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PGIm
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
HUGO BERNARDINO FERREIRA DA SILVA
ASPECTOS QUÍMICOS, CITOTÓXICOS E
IMUNOFARMACOLÓGICOS DO CAVALO MARINHO,
HIPPOCAMPUS REIDI
Salvador, Bahia 2015
HUGO BERNARDINO FERREIRA DA SILVA
ASPECTOS QUÍMICOS, CITOTÓXICOS E
IMUNOFARMACOLÓGICOS DO CAVALO MARINHO,
HIPPOCAMPUS REIDI
Dissertação de mestrado apresentada ao curso de Pós-graduação em Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Imunologia.
Orientadora: Profª. Drª. Camila A. Viana de Figueiredo.
Salvador, Bahia 2015
A minha mãe Simone e aos meus irmãos pelos ensinamentos e esforços realizados para concretização dos meus estudos. A minha querida esposa Elba Ferreira pelo amor e apoio incondicional e constante incentivo nesta jornada.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tomar minha vida em Tuas mãos e guiar os meus passos em caminhos seguros e tranquilos.
A toda minha Família, mãe e irmãos pelo apoio e incentivo em todos os momentos da minha vida, aos meus sogros e meus cunhados pelo carinho e amizade e pelas orações.
Ao meu amor, amiga e companheira Elba por ser minha grande incentivadora desde o princípio, pelo apoio, pela amizade pela convivência e pelo amor e carinho que sempre me dedicou. “Por você e com você que luto pelo futuro”.
À minha orientadora, Profª Dra. Camila Alexandrina de Figueiredo, por sua disponibilidade de orientação e ensinamentos que muito significaram para meu amadurecimento; pela sua compreensão diante das minhas dificuldades e pela amizade. Sempre me lembrarei dela como exemplo de pesquisadora.
À Profª. Drª. Neuza Maria Alcântara-Neves pelas oportunidades, aprendizado e apoio técnico para realização deste trabalho.
À minha Família do IMUNOBIO e LAA pelo acolhimento, companheirismo e colaboração na realização deste trabalho. Em especial ao Dr. Ryan, Tamires e Cintia pelo tempo dedicado na conclusão deste estudo.
A Raimon e Norma, pela amizade, pelos momentos de risos em meio ao desespero e pela parceria forte nessa caminhada, meus experimentos não seriam possíveis sem ajuda de vocês.
À Dra. Marta Machado, pela amizade e incentivo contínuo e por abrir um mundo de oportunidades a minha volta.
Aos meus amigos Anaque, Fabinho, Willian e Gerson pela prestatividade constante, amizade e apoio na realização deste trabalho.
À minha querida Profª Iranete Almeida pelos ensinamentos, incentivos e apoio incondicional na minha trajetória profissional.
Ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia da Universidade Federal da Bahia, na pessoa da coordenadora Silvia Lima Costa, dos professores e dos funcionários em especial a Dilcea, Sônia e Geovani pelo apoio administrativo.
À FAPESB e CAPES, pelo suporte financeiro que viabilizou o desenvolvimento deste projeto. A todos compartilho a alegria de concluir esse trabalho.
Realizaríamos muito mais se as coisas nos
parecessem menos impossíveis
RESUMO
A primeira linha de defesa do organismo a um dano tissular é orquestrado por uma resposta inflamatória. De modo geral, a inflamação compreende uma resposta fisiológica, no entanto, complexa que envolve a interação entre fatores solúveis e celulares, surgindo em qualquer tecido em resposta á uma lesão traumática, infecciosa, pós-isquêmica, tóxica ou autoimune. A terapêutica utilizada para tratar os distúrbios inflamatórios, envolve o uso de anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) e corticoides. No entanto, o uso constante e prolongado desses medicamentos apresentam diversos efeitos colaterais afetando diversos sistemas do organismo. Neste sentido, estudos de bioprospecção tornam-se necessários para compor o arsenal terapêutico contra as desordens inflamatórias. A biodiversidade marinha é uma importante fonte de produtos naturais. Neste estudo destacamos a espécie marinha denominada Hippocampus reidi (H. reidi) sendo um dos produtos naturais mais utilizados para o tratamento de asma e outras desordens inflamatórias em inquérito etnofarmacológico realizado pelo nosso grupo de pesquisa. Mediante o uso popular dessa espécie e que a literatura ainda carece de informações sobre sua propriedade imunofarmacólogica, o objetivo deste estudo foi descrever o perfil químico, citotóxico e o potencial efeito imunofarmacológico do extrato hidroalcoólico do H. reidi. O extrato hidroalcoólico de H. reidi foi
padronizado, utilizando um cromatografo líquido de alta eficiência (CLAE). Em modelo experimental in vitro avaliamos atividade citotóxica em células esplênicas, bem como, o efeito do extrato do H. reidi na produção de citocinas IL-4, IL-5, IL-10 e INF-y, produção de óxido nítrico em cultura de macrófagos peritoneiais, sobre a capacidade de relaxamento do músculo liso da traqueia isolada independente de epitélio de ratos, capacidade em estabilizar a membrana de eritrócitos e avaliação da expressão gênica do fator transcrição NFk-B. Os resultados obtidos demonstram que o extrato do H. reidi não apresentou toxicidade em células esplênicas nas concentrações utilizadas neste estudo avaliando o potencial anti-inflamatório. Foi possível também a identificação de compostos fenólicos no extrato bruto. H. reidi foi capaz de atenuar a produção de citocinas Th2, IL-4 e IL-5 e Th1, INF-y e modular a produção de citocina imunorregulatória IL-10. Reduziu também a produção de óxido nítrico, induziu estabilização da membrana de eritrócitos e inibiu o fator transcripcional NFk-B. Contudo, não apresentou efeito broncodilatador considerável nas concentrações testadas. Dessa forma, nosso estudo revela que extrato hidroalcoólico do H. reidi exibe ação anti-inflamatória em modelos experimentais in vitro, podendo ser um futuro candidato ao isolamento de moléculas a serem mais profundamente estudadas e, no futuro, compor o arsenal terapêutico de desordens inflamatórias.
