UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE-UFRN
Excreções de peixes amazônicos usando a abordagem da Estequiometria Ecológica e da Teoria Metabólica da Ecologia
ÁLVARO CARVALHO DE LIMA
Orientador: RONALDO ANGELINI Co-orientador: ADRIANO CALIMAN
Natal-RN, maio de 2019
Tese de doutorado apresentada ao programa de pós-graduação em Ecologia da UFRN, como requisito para obtenção do grau de doutor em ciências biológicas, área de concentração em Ecologia.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas, pela bolsa de doutorado concedida através do Programa de Bolsas de Pós Graduação em Instituições fora do estado (edital No. 010/2015).
À Universidade Federal do Amazonas pela liberação integral das minhas funções enquanto estive realizando o doutorado, em especial aos colegas professores do Departamento de Ciências Pesqueiras pelo incentivo e apoio material durante o processamento e armazenagem de amostras.
Ao Programa de Pós Graduação em Ecologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela excelência do quadro docente e pelas facilidades das instalações.
À coordenação do Laboratório de Recursos Hídricos e Saneamento, onde armazenei amostras, ao Laboratório de Limnologia do Departamento de Oceanografia e Limnologia (DOL), onde realizei as análises químicas das amostras. Agradeço também ao Instituto de Medicina Tropical por fornecer água ultra-destilada que usei nas análises.
Aos meus orientadores, Ronaldo Angelini e Adriano Caliman, pela atenção e tempo dedicados a minha orientação, por compartilharem ideias e acima de tudo pelo incentivo em mergulhar nas águas da Estequiometria Ecológica.
Ao técnico do DOL, Bruno Mattos Silva Wanderley, por ter me ensinado todas as análises de laboratório, sempre explicando os porquês das coisas. Sem sua ajuda teria sido impossível construir esta tese.
Ao Guilherme Gerhardt Mazzochini por ter ajudado com a análise estatística de parte dos dados.
Aos amigos e voluntários que me ajudaram com os trabalhos de campo: Kleisson Medeiros, Ian Rocha, Jairo Rodrigues, Marcus Girão, Júlio Siqueira, Flávio Soares, Guilherme Freire, Ronis da Silveira.
Agradecimento especial a Hélio Beltrão e Jansen Zuanon por ajudarem a identificar os peixes.
Pelo apoio emocional, agradeço a: minha mãe Maria Lúcia Chagas de Carvalho, minha irmã Raquel Carvalho de Lima, e minha companheira Caroline Vasconcelos.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
ÁLVARO CARVALHO DE LIMA
EXCREÇÕES DE PEIXES AMAZÔNICOS USANDO A ABORDAGEM DA ESTEQUIOMETRIA ECOLÓGICA E DA TEORIA METABÓLICA DA
ECOLOGIA
Orientador: Dr. Ronaldo Angelini Co-orientador: Dr. Adriano Caliman
NATAL-RN 2019
Tese de doutorado apresentada ao programa de pós-graduação em Ecologia da UFRN, como requisito para obtenção do grau de doutor em ciências biológicas, área de concentração em Ecologia.
Lima, Álvaro Carvalho de.
Excreções de peixes amazônicos usando a abordagem da Estequiometria Ecológica e da Teoria Metabólica da Ecologia / Álvaro Carvalho de Lima. - Natal, 2019.
39 f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Ecologia. Orientador: Prof. Dr. Ronaldo Angelini.
Coorientador: Prof. Dr. Adriano Caliman.
1. Peixes - Tese. 2. Taxa de excreção - Tese. 3. Nitrogênio - Tese. 4. Fósforo - Tese. 5. Ontogenia - Tese. I. Angelini, Ronaldo. II. Caliman, Adriano. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
Sumário
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 1
2. MATERIAIS E MÉTODOS ... 7
2.1. ÁREA DE ESTUDO... 7
2.2. EXPERIMENTOS PARA MEDIÇÃO DA EXCREÇÃO ... 8
2.3. ANÁLISES PARA DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO E FÓSFORO EXCRETADOS ... 9
2.3.1. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO EXCRETADO ... 9
2.3.2. DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO EXCRETADO ... 11
2.3.3. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO E FÓSFORO NA MASSA CORPORAL DOS PEIXES ... 13
2.3.4. COMPILAÇÃO DE INFORMAÇÕES SECUNDÁRIAS ... 14
2.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 14
3. RESULTADOS ... 16
3.1. Efeitos diretos e indiretos do tamanho do corpo na excreção de nitrogênio e fósforo por peixes amazônicos ... 16
3.2. Ontogenia e estequiometria da excreção em peixes ... 19
4. DISCUSSÃO ... 27
5. CONCLUSÃO GERAL ... 31
ANEXOS ... 31
RESUMO
Excreções de peixes amazônicos usando a abordagem da Estequiometria Ecológica e da Teoria Metabólica da Ecologia
Os peixes são elos importantes nos processos de sequestro, transferência e transformação de energia e nutrientes nas cadeias tróficas. Através de suas excreções os peixes fornecem nutrientes para os produtores primários e, em alguns sistemas de água doce, podem fornecer a maior parte do nitrogênio e do fósforo necessários aos organismos autotróficos. Tamanho corporal, hábito alimentar e características do ambiente influenciam as taxas de excreção dos peixes. A bacia amazônica possui a maior riqueza de espécies de peixes de água doce do planeta, sendo que nada se conhece a respeito da ciclagem de nutrientes mediada por estes organismos neste sistema. O objetivo central desta tese foi quantificar o aporte de nitrogênio e fósforo pelos peixes ao ecossistema amazônico, usando medidas diretas de excreção. Estas medidas foram realizadas através de 153 experimentos de incubação in situ, utilizando-se de 59 espécies de peixes nativos da Amazônia. Usamos modelos de equações estruturai para quantificar efeitos diretos e indiretos do tamanho do corpo nas taxas e razões de excreção. Os resultados mostraram que as taxas de excreção foram inversamente relacionadas a massa corporal e a estequiometria do corpo, enquanto a razão N:P excretada aumentou com a massa corporal. Buscamos identificar efeitos da ontogenia e da estequiometria do corpo sobre a excreção de N, P e N:P, usando dados secundários para criar um proxy de crescimento, assumindo que a taxa de crescimento é maior quanto mais distante do tamanho máximo da espécie o peixe está e assim comparamos a estequiometria de peixes jovens e adultos. Os resultados mostraram efeito do crescimento sobre a estequiometria do corpo e da excreção em indivíduos no início da fase juvenil. Concluímos que o tamanho, a estequiometria do corpo e ontogenia influenciam na excreção de N e P realizada por peixes.
Excretions of amazonian fishes using the approach of Ecological Stoichiometry and Metabolic Theory of Ecology
ABSTRACT
Fish are important in processes of uptake, transfer and transformation of energy and nutrients in aquatic food webs. Through their excretions, fish supply nutrients for autotroph organisms, representing the main source of nitrogen and phosphorous for primary producers in some fresh water systems. Body size, diet, as well as environment light-nutrient conditions, affect excretion rates and ratios of nutrient recycled by fish. The Amazon basin encompasses the most diverse fish fauna in the world, however nutrient recycling by fish in that ecosystem had never being surveyed so far. The main purpose of this thesis was to assess nitrogen and phosphorus release by fish, measuring their excretions in field conditions. One hundred fifty three incubation experiments were performed using 59 wild caught native species. We used structured equations models in order to measure direct and indirect effects of body size on excretion rates and ratio. Results showed that excretion rates were negatively related to body mass and body stoichiometry, while excreted N:P was positively related to body mass. We could reveal the indirect effect of body mass on excretion because body mass also affects body stoichiometry. In order to identify effects of ontogeny and body stoichiometry on N, P and N:P excretion we used second hand data to create a proxy to growth rate, assuming the fish grow faster as smaller they are from their maximum size, than we compared body stoichiometry and excretion rates and ratios of juvenile in contrast to adult fishes. Results revealed that growth affects body stoichiometry and excretion ratios in the beginning of the juvenile phase. Overall, our conclusions point out that body size, body stoichiometry and growth affect N and P release by fishes. Key-words: Excretion rate, N:P ratio, nitrogen, phosporous, ontogeny
1. INTRODUÇÃO GERAL
Peixes são elos importantes nos processos de sequestro, transferência e transformação de energia e nutrientes nas cadeias alimentares, por que ocupam diversos níveis tróficos e se constituem muitas vezes na maior biomassa dos ecossistemas aquáticos (Sterner & Elser, 2002; Vanni, Boros & McIntyre, 2013; Boros, Takács & Vanni, 2015). Através de seus deslocamentos (migrações) os peixes transportam nutrientes entre diferentes habitats e ecossistemas (Durbin et al., 1979; Meyer & Schulz, 1985; Persson, 1997). Além disso, peixes causam alterações nas comunidades aquáticas por meio de herbivoria, predação seletiva e bioturbação (Attayde et. al., 2010; Menezes et. al., 2010; Reissig et. al., 2015), assim como também fornecerem nutrientes para os produtores primários através de suas excreções.
