UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ Campus de SOBRAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
FLÁVIA MUNIZ DE MESQUITA
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DE UM NOVO INIBIDOR DE PROTEASE CISTEÍNICA ISOLADO DE Anacardium occidentale
SOBRAL 2016
FLÁVIA MUNIZ DE MESQUITA
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DE UM NOVO INIBIDOR DE PROTEASE CISTEÍNICA ISOLADO DE Anacardium occidentale
SOBRAL 2016
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia. Área de Concentração: Macromoléculas.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca Universitária
Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
M544i Mesquita, Flávia Muniz de.
Aplicações biotecnológicas de um novo inibidor de protease cisteínica isolado de Anacardium occidetale.: Estudo experimental / Flávia Muniz de Mesquita. – 2016.
83 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Campus de Sobral, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Sobral, 2016.
Orientação: Prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha . Coorientação: Profa. Dra. Lúcia Betânia da Silva Andrade . 1. Caju. 2. Bioprospecção . 3. Inibidor de protease . I. Título.
CDD 660.6
FLÁVIA MUNIZ DE MESQUITA
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DE UM NOVO INIBIDOR DE PROTEASE CISTEÍNICA ISOLADO DE Anacardium occidentale
Aprovada em ___/___/___
_____________________________________ Prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha (Orientador)
Universidade Estadual Vale do Acaraú (UVA)
_____________________________________ Prof. Dra. Lúcia Betânia da Silva Andrade (Co orientadora)
Universidade Estadual Vale do Acaraú (UVA)
_____________________________________ Prof. Dr. João Garcia Alves Filho (Examinador)
Instituto de Teologia Aplicada (INTA)
_____________________________________ Prof. Dr. José Roberto Viana Silva (Examinador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia. Área de Concentração: Macromoléculas.
_________________________________ Prof. Dr. Victor Alves Carneiro (Examinador)
Dedico aos meus pais Auxilene e Flávio, pelos seus 29 anos de casados.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus pela vida, por me conceder esta oportunidade de realizar mais um sonho, também por constantemente se fazer presente em todos os momentos dessa caminhada.
Em segundo lugar agradeço à minha família, meu pai Flávio, minha mãe Auxilene e as minhas irmãs Ericka, Vitória Jéssica e Kaylene, pelo amor, apoio, confiança e por todas as vezes que compreenderam minha ausência. Agradeço também ao meu avô Napoleão Mira, a quem tanto amo e admiro, pelos sábios conselhos, e por toda sua contribuição na minha formação pessoal e acadêmica.
Agradeço ao meu orientador prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha, pela oportunidade que me concedeu desde o início, por todos os ensinamentos, pela confiança, amizade e companheirismo.
Agradeço a profa. Dra. Lúcia Betânia da Silva Andrade, por sempre me receber com carinho em seu laboratório, pela paciência em todos os seus ensinamentos, não tenho palavras para descrever sua contribuição neste trabalho.
Ao prof. Dr. João Garcia Alves Filho, por todo apoio incondicional, dedicação confiança, por sempre me apoiar em todos os momentos difíceis da construção deste trabalho.
Ao prof. Dr. Victor Alves Carneiro, pela longa amizade, agradeço pela valorosa contribuição neste trabalho e por sempre ter sido alguém amigável sempre disposto a colaborar para concretização deste momento.
Ao laboratório de cultivo de células e tecidos, em especial ao prof. Dr. José Roberto Viana, por todo apoio neste trabalho, agradeço pela contribuição e por me recebido em seu grupo, sempre me apoiando em todos os momentos.
Aos meus queridos amigos Felipe Bezerra, Humberlânia Duarte e Wandy policarpo pela longa amizade, por dividir comigo vitórias e dificuldades, pelo apoio incondicional, minha eterna gratidão.
À Ellen Vasconcelos, pela amizade que construímos durante a elaboração deste trabalho, agradeço pela sua dedicação e por sempre ter sido uma pessoa amável e prestativa.
À Glaucinete Borges e Renato Passos, pela amizade e contribuição efetiva, pelos dias de planejamento experimental, por dividir conhecimentos e momentos de afeto.
A todos os meus companheiros de trabalho, do Núcleo de Biotecnologia de Sobral (NUBIS), laboratório de Biologia Molecular, que sempre ficaram à disposição, toda minha gratidão pela ajuda, carinho e por todos os momentos felizes em que aprendemos juntos.
Ao Erivan, Nívea e Paulo, amigos queridos que tanto me auxiliariam durante a caminhada, por todos os momentos que se dedicaram para que este trabalho viesse a se tornar realidade, nunca irei esquecer todo apoio.
Ao Ricardo Basto, por todo apoio e disponibilidade na análise estatística. À CAPES pelo apoio financeiro concedido na forma de bolsa de estudo.
Aos Professores do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia pelos valorosos ensinamentos.
“A maravilhosa disposição e harmonia do universo só pode ter tido origem segundo o plano de um Ser que tudo sabe e tudo pode. Isso fica sendo a minha última e mais elevada descoberta”
RESUMO
O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma espécie tipicamente brasileira, pertencente à família Anacardiaceae. Existem dois tipos de cajueiro, o gigante, conhecido como cajueiro comum e o anão-precoce que é caracterizado pelo porte baixo e precocidade no florescimento. Uma das partes mais importantes do cajueiro é o fruto, a castanha de caju, considerada rica em nutrientes é principalmente explorada por ser considerada uma fonte de compostos bioativos. Os inibidores de proteases (IPs) são definidos como proteínas capazes de ligar-se a proteases específicas, diminuindo ou cessando sua atividade catalítica. Dentre as principais classes estudadas destacam-se os inibidores de proteases do tipo cisteínicas, esses são comumente isolados de plantas especialmente de monocotiledôneas. Apesar de desempenharem importante função fisiológica nos vegetais, tais moléculas têm sido cada vez mais estudadas do ponto de vista biotecnológico. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo realizar o estudo e caracaterização in sílico de inibidores de proteases presentes no cajueiro, bem como validar e isolar tais compostos por técnicas de química de proteínas e estudar o potencial efeito citotóxico em modelo in situ de tecidos ovarianos bovinos. A análise dos resultados in sílico demostraram a presença de sequências completas e conservadas para inibidores de proteases vegetais, especialamente para o grupo das fitocistatinas. O isolamento de inibidores revelou a intensa atividade inibitória enzimática para o grupo de proteases cisteínicas, a molécula isolada ainda apresentou alta capacidade termoestável na temperatura de 100 °C. O ensaio in situ para efeitos citotóxicos do novo inibidor isolado de Anacardium occidentale L. realizado em ovários bovinos demostrou que as concentrações de 0,1 e 1,0 µg/ml não foram observados significativos efeitos deletérios em folículos, caracterizando uma potencial aplicabilidade na área farmacológica. Em conclusão, estes resultados sugerem que o inibidor de protease cisteínica isolado apresenta importantes aplicabilidades biotecnológicas em áreas diversas, especialmente na área farmacêutica onde sua classe já tem sido citada como uma ferramenta terapêutica.
