Efeito da L-glutamina na morfologia glomerular de ratos portadores de tumor de Walker-256

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL Av. Senador Salgado Filho - Cidade Universitária 59072-970 - Natal - RN – BRASIL Fone: +55-84-3215-3431 Fax: +55-84-3211-9207 E-mail: pgbioef@cb.ufrn.br. EFEITO DA L-GLUTAMINA NA MORFOLOGIA GLOMERULAR DE RATOS PORTADORES DE TUMOR DE WALKER-256.. Pós-graduando: KAIO RAMON DE AGUIAR LIMA Orientadora: PROFA. DRA. NAIANNE KELLY CLEBIS. Natal/RN 2018. 0.

(2) KAIO RAMON DE AGUIAR LIMA. EFEITO DA L-GLUTAMINA NA MORFOLOGIA GLOMERULAR DE RATOS PORTADORES DE TUMOR DE WALKER-256. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do título de Mestre em Morfologia.. Área de Concentração: Ciências Morfológicas. Orientadora: Profa. Dra. Naianne Kelly Clebis. Natal/RN 2018. 1.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB. Lima, Kaio Ramon de Aguiar. Efeito da L-glutamina na morfologia glomerular de ratos portadores de tumor de Walker-256 / Kaio Ramon de Aguiar Lima. Natal, 2018. 58 f.: il. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional. Orientadora: Profa. Dra. Naianne Kelly Clebis.. 1. Câncer - Dissertação. 2. Rim - Dissertação. 3. Antioxidantes - Dissertação. 4. Glomeruloesclerose - Dissertação. I. Clebis, Naianne Kelly. II. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 616-006.6. Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351. 2.

(4) Nome: Lima, Kaio Ramon de Aguiar Título: Efeito da L-Glutamina na Morfologia Glomerular de Ratos Portadores de Tumor de Walker-256.. Dissertação de Mestrado apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do título de Mestre em Morfologia pelo Programa de Pósgraduação em Biologia Estrutural e Funcional.. Aprovado em: 30 de janeiro de 2018.. BANCA EXAMINADORA Profª. Drª. NAIANNE KELLY CLEBIS – UFRN (Presidente). Julgamento:___________________Assinatura:_________________________. Profª. Drª. JACQUELINE NELISIS ZANONI – UEM (Membro externo). Julgamento:___________________Assinatura:_________________________. Profª. Drª. AURIGENA ANTUNES DE ARAÚJO – UFRN (Membro interno). Julgamento:___________________Assinatura:_________________________. 3.

(5) AGRADECIMENTOS. Agradeço primeiramente a Deus, pelo dom da vida, por estar sempre comigo, me dando força, sabedoria e determinação para concluir este trabalho. Aos meu pais (Maria Wilma de Aguiar e Itamiran Ferreira dos Santos) e aos meus tios (Maria José de Aguiar Oliveira e João Edilson de Aguiar Oliveira) por me ensinarem e darem como exemplo valores morais e éticos, me apoiando sempre que precisei, não tenho palavras para definir o quanto vocês são importantes para mim. Agradeço a professora Naianne Kelly Clebis, pelo exemplo de profissional humana e compreensiva, pelas oportunidades que me deu desde a graduação (monitoria e iniciação científica), e agora de fazer este trabalho, orientações e por tudo que aprendi durante esses dois anos. Agradeço à minha amiga Anna Paula Dionízio dos Santos, que esteve em todos os momentos comigo, dando-me força para alcançar nos meus objetivos, sendo atenciosa para ouvir meus problemas, sempre contribuindo para resolução dos mesmos, me ajudando na construção deste trabalho. Agradeço à toda a equipe do Microcelt, especialmente à Marília Oliveira, Marcelo Lisboa, Temístocles Negreiros e o Natan Reyges, que estiveram sempre disponíveis para retirar minhas dúvidas, e são pessoas que eu possuo muito carinho, respeito e sou grato pela amizade consolidada. Agradeço aos profissionais de outros laboratórios que também contribuíram na construção deste trabalho, em especial à professora Naissandra, por quem possuo muita admiração pela extrema competência, e que mesmo sem saber, me inspira e me motiva a buscar ser um profissional de excelência, sempre buscando novos conhecimentos com foco e prioridades. Por fim, agradeço às Professoras Doutoras Sheila Andreoli Balen, Joseli Brazorotto, Luciana Fontes da Cunha e Karinna Veríssimo Meira Taveira pela parceria formada, pela amizade construída, pe los conselhos e ensinamentos acadêmicos e de formação pessoal, que me fizeram crescer e as admirar cada vez mais.. 4.

(6) RESUMO A síndrome da caquexia relacionada ao câncer leva a mudanças metabólicas que levam o aumento do estresse oxidativo e inflamação que podem promover alterações morfofisiológicos nos diferentes órgãos. Este trabalho objetivou descrever morfologicamente as alterações glomerulares decorrentes da caquexia e o efeito da suplementação com L-glutamina (2%) na prevenção de danos renais. Foram utilizados 20 ratos da linhagem Wistar, machos, adultos, distribuídos em quatro grupos: controle (C); portadores de tumor de Walker-256 (TW); controle suplementado com L-glutamina 2% (CG) e, portadores de tumor de Walker-256 suplementados com L-glutamina 2% (TWG). Os resultados demonstraram redução da densidade glomerular no grupo TW e, evitou a perda glomerular em TWG. Houve aumento na área do tufo glomerular e redução do espaço urinário em TW. A área do mesangio glomerular foi maior nos grupos TW e TWG que em C, porém TWG foi menor que TW. O percentual da área ocupada por matriz extracelular no tufo glomerular foi maior em TW e TWG. A área glomerular ocupada por colágeno foi maior em TW e em TWG. A expressão do FGF-2 foi maior no grupo TW, enquanto que o TWG apresentou a menor imunomarcação de todos os grupos. Os dados indicam que no rim a caquexia alteração a morfologia glomerular com perda de glomérulos e fibrose glomerular. Tais alterações podem levar a danos funcionais renais comprometendo a filtração renais e os níveis de substâncias eliminadas, que servem como indicadores para a adequação de dose de medicamentos e para o tratamento. Por outro lado, a suplementação com L-glutamina melhora a maioria dos parâmetros analisados, minimizando os efeitos da caquexia nos rins dos animais tratados, em especial a densidade glomerular e a fibrose renal, justificando seu uso no tratamento de portadores de câncer. Palavras-chave: Câncer; Rim; Antioxidantes; Glomeruloesclerose.. 5.

(7) ABSTRACT v Cancer-related cachexia leads to metabolic changes leading to increased oxidative stress and inflammation that may promote morphological and physiological changes in different organs. This work aimed to describe morphologically the glomerular changes due to cachexia and the effect of supplementation with L-glutamine (2%) on renal protection. Twenty male Wistar rats were used, distributed in four groups: control (C); tumor carriers of Walker256 (TW); control supplemented with 2% L-glutamine (CG) and Walker-256 tumor carriers supplemented with 2% L-glutamine (TWG). The results demonstrated a reduction of the glomerular density in the TW group and a decrease in the glomerular loss in TWG. There was an increase in the area of the glomerular tuft and reduction of the urinary space in TW. The area of the glomerular mesangium was larger in the TW and TWG than in the C groups, but TWG was smaller than TW. The percentage of the area occupied by extracellular matrix in the glomerular tuft was higher in TW and TWG. The glomerular area occupied by collagen was higher in TW and TWG, but it was lower in the treated group. FGF-2 expression was higher in the TW group, whereas TWG showed the lowest immunolabelling of all groups. The data indicate that the cachexia in the kidney changes the glomerular morphology with loss of glomeruli and glomerular fibrosis. Such changes can lead to functional renal impairment compromising renal filtration and levels of eliminated substances, which serve as indicators for drug dose adequacy and for treatment. On the other hand, supplementation with L-glutamine improves most of the analyzed parameters, minimizing the effects of cachexia in the treated animals, especially glomerular density and renal fibrosis, justifying its use in the treatment of cancer patients.. Keywords: Cancer; Kidney; Antioxidants; Glomerulosclerosis.. 6.

