 12 a 24 horas. O metacarn é composto por metanol (60%), clorofórmio (30%) e ácido acético glacial (10%) e foi preparado aproximadamente uma hora antes da coleta. O intestino foi cortado transversalmente com bisturi e fixado aberto sobre papel filtro, para melhor visualização das vilosidades. Os animais, ainda sob anestesia, foram sacrificados por exsanguinação. O sangue dos animais controle foi centrifugado a 2000 g por 15 minutos, separado o plasma e congelado no freezer a -80°C para posterior separação da. P2 GPI.. 3.4.5. Inclusão dos tecidos em parafina Os fragmentos de tecidos foram processados no dia seguinte à coleta. Tecnicamente, foram submetidos à desidratação em etanol absoluto (três banhos de 30 minutos cada), diafanização em xilol (três banhos de 15 minutos cada), impregnação em parafina a 58°C (três banhos de 30 minutos cada) e, finalmente, foram incluídos em blocos de parafina..

(45) 24. 3.5. ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS TECIDOS Para análise morfológica dos tecidos, os cortes histológicos de fígado e intestino, dos animais submetidos à translocação bacteriana e sepse, foram corados pelo método hematoxilina-eosina (MICHALANY, 1998).. 3.5.1. Hematoxilina-eosina (HE). Soluções corantes utilizadas: Hematoxilina de Harris: 0,5 g de hematoxilina (Merck), 5 mL de álcool absoluto, 10 g de alúmen de potássio, 0,25 g de óxido de mercúrio e 100 mL de água destilada. Eosina: 0,5 g de eosina Y (Merck), 10 mL de água destilada e 90 mL de álcool a 95%.. As lâminas passaram por uma bateria de três banhos de xilol, para desparafinização, seguida por em três banhos de etanol absoluto para remoção do xilol e rehidratação em água destilada antes de ficarem imersas em hematoxilina de Harris por 5 minutos, em seguida foram lavadas em água corrente, diferenciadas em álcool-ácido (5 mergulhos), lavadas novamente em água corrente por 1 minuto e finalmente imersas em eosina por 2 minutos, e em água amoniacal (10 mergulhos). As lâminas coradas foram diferenciadas em álcool, diafanizadas em xilol e montadas com Entelan® (Merck) e lamínula..

(46) 25. 3.6. IMUNO-HISTOQuíMICA PARA B2GPI EM FíGADO E INTESTINO DE RATO Para determinação da presença de !32GPI nos tecidos, os cortes histológicos de fígado e intestino dos animais dos grupos CTB, TB, CS e S foram. submetidos. à. reação. imuno-histoquímica. utilizando. anticorpo. monoclonal clone 5F7 ou soro imune como anticorpo primário e o sistema EnVision®, AP (Dako Corporation Inc., Carpinteria, CA) com o anticorpo secundário.. 3.6.1. Preparação das lâminas. Silanização das lâminas As lâminas utilizadas no experimento foram silanizadas para uso. Para isto, foram desengorduradas e limpas com um banho de acetona por 2 minutos, seguindo-se o banho de silano (Sigma) a 4%, em acetona, por 2 minutos e quatro mergulhos em acetona (ALVES et aI. , 1999). Em seguida, as lâminas silanizadas foram deixadas na estufa 60°C (Fabre 119) por 1 hora para secar.. Obtenção dos cortes histológicos Os blocos de parafina contendo o tecido foram deixados no congelador a -20°C por 1 hora, antes de serem cortados. Os tecidos foram cortados em micrótomo (American Optical 820) com a espessura de 3).lm. Em seguida, os cortes foram cuidadosamente distendidos por flutuação em banho de água quente a 37°C (Fabre 167), colocados sobre.

(47) 26 lâminas silanizadas e deixados na estufa a 60°C por 24 horas para melhor adesão do tecido.. 3.6.2 . Imuno-histoquímica. Tampões utilizados: Tampão de lavagem: solução Tris salina tamponada (TBS) a 0,05 M com pH 7,2 a 7,6 contendo NaCI a 0,3 Me Tween 20 a 0,1% (TBST). Tampão de diluição: Tris-HCI a 0,05 M, pH 7,2 a 7,6 com soro albumina bovina (Sigma) a 1% (TBS/BSA) e soro normal de cabra a 5%. Solução de bloqueio: 5 g de leite desnatado em pó e 100 mL de tampão TBST. As lâminas contendo os cortes histológicos foram desparafinizadas em dois banhos de xilol por 5 minutos cada, dois banhos de etanol absoluto por 3 minutos cada, dois banhos de etanol a 95% por 3 minutos cada e foram então hidratadas em água destilada por 1 minuto. Para bloquear as ligações inespecíficas, passaram por um banho em solução de bloqueio por 20 minutos e foram lavadas no tampão de lavagem. Em seguida, as lâminas foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-f32GPI clone 5F7 (1 :1000) e soro imune de coelho (1 :5000) em câmara úmida (suporte plástico retangular contendo uma base de espuma umidecida com água) a 4°C durante 16 a 18 horas. Após este período, passaram por três banhos em tampão de lavagem de 5 minutos cada..