ABSTRACT
The cashew tree (Anacardium occidentale L.) is a typical Brazilian specie, belonging to the Anacardiaceae family. There are two types of cashew tree; giant, as known as common cashew and early-dwarf, which is characterized by small size and early blooming. The fruit is one of the most important parts of the cashew tree. In addition, cashew nuts are considered rich in nutrients, being widely exploited as sources of bioactive compounds. Protease inhibitors (PIs) are defined as proteins that bind to specific proteases, decreasing or ceasing its catalytic activity. Among the main studied categories, the inhibitors of cysteine proteases are highlighted, and these are commonly isolated from plants, especially monocots. Although they play an important physiological function in plants, such molecules have been increasingly studied from a biotechnological point of view. Thus, this work aims to conduct the study and characterization in silico of proteases inhibitors in cashew tree as well as validate and isolate such compounds through protein chemistry techniques and also study the potential cytotoxic effect in an in situ model of ovarian tissue from bovines. The analysis of in silico results showed the presence of complete and conserved sequences for plant protease inhibitors, especially for the group of phytocystatins. Isolation inhibitors revealed intense inhibitory enzymatic activity for the group of cysteine proteases, the isolated molecule further showed high thermostable capacity at a temperature of 100 ° C. The in situ assay for cytotoxic effects of the newly isolated inhibitor from Anacardium occidentale L. held in bovine ovaries demonstrated that concentrations of 0.1 and 1.0 µg/mL did not show significant deleterious effects on follicles, featuring a potential applicability in the pharmacological scenario. In conclusion, these results suggest that the isolated cysteine protease inhibitor has important biotechnological applicability in several areas, especially in the pharmaceutical field, where its category has already been mentioned as a therapeutic tool.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Tipos de cajueiro existentes na natureza... 22 Figura 2 – Alinhamento global das sequencias traduzidas dos transcritos de cajueiro
homólogos as cistatinas... 36 Figura 3 – Diagrama esquemático mostrando a posição do início e fim das ORFs
detectadas em três genes codificantes de cistatinas presentes no transcriptoma de sementes de cajueiro CCP76... 37 Figura 4 – Alinhamento global das três sequencias com ORFs traduzidas dos
transcritos de cajueiro homólogos as cistatinas... 39 Figura 5 – Peptídeos sinais identificados em sequências de cistatinas AoCys-1 e
AoCys-3. Gráficos gerados com o programa SignalP. O provável sítio de clivagem do peptídeo sinal é mostrado em vermelho; as regiões N-terminal e C-terminal do peptídeo são mostradas em verde e azul claro, respectivamente... 41 Figura 6 – Diagrama esquemático das três proteínas deduzidas a partir de sequencias
homólogas a cistatinas presentes no transcriptoma de sementes de cajueiro. A barra cinza indica a presença de peptídeo sinal e a parte amarela a sequência proteica madura... 42 Figura 7 – Cromatografia de troca iônica de F3060 de A. occidentale L. Perfil
cromatográfico a 280 nm de comprimento de onda... 55 Figura 8 – Eletroforese em gel de poliacrilamida 15%. (MW) Marcador molecular;
(EB) Extrato bruto; (F3060) Fração 30-60%; (P1) Pico 1 da cromatografia de troca iônica. A seta a direita indica o inibidor de A. occidentale L. isolado... 57 Figura 9 – Representação esquemática da organização e estrutura de folículo presentes
no ovário... 64 Figura 10 – Representação esquemática do processo de internalização de nutrientes
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Inibição da atividade da papaína pelas frações proteicas de A. occidentale L. F3060: Fração 0-30%; F3060: Fração 90%; F6090: Fração 60-90%... 53 Gráfico 2 – Inibição da atividade da papaína pelos picos cromatográficos P1, P2 e
P3... 56 Gráfico 3 – Porcentagem de folículos morfologicamente normais no tecido não
cultivado (D0), e em tecidos cultivados por 6 dias suplementados com IP. * representa diferenças significativas de P<0.05. Letras a e b indicam diferenças entre folículos primordiais, enquanto c e d representam diferenças para folículos em desenvolvimento... 70 Gráfico 4 – Porcentagem de folículos degenerados no tecido não cultivado (D0),
controle cultivado (α-MEM), e em tecidos cultivados por 6 dias suplementados com IP. Letras iguais representam semelhança estatística e letras diferentes indicam diferenças entre os grupos... 72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Família de inibidores de proteases em plantas... 26 Tabela 2 – Estatísticas da montagem do transcriptoma de sementes de cajueiro
CCP76... 35 Tabela 3 – Comparação entre as características químicas e motivos presentes nas três
sequencias homólogas a cistatinas presentes no transcriptoma de sementes de cajueiro... 43
LISTA DE ABREVIATURAS
Aminoácidos Ala (A) Alanina Arg (R) Arginina Asn (N) Asparagina Asp (D) Ácido aspártico Cys (C) Cisteína
Gln (Q) Glutamina Glu (E) Ácido Glutâmico Gly (G) Glicina
His (H) Histidina Ile (I) Isoleucina Leu (L) Leucina Lys (K) Lisina Met (M) Metionina Phe (F) Fenilalanina Pro (P) Prolina Ser (S) Serina Thr (T) Treonina Trp (W) Triptofano Tyr (Y) Tirosina Val (V) Valina
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
% Porcentagem
°C Grau Celsius
µL Microlitro
BLAST Ferramenta Básica de Alinhamento Local (Basic Local Alignment Search Tool)
CCP Clone de Cajueiro de Pacajus
CONAB Companhia Nacional de Abastecimento
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (Ethylenediamine tetraacetic acid)
Embrapa Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
g Grama
h Hora
HCl Ácido Clorídrico
Kg Quilograma
LCC Líquido da Castanha de Caju
m Metro M Molar m/v Massa/volume min Minutos mL Mililitro mM Milimolar
NaCl Cloreto de Sódio
nm Nanômetro
pb Pares de base
PCR Reação em cadeia da Polimerase pH potencial hidrogeniônico
PSA Persulfato de amônio
TEMED N,N,N',N'-tetrametil-etano-1,2-diamina IBGE Instituto Brasileiro de Geografia Estatística EC number Enzyme Commission Numbers
IP Inibidor de protease
BLAST Basic Local Alignment Search Tool ORFs Open Reading Frame
pI Ponto isoelétrico
MW Molecular Weight
CDS Coding DNA Sequence
KDa Kilo Daltons
CEP Campo Experimental de Pacajus
EB Extrato Bruto
BSA Albumina Sérica Bovina
DDT Ditiotreitol BANA α-N-benzoil-arginina-p-naftilamida DMSO Dimetilsulfóxido DMACA 4-Dimetilaminocinamaldeido µm Micrômetro mg Miligrama
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletrofores em gel de poliacrilamida contendo SDS TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina
µg Micrograma
mA Miliampère
UAI Unidade de Atividade Inibitória
SRD Sem Raça Definida
MEM Meio Essencial Mínimo
ng Nanograma
MMPs Metaloproteinases de matriz MEC Membrana extracelular
mRNA MicroRNA
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
1.1 INTRODUÇÃO...20
2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Aspectos gerais do cajueiro...21
2.2 Potencialidade do cajueiro...22
2.3 Enzimas proteolíticas...24
2.4 Inibidores de proteases...25
2.5 Inibidores de proteases cisteínicas...26
3 CAPÍTULO I – BUSCA E CARACTERIZAÇÃO in sílico DE INIBIDORES DE PROTEASES CISTEÍNICAS NO TRANSCRIPTOMA DE SEMENTES DE CAJUEIRO (Anacardium occidentale L.) 3.1 Introdução...29 3.2 Objetivos...31 3.2.1 Objetivo geral...31 3.2.2 Objetivos específicos...31 3.3 Estratégia experimental...32 3.4 Metodologia...33 3.5 Resultados e discussão...35 3.6 Conclusão...44
4 CAPÍTULO II – VALIDAÇÃO E ISOLAMENTO DE UM NOVO INIBIDOR DE PROTEASE DO TIPO CISTEÍNICA DE CAJUEIRO (Anacardium occidentale L.) 4.1 Introdução...46
4.2 Objetivos...47
4.2.1 Objetivo geral...47
4.3 Estratégia experimental...48
4.4 Metodologia...49
4.5 Resultados e discussão...53
4.6 Conclusão...59
5 CAPÍTULO III – ESTUDO DO EFEITO CITOTÓXICO DO INIBIDOR DE PROTEASE CISTEÍNICA ISOLADO DE Anacardium occidentale L. NO CULTIVO IN SITU DE FRAGMENTOS OVARIANOS BOVINOS 5.1 Introdução...61 5.2 Objetivos...66 5.2.1 Objetivo geral...66 5.2.2 Objetivos específicos...66 5.3 Estratégia experimental...67 5.4 Metodologia...68 5.5 Resultados e discussão...70 5.6 Conclusão...75 6 CONCLUSÕES...76 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...77
1 INTRODUÇÃO
O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma espécie de origem brasileira, encontrada principalmente em climas tropicais e subtropicais, e é a única espécie cultivada comercialmente do seu gênero (PAIVA; CRISÓSTOMO; BARROS, 2003). A variabilidade genética observada na cultura do cajueiro no Brasil tem sido agrupada em dois tipos bem definidos em relação ao porte, denominados de cajueiro tipo anão-precoce e cajueiro tipo comum. O cajueiro comum é o mais predominante no Nordeste do Brasil ocorrendo de forma natural sem a necessidade de plantio, enquanto que o cajueiro anão-precoce é caracterizado pelo porte baixo e precocidade de florescimento (CAVALCANTI et al., 2003).