(8) SUMÁRIO vi. RESUMO.............................................................................................................v ABSTRACT ........................................................................................................ vi 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 8 2. OBJETIVOS............................................................................................... 11 2.1 Objetivo Geral ...................................................................................... 11 2.2 Objetivos Específicos ........................................................................... 11 3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 12 3.1 Animais................................................................................................. 12 3.2 Células do Tumor Walker-256 .............................................................. 12 3.3 Tratamento com L-Glutamina 2% ......................................................... 13 3.4 Coleta e processamento do material .................................................... 13 3.4.1 ìndice de caquexia ....................................................................... 13 3.4.2 Processamento histológico ........................................................... 13 3.5 Captura das imagens ........................................................................... 14 3.6 Análise histopatológica ......................................................................... 14 3.6.1 Análise da Glomeruloesclerose ................................................... 14 3.7 Densidade numérica dos glomérulos ................................................... 15 3.8 Análises Morfométricas ........................................................................ 15 3.9 Expressão do FGF-2 ............................................................................ 17 3.10 Análise estatística............................................................................... 18 4. ARTIGO........................................................................................................ 19 5. CONCLUSÃO............................................................................................... 46 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 47 ANEXO ............................................................................................................. 52. 7.

(9) 1. INTRODUÇÃO O Câncer é uma doença agressiva, de interesse mundial, pois atinge pessoas de todas as idades e classes sociais, países desenvolvidos ou em desenvolvimento (KLIGERMAN, 1999; OMS, 2011; FERLAY et al. 2015), e por esta razão existe a necessidade de novos estudos com essa temática, que busquem melhorar a qualidade de vida de portadores minimizando os danos por ele causado, bem como, que promovam sua detecção precoce, estratégias de prevenção e controle. Segundo a OMS (2011) estima-se que em 2020 surjam mais de 17 milhões de novos casos de câncer, levando a morte mais de 10 milhões de pessoas no mundo. No Brasil, as estimativas para 2016 apontaram a incidência de aproximadamente 596 mil novos casos de câncer, o que se agrava pela alta letalidade desta doença nos países em desenvolvimento (FERLAY et al., 2015). No contexto atual, o câncer passou de uma massa celular sob uma descontrolada proliferação, para um tecido complexo composto por múltiplos tipos celulares distintos que participam de interações heterotípicas entre si (HANAHAN; WEINBERG, 2011). Por esta razão, a pesquisa sobre o câncer deixou de ser focada apenas na massa tumoral e passou a buscar o entendimento do papel do microambiente tumoral (HANAHAN; WEINBERG, 2011), do estresse oxidativo (REUTER et al., 2015) e da inflamação (ARGILÉS; LÓPEZ-SORIANO; BUSQUETS, 2012; REUTER et al., 2015) no processo de tumorigênese, promoção e progressão tumoral. Uma das complicações observadas com alta incidência nos pacientes oncológicos é a caquexia, sendo indiretamente responsável pela morte de até 20% de todos os pacientes com câncer (WARREN, 1932; ZEMAN, 1991). Embora nos últimos anos algumas definições de caquexia tenham aparecido, Argilés et al. (2010) afirmam de que todas elas compartilham dois fatores comuns: a perda de peso, principalmente por perda de músculo esquelético e gordura corporal, que não pode ser totalmente revertida pela terapia nutricional convencional, conduzindo ao comprometimento funcional progressivo do organismo e; a inflamação. A caquexia é considerada uma síndrome multifatorial (MUSCARITOLI et. al 2010; FEARON et. al 2011) que envolve alterações em várias vias 8.

(10) metabólicas, órgãos e tecidos (KOWATA et al., 2009). Tais alterações estão ligadas claramente a mecanismos compensatórios que buscam a manutenção da homeostase corporal, porém algumas dessas alterações são nocivas para o paciente e resultam em ineficiência metabólica, desperdício de energia que leva a perda muscular e atrofia muscular (ARGILÉS et al., 2014). No. presente. estudo. foi. utilizado. o. modelo. experimental. do. carcinossarcoma 256 de Walker, que mimetiza as condições da caquexia e imunossupressão (LIMA et al., 2005), promovendo extensa perda de peso devido ao catabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas (FREITAS et al., 2001), o que o torna um bom modelo experimental de caquexia em ratos (GARCIA, 2004; LIMA 2005; LEWIS et al., 2013; BORGHETTI et al., 2015; VIANA, 2015; OLIVEIRA, 2016), apesar de apresentar grande agressividade e crescimento rápido levando a morte do animal em no máximo 15 dias (EARLE, 1935; FERNANDES, 1995; MORAES et al., 2000). Segundo Ozbek (2012) o rim é um órgão altamente vulnerável aos danos causados pelas espécies reativas de oxigênio (ROS) presentes no estresse oxidativo/inflamação que está intimamente ligado à patologia do câncer e ao estado caquético. O estresse oxidativo ocorre por aumento das ROS e diminuição dos sistemas de defesa antioxidantes, o que leva a danos de biomoléculas, células e tecidos (DURACKOVÁ, 2010). Nos rins o reparo tecidual após uma lesão pode ocorrer de forma incompleta, resultando em fibrose, bem como, levando a modificações nas células mesangiais, na matriz mesangial e na membrana basal glomerular (SCHLONDORFF; BANAS, 2009; BONVENTR; YANG, 2011; COELHO, 2015). Para minimizar os níveis de ROS e, consequentemente, os danos causados pelo estrese oxidativo, têm sido implementados o uso de substâncias que ativem as vias antioxidantes, como por exemplo, a L-glutamina (GRIFFITHS, 2001; ROTH et.al.; 2002; FÜRST, et.al.; 2004; ALPERS, 2006; DEBERARDINIS; CHENG, 2010; HENSLEY; WASTI; DEBERARDINIS, 2013; FERDA; BIRGUL; GULBAS, 2014; ALTMAN; STINE; DANG, 2016), precursora na formação de glutationa (GSH), o principal antioxidante celular não enzimático do organismo. A L-glutamina além de antioxidante é também uma fonte de energia essencial para enterócitos em proliferação, assim como na manutenção da barreira intestinal (NEWSHOLME; LIMA, 2003; BIOLO et. al., 2005). Ela também fornece 9.

(11) de energia para células do sistema imunológico e não pode ser substituída por outros aminoácidos (NEWSHOLME; LIMA, 2003; FÜRST, et.al., 2004; BIOLO et. al., 2005). Durante períodos de estresse, existe um estado de deficiência deste antioxidante, evidenciado por uma diminuição dos níveis plasmáticos de glutamina (KRZYWKOWSKI et. al.,2001), por esse motivo, a sua suplementação com L-glutamina, tem sido postulada como importante imunomodulador em várias doenças ou situação de estresse catabólico (JOYNER, 2005), inclusive no câncer. Investigar possíveis. alterações renais de pacientes oncológicos. caquéticos é importante, assim como medidas de proteção deste órgão, pois devido à perda de massa muscular a função renal de pacientes caquéticos pode ser superestimada com base na concentração sérica de creatinina, uma vez, que esta perda de massa muscular leva a diminuição dos níveis séricos de creatinina, podendo resultar em sobredosagem de drogas excretadas pelos rins nestes pacientes (TROBEC et al., 2011). A excreção renal guia a decisão sobre iniciação/término de uma terapia e ajuste da dose, portanto, estimativa confiável da função renal é crucial na prática clínica (TROBEC et al., 2013). Desta forma, este estudo objetivou avaliar o efeito da L-glutamina na morfologia glomerular de ratos portadores de tumor de Walker-256.. 10.

(12) 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral: Investigar o efeito da l-glutamina na morfologia glomerular de ratos portadores de tumor de Walker-256.. 2.2. Objetivos específicos: ✓. Quantificar a densidade glomerular nos animais do presente estudo;. ✓. Mensurar os componentes glomerulares: área glomerular, área do tufo glomerular, área do espaço urinário, área do mesangio glomerular e percentual de matriz extracelular no tufo glomerular;. ✓. Determinar o grau de glomeruloesclerose nos animais do presente estudo;. ✓. Analisar a fibrose glomerular por meio da quantificação da área ocupada por fibras colágenas e pela expressão do Fator de Crescimento Fibroblástico-2 (FGF-2).. 11.