As excretas dos peixes contêm compostos nitrogenados e fosfatados, que são liberados pelas vias branquiais e urinárias, podendo ser rapidamente assimiláveis pelos organismos autotróficos (Persson, 1997; Zimmer, Herwig & Laurich, 2006). Nitrogênio e fósforo podem ser elementos limitantes para a produção primária, e aporte de nutrientes oriundos dos peixes pode ser relevante para ecossistemas marinhos e de água doce (Schaus et al., 1997; McIntyre et al., 2008; Wheeller, Miller & Crowl, 2015).
A Teoria Metabólica Ecológica (TME) e a Estequiometria Ecológica (EE) fornecem uma base teórica integrativa para os processos de reciclagem de nutrientes mediados por consumidores (Vanni & McIntyre, 2016). Estas teorias, que são fundamentadas em leis da física e da química (Elser et al., 1996; Sterner & Elser, 2002; Algeier et al., 2015). foram usadas nesta tese para investigar a ciclagem de nutrientes mediada por peixes amazônicos.
Teoria Metabólica Ecológica (TME)
Segundo a Teoria Metabólica Ecológica, a temperatura ambiente e o tamanho corporal influenciam o metabolismo por meio de diferentes mecanismos (Gillooly et al., 2001; Brown et al., 2004). A temperatura afeta o metabolismo na medida em que reações enzimáticas são aceleradas pelo aumento da temperatura; em temperaturas próximas a 0 oC a água nas células
tende a congelar, cessando as reações metabólicas. No extremo oposto, em temperaturas acima de 40 oC as reações metabólicas se tornam mais lentas devido ao aumento da influência do catabolismo (Gillooly et. al., 2001).
O tamanho do corpo, por seu turno, também modula a taxa metabólica. De acordo com a lei da invariância energética, a taxa metabólica do organismo (B) é função da massa corporal (M) elevada ao expoente de 3/4 (Elser et al., 1996; West et al., 1999, Gillooly et. al., 2001; Isaac et. al., 2010), isto implica que a taxa metabólica específica (B/M) é função da massa elevada a -1/4. Esta alometria é consequência da relação entre superfície e volume corporal, que limita a superfície de trocas e as redes de transporte de substâncias em células, órgãos e no organismo como um todo com o aumento do tamanho (Gillooly et. al., 2001). Esta mesma relação descreve a taxa metabólica basal, que é a taxa mínima de gasto energético para a simples manutenção das funções vitais; e a taxa metabólica de metabólica de campo, que inclui a alocação de energia para o crescimento e reprodução (Brown et. al., 2004).
Em síntese, quanto menor o organismo e maior a temperatura ambiente, mais acelerado é o metabolismo, refletindo em um aumento na taxa de excreção por unidade de massa (taxa de excreção específica) do organismo.
Estequiometria Ecológica (EE)
Na Estequiometria Ecológica (EE) a excreção é abordada de forma qualitativa, olhando as proporções entre os elementos químicos e seus fluxos entre o alimento e o organismo, e entre o organismo e ambiente. De acordo com EE a estequiometria da excreção é condicionada pela lei de conservação das massas (segunda lei de Lavoisier), que diz “nada se perde, nada se cria, tudo se transforma”. Em termos ecológicos significa que aquilo que o organismo excreta é o que sobrou de reações químicas mediadas pelo metabolismo, em que os reagentes iniciais são os elementos químicos presentes no ambiente (alimento) e o produto final é o organismo em sua constituição e funcionamento.
Os peixes, assim como a totalidade de organismos heterotróficos macroscópicos, obtêm os nutrientes de que precisam através dos alimentos
que ingerem. A matéria ingerida pode seguir dois caminhos: sair do organismo sem ser aproveitada (egesta) ou ser digerida, formando moléculas menores que podem ser assimiladas pelo organismo e empregada na forma de energia e matéria de acordo com a sua demanda metabólica. O alimento é, portanto um “pacotes” de nutrientes. Desta forma razão estequiométrica da excreção é resultado da diferença entre balanço de nutrientes entre o alimento digerido pelo organismo e os nutrientes necessários para sua manutenção, crescimento e reprodução (Schindler & Eby, 1997; Elser et. al., 2006; Elser & Urabe, 1999; Sterner & Elser, 2002; Hessen et al., 2013; Moody et al., 2015). A equação abaixo resume o processo de excreção de um consumidor.
𝐸𝑥 = 𝐴 × [𝑥]𝐴× 𝐸𝐴𝑥 − (𝐶 × [𝑥]𝑐)
Onde:
Ex é quantidade de um dado elemento x na excreção; A é a quantidade de alimento ingerido;
[x]A é a concentração do elemento no alimento;
EAx é a eficiência de assimilação do elemento pelo consumidor C é a massa do consumidor
[x]c é a concentração do elemento no corpo do consumidor
De uma perspectiva estequiométrica a razão de excreção, ou seja, a proporção entre dois elementos x, y na excreção de um organismo
heterotrófico segue o mesmo princípio:
𝑆𝑥: 𝑦 =𝐴 × [𝑥]𝐴× 𝐸𝐴𝑥 − (𝐶 × [𝑥]𝑐) 𝐴 × [𝑦]𝐴× 𝐸𝐴𝑦 − (𝐶 × [𝑦]𝑐)
Portanto, o desbalanceamento nutricional entre a composição do alimento e a composição do consumidor tende a gerar uma relação inversa entre a
quantidade excretada de um dado elemento e a concentração deste elemento no corpo do consumidor.
Nitrogênio e fósforo estão entre os seis elementos mais abundantes envolvidos na construção e funcionamento dos vertebrados, atrás apenas de H, O, C e Ca que é ligeiramente mais abundante que P (Sterner & Elser, 2002, p.3). Contudo as proporções destes elementos diferem entre os órgãos e tecidos. Nitrogênio toma parte na constituição de proteínas, ácidos nucléicos e nucleotídeos. Tecido epitelial e muscular são particularmente ricos em N (10% - 16%) e pobres em P (menos de 2%). Cerca de 40% da massa corporal de um vertebrado corresponde a músculo. Fósforo participa de processos de transformação energética (ATP-ADP) e síntese proteica (RNA), além de ter função estrutural na composição da membrana celular (na forma de fosfolipídios) e tecido ósseo. Ossos são particularmente ricos em P (cerca 12%) e relativamente pobres em N (menos de 4%). O esqueleto corresponde por 50% a 60% da massa corporal (Sterner & Elser, 2002 p. 170).
Em peixes, a massa seca do corpo contém de 8% a 13% de nitrogênio e de 1,5% a 4,5% de fósforo. Esta maior variação na quantidade de fósforo em comparação a nitrogênio possivelmente reflete diferenças interespecíficas na alocação de fósforo em estruturas ósseas (Sterner & Elser, 2002, p.171). Por consequência dessa demanda diferenciada de P em relação a N para formação de esqueleto, a razão N:P no corpo diminui à medida em que o animal aumenta de tamanho (Elser et al., 1996, Pilati & Vanni, 2007), resultando em tendência inversa na excreção; ou seja, a razão N:P excretada diminui com o aumento de tamanho.