O cajueiro é largamente explorado de diversas formas, todas as suas partes constituintes são aproveitadas, podendo representar importantes aplicações biotecnológicas e econômicas, além de características nutricionais e medicinais. A amêndoa da castanha é comercialmente valorizada, sendo rica em lipídeos (40-57%), proteínas (21%), minerais, carboidratos, cálcio, sódio e selênio, o qual desempenha um importante papel como antioxidante no organismo (KANNAMKUMARATH et al, 2002). Muitos compostos bioativos do cajueiro tem demonstrado um papel efetivo no tratamento de inúmeras patologias, nesse contexto as proteínas são uma importante fonte de novos conhecimentos e aplicações biotecnológicas.
Os inibidores de proteases presentes em ampla variedade de seres vivos atuam na conformação das enzimas proteolíticas, ocasionando a inibição de sua atividade enzimática. Em especial os inibidores de proteases cisteínicas, também denominados de cistatinas representam uma relevante classe de inibidores. O papel endógeno para esses inibidores nos vegetais são descritos na mobilização de nutrientes, componente associado de defesa e resistência a estresse. Apesar da relevância de elucidar o papel bioquímico de tais inibidores, muitos esforços nesta área residem na aplicabilidade e prospecção de tais moléculas na área médica e industrial (COOPELAND, 2013).
A identificação prévia de muitos inibidores de protease é facilitada pela disponibilidade de bancos de dados associados a novas ferramentas de bioinformática. O estudo in sílico tem proporcionado uma visão geral de características bioquímicas e moleculares específicas, contribuindo efetivamente para o mapeamento e identificação de novas substâncias (MUTZ et al., 2013). O isolamento de novos inibidores de protease abre perspectivas de estudos para a área farmacológica, uma vez que essas moléculas são
utilizadas em ensaios antimicrobianos, anti-inflamatórios e anti-proliferativo. No aspecto cancerígeno esses inibidores podem exercer um potente efeito inibitório sobre células tumorais, tal capacidade tem despertado o alto interesse por inibidores purificados para testes em cultivo (SEVENICH; JOYCE, 2014)
Muitos inibidores com potencial farmacológico têm sido propostos pela literatura no auxílio e tratamento de inúmeras patologias. Todavia, ainda são poucos os trabalhos que abordam o efeito citotóxico para células reprodutivas, visto que muitas drogas são capazes de induzir a esterilidade feminina devido à sua capacidade de influenciar no ciclo reprodutivo, os testes in situ são considerados uma excelente alternativa para estimativa de toxicidade em células normais.
2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Aspectos gerais do cajueiro
O cajueiro (Anacardium occidentale L.), planta de origem tipicamente brasileira é uma espécie encontrada em diversos habitats, desde regiões de zona da mata a faixa costeira (PAIVA; CRISÓSTOMO; BARROS, 2003). Pertencente à família Anacardiaceae e ao gênero Anacardium, é o único representante cultivado para fins comerciais. Do aspecto botânico apresenta caules resinosos, folhas persistentes e flores pequenas. O sistema reprodutivo é predominantemente alogâmico (fecundação cruzada), com polinização entomófila (NAMBIAR; PILLAI, 1985).
A diversidade genética do cajueiro tem sido agrupada em basicamente dois tipos, o comum (A. occidentale L.) e o anão precoce (A. occidentale var. nanum) (figura 1). O cajueiro comum é o mais prevalente, ocorrendo de forma natural sem a necessidade de plantio. Apresenta porte elevado e copa robusta, podendo atingir até 20 m de altura, dependendo das condições de clima, solo e salinidade (CRISÓSTOMO et al., 2001). O segundo tipo de cajueiro é conhecido como anão-precoce, caracterizado principalmente pelo seu porte baixo, foi desenvolvido pela EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) em 2002 para plantio comercial de sequeiro no Semiárido (referência 1).
O Brasil encontra-se na lista dos principais produtores de castanhas do mundo, atrás de alguns países como Vietnã, Nigéria, Índia e Indonésia. De acordo com a CONAB (Companhia Nacional de Abastecimento), ocorreram modificações no ranking de exportações no período de 2010 a 2014. A redução da importação tem sido associada com a crise econômica e financeira mundial, bem como a quebra da safra de castanha, devido às adversidades do clima (CONAB, 2014).
Na região Nordeste do Brasil, de clima tipicamente Semiárido, é encontrado a maior área de plantio dedicado ao cajueiro. Segundo o IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia Estatística) estima-se que os estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte representem cerca de 95% da produção nacional. Dantas e colaboradores (2015) relatam que a venda da castanha de caju contribui efetivamente para a economia local, gerando aproximadamente 300.000 mil postos de trabalho.
2.2 Potencialidades do cajueiro
Embora existam muitos estudos sobre o cajueiro, ainda são escassos na literatura trabalhos detalhados acerca de seus constituintes. O assunto tem recebido mais atenção apenas nos últimos anos pelo seu potencial funcional. No entanto, existe pouca informação sobre a estrutura química e as propriedades funcionais de suas moléculas. Portanto, nesta revisão, alguns temas serão abordados: castanhas de caju processamento e geração de resíduos, composição química e metabólica, atividades biológicas, e possíveis aplicações industriais e biotecnológicas.
As partes constituintes do cajueiro são amplamente utilizadas na indústria e representam importantes aplicações biotecnológicas e econômicas, além de relevantes características nutricionais e medicinais. A partir do pedúnculo é obtida uma grande quantidade de produtos, destacando-se a produção de sucos, refrigerantes, doces e geleias, acredita-se que seja uma excelente fonte de vitamina C, cálcio, fósforo e ferro (BEZERRA et al., 2008). O consumo in natura ainda é comprometido devido à baixa eficiência de preservação, diminuindo significativamente a porcentagem de industrialização.
A castanha de caju é composta por três partes distintas: casca (epicarpo e mesocarpo), película e amêndoa A casca corresponde de 65% a 70% do peso total, é constituída basicamente pelo mesocarpo esponjoso, cujos alvéolos são permeados de um componente cáustico e inflamável, denominado LCC (líquido da casca da castanha).
A. Cajueiro comum (A. occidentale L.); B. cajueiro anão-precoce (A.occidentale var. nanum). Fonte: (PAIVA; BARROS, 2004).
A B
O LCC é considerado um subproduto nobre, rico em compostos fenólicos (ácido anacardium, cardol e cardanol), sendo valorizado em indústrias químicas na produção de tintas, lubrificantes e cosméticos. Mais recentemente, tem despertado interesse na farmacologia devido à sua capacidade de interferir no crescimento microbiano (RIBEIRO et al., 2016).
A película ou revestimento consiste de uma fina camada protetora da amêndoa. Esta era inicialmente utilizada para a manutenção das caldeiras na extração de LCC e na alimentação do gado. Entretanto, numerosos autores observaram a presença de taninos, moléculas conhecidas como polifenóis e com capacidades medicinais, tais estudos abrem perspectivas para a utilização da película para outras finalidades (referência).
A amêndoa, parte comestível, formada por dois cotilédones representa cerca de 30% do peso total da castanha, é rica em lipídeos, proteínas e carboidratos, bem como em algumas vitaminas do complexo B (FETUGA; BABATUNDE; OYENUGA, 1974; OLOGUNDE et al., 2011). O consumo de castanhas tem sido relacionado à redução de colesterol, assim como, o risco de doenças cardiovasculares, em adição alguns componentes possuem papel antiobesidade e anticancerígeno (CHISHOLM et al., 2005).