(13) 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais Foram utilizados os rins retirados das carcaças de 20 ratos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus), machos com 64 dias de idade, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual de Maringá - UEM. Todos os procedimentos estão de acordo com princípios éticos adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pela CEUA/UFRN (Parecer 066/2016- anexo1). Os animais permaneceram, durante o período experimental com duração de 14 dias, alojados em caixas de polipropileno, providas de bebedouro e comedouro, mantidos em condições ambientais controladas de temperatura (22º±2ºC) e luminosidade (ciclo 12 horas claro/12 horas escuro) e, receberam água e ração ad libitum, na sala de experimentação animal do Departamento de Morfologia da UEM. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (n= 5): animais controle sem suplementação (C); animais portadores de tumor de Walker 256 sem suplementação (TW); animais controle suplementados com L-glutamina 2% (CG); e animais portadores de tumor de Walker 256 suplementados com L-glutamina 2% (TWG).. 3.2 Células do Tumor Walker-256 Células tumorais Walker 256 foram mantidas no laboratório através de passagens semanais por inoculação asséptica intraperitoneal de 2,0x106 células/animal. Após sete dias de crescimento ascítico, os animais foram eutanasiados com éter etílico e o exsudato peritoneal foi retirado e submetido à centrifugação. para. obtenção. das. células. tumorais,. as. quais. foram. ressuspendidas em PBS (16,5 mM, pH 7,5) para contagem em câmara de Neubauer. A viabilidade das células tumorais foi avaliada pelo método de exclusão do azul de trypan (GUARNIER et al., 2010). A suspensão das células tumorais contendo 8,0x107 células tumorais viáveis em 0,5 mL em PBS por animal, foi injetada no flanco direito posterior dos animais destinados aos grupos com tumor de Walker 256 (TW e TWG). Os animais controle (C e CG) foram inoculados apenas com PBS no mesmo local. 12.

(14) para simular o estresse sofrido pelos animais com tumor (GUARNIER et al., 2010).. 3.3 Tratamento com L-Glutamina 2% Os animais suplementados receberam a L-glutamina (Deg Importação de Produtos Químicos Ltda, São Paulo, SP, Brasil) incorporada à ração padrão na proporção de 2g/100g de ração (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil). A ração foi moída e acrescentada a L-glutamina (Fagron do Brasil Farmacêutica Ltda, São Paulo, SP, Brasil), em seguida foi reconfeccionada em pellets os quais foram posteriormente secos em estufas (ALVES et al., 2010). Os animais nãosuplementados receberam ração padrão balanceada para roedores sem suplementação.. 3.4 Coleta e processamento do material Ao final do experimento todos os animais foram pesados e eutanasiados com tiopental 40mg/kg de peso corporal (Laboratórios Abbott, Chicago, IL, USA) via intraperitoneal. Em seguida o tumor sólido de Walker 256 foi retirado e pesado. Foi realizada uma laparotomia para coleta dos rins, os quais foram lavados em PBS, pesados e, posteriormente fixados em solução tamponada de formaldeído a 10% e, destinados ao processamento histológico.. 3.4.1 Índice de Caquexia Os animais também foram pesados após a inoculação com as células tumorais (TW e TWG) e/ou PBS (C e CG). Para avaliar o índice de caquexia nos animais dos grupos TW e TWG a massa tumoral foi dissecada e pesada. Os resultados obtidos foram utilizados na equação abaixo, e os animais com perda de massa corporal superior a 10% foram considerados caquéticos (GUARNIER et al., 2010).. % Perda de massa corpórea = [PI - PF + (PT) + GPC] x 100/(PI+GPC) Onde: PI = peso corporal inicial do animal com tumor; PF = peso corporal final do animal com tumor; PT = peso do tumor; GPC = ganho de peso do grupo controle.. 3.4.2 Processamento histológico 13.

(15) Após 48 de fixação em solução tamponada de formaldeído a 10% os rins foram seccionados longitudinalmente, e destinados ao procedimento histológico de rotina com desidratação em série crescente de álcoois (80%, 90%, absoluto I, II e III), diafanização em xilol (três banhos) e emblocamento em parafina. Lâminas foram confeccionas com secções da amostra com 3 μm de espessura foram destinadas as colorações histoquímicas e imunohistoquímicas (ver item 3.7 e 3.10). 3.5 Captura das imagens As. imagens. foram. destinadas. as. análises. histopatológicas. e. morfométricas. Foram capturadas imagens do rim em 20 campos microscópicos por animal (n=5), com objetiva de 10x (área do campo microscópico 0.404656 mm2) para estimar a densidade glomerular e, com objetiva de 40x (área do campo microscópico 0.022241 mm2) para as demais análises, no microscópio Nikon Elipse E200-LED com câmera Nikon Digital DXM 1200, do Laboratório de Investigação do Câncer e Inflamação – LAICI, do Departamento de Morfologia/UFRN.. 3.6 Análise histopatológica O material corado com: HE para a análise da densidade glomerular; tricrômico de Masson para a análise do colágeno glomerular; e PAS (ácido periódico-Schiff) para as análises morfométricas dos diferentes componentes glomerulares e análise da glomeruloesclerose.. 3.6.1 Análise da Glomeruloesclerose A glomeruloesclerose foi avaliada utilizando a técnica semi-qualitativa descrita anteriormente por Wu et al. (1997) e modificada por Yuen et al. (2010), nas amostras coradas por PAS. O grau de esclerose em cada glomérulo foi classificado subjetivamente em uma escala de 0-4, sendo grau 0 normais, grau 1 (ligeiramente esclerótica: área esclerótica até 25%), grau 2 (moderadamente esclerótica: lesão esclerótica que ocupa de 25-50% do tufo glomerular), grau 3 (severamente esclerótica: área esclerótica 50-75%) e grau 4 (globalmente esclerótica: área esclerótica 75-100%). A glomeruloesclerose foi definida como espessamento da membrana basal glomerular, hipertrofia mesangial, oclusão 14.

(16) capilar (YUEN et al., 2010) e sinéquia de glomérulo aderente à cápsula de glomerular (LUIZ et al., 2013). O índice de glomeruloesclerose (IGE) foi então calculado usando a fórmula: 4 IGE = ∑Fi (i) (1) = 0. Onde, Fi é a porcentagem de glomérulos no rato com um determinado score (i) (YUEN et al., 2010).. 3.7 Densidade numérica dos glomérulos Na. análise. da. densidade. numérica. dos. glomérulos. renais. (glomérulos/mm2) foram mensurados todos os glomérulos presentes em 20 campos microscópicos/animal, totalizando 100 campos por grupo, com objetiva de 10x, nas amostras coradas com HE.. 3.8 Análises Morfométricas As análises morfométricas dos componentes glomerulares, área glomerular (µm2), área do tufo glomerular (µm2), área do espaço urinário (µm2), área do mesangio glomerular (µm2) e percentual de matriz extracelular no tufo glomerular foram realizadas nas amostras coradas pela técnica de PAS com objetiva de 40X, com o auxílio do no software ImageJ (Schneider; Rasband; Eliceiri, 2012), como segue: Software ImageJ: foi utilizada a ferramenta Freehand selections para demarcar e mensurar a área da cápsula glomerular e em seguida do tufo, sendo assim possível extrair a área do espaço urinário por consequência; Na mesma captura dentro da seleção do tufo glomerular foi realizada uma deconvolução de cores com H PAS (Image>Color>ColourDeconvolution>HPAS) para mensurar a área do mesângio e determinar o índice de matriz mesangial pela proporção que do tufo glomerular ocupada por matriz mesangial, excluindo os núcleos (SAITO et al., 2011) (Image>Adjust>Threshold>Seleciona o limite de marcação do mesangio>Apply>seleção tufo>Measure) (Figura 8).. 15.

(17) B. A. Figura 1. Capturas demonstrando processo de análise morfométrica das áreas do tufo e do corpúsculo glomerular (A), assim como da mensuração da área/índice da matriz mesangial (B). A análise da área ocupada por colágeno foi realizada nas amostras coradas por Tricrômico de Masson com objetiva de 40x, com o auxílio do software Image Pro Plus 6.0 (Ipwin 32, Media Cybernetics, L.P., MD, EUA) como segue: Image-Pro Plus 6.0: foi selecionada e mensurada a área marcada de azul em cada campo (Measure>Count/Size>SelectColors...>Precision1X1>Marca-se toda. área. de. colágeno>NewMask>Close>. AutomaticBrightObjects. >Count>View>Statistics> Copia o montante -Sum-) (Figura 9).. Figura 2. Capturas demonstrando processo de análise de colágeno dos campos corticais sob uma amplitude de 40X e na coloração tricômicro de Masson.. 16.