Hábito alimentar e a estequiometria da excreção
Conforme explicitado nos argumentos e nas equações acima a excreção resulta do desbalanceamento entre o alimento e o requerimento do consumidor, sendo que o alimento mais “equilibrado” para um consumidor seria aquele com a estequiometria mais semelhante àquela sua; nesse sentido um organismo com hábito canibal possuiria a dieta mais balanceada possível, enquanto um animal herbívoro teria a dieta mais desequilibrada possível. Portanto, o hábito alimentar é outra variável a ser considerada em estudos
sobre a ciclagem de nutrientes mediada por consumidores (Elser & Urabe, 1999; Esterner & Elser, 2002, p. 181). Contudo, este aspecto não deverá ser abordado nesta tese.
Ontogenia e estequiometria da excreção
A estequiometria dos organismos passa por mudanças vinculadas ao seu desenvolvimento, portanto é de se esperar que a estequiometria da excreção seja influenciada pelo crescimento dos organismos.
A partir de evidências para zooplâncton, insetos e bactérias, Sterner & Elser (2002, p. 142) sugerem haver uma associação entre taxa alta de crescimento com o aumento da concentração de P, causada pelo aumento na quantidade de RNA (rico em fósforo) nas células, reduzindo a razão N:P no corpo na fase inicial do crescimento. Esta hipótese é conhecida como Growth Rate Hypothesis (GRH) (Elser et al., 2003), entretanto esta relação (crescimento e estequiometria da excreção) ainda é escassamente documentada, especialmente para peixes (Vanni & McIntyre, 2016).
Peixes Amazônicos como objetos de estudo da ciclagem de nutrientes mediada por consumidores
Com cerca de 2.400 espécies descritas, a bacia Amazônicapossui a fauna de peixes mais rica do planeta (Reis et al., 2016). A riqueza de espécies é refletida em uma ampla variedade de hábitos alimentares, incluindo desde espécies generalistas, até as altamente especializadas, como por exemplo, consumidores de sangue ou escamas. A variedade de tamanhos também é alta, com espécies cujos adultos não ultrapassam poucos centímetros de comprimento, enquanto outras podem alcançar mais de dois metros (Queiroz et al., 2013).
As características tróficas dos ambientes aquáticos amazônicos são influenciadas pela geologia e clima. Assim, os rios provenientes dos escudos guianense e brasileiro drenam terrenos antigos e bastante lixiviados, resultando em águas com baixa quantidade de eletrólitos e ácida, devido à alta carga de ácidos húmicos e fúlvicos. Devido a coloração escura, estes rios são chamados de “água preta” e suas planícies de inundação são denominadas “igapó”. Em
contraste, rios que drenam a região andina e terrenos sedimentares são relativamente mais ricos em nutrientes, com grande quantidade de sólidos em suspensão e maior concentração de eletrólitos. A cor da água é barrenta devido à alta carga de argila e silte em suspensão, por isso são chamados de rios de “água branca” e suas planícies de inundação são chamadas de “várzea” (Furch, 1984; Sioli, 1984, McClain & Naiman, 2008).
As condições limnológicas nos rios na Amazônia mudam ao longo do ano, em função do pulso de inundação, em que o nível da água pode variar mais de dez metros, com alterações cíclicas no aporte de nutrientes, no regime de luz, na produção primária e na decomposição de matéria orgânica (Furch & Junk, 1997;Junk, 1984; Rai & Hill, 1984; Junk & Howard-Williams, 1984). Os peixes são integrados nesta dinâmica transferindo os nutrientes entre a planície inundada e o canal do rio. O entendimento dos fatores que afetam os processos de troca de nutrientes entre organismos consumidores e o meio tem aumentado nos últimos anos, mas os dados para a melhor formulação deste processo são ainda escassos (Algeier et al., 2015; Moody et al., 2015).
O objetivo central desta tese foi entender (quali e quantitativamente) o aporte de nitrogênio e fósforo de algumas das espécies de peixes da bacia amazônica. Mais especificamente, este estudo buscou: a) identificar e quantificar efeitos diretos e indiretos do tamanho do corpo nas taxas e razão de excreção de N e P; b) avaliar o efeito do crescimento sobre a estequiometria do corpo e sobre as taxas e razão de excreção de N e P. Para tal, partimos das as seguintes premissas: 1) a estequiometria da excreção é inversamente relacionada com a estequiometria do corpo; 2) a estequiometria do corpo varia com o crescimento devido a alocação de P no RNA para a síntese proteica nos estágios iniciais de desenvolvimento; 3) a estequiometria do corpo muda com o aumento de tamanho devido a alocação de P nos ossos.
2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. ÁREA DE ESTUDO
A coleta de dados foi realizada em um raio de 50 km da cidade de Manaus, Amazonas, Brasil. Os locais amostrados foram as planícies alagadas do rio Negro e Solimões. Respectivamente, o maior rio de água preta e o maior rio se água branca da Amazônia. Coletas também foram feita nos rios Tarumã e Ariaú, afluentes do rio Negro (Figura 1).
Figura 1. Área de estudo, assinalando os locais de realização dos experimentos.
Comparada com água do rio Negro, a água do Solimões contém dez vezes mais cátions (Na + K + Mg + Ca) e quatro vezes mais fósforo (Furch, 1984). A transparência de Secchi nos rios de água branca é de no máximo 50 cm, enquanto na água preta a transparência pode chegar até mais de um metro. A vegetação aquática nos ambientes de várzea (água branca) é de plantas herbáceas e floresta inundada. A vegetação aquática herbácea nos ambientes de água preta é menos abundante, em seu lugar predomina uma vegetação arbustiva, juntamente com floresta de igapó.
O nível da água varia cerca de dez metros ao longo do ano. A estação de subida das águas na região vai de novembro a maio, de junho a outubro o nível do rio baixa. O pulso de inundação condiciona mudanças no regime de nutrientes, luz, e ciclos de produção autotrófica, entre outros processos ecológicos nas planícies de inundação dos rios Solimões e Negro (os livros
editados em 1984 por Harald Sioli e por Wolfgang Junk, em 1997, fornecem muita informação a esse respeito).
2.2. EXPERIMENTOS PARA MEDIÇÃO DA EXCREÇÃO
Os experimentos de medição de excreção consistiram em incubar de um a cinco indivíduos de mesma espécie, por cerca de uma hora, em bolsas plásticas contendo água mineral previamente aerada. Os experimentos foram realizados in situ, com o propósito de manter as mesmas condições de ambientais existentes onde o peixe foi coletado.
Os peixes usados nos experimentos foram capturados com rede-de-cerco de tamanho de malha de cinco milímetros, medindo 15 metros de comprimento por 3 metros de altura. Tarrafa e rede-de-mão (rapixé) foram usadas em poucas ocasiões em locais onde não foi possível operar a rede-de-cerco. Estes apetrechos de pesca foram escolhidos por causar menos danos aos peixes. Imediatamente após a captura, os peixes foram enxaguados com água mineral e transferidos para as bolsas de incubação contendo de meio litro a três litros de água dependendo do tamanho dos indivíduos. Peixes não incubados em até cinco minutos após o momento da captura foram liberados. Bolsas plásticas contendo apenas água mineral e nenhum peixe foram usadas como controle do experimento.
Ao final de cada experimento uma amostra da água do tratamento e uma amostra do controle foram extraídas com seringas de 50 mL. A seguir, a água era passada por um filtro de seringa de porosidade inferior a 0,8 µm, para remover quaisquer partículas e foram recolhidas em frascos de plástico de 50 mL, que depois rotulados foram conservados em gelo. Os peixes usados nos experimentos foram eutanasiados com gelo e em seguida conservados em gelo. Foram registrados o tempo de duração de cada experimento e a temperatura da água no local a 20 cm de profundidade.