As sementes de cajueiro são ricas em proteínas, apresentando classes variadas e funções diversas, podem ser agrupadas em estruturais e metabólicas (auxiliam o crescimento e a estrutura da semente), proteínas de reserva (armazenam nitrogênio e enxofre) e proteínas de defesa (conferem resistência a patógenos, herbívoros ou dessecação) (FERREIRA; BORGUETTI, 2004). As proteínas de reserva são as mais abundantes nas sementes, na literatura são agrupadas de acordo com a sua solubilidade em água (albuminas), solução salina (globulinas), solução alcoólica (prolaminas) e soluções ácidas ou alcalinas (glutelinas). O nosso grupo tem sido um dos pioneiros no estudo de proteínas totais de A.occidentale L. muitos trabalhos detectaram o perfil proteico para diferentes genótipos, bem como a presença de proteínas alergênicas, moléculas potencialmente importantes do ponto de vista de saúde pública.
2.3 Enzimas proteolíticas
A clivagem proteolítica de peptídeos é uma das mais frequentes e importantes modificações de proteínas. As enzimas proteolíticas, também conhecidas como proteases ou peptidases participam de uma cascata de eventos bioquímicos e fisiológicos, desde o ciclo celular à morte programada da célula (NEURATH, 1986).
A relevância das proteases é evidenciada pela sua presença em todos os organismos vivos (RICHARDSON, 1991). Estudos apontam que elas representam cerca de 2% do produto gênico total distribuído em compartimentos celulares e teciduais (RAWLINGS; BARRET, 2004).
As proteases são classificadas em exopeptidases e endopeptidases de acordo com seu sítio de ação específico. As exopeptidases catalisam as ligações peptídicas próximas à extremidade, enquanto que as endopeptidases realizam a hidrólise interna em proteínas e polipetídeos (referência). Apesar da relativa simplicidade, as proteases nem sempre foram agrupadas claramente no sistema internacional de classificação e nomenclatura de enzimas EC number (Enzyme Commission Numbers), desenvolvido em 1950. Contudo, os avanços na caracterização química dos resíduos de aminoácidos no sítio ativo da enzima e análises das estruturas, permitiram agrupar as proteases em famílias e clans (FEIJOO-SIOTA; VILLA, 2011).
Atualmente, o banco de dados MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk) classifica as proteases de acordo com suas estruturas terciárias, características hierárquicas e mecanismos de catálise (RAWLINGS; BARRET; FINN., 2015). Na sua versão atual (9.13) considera seis principais classes: serino proteases, cisteíno proteases, aspartil proteases, metalo proteases, treonino proteases e glutamil proteases.
A classe das serino proteases inclui enzimas de mamíferos como tripsina, quimiotripsina e elastase. São extensivamente estudadas, pela importante função que exercem na diferenciação celular e no mecanismo regulatório em vegetais e mamíferos (CARTER; WELLS, 1988; VICUÑA et al., 2015). As cisteíno proteases também conhecidas como proteases tiol, possuem um mecanismo de catálise que envolve os resíduos cisteína e histidina no sítio ativo (BARRET et al., 2004). A classe inclui as proteases de plantas como a papaína (carica papaya) e a bromelaína (Ananas comosus), assim como as catepsinas lisossomais uma das principais representantes nos mamíferos (TURK et al., 1998).
As aspartil proteases são amplamente encontradas entre os vertebrados, vegetais, nematoides, parasitas, fungos e vírus, são especificamente inibidas por pepstatina e possuem dois resíduos de ácidos aspárticos, responsáveis pelas atividades catalíticas (DUNN, 2002). As metalo proteases são enzimas que requerem a ligação de um metal, geralmente zinco em seu sítio ativo, são enzimas encontradas desde fungos até organismos superiores.
As treonino e glutamil proteases foram descritas recentemente em 1995 e 2004, respectivamente. As treonino proteases estão envolvidas no turnover intracelular de proteínas, sendo geralmente encontradas em fungos, bactérias, vírus e animais (POWERS, 2002). As glutamil proteases foram reclassificadas como um sexto tipo catalítico de proteases. Sua distribuição é limitada em fungos filamentosos, sendo a única não descrita em mamíferos. (NIENABER et al., 1993).
As proteases vegetais possuem uma alta estabilidade em uma ampla faixa de temperatura e pH. Devido às características enzimáticas peculiares desde os tempos antigos extratos vegetais contendo enzimas proteolíticas eram utilizados na medicina tradicional (DRAG; SALVESEN, 2010). As proteases como a papaína e bromelaína têm sido utilizados em vários processos industriais, incluindo o processo de manipulação de fármacos e alimentos (BRAUN, 2005).
2.4 Inibidores de proteases
Inibidores de proteases (IPs) podem ser definidos como proteínas que se ligam às proteases de forma específica, diminuindo ou cessando sua atividade catalítica (BODE; HUBER, 1992). São encontrados inibidores de todas as classes de proteases citadas, cada um com sua ação específica em um grupo (Tabela 1) (RICHARDSON, 1991). Nos vegetais, diversos papéis foram sugeridos para esses inibidores, além do controle endógeno da ação enzimática das proteases, foram relatados tolerância ao estresse abiótico e componente associado aos processos de defesa das plantas contra pragas e patógenos (VALUEVA; MOSOLOV, 2004).
Durante as repostas dos mecanismos de defesa das plantas, essas moléculas podem ser frequentemente encontradas acumuladas em tecidos específicos atuando diretamente na interferência do processo digestório dos organismos agressores, causando efeitos de caráter negativo, modificando principalmente o desenvolvimento, o crescimento ou até
mesmo a sobrevivência dos organismos-alvo (SALES et al., 2005; ANDRADE et al, 2010).
Tabela 1 – Família de inibidores de proteases em plantas
2.5 Inibidores de proteases cisteínicas
Os inibidores de proteases cisteínicas, também chamados de cistatinas são considerados inibidores de característica competitiva, atuam no sítio ativo das enzimas alvo bloqueando a ação no substrato. De forma geral, nos vegetais podem estar associados ao desenvolvimento de órgãos reprodutivos e vegetativos, bem como resposta a estresse biótico e abiótico (CARRILO et al., 2011).
Primeiramente identificada e caracterizada em animais, as cistatinas atualmente encontram-se subdivididas em três classes: estefinas, cistatinas clássicas e kininogênios (BENCHABANE et al., 2010). Vale ressaltar que a identificação das cistatinas baseia-se majoritariamente na presença de regiões conservadas, sendo a principal delas o motivo QxVxG, encontrado na região amino-terminal. Esses motivos são caracterizados como os principais responsáveis pela atividade inibitória como cistatina (BODE et al., 1988).
Proteases Classe de inibidores Família de inibidores
Proteases Serínicas Inibidores de proteases serínicas
Bowman-Birk, Kunitz, Batata I, Batata II
Proteases Cisteínicas Inibidores de protease cisteínicas
Cistatinas de planta (fitocistatinas)
Proteases Aspárticas Inibidores de protease aspárticas
Inibidores de protease aspárticas
Metaloproteases Inibidores de metaloproteases Inibidores de carboxipeptidase A e B
As fitocistatinas, por diferirem dos demais grupos apresentados foram agrupados e uma nova classe. O novo grupo abriga apenas as cistatinas de origem vegetal que apresentam a sequência LARFAV na região da α-hélice da estrutura (MARGIS; REIS; VILLERET 1998). As fitocistatinas são amplamente expressas em sementes jovens na fase de desenvolvimento do vegetal, alguns estudos sugerem que essas moléculas atuem na proteção ativa da planta, agindo na produção de diversas substâncias constitutivas do mestabolismo (HWANG et al., 2009).
Os estudos iniciais para fitocistatinas foram realizados em arroz, onde foram identificados apenas dois genes OcI e OcII (BERTIR; STORER, 1995; ABE et al., 1987). Desde então, estas se tornaram as primeiras cistatatinas caracterizadas na literatura, tendo especifidade contra proteases cisteínicas. Outros inibidores do tipo fitocistatinas já foram extensamente descritos em outros vegetais, como cereais e tubérculos.