(18) 3.9 Expressão do FGF-2 Lâminas sinalizadas com secções de 3µm de espessura foram confeccionadas para a análise da expressão do Fator de Crescimento Fibroblástico-2 (FGF-2). As lâminas foram desparafinizadas em dois banhos de xilol por 10 minutos (xilol I, II e III), em seguida passadas em 5 banhos de 3 minutos em álcool (Absoluto I, II e III, 95% e 80%) e, em água destilada. Em seguida, as lâminas foram submergidas em PBS por 10min. A recuperação antigênica foi realizada com a solução de citrato de sódio em banho Maria por 30 min. O bloqueio da peroxidase endógena correu com peróxido de hidrogênio a 3% (Synth, Diadema-SP, Brasil) por 20 minutos, intercalando a cada 10 minutos com dois banhos de água destilada. As lâminas foram então lavadas com água destilada por duas vezes, para o bloqueio de marcações inespecíficas com BSA a 5% (Sigma, St. Louis, MO, EUA) diluído em PBS por 2h. Em seguida foi realizada quatro lavagens, duas com água destilada e outras duas com PBS. Após esta etapa as amostras foram incubadas com o anticorpo primário FGF-2 (1:800, SC #1360, Santa Cruz Biotecnologia, Interprise, Brasil) por 12 horas (overnight). O material foi lavado com PBS e, incubado com anticorpo secundário conjugado com streptABComplex/HRP Duet, Mouse/Rabbit (K0492 DAKO, Dako North America, Carpinteria, CA, USA) em temperatura ambiente. Foram realizadas duas lavagens com o tampão PBS e aplicado o kit DAKO Liquid DAB + substrate Chromogen System (K3468 DAKO, Dako North America, Carpinteria, CA, USA) por 10 minutos. O material foi lavado em água destilada e corado com Hematoxilina de Harris (MHS16-Sigma, Sigma, St. Louis, MO, EUA), por 15 minutos e, em seguida lavado em água corrente por 10 minutos, desidratado em álcool 95% e em álcool absoluta (três vezes) por 10 segundos cada, e em xilol (três vezes) por 10 segundos, e posteriormente as lâminas foram montadas com lamínula e meio de montagem Permount. A análise da densidade de volume (Vv) (GUNDERSEN; JENSEN, 1987; NYENGAARD, 1999; MARDARIM-DE-LACERDA, 2003; SHIRAZI et al., 2011; NOORAFSHA et al., 2013) da expressão do FGF-2 foi realizada nas imagens previamente capturadas (item 2.6) com o auxílio de um sistema teste de pontos (composto por 475 pontos) no software ImagePro Plus 7 (Media Cybernetics Inc., Rockville, MD, USA). Para tanto foi utilizada a seguinte fórmula: Vv = Pint/ Pref., 17.

(19) onde Pint é o número total de pontos que tocaram as células de interesse e, Pref é o número total de pontos do sistema teste (475).. 3.10 Análise estatística Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. Foi utilizada a análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey (GraphPad Prism 6 Software, La Jolla, CA, EUA). Os dados referentes ao peso do tumor foram analisados pelo teste t de Student. O nível de significância adotado para todos os testes foi de 5%.. 18.

(20) 4. ARTIGO. EFEITO DA L-GLUTAMINA NA MORFOLOGIA GLOMERULAR DE RATOS COM SÍNDROME DE CAQUEXIA. KAIO RAMON DE AGUIAR LIMA1; SARA RAQUEL GUSMÃO2; LUCIANE FRACARO2; NATAN REYGES CASTRO DA PURIFICAÇÃO1; RAIMUNDO FERNANDES DE ARAÚJO JÚNIOR3; SILVIA LACCHINI4; JULIANA VANESSA COLOMBO MARTINS PERLES2; JACQUELINE NELISIS ZANONI2; NAIANNE KELLY CLEBIS1. 1. KAIO RAMON DE AGUIAR LIMA. Laboratório de Microscopia Celular e Tecidual, Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional, Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. + 55 84 3215-3431 kaioslps@outlook.com 2. SARA RAQUEL GARCIA DE SOUZA. Departamento de Ciências Morfofisiológicas, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR, Brasil. +55 44 3011-4340 sara.raquel.gusman@gmail.com 2. LUCIANE FRACARO. Departamento de Ciências Morfofisiológicas, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR, Brasil. +55 44 3011-4340 luci_fracaro@hotmail.com 1. NATAN REYGES CASTRO DA PURIFICAÇÃO. Laboratório de Microscopia Celular e Tecidual, Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional, Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. + 55 84 3215-3431 natanbiologia@yahoo.com.br 3. RAIMUNDO FERNANDES DE ARAÚJO JÚNIOR. Laboratório de investigação do Câncer e Inflamação, Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional, Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. + 55 84 3215-3431 araujojr@cb.ufrn.br 4. SILVIA LACCHINI. Laboratório de Morfologia Funcional Aplicada à Cardiologia (LaMorFAC), Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas, Departamento de Anatomia, Instituto de Ciências Biomédicas III, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil. + 55 11 3091-7366 lacchini@icb.usp.br. 19.

(21) 2. JULIANA VANESSA COLOMBO MARTINS PERLES. Departamento de Ciências Morfofisiológicas, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR, Brasil. +55 44 3011-4340 jjvcm77@gmail.com 2. JACQUELINE NELISIS ZANONI. Departamento de Ciências Morfofisiológicas, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR, Brasil. +55 44 3011-4340 jnzanoni@uem.br 1. NAIANNE KELLY CLEBIS (Autor correspondente). Laboratório de Microscopia Celular e Tecidual, Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional, Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. + 55 84 3215-3431 nkclebis@hotmail.com. AUTOR CORRESPONDENTE: Profa. Dra. Naianne Kelly Clebis ENDEREÇO: Universidade Federal do Rio Grande do Norte/ Centro de Biociências/ Departamento de Morfologia/ Laboratório de Microscopia Celular e Tecidual – MICROCELT/Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional. BR 101, s/n – Campus Universitário Lagoa Nova - Bairro: Lagoa Nova – Natal – RN CEP: 59078-970 Telephone: +55 84 32153431 Fax: +55 84 32119207 E-mail: nkclebis@hotmail.com. CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES: KRAL, processamento, análise dos dados e preparação do manuscrito; SRG, LF, manejo dos animais; NRCP, análise do material; SL, RFAJ, interpretação dos resultados; JNZ, JVCMP, elaboração do design experimental; NKC, elaboração do design experimental, interpretação dos dados e revisão do manuscrito.. 20.

(22) RESUMO A síndrome da caquexia relacionada ao câncer leva a mudanças metabólicas que levam o aumento do estresse oxidativo e inflamação que podem promover alterações morfofisiológicos nos diferentes órgãos. Este trabalho objetivou descrever morfologicamente as alterações glomerulares decorrentes da caquexia e o efeito da suplementação com L-glutamina (2%) na proteção renal. Foram utilizados 20 ratos da linhagem Wistar, machos, adultos, distribuídos em quatro grupos: controle (C); portadores de tumor de Walker-256 (TW); controle suplementado com L-glutamina 2% (CG) e, portadores de tumor de Walker-256 suplementados com L-glutamina 2% (TWG). Os resultados demonstraram redução da densidade glomerular no grupo TW e, diminuição da perda glomerular em TWG. Houve aumento na área do tufo glomerular e redução do espaço urinário em TW. A área do mesangio glomerular foi maior nos grupos TW e TWG que em C, porém TWG foi menor que TW. O percentual da área ocupada por matriz extracelular no tufo glomerular foi maior em TW e TWG. A área glomerular ocupada por colágeno foi maior em TW e em TWG, sendo menor no grupo tratado. A expressão do FGF-2 foi maior no grupo TW, enquanto que o TWG apresentou a menor imunomarcação de todos os grupos. Os dados indicam que no rim a caquexia alteração a morfologia glomerular com perda de glomérulos e fibrose glomerular. Tais alterações podem levar a danos funcionais renais comprometendo a filtração renais e os níveis de substâncias eliminadas, que servem como indicadores para a adequação de dose de medicamentos e para o tratamento. Por outro lado, a suplementação com L-glutamina melhora a maioria dos parâmetros analisados, minimizando os efeitos da caquexia nos rins dos animais tratados, em especial a densidade glomerular e a fibrose renal, justificando seu uso no tratamento de portadores de câncer. Palavras-chave: Câncer; Rim; Antioxidantes; Glomeruloesclerose.. 1. INTRODUÇÃO O Câncer é uma doença agressiva, de interesse mundial, pois atinge pessoas de todas as idades e classes sociais, países desenvolvidos ou em desenvolvimento. 1,2,3 No contexto atual, o câncer passou de uma massa celular sob uma descontrolada proliferação, para um tecido complexo composto por múltiplos tipos celulares distintos 21.