.
Palavras-chave: Biodiversidade marinha. Hippocampus reidi. Bioprospecção.
ABSTRACT
The body’s first line of defense is orchestrated by an inflammatory response which involves complex interactions between soluble factors and cells, arising in any tissue in response to a traumatic, infectious, post-ischemic injury, toxic or by autoimune mechanisms. The treatment used for inflammatory disorders involves the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDS) and esteroids. However, the constant and prolonged use of these drugs have many side effects which may affect many organs. For this reason, looking for new drugs whithin natural products may be a strategy in order to amplify the therapeutical arsenal against inflammatory disorders in general. Marine biodiversity is an important source of natural products. In this study, we have used the marine specie called Hippocampus reidi (H. reidi) which was one of the most cited natural products used for the treatment of asthma and other inflammatory conditions in an ethnobotanic survey conducted by our group. Considering the popular use of this species and the lack of information in literature about its immunopharmacological property, the aim of this study was to describe the chemical profile and the cytotoxic as well as immunophamacologic potential of the H. reidi hydroalcoholic extract.
Hydroalcoholic extract of H. reidi was standardized using a High Performance Liquid Chromatograph (HPLC). In vitro, we evaluated its cytotoxic activity on spleen cells, as well as the effect of H.reidi on the production of 4, 5,
IL-10 and IFN-y, nitric oxide production in macrophage culture, the capacity of the relaxation of smooth muscle on isolated rat trachea, the stabilizing capacity of
H. reidi on membranes of red blood cells and, finally, we evaluated NFk-B gene
expression. Our results shown that the H.reidi extract had no toxicity in spleen
cells at the concentrations used in this study evaluating the anti-inflammatory potential.It was also possible to identify phenolic compounds in the crude extract. H.reidi was able to attenuate the production of Th2 cytokines, IL-4 and
IL-5 and Th1, IFN-y production and modulate the immunoregulatory cytokine, IL-10.Also we observed a reduction on nitric oxide production by the extract as well as a stabilization of erythrocyte membrane in addition to the inhibition of the transcriptional fator, NFk-B.However, no significant bronchodilator effect at the concentrations tested was observed.Thus, our study reveals that hydroalcoholic extract of H.reidi exhibits anti-inflammatory action in vitro and
may be a candidate for molecules isolation to be further studied and, in a perspective of being in a near future, part of the therapeutical arsenal of inflammatory disorders.
.