CAPÍTULO I
BUSCA E CARACTERIZAÇÃO in sílico DE INIBIDORES DE PROTEASES CISTEÍNICAS NO TRANSCRIPTOMA DE SEMENTES DE CAJUEIRO
3 BUSCA E CARACTERIZAÇÃO in silico DE INIBIDORES DE PROTEASES CISTEÍNICAS NO TRANSCRIPTOMA DE SEMENTES DE CAJUEIRO (Anacardium occidentale L.)
3.1 INTRODUÇÃO
O transcriptoma é o conjunto de todos os genes transcritos em uma célula e sua abundância relativa varia conforme estágio de desenvolvimento ou condição fisiológica (WANG, GERSTEIN e SNYDER, 2009). Assim como o genoma, o transcriptoma pode ser obtido pelas novas tecnologias de sequenciamento e essa tecnologia passou a ser chamada de RNA-Seq. Embora o transcriptoma seja menor que o genoma, o sequenciamento por RNA-Seq é bastante desafiador por vários motivos. O primeiro é que, ao contrário do genoma, o transcriptoma contém genes cuja expressão (número de cópias) varia em diversas ordens de magnitude. Além disso, o processamento de RNA torna a tarefa de montagem bem mais complexa quando comparada a montagem de genomas.
Mesmo que um organismo já possua seu genoma sequenciado, o estudo do transcriptoma por RNA-Seq é importante, pois permite a análise da expressão de milhares de genes, mesmo que eles sejam pouco expressos. A técnica de RNA-Seq é mais versátil que estudos envolvendo microarranjos e PCR em tempo real e está sendo bastante utilizada no estudo de transcriptoma em plantas não modelo. Entre os inúmeros programas montadores de genoma e transcriptoma, um dos mais populares para a criação de um transcriptoma sem um genoma de referência é o Velvet. O programa consiste na reconstrução de sequências genômicas a partir de um conjunto de dados de leituras curtas (ZERBINO e BIRNEY, 2008).
A montagem do transcriptoma pode ser feita com o auxílio do genoma do organismo como referência. No entanto, em organismos que não possuem genomas sequenciados, é possível fazer uma montagem usando a estratégia De novo. Na maioria das espécies, especialmente as plantas poliplóides, a falta genomas de referência ocorre devido ao tamanho e a complexidade de seus genomas (MARTIN; WANG, 2011). Uma vez realizada a montagem, o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - Ferramenta Básica de Alinhamento Local) é utilizado para comparação rápida de sequências (ALTSCHUL et al., 1990). O objetivo da ferramenta é encontrar uma sequência homóloga em outro organismo que possua uma função conhecida.
Nos últimos anos as metodologias ligadas à bioinformática têm crescido de forma exponencial, diversos programas e ferramentas possibilitaram o conhecimento acerca de mecanismos moleculares e bioquímicos de novas moléculas, fornecendo subsídios importantes para programas de melhoramento genético, expressão de genes, estudos de estrutura/função e prospecção.
Diversos trabalhos realizados in sílico abrem novos caminhos a serem elucidados in vitro, dentre as principais moléculas estudadas destacam-se as proteínas e de forma mais específica os inibidores de proteases. O banco de dados MEROPS consiste em uma das principais plataformas de bioinformática voltada para o estudo de enzimas, inibidores e substratos em geral. Atualmente, é possível caracterizar inibidores de proteases de acordo com seu grupo de ação, sítio ativo, presença de peptídeo sinal, ORFs, bem como estimar uma possível massa teórica para a molécula a ser estudada.
Os avanços na área contribuem efetivamente para estabelecimento de estudos bioguiados de isolamento, caracterização e purificação de potenciais inibidores de proteases.
3.2 OBJETIVOS 3.2.1 Objetivo geral
Identificar e caracterizar de forma in sílico inibidores de proteases cisteínas vegetais presentes no transcriptoma de Anacardium occidentale L.
3.2.2 Objetivos Específicos
• Obter uma montagem De novo de boa qualidade considerando parâmetros de N50; • Realizar a identificação de sequências similares à cistatinas pela ferramenta BLAST;
• Realizar o alinhamento global das sequências pelo programa MultAlign. • Identificar possíveis ORFs nas sequências homólogas às cistatinas;
• Verificar a presença de peptídeo sinal, bem como de regiões conservadas para cistatinas vegetais;
3.4 METODOLOGIA
3.4.1 Montagem de novo do transcriptoma de sementes
A montagem de novo foi realizada através do programa Velvet seguido por Oases a partir da biblioteca de reads, referente ao transcriptoma de sementes de cajueiro anão-precoce CCP76, obtida por Alves-Filho (2013). Os parâmetros utilizados foram: k-mer 31, valor de cobertura de 30, corte de cobertura de 30 e tamanho mínimo do transcrito (arquivo de saída do Oases) de 300 (Tabela x).
3.4.2 Identificação de cistatinas baseado em homologia
A identificação dos genes que codificam cistatinas do cajueiro foi feita pelo algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) utilizando as sequencias do transcriptoma de sementes do cajueiro anão-precoce CCP76 contra os bancos de dados do Swiss-Prot e TrEMBL. Os parâmetros foram ajustados para conter apenas alinhamentos com o E-value inferior ou igual a 1x10-5. As sequencias dos bancos de dados
foram obtidas pelo servidor UniProt e filtradas por pesquisa booleana para exibir apenas cistatinas. Posteriormente foi feita uma busca por genes com a região CDS completa, através de BLASTn, alinhando os contigs do cajueiro contra os genes depositados no Genbank do NCBI. Os genes de cistatinas que apresentaram maior percentual de identidade com os genes depositados no banco de dados, que possuíam CDS completo, foram selecionados e tiveram suas sequencias traduzidas, nos 6 frames de leitura, utilizando a ferramenta translate do ExPASy (http://web.expasy.org/translate/). As sequencias traduzidas foram novamente alinhadas, por alinhamento global, utilizando a ferramenta Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), a fim de determinar seu grau de similaridade e verificar se alinhavam completamente.
As sequencias identificadas através do alinhamento BLAST contra os bancos de dados do UniProt, também foram analisadas, objetivando a busca por possíveis domínios conservados, característicos de inibidores de proteases cisteínicas. Para tal, realizou-se um BLASTx manual, alinhando os contigs do cajueiro contra as sequencias depositadas no banco de dados de proteínas não redundantes do NCBI.
3.4.3 Detecção e alinhamento de ORFs
e um diagrama esquemático mostrando a posição da ORF na sequencia foi feita utilizando o Microsoft Office Power Point. A sequencia da ORF foi traduzida em Frame 1 utilizando a ferramenta translate do ExPASy (http://web.expasy.org/translate/). O alinhamento das sequencias das ORFs foi feita utilizando o MultAlign
(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/).
3.4.4 Detecção do peptídeo sinal, ponto isoelétrico e massa molecular das ORFs
O SignalP é um programa que utiliza redes neurais para produzir três padrões de saída para cada aminoácido da sequencia de entrada. O score-C é capaz de distinguir o ponto de clivagem do resto da sequencia. O score-C é alto na posição imediatamente após o sítio de clivagem (o primeiro resíduo da proteína madura). O score-S é capaz de distinguir posições dentro do peptídeo sinal daquelas da proteína madura e aquelas proteínas que não apresentam peptídeo sinal. O score-Y é uma combinação do score-C com a inclinação do score-S, resultando numa melhor previsão do sítio de clivagem.
A massa teórica e o ponto isoelétrico das ORFs foram obtidas pela ferramenta Compute_pI/MW do ExPASY (http://web.expasy.org/compute_pi/) utilizando massa média como parâmetro.
3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.5.1 Montagem do transcriptoma de sementes de cajueiro
Com base nos parâmetros utilizados na montagem do transcriptoma de sementes de cajueiro CCP76 foi possível identificar um total de 22.540 sequências transcritas com boa qualidade (Tabela 2). O maior contig apresentou um tamanho próximo a 5.000 nucleotídeos e 50% dos nucleotídeos utilizados na montagem estão presentes em contigs iguais ou maiores que 490 bp (N50 = 490). O baixo percentual de reads utilizados na montagem são um reflexo da abordagem da montagem de novo combinado com parâmetros bastante exigentes visando contigs de boa qualidade.