(23) que participam de interações heterotípicas entre si.4 Por esta razão, a pesquisa sobre o câncer deixou de ser focada apenas na massa tumoral e passou a buscar o entendimento do papel do microambiente tumoral,4 do estresse oxidativo5 e da inflamação6 no processo de tumorgênese, promoção e progressão tumoral.5,6 Aproximadamente 50% dos pacientes com câncer desenvolverão a síndrome de caquexia7,8 na qual há inflamação sistêmica9 e desequilíbrio energético que levam a perde de peso por redução da massa muscular e do tecido adiposo.10,11,12,13 O metabolismo lipídico influenciado pela ativação de citocina pró-inflamatórias está associado a perda de peso na caquexia.14 A caquexia é considerada uma síndrome multifatorial15,16 que envolve alterações em várias vias metabólicas, órgãos e tecidos.17 Tais alterações estão ligadas claramente a mecanismos compensatórios que buscam a manutenção da homeostase corporal, porém algumas dessas alterações são nocivas para o paciente e resultam em ineficiência metabólica, desperdício de energia que leva a perda muscular e atrofia muscular.18 A caquexia leva a diminuição da resposta aos tratamentos antitumorais prejudicando o tratamento de pacientes com câncer, porém ainda não existem diretrizes para seu diagnóstico e tratamento.19,20 No presente estudo foi utilizado o modelo experimental do carcinossarcoma 256 de Walker, que mimetiza as condições da caquexia e imunossupressão,21 promovendo extensa perda de peso devido ao catabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas, 22 o que o torna um vantajoso modelo experimental de caquexia em ratos,23,21,24,25,26,27 com a desvantagem de apresentar grande agressividade, crescimento muito rápido e pequeno período de latência, levando a morte do animal em no máximo 15 dias, dificultando a avaliação da eficácia da ação de drogas. 28,29 Na caquexia relacionada ao câncer ocorre dano mitocondrial antes mesmo do início da perda de massa muscular, o que leva a excesso de espécies reativas de oxigênio (ROS) e, consequentemente, ao estresse oxidativo, que induz os danos musculares posteriores.30 Além disso, é possível observar em pacientes com câncer redução das substâncias antioxidantes endógenas que somadas as mudanças mitocondriais elevam ainda mais o estresse oxidativo nestes pacientes.31 Os rins são órgãos altamente vulneráveis aos danos causados pelos ROS presentes no estresse oxidativo/inflamação que está intimamente ligado ao estado caquético.32 O estresse oxidativo ocorre por aumento das ROS e diminuição dos sistemas de defesa antioxidantes, o que leva a danos de biomoléculas, células e tecidos.33 Nos rins o reparo tecidual após uma lesão pode ocorrer de forma incompleta, resultando em fibrose, bem. 22.

(24) como, levando a modificações nas células mesangiais, na matriz mesangial e na membrana basal glomerular.34,35,36 Para minimizar os níveis de ROS e, consequentemente, os danos causados pelo estrese oxidativo, têm sido implementadas terapias com o uso de substâncias que ativem as vias antioxidantes, como por exemplo, a L-glutamina,37,38,39,40,41,42,43,44 precursora na formação de glutationa (GSH), o principal antioxidante celular não enzimático do organismo. A L-glutamina além de antioxidante é também uma fonte de energia essencial para enterócitos em proliferação, assim como na manutenção da barreira intestinal.45,46 Ela também fornece energia para células do sistema imunológico e não pode ser substituída por outros aminoácidos.45,21,39,46 Durante períodos de estresse, existe um estado de deficiência deste antioxidante, evidenciado por uma diminuição dos níveis plasmáticos de glutamina,47 por esse motivo, a suplementação com L-glutamina, tem sido postulada como importante imunomodulador em várias doenças ou situação de estresse catabólico,48 inclusive no câncer. Investigar possíveis alterações renais na caquexia cancerígena é importante, assim como medidas de proteção deste órgão, pois devido à perda de massa muscular a função renal pode ser superestimada com base na concentração sérica de creatinina, uma vez, que esta perda de massa muscular leva a diminuição dos níveis séricos de creatinina, podendo resultar em sobredosagem de drogas excretadas pelos rins.49 A excreção renal guia a decisão sobre iniciação/término de uma terapia e ajuste da dose, portanto, estimativa confiável da função renal é crucial na prática clínica.50 Desta forma, este estudo objetivou avaliar o efeito da L-glutamina na morfologia glomerular de ratos portadores de tumor de Walker-256.. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Animais Foram utilizados os rins retirados das carcaças de 20 ratos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus), machos com 64 dias de idade, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual de Maringá - UEM. Todos os procedimentos estão de acordo com princípios éticos adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pela CEUA/UFRN (Parecer 066/2016- anexo1). Os animais permaneceram, durante o período experimental com duração de 14 dias, alojados em caixas de polipropileno, providas de bebedouro e comedouro, mantidos em condições ambientais controladas de temperatura (22º±2ºC) e 23.

(25) luminosidade (ciclo 12 horas claro/12 horas escuro) e, receberam água e ração ad libitum, na sala de experimentação animal do Departamento de Ciências Morfológicas da UEM. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (n= 5): animais controle sem suplementação (C); animais portadores de tumor de Walker 256 sem suplementação (TW); animais controle suplementados com L-glutamina 2% (CG); e animais portadores de tumor de Walker 256 suplementados com L-glutamina 2% (TWG).. 2.2 Células do Tumor Walker-256 Células tumorais Walker 256 foram mantidas no laboratório através de passagens. semanais. por. inoculação. asséptica. intraperitoneal. de. 2,0x106. células/animal. Após sete dias de crescimento ascítico, os animais foram eutanasiados com éter etílico e o exsudato peritoneal foi retirado e submetido à centrifugação para obtenção das células tumorais, as quais foram ressuspendidas em PBS (tampão fosfato 16,5 mM, pH 7,5) para contagem em câmara de Neubauer. A viabilidade das células tumorais foi avaliada pelo método de exclusão do azul de trypan.51 A suspensão das células tumorais (Walker 256) contendo 8,0x107 células tumorais viáveis em 0,5 mL em PBS (16,5 mM, pH 7,5) por animal, foi injetada no flanco direito posterior dos animais destinados aos grupos com tumor de Walker 256 (TW e TWG). Os animais controle (C e CG) foram inoculados apenas com PBS (tampão fosfato 16,5 mM, pH 7,5) no mesmo local para promover o mesmo estresse sofrido pelos animais com tumor.51. 2.3 Tratamento com L-Glutamina 2% Os animais suplementados receberam a L-glutamina (Deg Importação de Produtos Químicos Ltda, São Paulo, SP, Brasil) incorporada à ração padrão na proporção de 2g/100g de ração (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil). A ração foi moída e acrescentada a L-glutamina (Fagron do Brasil Farmacêutica Ltda, São Paulo, SP, Brasil), em seguida foi reconfeccionada em pellets os quais foram posteriormente secos em estufas.52 Os animais não-suplementados receberam ração padrão balanceada para roedores sem suplementação. O período experimental durou 14 dias.. 2.4 Coleta e processamento do material 24.

(26) Ao final do experimento todos os animais foram pesados e eutanasiados com tiopental 40mg/kg de peso corporal (Laboratórios Abbott, Chicago, IL, USA) via intraperitoneal. Em seguida o tumor sólido de Walker 256 foi retirado e pesado. Foi realizada uma laparotomia para coleta dos rins, os quais foram lavados em PBS (16,5 mM, pH 7,5), pesados e, posteriormente fixados em solução tamponada de formaldeído a 10% e, destinados ao processamento histológico.. 2.4.1 ÍNDICE DE CAQUEXIA Para avaliar o índice de caquexia a massa tumoral total foi dissecada e pesada. Os resultados obtidos foram utilizados na equação abaixo, e os animais com perda de massa corporal superior a 10% foram considerados caquéticos.51 % Perda de massa corpórea = [PI - PF + (PT) + GPC] x 100/(PI+GPC) Onde: PI = peso corporal inicial do animal com tumor; PF = peso corporal final do animal com tumor; PT = peso do tumor; GPC = ganho de peso do grupo controle.. 2.5 Processamento histológico Após 48h de fixação em solução tamponada de formaldeído a 10% os rins foram seccionados longitudinalmente e, destinados aos procedimentos histológicos de rotina com desidratação em série crescente de álcoois (80%, 90%, absoluto I, II e III), diafanização em xilol (xilol I, II e III) e emblocamento em parafina. Lâminas foram confeccionas com secções da amostra com 3 μm de espessura e, estas foram destinadas as colorações histoquímicas e imunohistoquímicas (ver item 3.7 e 3.10).. 2.6 Captura das imagens As imagens foram destinadas as análises histopatológicas e morfométricas. Foram capturadas imagens do rim em 20 campos microscópicos por animal (n=5), com objetiva de 10x (área do campo microscópico 0.404656 mm2) para estimar a densidade glomerular e, com a objetiva de 40x (área do campo microscópico 0.022241 mm2) para as demais análises, no microscópio Nikon Elipse E200-LED com câmera Nikon Digital DXM 1200, no Laboratório de Investigação do Câncer e Inflamação – LAICI, do Departamento de Morfologia/UFRN.. 25.