Keywords: Marine biodiversity. Hippocampus reidi. Bioprospecting.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Hippocampus reidi desidratado ... 25 Figura 2: Processo com múltiplas etapas da migração dos leucócitos dos
vasos sanguíneos ... 31
Figura 3: Preparo do extrato hidroalcoólico do Hippocampus reidi ... 45
Figura 4: Cromatograma obtido por CLAE-DAD do extrato hidroalcoólico do cavalo marinho H. reidi ... 54
Figura 5: Avaliação de citotoxidade do extrato hidroalcoólico do H. reidi em cultura de esplenócitos de camundongos ... 55
Figura 6: Efeito do tratamento do extrato hidroalcoólico do H. reidi sobre a produção de IL-4 em cultura de esplenócitos de camundongos ... 56
Figura 7: Efeito do tratamento do extrato hidroalcoólico do H. reidi sobre a produção de IL-5 em cultura de esplenócitos de camundongos ... 56
Figura 8: Efeito do tratamento do extrato hidroalcoólico do H. reidi sobre a produção de INF-y em cultura de esplenócitos de camundongos ... 57
Figura 9: Efeito do tratamento do extrato hidroalcoólico do H. reidi sobre a produção de IL-10 em cultura de esplenócitos de camundongos ... 57
Figura 10: Efeito do tratamento do extrato hidroalcoólico do H. reidi sobre a produção de óxido nítrico em cultura de macrófagos peritoneais... 58
Figura 11: Efeito do tratamento do extrato hidroalcoólico do H. reidi sobre a
musculatura lisa das vias aéreas, em traqueias isoladas de ratos wistar, sem epitélio e pré-contraídas com carbacol ... 59
Figura 12: Percentagens de estabilização da membrana por diferentes
concentrações do extrato do H. reidi (125, 62 e 31 μg/ml) ... 60
Figura 13: Efeito do tratamento do extrato hidroalcoólico do H. reidi sobre a
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Exemplos de desordens inflamatórias ... 29
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA Ácido araquidônico
AAS Ácido acetilsalicílico
AbsA Absorbância da amostra
AbsC Absorbância do controle
ADS Sistema de aquisição de dados
AIEs Corticóides
AINES Anti-inflamatórios não esteroidais
Ara-A Vidarabina
Ara-C Citarabina
Biomar Biodiversidade Marinha BK Bradicinina
C3a Fragmentos do sistema complemento
C5a Fragmentos do sistema complemento
CCh Contração tônica submáxima ao carbacol
CEUA Comissão de Ética para o Uso de Animais
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CO2 Dióxido de carbono
COX- Cicloxigenase
CTRL Controle
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico ELAM-1 E-selectina
ELISA Ensaio de imunoadsorção ligado a enzima
Emax percentagem do relaxamento máximo
g Gramas
H. reidi Hippocampus reidi
H2O Fórmula química da água
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
ICAM-1 Molécula de adesão intracelular-1 IgE Imunoglobulina E
IkB Proteína inibitória da kappa B
IL- Interleucina
INF-y Interferon-gama
iNOS Óxido nítrico-sintase induzida
KCl Cloreto de potássio
Km Quilômetros
LPS Lipopolissacarídeo
MAPK Proteína cinase ativada por mitógeno
MAPK Proteína-quinases ativadas por mitógenos
mg Miligramas
MgCl2 Cloreto de magnésio
mL Mililitros
mm Milímetros
MMA Ministério do Meio Ambiente
MTT Sal brometo de TETRAZÓLIO
MyD88 Fator de diferenciação mielóide 88
µg Microgramas
µl Microlitros
NFk-B Fator de transcrição nuclear kappa B
ng Nanogramas
nM Nanomolar
NO Óxido Nítrico
O2 Oxigênio
p50 Subunidade do Fator de transcrição nuclear kappa B
p65 Subunidade do Fator de transcrição nuclear kappa B
PAF Fator ativador de plaquetas
pg Pico gramas
PGs Prostaglandinas
PWM Pokeweed
Re1A Subunidade do Fator de transcrição nuclear kappa B
RNA Ácido ribonucléico
RPM Rotações por minuto
RPMI Meio de cultura celular
RT-PCR Reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa
SBF Soro fetal bovino
SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade SUS Sistema Único de Saúde
Th1 Linfócitos T auxiliar tipo 1
Th2 Linfócitos T auxiliar tipo 2
TNF Fator de necrose tumoral
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UI Unidades
VCAM-1 Molécula de adesão vascular celular-1
o
C Graus Celsius
SUMÁRIO
I – INTRODUÇÃO ... 15
1. INTRODUÇÃO ... 16
II – REVISÃO DA LITERATURA ... 18
2. REVISÃO DA LITERATURA ... 19
2.1 Biodiversidade e Bioprospecção de novos fármacos ... 19
2.2 Biodiversidade marinha ... 22
2.3 Cavalo Marinho – Hippocampus reidi ... 24
2.4 Inflamação ... 27
2.5 Eventos vasculares e celulares envolvidos na resposta inflamatória ... 29
2.6 Mediadores químicos envolvidos na inflamação ... 31