Tabela 2: Estatísticas da montagem do transcriptoma de sementes de cajueiro CCP76.
Parâmetro Valor
Nº de reads 28.085.118
N50 490
Tamanho do maior contig 4.953 Total de transcritos 22.540
% reads usados 3.713.700 (13,223 %)
De forma semelhante aos nossos resultados, a montagem De novo de Polygonum cuspidatum apresentou um valor de N50 correspondente a 408 bp (CHENG et al., 2012).
3.5.2 Busca por sequências de cistatinas baseado em semelhança
Utilizando o programa BLASTx, foi possível identificar 10 sequências do transcriptoma de sementes do cajueiro semelhantes as cistatinas presentes no banco de dados SwissProt. Diversos trabalhos in sílico visando à busca por cistatinas em vegetais foram realizados, entre eles o projeto genoma da cana-de-açúcar que identificou cerca de 20 sequências homólogas (GIANOTTI 2008). Outros estudos como o de arroz detectaram 12 cistatinas homólogas (referência), enquanto que apenas 6 foram identificadas para o cacau (PIROVANI et al., 2010).
O alinhamento das 10 sequências homólogas a cistatinas revelou que nem todas apresentam a sequência consenso Leu-Ala-Arg-Ala-Val (LARFAV), em destaque na
caixa verde da figura 2. A presença da sequência LARFAV é exclusiva para vegetais, sendo especificamente utilizada para a identificação de fitocistatinas. Geralmente localiza-se na região correspondente a uma alfa-hélice próximo ao N-terminal (MOSOLOV e VALUEVA, 2005).
Figura 2 - Alinhamento global das sequencias traduzidas dos transcritos de cajueiro homólogos as cistatinas.
3.5.3 Busca de ORFs em sequências de cistatinas
Entre as 10 sequências semelhantes a cistatinas presentes no transcriptoma de sementes do cajueiro, somente três possuem ORFs com base no programa BioEdit e mostrada esquematicamente na figura 2.
A primeira sequência denominada de AoCys_1 (Anacardium occidentale Cystatin-1), possui 855 nucleotídeos oriundas do processo de montagem e uma ORF de 389 pb sendo esta a menor ORF encontrada. A sequência AoCys-2 possui uma ORF de 677 pb enquanto a ORF para AoCys-3 apresentou uma comprimento significativamente maior de 1.163 pb (Figura 3).
Figura 3 - Diagrama esquemático mostrando a posição do início e fim das ORFs detectadas em três genes codificantes de cistatinas presentes no transcriptoma de sementes de cajueiro CCP76.
Nossos dados revelam semelhanças com outros trabalhos já publicados na literatura, como o de Gianotti (2008), que estudando fitocistatinas de cana-de-açúcar detectou 3 ORFs variando entre 366 a 786 nucleotídeos, bem como o de Pirovani e colaboradores (2010) que obteveram ORFs entre 372 a 627 bp.
3.5.4 Busca por sequências conservadas entre as cistatinas identificadas
O alinhamento das três sequencias de cistatinas presentes no transcriptoma de sementes de cajueiro permitiu detectar a presença do motivo “LA(G)RF(Y)AV” em duas das três sequencias analisadas (Figura 4). Além disso, também foi possível identificar o motivo clássico para inibição da papaína (QVG) nas mesmas duas sequências onde foram encontradas o motivo LARFAV, ou seja, nas sequencias AoCys-1 e AoCys-3.
Quando analisadas de forma comparativa e evolutiva, muitas fitocistatinas revelaram a ausência da sequência consenso, entretanto apresentam o domínio clássico QVV, provavelmente envolvido na formação do complexo enzima-substrato (KIGGUNDU et al., 2006). De acordo com Reis e Margis (2001) que classificaram as fitocistatinas em quatro grupos, as sequências que compartilham o motivo LARFAV, bem como o domínio QVV pertencem ao grupo I, onde são categorizadas as fitocistatinas que apresentam organização estrutural clássica.
41 3.5.5 Caracterização in silico das três ORFs detectadas
3.5.5.1 Detecção de peptídeo sinal
Entre as três sequências de cistatinas que possuem ORFs, duas possuem peptídeo sinal, conforme mostrado pelo programa SignalP (Figura 5). A sequência Locus_7813 (AoCys-1) juntamente com a Locus_3203 (AoCys-3) possuem um gráfico característico para a presença de peptídeo sinal, sugerindo que essas cistatinas são provalmente secretadas.
O peptídeo sinal representa uma importante sequência sinalizadora do endereçamento de algumas proteínas para o retículo endoplasmático. Trabalhos realizados em vegetais utilizando o programa SignalP, têm demonstrado a presença do peptídeo sinal em outras fitocistatinas, como no arroz asiático, morango e em açafrão (MARTINEZ et al., 2005; CHAN et al., 2014).
42 Figura 5 – Peptídeos sinais identificados em sequências de cistatinas 1 e AoCys-3. Gráficos gerados com o programa SignalP. O provável sítio de clivagem do peptídeo sinal é mostrado em vermelho; as regiões N-terminal e C-terminal do peptídeo são mostradas em verde e azul claro, respectivamente.
43 Subtraindo o peptídeo sinal da sequência AoCys-1, teremos um peptídeo sinal de 25 resíduos, o mesmo se aplica a proteína AoCys-3, a qual ocorre uma redução de 388 para 355 aminoácidos na cadeia, resultando em um peptídeo sinal de 33 resíduos (Figura 6). Esses dados corroboram com trabalhos anteriormente supracitados onde Martinez e colaboradores (2005) identificaram um peptídeo sinal em fitocistina de morango com aproximadamente 29 resíduos de aminoácidos.
Figura 6 - Diagrama esquemático das três proteínas deduzidas a partir de sequencias homólogas a cistatinas presentes no transcriptoma de sementes de cajueiro. A barra cinza indica a presença de peptídeo sinal e a parte amarela a sequÊncia proteica madura.
Os valores de massa e ponto isoelétrico teóricos foram estimados pela ferramenta do ExPASy para as três proteínas codificantes (tabela 3), estes dados prévios obtidos pela análise in sílico possuem extrema relevância, pois fornecem uma base estimativa para testes in vitro.
44 Tabela 3: Comparação entre as características químicas e motivos presentes nas três sequencias homólogas a cistatinas presentes no transcriptoma de sementes de cajueiro.
Nome Ponto isoelétrico Massa molecular (KDa) Carga em pH 8 Peptídeo sinal Sequência LARFAV AoCys-3 (3203-ORF)
4,86 42,86 Negativa Sim Não
AoCys-2 (2153-ORF)
8,62 25,68 Positiva Não Sim
AoCys-1 (7813-ORF)
9,26 15,07 Positiva Sim Sim
Os resultados apresentados na tabela reforçam a compatibilidade de nossos dados com fitocistinas bem caracterizadas na literatura. Segundo Christoff e Margis (2014) essas proteínas apresentam cadeias simples com massas moleculares variando de 13 e 24 KDa, além da presença do peptídeo sinal e da sequência consenso LARFAV. Tais características adicionais obtidas pela busca in sílico nos permite inferir com mais exatidão que as sequências apresentadas no trabalho tratam-se de fitocistatinas do grupo I como anteriormente citado.
45 3.6 CONCLUSÃO
Ao analisar o transcriptoma de sementes de cajueiro pela ferramenta BLASTx, foram detectadas 10 sequências homológas às cistatinas vegetais depositadas no banco de dados Swiss-Prot e TrEMBL, dessas sequências 3 foram identificadas com a presença de ORFs no programa BioEdit, sendo que 2 apresentavam a sequência conservada LARFAV, característica das fitocistatinas. Além disso, foi possível estimar a presença de peptídeo sinal pelo programa SignalP em 2 das 3 cistatinas que possuem ORFs.
46 CAPÍTULO II
VALIDAÇÃO E ISOLAMENTO DE UM NOVO INIBIDOR DE PROTEASE DO TIPO CISTEÍNICA DE CAJUEIRO (Anacardium occidentale L.)