(27) 2.7 Análise histopatológica O material corado com: HE para a análise da densidade glomerular; tricrômico de Masson para a análise do colágeno glomerular; e PAS (ácido periódico-Schiff) para as análises morfométricas dos diferentes componentes glomerulares e análise da glomeruloesclerose.. 2.7.1 ANÁLISE DA GLOMERULOESCLEROSE A glomeruloesclerose foi avaliada utilizando a técnica semi-qualitativa descrita anteriormente por Wu53 e modificada por Yuen,54 nas amostras coradas por PAS. O grau de esclerose em cada glomérulo foi classificado subjetivamente em uma escala de 0-4, sendo grau 0 normais; grau 1 (ligeiramente esclerótica: área esclerótica até 25%); grau 2 (moderadamente esclerótica: lesão esclerótica que ocupa de 25-50% do tufo glomerular), grau 3 (severamente esclerótica: área esclerótica 50-75%) ou grau 4 (globalmente esclerótica: área esclerótica 75-100%). A glomeruloesclerose foi definida como espessamento da membrana basal glomerular, hipertrofia mesangial, oclusão capilar54 e sinéquia de glomérulo aderente à cápsula de glomerular.55 O índice de glomeruloesclerose (IGE) foi então calculado usando a fórmula: 4 IGE = ∑Fi (i). (2) = 0. Onde, Fi é a porcentagem de glomérulos no rato com um determinado score (i).54. 2.8 Densidade numérica dos glomérulos Na análise da densidade numérica dos glomérulos renais (glomérulos/mm2) foram. quantificados. todos. os. glomérulos. presentes. em. 20. campos. microscópicos/animal, totalizando 100 campos por grupo, com objetiva de 10x, nas amostras coradas com HE.. 26.

(28) 2.9 Análises Morfométricas As análises morfométricas dos componentes glomerulares, área glomerular (µm2), área do tufo glomerular (µm2), área do espaço urinário (µm2), área do mesangio glomerular (µm2) e percentual de matriz extracelular no tufo glomerular foram realizadas nas amostras coradas pela técnica de PAS com objetiva de 40X, com o auxílio do no software ImageJ (Schneider; Rasband; Eliceiri, 2012), como segue: Software ImageJ: foi utilizada a ferramenta Freehand selections para demarcar e mensurar a área da cápsula glomerular e em seguida do tufo, sendo assim possível extrair a área do espaço urinário por consequência; Na mesma captura dentro da seleção do tufo glomerular foi realizada uma deconvolução de cores com H PAS (Image>Color>ColourDeconvolution>HPAS) para mensurar a área do mesângio e determinar o índice de matriz mesangial pela proporção que do tufo glomerular ocupada por matriz mesangial, excluindo os núcleos (Image>Adjust>Threshold>Seleciona o limite de marcação do mesangio>Apply>seleção tufo>Measure).56 A análise da área ocupada por colágeno foi realizada nas amostras coradas por Tricrômico de Masson com objetiva de 40x, com o auxílio do software Image Pro Plus 6.0 (Ipwin 32, Media Cybernetics, L.P., MD, EUA) como segue: Image-Pro Plus 6.0: foi selecionada e mensurada a área marcada de azul em cada campo (Measure>Count/Size>SelectColors...>Precision1X1>Marca-se toda área de. colágeno>NewMask>Close>. AutomaticBrightObjects. >Count>View>Statistics>. Copia o montante -Sum-).. 2.10 Expressão do FGF-2 Lâminas silanizadas com secções de 3µm de espessura foram confeccionadas para a análise da expressão do Fator de Crescimento Fibroblástico-2 (FGF-2). As lâminas foram desparafinizadas em dois banhos de xilol por 10 minutos (xilol I, II e III), em seguida passadas em 5 banhos de 3 minutos em álcool (Absoluto I, II e III, 95% e 80%) e, em água destilada. Em seguida, as lâminas foram submergidas em PBS (16,5 mM, pH 7,5) por 10min. A recuperação antigênica foi realizada com a solução de citrato de sódio em banho Maria por 30 min. O bloqueio da peroxidase endógena correu com peróxido de hidrogênio a 3% (Synth, Diadema-SP, Brasil) por 20 minutos, intercalando a cada 10 minutos com dois banhos de água destilada. As lâminas 27.

(29) foram então lavadas com água destilada por duas vezes, para o bloqueio de marcações inespecíficas com BSA (albumina sérica bovina) a 5% (Sigma, St. Louis, MO, EUA) diluído em PBS por 2h. Em seguida foi realizada quatro lavagens, duas com água destilada e outras duas com PBS. Após esta etapa as amostras foram incubadas com o anticorpo primário FGF-2 (1:800, SC #1360, Santa Cruz Biotecnologia, Interprise, Brasil) por 12 horas (overnight). O material foi lavado com PBS (16,5 mM, pH 7,5) e, incubado com anticorpo secundário conjugado com streptABComplex/HRP Duet, Mouse/Rabbit (K0492 DAKO, Dako North America, Carpinteria, CA, USA) em temperatura ambiente. Foram realizadas duas lavagens com o tampão PBS e aplicado o kit DAKO Liquid DAB + substrate Chromogen System (K3468 DAKO, Dako North America, Carpinteria, CA, USA) por 10 minutos. O material foi lavado em água destilada e corado com Hematoxilina de Harris (MHS16-Sigma, Sigma, St. Louis, MO, EUA), por 15 minutos e, em seguida lavado em água corrente por 10 minutos, desidratado em álcool 95% e em álcool absoluta (três vezes) por 10 segundos cada, e em xilol (três vezes) por 10 segundos, e posteriormente as lâminas foram montadas com lamínula e meio de montagem Permount. A análise da densidade de volume (Vv) (GUNDERSEN; JENSEN, 1987; NYENGAARD, 1999; MARDARIM-DE-LACERDA, 2003; SHIRAZI et al., 2011; NOORAFSHA et al., 2013) da expressão do FGF-2 foi realizada nas imagens previamente capturadas (item 2.6) com o auxílio de um sistema teste de pontos (composto por 475 pontos) no software ImagePro Plus 7 (Media Cybernetics Inc., Rockville, MD, USA). Para tanto foi utilizada a seguinte fórmula: Vv = Pint/ Pref., onde Pint é o número total de pontos que tocaram as células de interesse e, Pref é o número total de pontos do sistema teste (475).. 2.11 Análise estatística Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. Foi utilizada a análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey (GraphPad Prism 6 Software, La Jolla, CA, EUA). Os dados referentes ao peso do tumor foram analisados pelo teste t de Student. O nível de significância adotado para todos os testes foi de 5%.. 28.