(48) 27 Foram então, incubadas com o anticorpo secundário do kit EnVision®, AP,. acoplado a um polímero conjugado com fosfatase alcalina para. amplificação do sinal, em câmara úmida à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida passaram por três banhos em tampão de lavagem de 5 minutos cada. A revelação da reação foi realizada com cromógeno Fasf Red, adicionado de levamisol, (inibidor da fosfatase alcalina endógena), o qual foi preparado e imediatamente colocado sobre os cortes à temperatura ambiente durante 5 a 30 minutos. Deste procedimento resulta um precipitado corado em vermelho no lugar do antígeno. O aparecimento da cor foi monitorado pelo microscópio óptico comum (Olympus América Inc., Melville, NY) e a reação foi bloqueada com um banho de água destilada por 5 minutos. A contracoloração foi feita com hematoxilina de Mayer (MICHALANY, 1998) por 30 segundos e banho em água corrente até clarear, seguidos de 10 mergulhos em água amoniacal a 37mM e banho em água corrente durante 2 a 5 minutos. As lâminas foram montadas com meio aquoso Faramount® (Dako) e lamínula.. 3.7. ESTUDO CITOQuíMICO As áreas de marcação imuno-histoquímica focal nos cortes de fígado de ratos submetidos à sepse associada ou não à translocação bacteriana foram também analisadas por estudo citoquímico utilizando dois diferentes métodos de colorações: método hematoxilina-eosina (descrito acima) e o método de Highman com o vermelho Congo para o amilóide (MICHALANY, 1998)..

(49) 28 3.7.1. Vermelho Congo. Soluções corantes utilizadas: Vermelho Congo: 0,5g de vermelho Congo e 100 mL de álcool a 50%. Hidróxido de potássio: 0,2g de hidróxido de potássio e 100 mL de álcool a 80%.. As lâminas foram, previamente, desparafinizadas, desidratadas e hidratadas. Em seguida foram lavadas em água destilada, coradas no vermelho Congo por 5 minutos, diferenciadas rapidamente em hidróxido de potássio (3 a 5 segundos) e lavadas em água corrente. As lâminas foram contracoradas pela hematoxilina, lavadas em água corrente, diferenciadas em álcool-ácido e novamente lavadas em água corrente. Finalmente, foram desidratadas, diafanizadas e montadas.. 3.8. ANÁLISE QUANTITATIVA DA MARCAÇÃO HEPÁTICA PARA P2GPI Após a reação imuno-histoquímica, foram capturados 12 campos contíguos de cada corte histológico com aumento de 400 vezes em câmera DP12 (Olympus) acoplada a um microscópio óptico (Olympus) . A marcação imuno-histoquímica foi estudada utilizando o programa UTHSCSA ImageTool 3.0.. O programa foi calibrado para as medidas em unidades de área, JJm 2, através da medida de um retículo padrão. Em seguida as imagens capturadas foram. transformadas. de. coloridas. para. tons. de. cinza.. As. áreas. correspondentes a células de cada campo capturado foram medidas,.

(50) 29 manualmente, descontando-se os espaços extracelulares (luz de vasos, principalmente). Esta medida foi identificada como "Área Total", para cada animal do experimento. Em cada campo capturado, foram também contadas as células marcadas por imuno-histoquímica e medidas as áreas de marcação. Em ambos os casos, foram considerados independentemente os resultados dos dois padrões de marcação observados no material: citoplasmática difusa e focal. A Área Total de marcação por animal, para cada padrão de marcação, foi calculada a partir dos dados individuais obtidos por campo.. 3.9. ESTATíSTICA Os resultados da análise quantitativa foram analisados pelo método One-way ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni para comparação de médias de amostras independentes. Os cálculos foram feitos com o programa de estatística SPSS (SPSS Inc)..