Ao fim de cada dia de coleta as amostras de água foram congeladas em freezer e os peixes usados nos experimentos foram trazidos para laboratório, onde foram identificados ao mais baixo nível taxonômico possível e postos a secar em estufa até atingirem peso constante. Após secagem, os peixes foram
macerados manualmente usando graal e pistilo, até resultar em um pó homogêneo, e em seguida foram armazenados em frascos de vidro e congelados. Peixes maiores foram triturados usando multiprocessador de alimentos antes de serem macerados manualmente. Foram registrados o peso fresco e peso seco dos indivíduos usados nos experimentos. Em casos em que não foi possível homogeneizar totalmente o peixe durante a trituração, devido a presença fragmentos de pele e/ou escamas grossas, as frações foram guardadas em frascos separados. O armazenamento, secagem e pulverização das amostras foram feitos no Laboratório de Tecnologia do Pescado da Universidade Federal do Amazonas.
2.3. ANÁLISES PARA DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO E FÓSFORO
EXCRETADOS
2.3.1. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO EXCRETADO
As amostras congeladas de água foram trazidas para o Laboratório de Limnologia, no Departamento de Oceanografia e Limnologia (DOL) da UFRN. Depois de descongeladas e atingirem a temperatura ambiente, alíquotas de 15 mL de cada amostra foram depositadas em frascos de vidro, previamente lavados em ácido clorídrico a 10%, que depois terem sido enxaguados três vezes com água miliQ, foram muflados a 450 ̊C por duas horas. Os frascos contendo as amostras eram imediatamente fechados com parafilme e levados a um analisador de elementos (modelo TOC-V CPH/CPN, SHIMADZU CORPORATION, Kyoto, Japão Versão 2.10. O qual daqui pra frente será chamado de TOC).
A medição de nitrogênio total do TOC é feita por quimiluminescência após combustão. A amostra é queimada a 720 ̊C, nestas condições o nitrogênio na amostra se converte em óxido nitroso (N2O), que é transportado em uma
coluna de gás (Ar Sintético 5.0 FID) até o sensor de quimiluminescência. O sinal de detecção gera um pico cuja área é convertida em concentração de nitrogênio, por meio de um software próprio do equipamento.
Em cada bateria de análise foram incluídos dois frascos contendo água miliQ, que serviram como “brancos”, sendo que a média da concentração dos brancos foi subtraída das leituras dos tratamentos e controles analisados.
A quantidade de nitrogênio excretado foi calculada como sendo a diferença da concentração do elemento entre o tratamento (bolsa contendo peixe) e o controle (bolsa contendo apenas água), multiplicado pelo volume de água usado na incubação, conforme a equação a seguir:
Nexc = ([Nt] − [Nc]) ∗ Vinc equação 1
onde:
Nexc: quantidade de N excretado pelo peixe em mg;
[Nt]: concentração de N no tratamento em mg.L-1;
[Nc]: concentração de N no controle em mg.L-1;
Vinc: volume de água usado na incubação em Litros
A taxa de excreção individual (TEI) foi calculada dividindo Nexc pelo
tempo de incubação em horas:
TEI =Nexc
t∗n equação 2
onde:
TEI: taxa de excreção em mg.h-1
Nexc: quantidade de N excretado em mg;
t: tempo de incubação em horas;
n: número de indivíduos incubados
A taxa de excreção específica (TEE) de nitrogênio foi calculada como segue:
TEE = (Nexc
m∗t) /n equação 3
onde:
TEE: taxa de excreção em mg.g-1.h-1;
m: soma da massa seca dos indivíduos incubados em g;
t: tempo de incubação em horas;
n: número de indivíduos incubados
2.3.1.1. CALIBRAÇÃO DO TOC
O TOC, foi calibrado usando solução padrão de Nitrato de Sódio (NaNO3)
com concentração de 1g.L-1, que produziu uma curva de calibração com valores entre 0,02 a 1 mg.L-1, por meio de uma rotina automática de diluições da solução padrão, programada no aparelho. O processo de calibração do TOC foi repetido cada vez que se fez troca de gases, de reagentes, ou quando alguma manutenção foi realizada.
2.3.2. DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO EXCRETADO
Foram utilizados frascos plásticos, tipo Falcon, previamente lavados em ácido clorídrico a 10%, que depois terem sido enxaguados três vezes com água miliQ, foram enxaguados com cerca de 5 mL da própria amostra. Dez mL de amostra foram transferidos para cada frasco, usando um pipetador automático. Em cada bateria de análise, foram incluídos dois frascos contendo 10 mL de água miliQ para servir como branco. Em seguida, em cada frasco, foram adicionados 2 mL de reagente corante combinado, que é elaborado pela mistura de 50 mL de Ácido Sulfúrico (H2SO4) 5N, 5 mL de Antimônio Tartarato
de Potássio (K2(C4H2O6Sb)2.3H2O), 15 mL de Molibdato de Amônio
((NH4)6Mo7O24.4H2O) e Ácido Ascórbico (C6H8O6) 0,1M.
O princípio de medição de fósforo consiste em que, no meio ácido, os íons ortofosfato (PO4-3) combinam com o Molibdato de Amônio, resultando em Ácido
Fosfomonobílico (H3PMo12O40). A reação desenvolve coloração azul, cuja
intensidade e diretamente proporcional à quantidade de fósforo incorporado.
Após cerca de 10 minutos dessa mistura, a reação de cor se completa e as amostras foram levadas ao espectrofotômetro (Bioespectro, modelo SP 220) para medir a absorbância na faixa de 885 ɳm. Para cada amostra foram
efetuadas três medidas de absorbância. Entre uma leitura e outra, a cubeta era lavada três vezes com água miliQ. A média das absorbâncias lidas, subtraída da média das absorbâncias dos brancos, foi atribuída para cada amostra.
Os valores de absorbância foram convertidos em valores de concentração (mg.L-1) de fósforo: 𝑋 =𝑌−𝑎 𝑏 equação 4 Onde: X: concentração de fósforo em (mg.L-1); Y: absorbância da amostra
a: coeficiente linear (intercepto) da regressão linear entre X e Y b: coeficiente angular (inclinação) da regressão linear entre X e Y
Os valores dos parâmetros a e b foram obtidos seguindo os passos descritos na seção 2.4.2.1 abaixo.
A quantidade de fósforo excretado, bem como as taxas de excreção (TEI e TEE) foram determinadas da mesma maneira descrita para o nitrogênio, usando as equações 1, 2 e 3, respectivamente.
2.3.2.1. CALIBRAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO
Uma solução padrão de Fosfato de Potássio (KH2PO4) contendo 2,5 mg de
P.L-1 foi diluída a fim de obter soluções com concentrações de fósforo de: 0,05; 0,25; 0,50; 0,75; 0,10 (mg.L-1). Depois, foi medida a absorbância na faixa de 885 ɳm de cada uma das soluções e em seguida foram calculados os parâmetros da equação 4, bem como o coeficiente de determinação da reta de regressão (R2), sendo considerados satisfatórios valores de R2 maiores que 0,98.
Este processo de calibração foi repetido cada vez que houve troca de reagentes ou alguma manutenção foi realizada no equipamento.
2.3.3. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO E FÓSFORO NA MASSA CORPORAL DOS PEIXES
As análises de nitrogênio e fósforo na massa corporal dos peixes seguiram os mesmos princípios e métodos de medição usados nas análises de água (seção 2.3.1 e seção 2.3.2), sendo que foram precedidas por uma reação de digestão, na qual o N e P existentes na massa do peixe são convertidos em nitritos, nitratos e fosfatos.
2.3.3.1. DIGESTÃO DAS AMOSTRAS
Uma alíquota de cerca de 20 mg de amostra foi dissolvida em 30 mL de MiliQ em frascos autoclaváveis de vidro borosilicato com tampa rosqueada. Em seguida foram adicionados 8 mL de solução digestora de Persulfato de Potássio (K2S2O8) 5%. Os frascos foram fechados, porém as tampas
rosqueadas não foram apertadas até o máximo, para que os frascos não criassem vácuo, o que impediria a reabertura depois. As amostras foram autoclavadas por duas horas em pressão de 1,2 a 1,4 Kgf.cm-2. Em cada bateria de autoclavagem foram incluídos dois frascos contendo apenas as mesmas quantidades de água MiliQ e de Persulfato de Potássio usadas na digestão das amostras, para servirem como “branco”.