(30) 3. RESULTADOS 3.1 Parâmetros fisiológicos O peso corporal final foi 13,15% menor em TW se comparado a C (p<0,001). TWG foi 6,9% maior que TW (p<0,001). CG foi semelhante a C. O peso do tumor foi 7,87% menor em TWG que em TW, porém esta diferença não foi significativa (P>0,05). Quanto o ganho de peso corporal houve redução de 50,56% no grupo TW em comparação a C (p<0,001). Em TWG houve aumento de 29,8% em relação a TW (p>0,05). CG e C foram semelhantes. Não foram observadas diferenças no peso dos rins entre os grupos estudados. Os resultados referentes aos parâmetros fisiológicos peso (corporal, tumoral e renal), ganho de peso corporal e índice de caquexia estão apresentados na Tabela 1.. 3.2 Análise da densidade glomerular Nos animais dos grupos C (Figura 1A, B), TW (Figura 1A, C), CG (Figura 1A, D) e TWG (Figura 1A, E). TW foi 14,52% menor que C (p<0,05). Nos animais do grupo TWG a densidade glomerular foi 7,87% maior que TW. CG foi próximo de C (p>0,05). Os dados da densidade glomerular estão apresentados na Figura 1.. 3.3 Morfometria e glomeruloesclerose Quanto a área glomerular (µm2) não foi detectada diferença entre os animais desta pesquisa (p>0,05) (Figura 2A). A área do tufo glomerular (µm2) foi em TW 23,03% maior que C (p<0,05). TWG foi 16,38% menor que TW (p<0,05). TWG, GC e C foram semelhantes (Figura 2B). A área do espaço urinário (µm2) estava reduzida em TW em relação a C (50,73%) (p<0,05). TWG foi 47,13% maior que TW (p<0,05). TWG foi semelhante a C e, CG também foi igual a C (p>0,05) (Figura 2C). Em 80% dos glomérulos de TW amostrados foi observado sinéquia, na qual o tufo estava aderido a cápsula glomerular, com ausência total ou parcial do espaço urinário. Enquanto que no grupo TWG houve redução da incidência de sinéquia. A área do mesangio (µm2) foi em TW 46,39% maior que C (p<0,05). TWG foi 26,25% menor que TW (p<0,05). C e CG foram semelhantes (p>0,05) (Figura 2D). Com relação aos percentuais de matriz no tufo glomerular (%) TW 35,75% maior que C (p<0,05). TWG foi 7,55% menor que TW (p>0,05). CG foi 24,84% menor que C (p<0,05) (Figura 2E).. 29.

(31) A maioria dos glomérulos analisados do grupo C foi classificada com grau 0 de glomeruloesclerose (72%) e, 91% entre grau 0 e 1. No grupo TW a maioria dos glomérulos estavam totalmente comprometidos com grau 4 (67%) e, 78% estava entre o grau 3 e 4. No grupo CG a maioria dos glomérulos era normal com grau 0 (93%) e, 100% deles foi classificado entre grau 0 e 1. No grupo TWG a maioria dos glomérulos estava classificada em grau 4 (44%), sendo que em relação ao grupo TW houve redução de 32,8% dos glomérulos de grau 4 e aumento daqueles de grau 1 (77,7%) e grau 0 (23%) (Figura 4F).. 3.4 Análise das fibras colágenas e da expressão do FGF-2 Dentre os animais dos grupos C, TW, CG e TWG, foi observado aumento de 59,32% em TW na área ocupada por fibras colágenas em relação a C (p<0,05). TWG foi 20,29% menor que TW (p<0,5). CG foi 28,29% maior que C (p<0,05). Os resultados da análise da área ocupada por fibras colágenas nos glomérulos renais (µm2) estão demonstrados nas Figuras 3A-E. Nos dados da expressão do FGF-2 (Vv), os animais do grupo TW foi 39,47% maior que C (p<0,001). TWG foi 66,91% menor que TW (p<0,001) e, 45,33% menor que C (p<0,05). Tais dados estão apresentados nas Figuras 5F-J.. DISCUSSÃO Neste estudo observamos menor peso corporal final de animais do grupo TW quando comparadado com os grupo C (p<0,001), devido maior perda de peso ocorrer nos portadores de câncer, pois o tumor possui alto consumo de energia e gera uma ineficiência energética, responsável pela maior utilização da glicose, diminuição do glicogênio intramuscular e hepático.64 Um discreto aumento foi observado quando comparado TWG com TW, porém sem diferefença estatisticamente significante; semelhantes aos achados de Lima63 que não verificou alteração do peso corporal e nem do peso do tumor de ratos com tumor de Walker 256 em relação a ratos com tumor de Walker 256 suplementados com Lglutamina. De acordo com Moraes29 o curto período experimental pode ter interferido no peso renal e no peso do tumor para não terem sido vistas diferenças entre os grupos.. 30.

(32) No que concerne ao Índice de Caquexia (IC) obtivemos um resultado satisfatório, tendo em vista que os animais do grupo TW apresentaram um IC maior que do grupo TWG (p<0,001) e tais parâmetros estão sendo correlacionados com a sobrevivência de portadores de câncer, e a observação do sistema de classificação de perda de peso e os níveis da caquexia podem melhorar o prognóstico destes pacientes.62 A perda de peso na caquexia, está relacionada com a atrofia muscular que é, em parte, resultado da inadequada atividade anabólica neuro-hormonal e/ou excesso da atividade catabólica.63 Alguns estudos buscam melhorar o quadro da caquexia prevenindo a perda excessiva de peso, obtendo resultados promissores como aumento na sobrevivência de ratos caquéticos e redução da massa tumoral.12,65,66 Segundo Friesen70 o custo energético do tumor é de aproximadamente 190 a 470 kcal/kg de tumor/dia, fomentando o desenvolvimento de terapias nutricionais que busquem o equilíbrio energético em pacientes com câncer. O alto custo energético do tumor associado aos elevados níveis de consumo de glicose e glutamina promovem danos musculares para nutrir o tumor, contribuindo para a caquexia.70 Ao observarmos o parâmetro da densidade glomerular, vemos que a caquexia pode piorar a função renal em paciente com doença renal crônica,72,73 e que a Lglutamina minimizou os danos renais referentes a perda de glomérulos. Alterações na quantidade de glomérulos em animais caquéticos pode além de comprometer a homeostase corporal, ser prejudicial para a definição das dosagens das drogas utilizadas para o tratamento. 75 Nossos resultados morfométricos evidenciaram múltiplas alterações nos rins dos animais do grupo TW, indicando que a caquexia pode piorar a função renal como apresentando anteriormente.72,73 Isso se dá pois o estresse oxidativo e a resistência vascular mudam os níveis de perfusão renal.74 Dentre as alterações, temos a hipertrofia do tufo glomerular, nos animais do grupo TW, possivelmente produzida pela proliferação de células no mesângio (hipertrofia mesangial, também característica do referido grupo) e, a chamada proliferação endocapilar envolvendo o endotélio capilar e os leucócitos infiltrantes, frequentemente observado nos casos de injúria renal,76 semelhantemente aos achados de Hinamoto77 que analisou o efeito protetor do VASH1 sob alterações renais, observando dentre outros parâmetros a hipertrofia glomerular baseado na área do tufo glomerular. O tratamento com a l-glutamina foi capaz de reverter esse aumento da área. 31.

(33) do tufo glomerular, se assemelhando com o do grupo C (p<0,001); assim como da área mesangial (p<0,001). O mesangio está sendo visto como uma forma especial de pericitos microvasculares, formando uma unidade de integração funcional mesângio-endotéliopodócitos. Estrategicamente localizadas, eles estão diretamente envolvidos em fenômenos biológicos que regem a fisiologia renal,78 assim como numa ampla variedade de doenças glomerulares.79,56,77 Os resultados da maior incidência da glomeruloesclerose em TW pode ser atribuído a inflamação, na qual além dos mastócitos e os leucócitos recrutados para o local do dano gerando uma maior absorção de oxigênio há um aumento na liberação e acumulação de ROS no local de dano.80,81 As células inflamatórias produzem citocinas que recrutam células inflamatórias adicionais para o local lesionando, produzindo ainda mais ROS e, este ambiente inflamatório/oxidativo sustentado leva a um círculo vicioso devastador para o organismo e, sendo o rim um órgão altamente vulnerável aos danos causados pelas espécies reativas de oxigênio,32,5 isso justifica o alto índice de glomeruloesclerose nos animais do grupo TW. O tratamento com L-glutamina 2% foi capaz de minimizar o efeito devastador da caquexia nos rins dos ratos TWG, possivelmente por sua ação imunomoduladora, sendo combustível para células do sistema imunológico e, como precursora para síntese de glutationa, importante enzima antioxidante que protege as células do estresse oxidativo.38,39 A retomada dos adequados níveis plasmáticos de L-glutamina evita as alterações fisiológicas adaptativas que desencadeiam e agravam o processo de caquexia.40,47 Foi possível observar uma deposição de colágeno aumentada no grupo TW seria reflexo de um processo inflamatório mais intenso nesse grupo, assim como de fibrose, tendo em vista que as células glomerulares e tubulares respondem ao processo inflamatório apresentando lesão da membrana basal e pela transição epitelialmesenquimal se transformando em fibroblastos, que produzem colágeno, que por sua vez, lesa os vasos e os túbulos renais, eventualmente determinando a formação de uma cicatriz acelular.82,83,84,85 No grupo TWG podemos observar uma redução da deposição de colágeno quando comparado com TW, talvez pela redução da inflamação, com o fortalecimento do sistema imunológico associado a diminuição dos ROS por meio da glutationa,. 32.