47 4 VALIDAÇÃO E ISOLAMENTO DE UM NOVO INIBIDOR DE PROTEASE DO TIPO CISTEÍNICA DE CAJUEIRO (Anacardium occidentale L.)
4.1 INTRODUÇÃO
São muitos os relatos na literatura que abordam as aplicações dos inibidores de proteases em diversas áreas. Estudos evidenciam a redução do crescimento microbiano, inflamação e atividade viral. Popovic e colaboradores (2013) relataram o potencial antibacteriano de um inibidor de protease purificado Kiwi (Actinidia deliciosa) frente ao crescimento de Agrobacterium tumefaciens, Burkholderia cepacia e Erwinia carotovora. Alguns trabalhos também citam a potente atividade inibitória de células tumorais relacionadas com a ação de inibidores de proteases, segundo estudos tais moléculas agem na supressão de metástase (OLSON et al., 2015).
Desta forma, o isolamento de novas moléculas bioativas, em especial inibidores de proteases tem crescido de forma expressiva ao longo dos anos. Esse aumento em grande parte é impulsionado pelo incremento de técnicas robustas de isolamento, bem como métodos eficientes de caracterização.
Diversos inibidores de proteases são isolados de inúmeras fontes vegetais, como semesntes, tubérculos, folhas e raízes (QUAIN et al., 2014). Apesar de várias famílias já terem sido estudadas. Para o cajueiro ainda pouco se sabe acerca da presença de inibidores de proteases. O único relato trata-se de Marques e Xavier-Filho (1991) que realizaram um breve estudo para detectar a atividade de inibidores de tripsina, quimiotripsina e papaína na goma de cajueiro.
48 4.2 OBJETIVOS
4.2.1 Objetivo geral
Validar e isolar um novo inibidor de protease cisteínica de Anacardium occidentale L
4.2.2 Objetivos Específicos
• Obter frações proteicas para o extrato bruto de Anacardium occidentale L. • Identificar a fração proteica com potencial atividade inibitória
• Obter o perfil cromatográfico para a fração de atividade
49 4.3 ESTRATÉGIA EXPERIMENNTAL
50 4.4 METODOLOGIA
4.4.1 Obtenção das amêndoas
As sementes de cajueiro anão precoce (CCP09) foram adquiridas no Campo Experimental de Pacajus (CEP) da EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) localizado cerca de 50 Km de Fortaleza.
4.4.2 Preparação do extrato proteico de amêndoas de Anacardium occidentale
As amêndoas de cajueiro (Anacardium occidetale L.) foram moídas até a formação de um pó de granulação fina. As proteínas totais desta farinha foram extraídas em tampão Tris/HCl 50 mM pH 7,5, na proporção de 1:10 (farinha : tampão de extração, m/v). O extrato proteico foi submetido à agitação constante por 3 h em temperatura ambiente. Decorrido o tempo de extração o extrato foi previamente filtrado em tecido de trama fina e posteriormente centrifugado a 12.000 x g por 30 min a 4 °C e o sobrenadante coletado foi denominado extrato bruto (EB).
4.4.3 Fracionamento proteico com sulfato de amônio
O extrato bruto proveniente da centrifugação foi fracionado com sulfato de amônio em três faixas: 0-30%, 30-60% e 60-90%. O sal foi adicionado em pequenas quantidades na solução sob agitação constante. Após cada etapa de precipitação as frações eram deixadas na geladeira (4 °C ) por um período overnight sendo posteriormente centrifugadas (12.000 x g por 30 min a 4 °C). Os precipitados resultantes de cada faixa de saturação foram ressuspendidos em água grau milli-Q e dialisados contra água em temperatura ambiente por aproximadamente 48 h com trocas a cada 4 h. Em seguida a diálise, o material foi liofilizado, pesado e estocado em freezer – 20 °C. As frações supracitadas foram denominadas de F030, F3060 e F6090, correspondente a cada faixa de saturação, sendo ainda ressuspendidas na proporção de 5 mg/ml em tampão Tris/HCl 50 mM pH 7,5. Uma alíquota de cada fração foi submetida a tratamento térmico por fervura em banho-maria a 100 °C por 3 min e novamente centrifugada a 12.000 x g por 30 min.
51 4.4.4 Quantificação da concentração de proteínas
Proteínas totais solúveis foram quantificadas pelo método de Bradford (1976), utilizando a albumina sérica bovina (BSA) como proteína padrão.
4.4.5 Determinação da atividade anti-papainásica
A atividade inibitória do extrato bruto e das frações proteicas foi determinada utilizando a metodologia descrita por Abe e colaboradores (1992). Para a realização da atividade anti-papainásica foram utilizadas alíquotas de 20 µl de uma solução de papaína previamente preparada (solução estoque: 1 mg de papaína dissolvida em água milli-Q. / Solução de trabalho: 300 µl de solução estoque foi diluída 50 vezes em tampão fosfato de sódio 0,25 M, pH 6,5) 40 µl de solução ativadora (tampão fosfato de sódio 0,25 M, pH 6,5, EDTA 0,1 mM e DTT 3mM) e 340 µl de tampão fosfato de sódio 0,25 M, pH 6,5 e 100 µl das amostras a serem analisadas quanto a atividade inibitória, foram pipetadas sequencialmente em tubos de ensaio, em banho de gelo. Ao final da primeira etapa reacional, foram adicionados 200 µl de substrato BANA (dissolvidos em 500 µl de DMSO e acrescido de 10 ml de tampão fosfato de sódio 0,25 M, pH 6,5, q.s.p). Após 20 min de incubação a 37 °C em banho-maria a reação foi paralisada com 500 µl de solução stop (1 ml de HCl e 49 ml de etanol). Após o período de 5 minutos em temperatura ambiente, foram adicionados 500 µl do revelador DMACA (0,06% dissolvido em 30 ml de etanol). Decorridos 30 minutos a absorbância foi medida em espectrofotômetro a 540 nm. Vale ressaltar que para as provas de brancos a reação foi paralisada antes da adição do substrato BANA.
52 4.4.6 Isolamento do inibidor de protease cisteínica de F3060 por cromatografia de troca iônica
Para as atividades de isolamento de inibidores de proteases cisteínicas provenientes da F3060 de Anacardium occidentale L. a coluna cromatrográfica MONO Q 5/50 (GE Healthcare) foi previamente acoplada ao equipamento ÄKTA Protein Purification Systems (GE Healthcare) sendo em seguida lavada com água milli-q filtrada 0,22 µm e álcool 20%. Após o procedimento de lavagem, a coluna foi equilibrada com o tampão de eluição Tris HCl 20 mM pH 8,0 por 5 cinco minutos com fluxo de 1 ml/min. Para a cromatografia o liofilizado da F3060 foi ressuspendido no mesmo tampão de equilíbrio da coluna na concentração de 10 mg/ml. Esta solução preparada foi submetida à cromatografia em um volume padrão de 500 µl de amostra. Proteínas adsorvidas na coluna cromatográfica foram eluídas com tampão Tris HCl 20 mM pH 8,0 + NaCl 1M. Os picos foram coletados manualmente em tubos estéreis de 50 ml, sendo posteriormente dialisados contra água por 48 h e liofilizados até a completa sublimação da água residual. Os picos foram separados em amostras distintas, de acordo com o perfil cromatográfico e ressuspedidos em Tris HCl pH 7,5 para posterior realização do ensaio de atividade inibitória para proteases cisteínicas como descrito no tópico anterior.