Ao saírem da autoclave, as amostras e “brancos” foram deixadas para atingirem a temperatura ambiente. Usando um micropipetador transferia-se dali 15 mL de solução da amostra digerida para frascos de vidro previamente limpos, que depois de tampados com parafilme, foram levados para análise de nitrogênio total no TOC.
Para análise de fósforo, foram usados frascos tipo Falcon previamente limpos e enxaguados com a própria amostra, onde foram colocados cinco mL da solução de amostra digerida mais um mL de reagente corante combinado. Por causa da massa corporal dos peixes conter tipmuito fósforo, após a reação de cor se completar, as amostras foram diluídas com adição de 30 mL de água miliQ, com a finalidade de reduzir a intensidade de azul, fazendo que as medidas caíssem dentro dos limites de detecção do espectrofotômetro. As concentrações obtidas foram corrigidas para compensar o efeito da diluição.
2.3.3.2. CÁLCULO DAS CONCENTRAÇÕES DE NITROGÊNIO E FÓSFORO NA MASSA CORPORAL DOS PEIXES
O cálculo da quantidade de nutriente na massa corporal do peixe (X) é feito pela razão entre a concentração da massa de amostra diluída [M] e a concentração de nutriente [x] lida na amostra multiplicada por (m):
𝑋 = {[𝑥]
[𝑀]} ∗ 𝑚 equação 6
2.3.4. COMPILAÇÃO DE INFORMAÇÕES SECUNDÁRIAS
A base de dados Fishbase (www.fishbase.org) foi usada como fonte de informações para: 1- classificar as espécies amostradas quanto ao hábito alimentar em três categorias tróficas (onívoro, carnívoro, detritívoro); 2- calcular um proxy da taxa de crescimento dos indivíduos amostrados, que foi feito da seguinte forma: a partir dos valores de comprimento máximo e os parâmetros da relação peso comprimento das espécies amostradas, foi calculada a massa fresca correspondente ao tamanho máximo da espécie. Em seguida os valores de massa fresca dos indivíduos amostrados foram transformados em valores percentuais relativos ao tamanho máximo da espécie e então transformados em logarítmos decimais para resultar em uma curva assintótica.
2.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Basicamente foram usados modelos gerais lineares e modelos de equações estruturais. As variáveis resposta foram as taxas e razões de excreção, como variáveis preditoras foram usadas a massa corporal (peso seco), as concentrações de N e P no corpo em porcentagem da massa seca e a razão N:P molar do corpo. Antes das análises foram excluídos dados de experimentos de excreção que deram resultados negativos (casos em que os peixes aparentemente absorveram nutrientes da água). Quando aconteceu de mais de um experimento ter sido realizado com uma mesma espécie em um mesmo dia e local de coleta foi calculada uma média da excreção por espécie. Os dados usados nas análises foram transformados em logarítmos decimais
para homogeneizar as variâncias e em seguida padronizamos os dados para unidades de desvio padrão.
Para quantificar os efeitos do tamanho do corpo na excreção usamos modelos de equações estruturadas (SEM). Estes permitem explorar hipóteses sobre a estrutura causal entre variáveis de um sistema. A estrutura causal do sistema (hipótese) é representada num diagrama de setas ou caminhos (paths). O diagrama é traduzido em um conjunto de equações lineares (modelos componentes), que são avaliadas individualmente. Uma vantagem destes modelos é permitir que uma mesma variável apareça como preditora de uma relação e como variável resposta em outra relação do mesmo modelo, permitindo o teste e a quantificação de efeitos indiretos (Lefcheck, 2016).
O ajuste dos parâmetros das equações lineares é feito encontrando os valores que melhor reproduzem a covariância observada. A adequação do modelo global (global goodness-of-fit) aos dados observados é avaliada por meio de um teste Qui-quadrado para comparar a matriz de covariância estimada com a observada (Grace, 2006). As relações de causa e efeito (hipóteses) são consideradas consistentes quando é alta a probabilidade da somatória das significâncias dos modelos individuais, representada pela estatística C de Fisher, acontecer por acaso (Lefcheck, 2016), ou seja, o modelo causal é rejeitado se o valor de C é menor que o nível de significância escolhido (Shipley, 2009). Para estas análises foi usado o pacote PIECEWISESEM do R (https:// github.com/jslefche/piecewiseSEM).
Para investigar o efeito do crescimento sobre a estequiometria do corpo e da excreção foram usados modelos de regressão múltipla considerando como variáveis preditoras das taxas de excreção de N, P e razão N:P excretada: 1) a massa corporal; 2) a razão N:P do corpo; 3) o proxy de taxa de crescimento. Usamos o Fator de Inflação da Variância (VIF) para inspecionar o grau de autocorrelação entre as variáveis preditoras (Dormann et al., 2013).
Avaliação das premissas dos modelos de regressão: linearidade, normalidade e efeito de pontos extremos foi feita por inspeção visual (ANEXO 2). Para verificar efeito isolado do crescimento na excreção descontando os efeitos do tamanho e estequiometria do corpo, usamos um exame das parciais
do modelo de regressão. Os gráficos das parciais mantêm constantes (no valor da mediana) as demais variáveis preditoras para tentar revelar o efeito de uma variável preditora isoladamente. Para estas análises foram utilizados os pacotes ppcor e car do programa R.
Três modelos foram ajustados: 1) com o conjunto de dados completos, 2) com os dados de peixes abaixo de 10% do tamanho máximo, aqui considerados juvenis; 3) com os dados de peixes acima de 10% do tamanho máximo, denominados aqui não-juvenis. A ideia foi examinar separadamente a fase inicial do crescimento, que é onde esperamos ter efeito mais forte da taxa de crescimento na estequiometria da excreção. O limite de 10% do tamanho total para separar os dados foi estabelecido por duas razões, uma é biológica, a outra é estatística: 1) por não termos conhecimento prévio sobre em que tamanho as espécies saem da fase juvenil, consideramos seguro estabelecer este limiar de 10% como garantia que todas as espécies abaixo deste tamanho não são adultos; 2) esta partição dos dados fornece dois subconjuntos com o mesmo número de réplicas.
3. RESULTADOS
3.1. Efeitos diretos e indiretos do tamanho do corpo na excreção de nitrogênio e fósforo por peixes amazônicos
. Foram usados dados de 101 experimentos de incubação realizados com indivíduos de 46 espécies, com tamanhos entre 2,4 miligramas e 108 gramas de massa seca (Tabela 1). A massa corporal explicou mais de 70% da variância observada nas taxas de excreção de N e P (p< 0,003; Figs. 1A, 1B) e cerca de 30% da variação na razão N:P excretada (Fig. 1C), que foi positivamente relacionada com o tamanho do corpo. Os efeitos diretos do tamanho do corpo nas taxas de excreção de N e P foram negativos, padrão que é esperado pela TEM. A variação do tamanho, por outro lado, também afetou significativamente (p<0,001) a estequiometria do corpo, explicando entre 12% e 17% da variação das concentrações de nitrogênio e fósforo.
Tabela 1 – Espécies amostradas, número de experimentos e amplitudes de tamanho de corpo por espécie.