(34) semelhante aos achados de Yoshida,86 que observou os efeitos da glutamina em pacientes com câncer. O FGF-2 induz in vitro e in vivo a proliferação celular em uma variedade de células, incluindo fibroblastos e células endoteliais.82,87,88 Nos rins, sua síntese ocorre em células mesangiais cultivadas83 e podócitos,89, sendo mitogênico e com indícios de uma participação essencial na reorganização do citoesqueleto de actina em ambos os tipos celulares.90 Após o dano das células glomerulares, o FGF-2 é liberado e atua sinergicamente com outros compostos mitogênicos para estimular a proliferação celular.91,92,93 Assim como no trabalho de Randles94 no qual o aumento da sinalização de FGF-2 apresentou um papel patológico no glomérulo, nossos achados também indicam danos renais por aumento do FGF-2 no grupo TW, o que poderia ser justificado pelo aumento do estresse oxidativo e pela inflamação característicos da caquexia e, servindo como mediadores no desenvolvimento e progressão da doença renal crônica e suas complicações.95 Nos animais do grupo TWG houve uma diminuição estatisticamente significativa (p<0,001), indicando que a administração teve efeito protetor nos glomérulos desses animais.. 5. CONCLUSÃO Os resultados deste trabalho demonstram que a síndrome de caquexia cancerígena em ratos atinge a morfologia glomerular, gerando hipertrofia glomerular, expansão mesangial, espessamento de membrana basal, oclusão capilar, sinéquia do tufo acoplado à cápsula glomerular, deposição de colágeno, diminuição da densidade numérica dos glomérulos e aumento da expressão de FGF-2. Por outro lado, a suplementação com L-glutamina a 2% teve efeito benéfico na morfologia glomerular de ratos, diminuindo no grupo tratado as alterações glomerulares observadas na síndrome de caquexia, ou seja, teve efeito protetor nos glomérulos renais, consequentemente, diminuindo os danos renais nesses animais. Desta forma, pelo menos neste estudo, a administração de L-glutamina provavelmente reduziu o estresse oxidativo e a inflação decorrentes do câncer, potencializando a via redox da glutationa.. 6. REFERÊNCIAS 1. Kligerman, J. O Câncer como um Indicador de Saúde no Brasil. Revista Brasileira de Cancerologia. 1999; 45:3.. 33.

(35) 2. World Health Organization. Global health observatory data repository. 2011.. Number. of. deaths. (World). by. cause.. Available. from:. http://apps.who.int/gho/data/node.main. CODWORLD? Acesso em 12 maio 2016. 3. Ferlay, Jacques et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International journal of cancer. 2015;136:359-386. 4. Hanahan, D; Weinberg, Robert A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011; 144:646-674. 5. Reuter, S, et al. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked?. Free Radical Biology and Medicine. 2010;49:1603-1616. 6. Argiles, JM, Lopez-Soriano, FJ, Busquets, S. Counteracting inflammation: a promising therapy in cachexia. Critical Reviews™ in Oncogenesis. 2012;17:3. 7. Suzuki, H, et al. Cancer cachexia—pathophysiology and management. Journal of gastroenterology. 2013;48:574-594. 8. Aoyagi, T, et al. Cancer cachexia, mechanism and treatment. World journal of gastrointestinal oncology. 2015;7:17. 9. Vanderveen, BN, Fix, DK, Carson, JA. Disrupted skeletal muscle mitochondrial dynamics, mitophagy, and biogenesis during cancer cachexia: a role for inflammation. Oxidative medicine and cellular longevity. 2017; 2017. 10. Trobec, K, et al. Pharmacokinetics of drugs in cachectic patients: a systematic review. PLoS One. 2013;8:79603. 11. Zimmers, TA, Fishel, ML, Bonetto, A. STAT3 in the systemic inflammation of cancer cachexia. In: Seminars in cell & developmental biology. Academic Press, 2016;54:28-41. 12. Asp, ML, et al. Rosiglitazone delayed weight loss and anorexia while attenuating adipose depletion in mice with cancer cachexia. Cancer biology & therapy. 2011;12:957-965. 13. Onesti, JK, Guttridge, DC. Inflammation based regulation of cancer cachexia. BioMed research international. 2014:2014.. 34.

(36) 14. Tsoli, M, et al. Depletion of white adipose tissue in cancer cachexia syndrome is associated with inflammatory signaling and disrupted circadian regulation. PLoS One. 2014;9:92966. 15. Muscaritoli, M, et al. Consensus definition of sarcopenia, cachexia and pre-cachexia: joint document elaborated by Special Interest Groups (SIG) “cachexia-anorexia in chronic wasting diseases” and “nutrition in geriatrics”. Clin Nutr. 2010;29:154-159. 16. Tan, BHL; Fearon, KCH. Cytokine gene polymorphisms and susceptibility to cachexia. Current opinion in supportive and palliative care. 2010;4:243248. 17. Kowata, CH, Benedetti, GV, Travaglia, T, Araújo, EJ. A. Fisiopatologia da caquexia no câncer: uma revisão. Arq. Ciênc. Saúde UNIPAR. 2009;13:267-272. 18. Argilés, JM, et al. Cancer cachexia: understanding the molecular basis. Nature reviews Cancer. 2014;14:754-762. 19. Suzuki,. H,. et. al.. Cancer. cachexia—pathophysiology. and. management. Journal of gastroenterology. 2013;48:574-594. 20. Schcolnik-Cabrera, A, et al. Understanding tumor anabolism and patient catabolism in cancer-associated cachexia. American journal of cancer research. 2017;7:1107. 21. Lima, TM et al. Cachexia induced by Walker 256 tumor growth causes rat lymphocyte death. Cancer Immunology, Immunotherapy. 2005;54:179-186. 22. Freitas, JJS, et al. Walker‐256 tumor growth causes oxidative stress in rat brain. Journal of neurochemistry. 2001;77:655-663. 23. Garcia, EM. Determinação da taxa de peroxidaçao lipídica no tumor de walker256 de ratos suplementados cronicamente com óleo de peixe. 2004;40. 24. Oliveira, AG. Efeitos do tratamento com metformina sobre o desenvolvimento do tumor de walker 256 e o metabolismo proteico muscular em ratos wistar. 2016;82. 25. Viana, LR. Efeitos da suplementação nuricional com leucina no perfil metabolômico sistêmico e do tecido tumoral em ratas portadoras do tumor de walker 256. 2015;60 35.

(37) 26. Garcia, EM. Determinação da taxa de peroxidaçao lipídica no tumor de walker256 de ratos suplementados cronicamente com óleo de peixe. 2004;40. 27. Lima, TM, et al. Cachexia induced by Walker 256 tumor growth causes rat lymphocyte death. Cancer Immunology, Immunotherapy.2005;54:179186. 28. Earle, WR. A study of the Walker rat mammary carcinoma 256, in vivo and in vitro. The American Journal of Cancer. 1935;24:566-612. 29. Moraes, SP, et al. Modelo experimental de tumor de Walker. Acta cir. Bras. 2000;15:237-42. 30. Brown, JL, et al. Mitochondrial degeneration precedes the development of muscle atrophy in progression of cancer cachexia in tumour‐bearing mice. Journal of cachexia, sarcopenia and muscle, 2017;8:926-938. 31. Sullivan-Gunn, MJ, et al. Decreased NADPH oxidase expression and antioxidant activity in cachectic skeletal muscle. Journal of cachexia, sarcopenia and muscle. 2011;2:181-188. 32. Ozbek, E. Induction of oxidative stress in kidney. International journal of nephrology. 2012;2012. 33. Durackova, Z. Some current insights into oxidative stress. Physiological Research. 2010;59:459. 34. Schlöndorff, D, Banas, B. The mesangial cell revisited: no cell is an island. Journal of the American Society of Nephrology. 2009;20:11791187. 35. Bonventre, JV; Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. The Journal of clinical investigation. 2011;121:4210. 36. Fernanda O. Efeitos renais da exposição crônica a nicotina em camundongos com deficiência de klotho. 2015;109. 37. Griffiths, RD. The evidence for glutamine use in the criticallyill. Proceedings of the nutrition society. 2001;60:403-410. 38. Roth, E, et al. Regulative potential of glutamine-relation to glutathione metabolism. Nutrition. 2002;18:217-221. 39. Fürst, P, Alteheld, B, Stehle, P. Why should a single nutrient—glutamine— improve outcome? The remarkable story of glutamine dipeptides. Clinical nutrition supplements. 2004;1:3-15. 36.