4.4.7 Eletroforese unidimensional na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
Para avaliarmos a pureza do inibidor e sua suposta massa molecular, foi realizada a eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida de acordo com o método descrito por Laemmli (1970). O gel de separação foi preparado utilizandos os seguintes reagentes: acrilamida/bisacrilamida 22,2%, tampão Tris HCl pH 8,0, água milli-q, SDS 10%, PSA 20% e TEMED. O gel de empilhamento foi ajustado para concentração final de 3,5 % . Este gel foi preparado com 0,5 ml de acrilamida/bisacrilamida, 312, 5 µl de tampão Tris HCl pH 8,0, 1,65 ml de água milli-q, 24 µl de SDS 10%, 12,5 µl de PSA 20% e 1,5 µl de TEMED. O tampão de amostra constituído por Tris HCl 62,5 mM pH 8, SDS 2%, glicerol 10% e azul de bromofenol 0,01% foi adicionado às amostras proteicas provenientes de diferentes etapas de purificação. Vale ressaltar que todas as amostras foram padronizadas pelo Bradford sendo adicionados no gel aproximadamente 15 µg de proteína para cada amostra. Após a completa montagem do sistema as placas foram mergulhadas na cuba contendo tampão de corrida (Tris, glicina, SDS) e em seguida aplicadas em uma corrente de 20 mA e 150 volts. Após a finalização da corrida eletroforética o gel foi
53 cuidadosamente retirado para o processo coloração com solução de Comassie G-250 (Blue Silver) (CANDIANO et al., 2004) por 24 h e armazenados em solução de ácido acético 5%. Para obtenção da imagem, os géis foram escaneados utilizando-se o equipamento ImageScannerIII da GE Healthcare.
54 4.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.5.1 Obtenção do extrato bruto e atividade inibitória de frações proteicas de A. occidentale L.
O extrato bruto (EB) extraído com tampão Tris HCl 50 mM, pH 7,5 foi previamente testado em ensaio de atividade inibitória enzimática para a papaína demonstrando uma atividade total de 100%. O EB foi posteriormente fracionado com sulfato de amônio resultando em 3 frações proteicas denominadas de F030, F3060, F6090 respectivas a cada faixa de saturação. As frações obtidas foram aquecidas por 3 minutos, a 100 °C, em banho-maria. De forma geral foi observar que o aquecimento das frações intensificou a atividade inibitória enzimática, reduzindo a ação de proteases endógenas. Portanto, o pré-aquecimento foi utilizado nas etapas subsequentes de purificação, pois demonstrou ser um método eficiente de potencialização da atividade de inibidores.
Dentre as frações precipitadas a F3060 apresentou a maior atividade anti-papainásica, atingindo um índice de aproximadamente 93% de inibição (Grafico 1). Por ter apresentado um resultado significativamente mais elevado em relação às outras frações a F3060 foi utilizadas nos passos subsequentes do trabalho.
Gráfico 1 – Inibição da atividade da papaína pelas frações proteicas de A. occidentale L. F3060: Fração 0-30%; F3060: Fração 60-90%; F6090: Fração 60-90%.
0 20 40 60 80 100 F030 F3060 F6090 IN IBIÇÃ O (% )
55 Muitos trabalhos publicados na literatura relatam o isolamento e caracterização de inibidores de proteases cisteínicas. Esses inibidores têm sido identificados em uma ampla variedade de vegetais, desde monocotiledôneas a dicotiledôneas. Os principais exemplos incluem arroz (ABE et al., 1987), soja (KOIWA et al., 1998), trigo (KURODA et al., 2001), morango (MARTINEZ et al., 2005) e cana-de-açúcar (GIANOTTI, 2009). No cajueiro Marques e Xavier-Filho (1991) relataram a atividade de inibidores de tripsina, quimiotripsina e papaína apenas em exsudatos (goma), sendo este trabalho considerado o único relato encontrado na literatura.
Semelhante a outros inibidores de papaína purificados e caracterizados, a F3060 de A.occidenatale L. demonstrou atividade termo-resistente, mantendo sua capacidade inibitória quando aquecida a 100 °C. Embora a resistência térmica de muitos inibidores de proteases cisteínicas tenha sido atribuída às pontes dissulfeto e aos sítios de glicosilação, as cistatinas vegetais são conhecidas por não apresentarem tais características. Além da presença de inúmeras pontes de hidrogênio e da estrutura em loop (NAGATA et al., 2000; BENCHABANE et al., 2010), segundo Margis e colaboradores (1998), as interações hidrofóbicas também são responsáveis por manter a estrutura funcional da proteína.
4.5.2 Isolamento de um inibidor de protease cisteínica de F3060 por cromatografia de troca iônica
A amostra F3060 aplicada na cromatografia de troca iônica foi monitorada em uma densidade óptica de 280 nm e apresentou três picos cromatográficos (figura 7), denominados de P1, P2 e P3. O primeiro pico detectado não foi retido pela carga da coluna, sendo o único para esta característica. Os dois outros picos (P2 e P3) foram eluídos com tampão de desorção (Tris HCl 20 mM pH 8,0 + NaCl 1M) em fluxo constante de 1 ml/min.
56 Figura 7 – Cromatografia de troca iônica de F3060 de A. occidentale L. Perfil cromatográfico a 280 nm de comprimento de onda.
Para muitos estudos, a etapa de isolamento e caracterização de moléculas é imprescindível. As técnicas cromatográficas têm sido utilizadas com intuito de aperfeiçoar a etapa de purificação de diversas moléculas, visando eventuais aplicações. A cromatografia de troca iônica é uma técnica bastante difundida apresentando compatibilidade e confiabilidade de resultados. Em pesquisa é bastante disseminada no campo da Biologia, sendo utilizada na separação de macromoléculas baseada nas diferenças de cargas (KLEIN, 2010).
Quanto ao ensaio inibitório enzimático para os picos cromatográficos, observamos que tanto o P1 quanto o P2 apresentaram uma relevante atividade inibitória para a papaína quando comparados ao P3 (Gráfico 2). Entretanto, devido à característica cromatográfica apresentada pelo P1, bem como o alto valor da sua atividade específica calculada em torno de 3056 UAI/mg de proteína este foi utilizado para estudos posteriores.
57 Gráfico 2 – Inibição da atividade da papaína pelos picos cromatográficos P1, P2 e P3.
Como demonstrado pelo gráfico 2, podemos notar que ambos os picos cromatográficos (P1 e P2) foram detectados com atividade inibitória. O resultado nos permite inferir que a F3060 estudada apresenta inibidores de diferentes cargas de acordo com o perfil cromatográfico obtido. Esses dados tornam-se ainda mais relevantes por validarem os estudos in sílico previamente realizados neste trabalho, onde foi possível estimarmos cargas elétricas distintas para o grupo de inibidores de proteases identificados no transcriptoma de A. occidentale L.
Esses resultados também estão de acordo com trabalhos apresentados na literatura onde demonstram que alguns vegetais podem apresentar inibidores com características distintas para a mesma protease. Como exemplo clássico podemos citar o estudo de Kondo e colaboradores (1990) que identificaram duas cistatinas em arroz, ambas com especificidade contra proteases cisteínicas. Mais recentemente esses resultados já foram observados em outros vegetais, como o trigo, onde foram descritas seis cistatinas distintas (DUTT et al., 2010). 0 20 40 60 80 100 120 P (1) P (2) P (3) IN IBIÇÃ O (% )
58 4.5.3 Análise proteica por eletroforese unidimensional (SDS-PAGE)
As etapas de isolamento do inibidor de A. occidentale L. foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida 15% (Figura 8). Observamos que uma única banda foi corada para a raia contendo o P1, indicado o grau de isolamento do inibidor.
Figura 8 – Eletroforese em gel de poliacrilamida 15%. (MW) Marcador molecular; (EB) Extrato bruto; (F3060) Fração 30-60%; (P1) Pico 1 da cromatografia de troca iônica. A seta a direita indica o inibidor de A. occidentale L. isolado.
A massa molecular para o P1 foi calculada de acordo com o MW padrão da corrida eletroforética. Foi possível observar uma banda proteica com peso de aproximadamente 15 a 16 KDa. O resultado observado novamente corrobora com nossos dados previamente apresentados pela discussão in sílico do capítulo I, onde identificamos um possível inibidor de carga positiva com massa estimada em 15 KDa.
O inibidor isolado de A. occidentale L. apresenta características que nos permite agrupá-lo as cistatinas vegetais. Essa família também chamada de fitocistatina foi sugerida por Margis et al., (1998) por apresentar características que diferiam das demais cistatinas animais. Baseando-se no peso molecular, as fitocistatinas podem ser