Espécie n. experimentos massa seca (g) Mín. Máx. Acarichthys heckelli 10 0,540 13,610 Acaronia nassa 3 0,036 2,766 Aequidens palidus 2 0,080 0,250 Apistograma gephyra 1 0,190 Apistograma sp 1 0,120 Brycon cf. pesu 6 0,091 4,590 Bryconops caudomaculatus 3 0,642 2,463 Chalceus erythrurus 2 8,800 9,600 Cichla ocelaris 1 1,200 Cichlassoma amazonarum 1 0,290 Copela nattereri 1 0,068 Copela sp 1 0,119 Ctenobrycon hauxwellianus 1 0,670 Ctenobrycon spilurus 3 0,062 0,185 Curimatopsis cripticus 1 0,946 Fluviphylax sp 2 0,002 0,007 Geophagus altifrons 5 2,060 18,119 Hemigrammus analis 3 0,159 0,220 Hemigrammus diagonicus 1 0,108 Hemigrammus levis 4 0,032 0,093 Hemiodus atranalis 2 1,490 2,550 Hemiodus goeldii 1 5,220 Hemiodus immaculatus 1 1,910 Hemiodus microlepis 1 4,770 Heros severus 1 6,520 Hoplias malabaricus 5 0,290 108,500 Leporinus fasciatus 1 0,888 Leporinus friderici 1 82,880 Loricariichthys acutus 2 4,030 5,990 Mesonauta festiva 1 2,045 Mesonauta insignis 1 0,221 Moenkhausia intermedia 1 1,390 Moenkhausia lepidura 1 0,330 Mylossoma aureum 1 13,310 Mylossoma sp 1 0,103 Nemadoras elongatus 2 1,480 2,270 Odontostilbe fugitiva 1 0,015 Pseudoplatystoma punctifer 1 16,020 Pterophylum scalarium 4 3,880 6,550 Raphiodon vulpinus 1 12,670 Rivulus sp 1 0,218 Satanoperca acutisseps 1 9,180 Satanoperca jurupari 1 5,720 Semaprochilodus insignis 1 11,470 Sturisoma lyra 1 4,590 Sturisoma sp 1 2,200
Figura 1- Modelos de equações estruturais explorando as relações entre o tamanho e estequiometria do corpo com a excreção de: (A) nitrogênio N, (B) de fósforo P, (C) razão N:P na excreção. Setas representam relações unidirecionais entre as variáveis. A largura das setas foi baseada na magnitude do efeito das variáveis preditoras sobre as variáveis respostas (coeficientes das regressões são apresentados nas caixas de texto sobre as setas). Os R2 de cada modelo componente são mostrados ao lado da ponta de cada seta. Todos os coeficientes foram significativos (p<0,001) exceto quando assinalados com “ns”.
Estes resultados evidenciam que o tamanho do corpo afetou diretamente a excreção e a estequiometria do corpo. A magnitude do efeito do tamanho foi maior sobre a excreção de N e P do que para a razão N:P. A razão N:P, em contraste, foi mais influenciada pela estequiometria do corpo, particularmente em função da variação na concentração de fósforo, como será visto a seguir.
Analisando os efeitos diretos da estequiometria do corpo nas taxas e razão de excreção, encontramos que a concentração de fósforo no corpo explicou 38% da variação na taxa de excreção deste nutriente (Fig. 1B). Por outro lado, a excreção de N não foi afetada pela concentração de N no corpo
(Fig. 1A). Os coeficientes dos modelos componentes (valores associados às setas) mostraram que a variação de fósforo no corpo foi mais determinante da razão N:P excretada do que a massa corporal (Fig. 1C).
Em síntese, os resultados dos modelos componentes apontam que a excreção de N é regulada pelo tamanho corporal em si, ao passo que a excreção de P e a razão N:P excretada são reguladas ao mesmo tempo pelo tamanho e pela estequiometria do corpo. Os coeficientes dos modelos componentes podem ser multiplicados para fornecer uma medida do efeito indireto do tamanho na excreção via estequiometria do corpo. Por exemplo, o coeficiente linear do efeito indireto do tamanho do corpo na taxa de excreção de P (Fig. 1B) é –0,25 (-0,62 * 0,41). De igual forma, o efeito indireto do tamanho na excreção de N:P é 0,23 (-0,38 * -0,62). Este resultado mostra que a magnitude de efeito total do tamanho do corpo (integrando efeitos diretos e indiretos) é aumentada em 25% na excreção de P e 74% na razão N:P do que se apenas o efeito direto do tamanho do corpo é levado em consideração.
Apesar de os modelos componentes terem explicado razoavelmente a variação observada entre as variáveis, os modelos propostos na hipótese foram rejeitados (os valores da estatística C de Fisher foram 124, 100 e 18,6 para os modelos de excreção de N, P e razão N:P, respectivamente, em todos os modelos os valores de p foram menores que 0,005).
3.2. Ontogenia e estequiometria da excreção em peixes
Foram usados dados de 47 experimentos de incubação realizados com indivíduos de 26 espécies de peixes nativos da bacia amazônica, com tamanhos entre 0,10 a 408 gramas de massa fresca (Tab. 2). Os modelos ajustados explicaram entre 56% e 64% da variância na taxa de excreção de N (Tab. 3), cerca de 70% da variância na taxa de excreção de P (Tab. 4), e entre 34% e 49% da razão N:P excretada (Tab. 5).
Tabela 2- Espécies usadas na análise. Dados de peso máximo das espécies foram compilados de www.fishbase.org. * tamanho máximo foi emprestado de C. epakros
Espécie
peso do peixe amostrado (g massa fresca)
peso máximo da espécie (g massa fresca) Aequidens palidus 1,29 457,6 Aequidens palidus 0,37 457,6 Bryconops caudomaculatus 7,57 35,6 Bryconops caudomaculatus 10,14 35,6 Bryconops caudomaculatus 7,48 35,6 Bryconops caudomaculatus 3,19 35,6 Bryconops caudomaculatus 2,63 35,6 Bryconops giacopinni 19,35 47,3 Chalceus erythrurus * 30,39 243,0 Chalceus erythrurus * 33,15 243,0 Cichla ocelaris 6,00 4.935,7 Ctenobrycon hauxwellianus 2,47 17,7 Geophagus altifrons 86,03 316,0 Geophagus altifrons 27,08 316,0 Geophagus altifrons 47,26 316,0 Geophagus altifrons 55,06 316,0 Geophagus altifrons 10,17 316,0 Hemiodus immaculatus 70,68 245,9 Hemiodus immaculatus 9,12 245,9 Hemiodus microlepis 21,10 277,0 Heros severus 27,61 385,4 Hoplias malabaricus 13,15 3104,5 Hoplias malabaricus 110,60 3104,5 Hoplias malabaricus 408,87 3.104,5 Hoplias malabaricus 1,50 3.104,5 Hoplias malabaricus 2,31 3.104,5 Hoplias malabaricus 84,84 3.104,5 Leporinus friderici 276,71 1.709,5
O proxy de crescimento foi significativo apenas para a razão N:P excretada no modelo ajustado com os dados de peixes juvenis (menores que 10% do tamanho máximo), mas não para peixes maiores que 10% do tamanho máximo (Tab. 5). O efeito do proxy de crescimento teve a mesma magnitude de efeito da estequiometria do corpo.