(51) 30. 4. RESULTADOS 4.1. PURIFICAÇÃO DE ~rGLlCOPROTEíNA I DE RATO Alíquotas de. ~2GPI. de rato, obtidas da eluição da coluna em tampão. Tris 20mM / NaCI 350mM, pH 8,5, foram utilizadas para estudo do padrão de migração em gel de eletroforese em. SDS-PAGE corado pela prata,. densitometria e imunoblot. O resultado típico de uma eletroforese da. ~2GPI. de. rato em gel de SDS-PAGE a 12,5% corado pela prata, está mostrado na figura 3A. A linha 1 mostra o perfil de migração eletroforética da !32GPI de rato. As linhas 2 e 3 mostram as formas dimérica e monomérica da !32GPI humana, respectivamente, nas mesmas condições de análise, que serviram como controle positivo da separação. Para determinação dos pesos moleculares de cada banda de !32GPI de rato, foi realizada a densitometria, mostrada na figura 38. Foram identificadas 6 bandas principais, formando um grupo, na região de peso molecular entre 40 e 64 kDa e uma banda isolada , em 133 kDa . A banda mais fortemente marcada apareceu na região correspondente ao peso molecular de 50 kDa, compatível com a literatura (YAN et ai, 2004)..

(52) 31 B. A. kDa. 1. PM. 2. 3. ... -. 116,0 _ 66,2 _. 3. 133- -. ~-. 55. 45,0 -. 2. 1. PM. - c;:-. 44 -. -. 64 50 40. 35,0 25,0 _ 18,4 -. Figura 3. Padrão típico de migração da 132GPI em gel SDS-PAGE a 12,5% corado pela prata (A) e imagem da densitometria (B). PM : padrão de peso molecular; linha 1: 132GPI purificada de soro de rato; linha 2: forma dimérica e linha 3: forma monomérica da 132GPI purificada de soro humano.. 4.2. IMUNOBLOT. o. imunoblot, representado na figura 4, foi realizado com 2 J.!g da. ~2GPI. de rato purificada. Amostras de 2 J.!g da [.h GPI purificada de soro humano, nas formas dimérica e monomérica, serviram como controle da reação com o anticorpo monoclonal anti-JhGPI humana (clone 5F7) e soro imune de coelho. A proteína purificada de rato não pode ser identificada na forma monomérica com anticorpo monoclonal (figura 4A), nem com o soro imune (figura 4B), específicos para a proteína humana, apresentando somente bandas de aproximadamente 130 kDa que talvez correspondam a formas clivadas e dimerizadas da. ~2GPI.. Os controles positivos de !32GPI humana nas formas. dimérica e monomérica, apresentaram bandas com peso molecular de aproximadamente 50k Da fortemente marcadas pelo anticorpo monoclonal e uma marcação fraca com o soro imune..

(53) 32 B. A. 66,2. PM 1 2 3. PM 1 2 3. kDa. ... ~. 45,0 - .. 35,0 -. ~. .,. 18,4 --... .... 25,0. Figura 4. Imunoblot para ~2GPI revelado com anticorpo anti-~2GPI (A) monoclonal, clone 5F7 e (B) soro imune de coelho. PM: padrão de peso molecular. Linha 1: ~ 2GPI purificada de soro de rato. linha 2: amostra de ~ 2GPI humana contendo a forma dimérica. linha 3: ~2GPI humana purificada (forma monomérica). Sistema Trans-Blot (BioRad).. 4.3.. ANÁLISE. MORFOLÓGICA. DO. FíGADO. E. INTESTINO. DOS. SUBMETIDOS À SEPSE A análise morfológica dos cortes de fígado e intestino dos grupos experimentais CTB, TB, CS e S está mostrada nas figuras 5 e 6. Todos os grupos estudados (CTB, TB, CS e S) mostraram preservação na morfologia dos tecidos, tanto no fígado , quanto no intestino (íleo) dos aminais. No fígado, os animais do grupo S (figura 5A) e do grupo TB (figura 5C) não apresentam sinais celulares evidentes de inflamação, nem presença de. A.

(54) 33 infiltrado inflamatório, comparando com os grupos CS (figura 58) e CT8 (figura 50) , que também mostraram ausência de alterações morfológicas. No intestino, o grupo S (figura 6A) e o grupo T8 (figura 6C) mostraram preservação. morfológica. inflamatório na. da. mucosa. região submucosa,. intestinal,. porém. com. infiltrado. mostrando a presença de células. mononucleares do sangue e algumas células apoptóticas. Células em apoptose aparecem também nos grupos CS (figura 68) e CT8 (figura 60)..

(55) Figura 5. Aspecto histológico típico do fígado de ratos submetidos ao modelo experimental de sepse associada à translocação bacteriana e seus respectivos controles. A: sepse (S). B: controle da sepse (CS). C: translocação bacteriana (TB). O: controle da translocação bacteriana (CTB) . Fotomicrografia de cortes de 3 ~lm , HE, (400X)..

(56) 35. Figura 6. Aspecto histológico típico do intestino (íleo) de ratos submetidos ao modelo experimental de sepse associada à translocação bacteriana e seus respectivos controles. A : sepse (S) . B: controle da sepse (CS). C: translocação bacteriana (TB). O: controle da translocação bacteriana (CTB). Fotomicrografia de cortes de 3 ~lm, HE, (400X)..