Tab. 2 cont. Espécie
peso do peixe amostrado (g massa fresca)
peso máximo da espécie (g massa fresca) Mesonauta festiva 8,29 101,3 Moenkhausia lepidura 1,33 11,3 Moenkhausia lepidura 1,26 11,3 Mylossoma aureum 61,89 212,6 Mylossoma duriventre 3,18 667,1 Mylossoma sp 0,60 667,1 Odontostilbe fugitiva 0,10 0,8 Pterophylum scalarium 26,17 21,4 Pterophylum scalarium 16,25 21,4 Pterophylum scalarium 22,56 21,4 Raphiodon vulpinus 55,97 3.756,9 Rhytiodus argenteofucus 70,54 466,2 Satanoperca jurupari 24,30 225,0 Schizodon fasciatus 30,39 724,9 Schizodon fasciatus 16,70 724,9 Schizodon fasciatus 10,75 724,9 Semaprochilodus insignis 47,39 631,0 Triportheus albus 15,32 225,1 Triportheus angulatus 11,23 253,2
Tabela 3. Parâmetros e estatísticas dos modelos de regressão para N excretado. Dados de entrada nos modelos foram transformados em logaritmos decimais e expressos em unidades de desvio padrão (*** p<<0,001; ** p < 0,001; * p ≤ 0,05, n.s = p > 0,05)
Tabela 4. Parâmetros e estatísticas dos modelos de regressão para P excretado. Dados de entrada nos modelos foram transformados em logaritmos decimais e expressos em unidades de desvio padrão (*** p<<0,001; ** p < 0,001; * p ≤ 0,05, n.s = p > 0,05)
N excretado Todos os tamanhos
Juvenis massa fresca <10% do peso máximo Não juvenis massa fresca > 10% do peso máximo coef.pad. IC 95% coef.pad IC 95% coef.pad IC 95% Intercepto -8,53e-12 -0,18 0,18 -7,98e-11 -0,29 0,29 -4,17 e-11 -0,28 0,28 crescimento -0,15 -0,37 0,07 -0,24 -0,66 0,18 0,08 -0,24 0,41 massa seca -0,72*** -0,94 -0,50 -0,58** -1,00 -0,16 -0,84*** -1,14 -0,53 N corpo 0,07 -0,12 0,26 0,06 -0,25 0,38 0,14 -0,18 0,46 R2 ajustado 0,64 0,56 0,61 F 26,38 10,02 11,36 g.l. 39 19 17 P 1,7e-9 0,0004 0,0002
P excretado Todos os tamanhos
Juvenis massa fresca <10% do peso máximo Não juvenis massa fresca > 10% do peso máximo coef.pad IC 95% coef.pad IC 95% coef.pad IC 95% Intercepto -1,84e-11 -0,16 0,16 -1,38e-10 -0,25 0,25 -8,52e-11 -0,25 0,25 crescimento 0,04 -0,15 0,23 0,18 -0,19 0,55 0,09 -0,18 0,35 massa seca -0,76*** -0,95 -0,56 -0,81*** -1,10 -040 -0,76*** -1,04 -0,47 P corpo -0,25** -0,43 -0,08 -0,33 -0,62 -0,04 -0,21 -0,50 0,07 R2 ajustado 0,71 0,69 0,69 F 36,42 16,52 15,81 g.l. 39 18 17
Tabela 5. Parâmetros e estatísticas dos modelos de regressão para razão N:P excretada. Dados de entrada nos modelos foram transformados em logaritmos decimais e expressos em unidades de desvio padrão (*** p<<0,001; ** p < 0,001; * p ≤ 0,05, n.s = p > 0,05)
A dispersão dos resíduos dos modelos (Figs. 2, 3 e 4) mostra que a variância dos dados não é sempre homogênea. Esta heterogeneidade foi causada por outliers no conjunto total dos indivíduos (Fig.2), com maior variância nos tamanhos menores no caso do modelo com indivíduos menores que 10% (Fig.3) e maior variância nos tamanhos maiores no caso do modelo com indivíduos maiores que 10% (Fig.4). A exclusão dos outliers não modificou as tendências observadas, e melhorou pouco o ajuste dos modelos (resultados não mostrados aqui), por isto optamos por manter os outliers nas análises e mostrar a variabilidade dos dados. Autocorrelação entre as variáveis preditoras foi baixa (VIF < 1,5 para todos os pares de variáveis), indicando que a falta de independência não violou fatalmente as premissas de abordagem por modelos lineares.
O coeficiente para o proxy de crescimento nos peixes juvenis (menores que 10% do tamanho máximo) teve magnitude semelhante ao efeito da massa corporal, mostrando que a razão N:P excretada é influenciada pelo estágio de
N:P excretado Todos os tamanhos Tab 5 Juvenis massa fresca <10% do peso máximo Não juvenis massa fresca > 10% do peso máximo coef.pad. IC 95% coef.pad IC 95% coef.pad IC 95% Intercepto 1,18e-10 -0,24 0,24 -6,99e-12 -0,36 0,36 1,00 e-10 -0,33 0,33 crescimento -0,35* -0,63 -0,05 -0,63* -1,20 -0,05 -0,21 -0,54 0,13 massa seca 0,38* 0,08 0,66 0,47 -0,05 0,99 0,38* 0,02 0,73 N:P corpo -0,53*** -0,80 -0,26 -0,65* -1,14 -0,16 -0,55** -0,90 -0,20 R2 ajustado 0,39 0,34 0,49 F 10,01 4,56 7,39 g.l. 39 18 17 P 5,05e-5 0,015 0,002
crescimento em igual medida da influência da mudança de massa. O sinal negativo do proxy de crescimento (Tab. 5) indica que a razão N:P excretada aumenta quanto mais distante do limiar de 10% do tamanho máximo. Assumindo que a taxa de crescimento é inversamente relacionada ao tamanho, quanto maior a taxa esperada de crescimento maior foi a razão N:P excretada.
A razão N:P na excreção foi influenciada negativamente pela razão N:P no corpo dos peixes (Tab 5). Mudanças na estequiometria do corpo em função da taxa de crescimento são previstas de acordo com a teoria estequiométrica. Para investigar isso, nós modelamos a razão N:P do corpo em função da massa corporal e do proxy de crescimento. O resultado mostrou que razão N:P no corpo foi afetada negativamente pelo proxy de crescimento nos peixes juvenis (menores que 10% do tamanho máximo) corroborando um efeito indireto do crescimento na excreção através da estequiometria do corpo. Em peixes maiores (acima de 10% do tamanho máximo da espécie) a razão N:P no corpo não sofreu influência significativa do proxy de crescimento (Tab. 6, Fig. 5). Interessante mencionar que os interceptos dos modelos ajustados com os dados log-transformados forneceram valores de (1,2 e 1,9) substituindo estes valores no expoente da base decimal encontramos valores próximos da razão N:P de Redfield (Tab. 6).
Figura 2. Resíduos e parciais do modelo linear da razão N:P excretada (logNPE) em função da massa seca do corpo (logMS), proxy de crescimento (logW) e N:P corpo (logNPB) ajustado com todo o conjunto de dados (todos os tamanhos).
Figura 3. Resíduos e parciais do modelo linear da razão N:P excretada (logNPE) em função da massa seca do corpo (logMS), proxy de crescimento (logW) e N:P corpo (logNPB) ajustado para peixes menores que 10% do tamanho máximo da espécie.
Figura 4. Resíduos e parciais do modelo linear da razão N:P excretada (logNPE) em função da massa seca do corpo (logMS), proxy de crescimento (logW) e N:P corpo (logNPB) ajustado para peixes maiores que 10% do tamanho máximo da espécie.
Tabela 6. Parâmetros e estatísticas dos modelos de regressão de N:P no corpo (*** p<<0,001; ** p < 0,001; * p ≤ 0,05, n.s = p > 0,05). N:P corpo Juvenis (abaixo que 10% do peso máximo) Não juvenis (acima de 10% do peso máximo) coef. IC 95% coef. IC 95% Intercepto 1,21 *** 1,14 1,28 1,19 *** 0,84 1,55 Crescimento -0,12 * -0,24 -0,005 -0,005 ns - 0,26 0,25 massa seca -0,04 ns -0,18 0,09 -0,05 ns -0,14 0,04 R2 ajustado 0,36 0,03 F 7,00 0,657 g.l. 19 18 P 0,005 0,530
Figura 5. Resíduos e parciais dos modelos de regressão da razão N:P no corpo (logNPB) em função do proxy de crescimento (logW) e da massa corporal (logMS). (A, B, C) para peixes juvenis (abaixo de 10% do tamanho máximo da espécie) e (D, E, F) para peixes não juvenis (acima de 10% do tamanho máximo da espécie).
4. DISCUSSÃO
Para as 46 espécies de peixes amazônicos aqui analisadas, o tamanho do corpo foi o fator que mais influenciou as taxas de excreção do corpo, além disso, afetou a excreção de P e N:P indiretamente via estequiometria do corpo. Isto está de acordo com as teorias do metabolismo e da estequiometria.
Considerando as relações de causa e efeito estabelecidas na hipótese, o tamanho afeta mais a excreção de N e P do que as concentrações destes elementos no corpo. Em contraste, a razão N:P na excreção foi afetada diretamente pelo tamanho, mas principalmente pelo conteúdo de P no corpo. É importante ressaltar que os modelos de equações estruturais permitiram
identificar a magnificação do efeito do tamanho do corpo na excreção em função de seus efeitos indiretos na estequiometria do corpo.
Até o quanto sabemos, existem pouquíssimos estudos sobre ciclagem de nutrientes mediada por peixes de água doce nos neotrópicos, exceções seriam Vanni et al. (2002) e McIntyre et al. (2008) que estudaram peixes de um riacho de quarta-ordem. Em comparação, nossos dados provêm de um sistema de planícies de inundação de dois rios de grande escala. Destaca-se que a base de dados usada incluiu indivíduos de pequenos tamanhos (2,4 mg a 108,5 g de massa seca), de diferentes espécies, com adultos de espécies pequenas e juvenis de espécies grandes, e mesmo assim o padrão se manteve e nossos resultados parecem confirmar a Teoria Metabólica da Ecologia (TME) em relação à alometria do metabolismo.
Estudos sobre ciclagem de nutrientes mediada por consumidores aquáticos atestam o tamanho corporal como fator preponderante na excreção (Algeier et al., 2015; Vanni & McIntyre, 2016). Nossos resultados avançam além disso, mostrando que a excreção sofre efeitos indiretos do tamanho via estequiometria do corpo. A teoria em Estequiometria Ecológica (EE) prevê que o aumento do tamanho provocaria uma diminuição de N:P no corpo de vertebrados, por causa do aprisionamento de fósforo em estruturas ósseas e escamas. Em consequência, seria esperado um aumento da razão N:P excretada (Elser et al., 1996; Sterner & Elser, 2002). Nossos resultados aparentemente corroboram estas previsões.
Comparando nossas análises com outros trabalhos abordando efeitos da estequiometria do corpo na excreção notamos algumas conclusões diferentes. Vanni e McIntyre (2016) e Algeier et al. (2015), por exemplo, encontraram um fraco efeito da razão N:P do corpo sobre a razão N:P excretada, bem como que a concentração de N no corpo pouco explica a excreção do próprio N. Em contraste, nossos resultados não revelaram efeito semelhante para a excreção de N, mas por outro lado mostraram que o conteúdo de P no corpo explicou a excreção de P e N:P (Vanni et al,. 2002).
Uma limitação de nossos resultados é a falta de informação sobre a composição estequiométrica do alimento consumido pelos peixes usados em
nossos experimentos. Porém, é importante observar que a análise de conteúdo do trato digestório de peixes muito pequenos como os aqui usados, é trabalhosa e pode ser inútil na medida que o alimento ingerido não é necessariamente digerido, podendo não se refletir na excreção (Vanni & McIntyre, 2016). Outro efeito de confusão é que os peixes podem passar por mudanças na dieta, causadas por ontogenia (Pilati & Vanni, 2007; Boros, Sály & Vanni, 2015) mas, especialmente em nosso caso, por variações sazonais na disponibilidade de alimento (Mortillaro et al., 2015). Considerando estas limitações, o modelo mínimo proposto por Sterner & Elser (2002), parece ser uma alternativa útil para analisar a excreção mediada por peixes. No entanto, há evidência de que a incorporação de informação da dieta e qualidade do alimento incremente o poder de explicação dos modelos de excreção baseados em EE (Algeier et al., 2015; Vanni & McIntyre, 2016). Assim, ressaltamos este ponto como um novo passo que pode ser dado nos estudos futuros para espécies de peixes amazônicas.
De fato, como vimos nos resultados, modelo global foi rejeitado indicando que é bastante provável que outras variáveis preditoras não incluídas no modelo devem ser consideradas (temperatura, dieta, guilda trófica, ontogenia, eficiência de assimilação, etc.). Neste trabalho mostramos a utilidade de modelos de equações estruturais permitindo desmembrar efeitos diretos e indiretos da TEM e EE nos processos de ciclagem de nutrientes por consumidores, assim permitindo ampliar o conhecimento deste processo.
Nossos resultados mostraram que a razão N:P excretada foi influenciada mais fortemente e negativamente pela estequiometria do corpo mas também influenciada (positivamente) pela massa corporal. De acordo com a teoria estequiométrica, a excreção de N:P aumenta com a massa corporal por que os peixes maiores retêm proporcionalmente mais P, provocando diminuição da razão N:P no corpo. Por outro lado, peixes que crescem numa velocidade maior (juvenis) têm menor razão N:P de excreção.
A GRH (Growth Rate Hypothesis) prevê que os organismos em fase de crescimento acelerado, contêm mais fósforo no corpo em função da maior quantidade de RNA empregado na síntese protéica e por isto, a razão N:P no
corpo tenderia a diminuir nas fases iniciais de crescimento. No entanto, os resultados que encontramos (Fig. 5B) não mostram isto, ao contrário, nossos resultados mostram que a razão N:P no corpo dos peixes juvenis tende a aumentar no início do crescimento, que é a mesma tendência observada nos peixes estudados por Tanner et al. (2000); Pilati & Vanni (2007) e Boros, Sály e Vanni (2015).
Tanner et al. (2000) sugeriram que isto seria causado por que espécies de rápido crescimento aumentam proporcionalmente mais em músculos (tecido rico em N e pobre em P) do que em ossos e escamas. Por outro lado, diminuição na razão N:P associada ao crescimento também pode ser explicada pelo aumento da concentração de P no corpo, decorrente da formação de ossos e escamas (Pilati & Vanni, 2007; Boros, Sály & Vanni 2015). Nossos resultados indicam que a variação na razão N:P no corpo são decorrentes mais da alocação de P em estruturas ósseas do que de processos fisiológicos previstos pela GRH. Isto por que a proporção de P associada ao RNA é muito pequena em relação ao conteúdo total de P no corpo dos peixes, o que torna o efeito da GRH na estequiometria do corpo imperceptível (Tanner et al., 2000). Contudo, como nossos experimentos não incluíram a fase larval, é impossível descartar a hipótese de que a GRH não se aplique ao desenvolvimento ontogenético em peixes.
Estudos em estequiometria ecológica de peixes mostram que mudanças na composição do corpo durante o crescimento acontecem abruptamente, tanto por efeitos ontogenéticos, como por mudanças de dieta, fazendo necessário dividir o espectro de tamanhos para tentar estabelecer relações monotônicas entre as variáveis. Os trabalhos de Vrede et al. (2011) com Perca fluviatilis, e Pilati e Vanni (2007) com Dorosoma cepedianum e Danio rerio, estabeleceram limiares em torno de 20% do tamanho adulto. Em nosso trabalho dividimos o conjunto dos dados em peixes menores e maiores que 10% do tamanho máximo, obtendo dois subconjuntos com número de amostras similares, permitindo um delineamento estatístico equilibrado e mais rigoroso na diferenciação dos grupos que os trabalhos supracitados.
Desta forma, estes experimentos nos permitem concluir que: 1) a estequiometria da excreção foi influenciada pelo tamanho e pela estequiometria do corpo e que, nos menores tamanhos, também atua um fator adicional, vinculado ao crescimento; 2) nessa fase a estequiometria do corpo também é afetada pelo crescimento, entretanto este efeito aparentemente não corresponde ao mecanismo proposto pela GRH.
5. CONCLUSÃO GERAL
A excreção de nitrogênio (N) e fósforo (P) realizada por 46 espécies de peixes, de tamanhos entre 2,4 mg e 108,5 g de massa seca, nativas da Amazônia Central, foi investigada a partir das estruturas conceituais da Teoria Metabólica Ecológica e da Estequiometria Ecológica. Este é o primeiro estudo usando estas abordagens em sistemas aquáticos de planícies de inundação amazônicos. Nossos resultados apontam para as seguintes conclusões:
O tamanho do corpo dos peixes afetou direta e negativamente as taxas de excreção específicas de N e P.
O tamanho do corpo afetou diretamente e positivamente a estequiometria da excreção
A razão N:P excretada e a taxa de excreção de fósforo foram afetadas pela estequiometria do corpo, que por sua vez foi influenciada pelo tamanho corporal. Portanto a variação do tamanho corporal afetou direta e indiretamente a excreção realizada pelos peixes.
Em adição aos mecanismos listados acima, a razão N:P excretada foi afetada por mudanças ontogenéticas na estequiometria do corpo.
ANEXO 1 Gráficos de dispersão dos dados usados nas análises. Os eixos das ordenadas nos gráficos D e E são porcentagem de N e P no corpo, respectivamente.
ANEXO 2 Gráficos de normalidade e leverage dos modelos ajustados (Tab.3). No topo: todos os tamanhos; no meio: peixes menores que 10%; a baixo: peixes maiores que 10% do tamanho máximo.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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