2.7 Terapia anti-inflamatória ... 37 III – OBJETIVOS ... 40 3. OBJETIVOS ... 41 3.1 Objetivo Geral ... 41 3.2 Objetivos Específicos ... 41 IV – METODOLOGIA ... 42 4. METODOLOGIA ... 43 4.1 Considerações Éticas ... 43 4.2 Animais ... 43
4.3 Obtenção do H. Reidi e preparo do extrato hidroalcoólico de H. Reidi ... 43
4.4 Avaliação do potencial citotóxico e proliferativo do H. Reidi in vitro ... 44
4.5 Produção de citocinas in vitro em cultura de células esplênicas ... 46
4.6 Determinação da produção de óxido nítrico (NO) em macrófagos peritoneais ... 47
4.7 Investigação do potencial broncodilatador do extrato hidroalcoólico do H. Reidi ... 48
4.8 Teste de estabilidade da membrana ... 49
4.9 Avaliação do fator transcripcional NFk-B por RT-PCR ... 50
4.10 Análise estatística ... 52
V – RESULTADOS ... 49
5.1 Extrato hidroalcoólico do H. Reidi apresenta compostos fenólicos ... 54
5.2 Perfil de citotoxidade do extrato hidroalcoólico do Hippocampus reidi (H. reidi) em esplenócitos de camundongos ... 55
5.3 Efeito do extrato hidroalcoólico do H. reidi sobre a produção de citocinas IL-4, IL-5, IL-10 e INF-Y em cultura de esplenócitos ... 56 5.4 Extrato hidroalcoólico de H. reidi reduz os níveis de óxido nítrico em cultura de macrófagos peritoneais ... 58
5.5 Efeito do extrato hidroalcoólico do H. reidi sobre a musculatura lisa das vias aéreas de ratos ... 59 5.6 Efeito do extrato hidroalcoólico do H. reidi na estabilização da membrana... 60
5.7 Tratamento com extrato hidroalcoólico do H. reidi atenua a expressão de NF-kB em cultura de esplenócitos ... 61 VI – DISCUSSÃO ... 62 6. DISCUSSÃO ... 63 VII – CONCLUSÕES ... 67 7. CONCLUSÕES ... 68 VII – REFERÊNCIAS ... 69 8. REFERÊNCIAS ... 70
1.1 INTRODUÇÃO
Os produtos naturais têm sido considerados a maior fonte de inspiração para diversas áreas da química e da biologia de um modo geral. E através da síntese das moléculas existentes nos seres vivos, o homem tem obtido inovações para o seu beneficio em diversas áreas, dentre elas, a produção de novos fármacos. Neste sentido os produtos de origem marinha tem se destacado na área de bioprospecção, e o Comitê Executivo para Levantamento e Avaliação do Potencial Biotecnológico da Biodiversidade Marinha (Biomar), no seu Plano Nacional de Trabalho (PNT-Biomar) estabelece como uma das áreas a serem priorizadas o desenvolvimento de fármacos, a partir de produtos marinhos. Para isto, faz-se necessário um maior conhecimento da quimiotaxonomia dos organismos marinhos ao nosso alcance, o isolamento de moléculas derivadas de desses produtos naturais e a avaliação de sua atividade biológica (HUNT & VINCENT, 2006).
Reconhecendo o importante papel dos produtos naturais de origem marinha no
contexto apresentado acima, destacamos a espécie Hippocampus reidi
popularmente conhecido por cavalo marinho. O interesse por esta espécie marinha se deu pelo fato da mesma ter sido citada em um inquérito etnofarmacológico realizado por nosso grupo para o tratamento de asma e outras desordens inflamatórias realizado na Baía de Todos os Santos, a segunda maior baía costeira do Brasil localizada nas proximidades da cidade de Salvador (Bernardino et al – submetido). Estudos recentes indicam que o cavalo marinho apresenta atividade anti-inflamatória via inibição de mediadores inflamatórios como óxido nítrico-sintase induzida (iNOS) e ciclo-oxigenase-2 (COX2) através das vias de bloqueio como o fator nuclear kappa B (NFK-B) (B. RYU ET AL, 2009).
Diariamente no Brasil, milhares de unidades de cavalos marinhos são vendidos em feiras livres, sua comercialização envolve a coleta de animais vivos para fins de aquarismo e a venda de animais secos como peças de artesanatos e como instrumentos terapêuticos para tratar diversas doenças, tais como,
gastrite, asma, impotência sexual e artrite (ROSA et al. 2002, ROSA et al.
2005). A coleta inconsciente desses animais torna o cavalo marinho uma das espécies ameaçadas de extinção, de modo que pesquisas na área de
bioprospecção objetiva obter mais informações acerca dos seus aspectos químicos, citotóxicos e farmacológicos, favorecendo assim o uso racional dessa espécie.
A primeira defesa do organismo a um dano tecidual é a resposta inflamatória. De modo geral, os processos inflamatórios compreendem em uma resposta complexa que envolve componentes vasculares, celulares e uma ampla gama de diversidade de substâncias solúveis, apresentando como sinais clínicos característicos o rubor, calor, edema, dor e prejuízo funcional. A finalidade do processo inflamatório é remover o estímulo lesivo e iniciar a recuperação tecidual local (COTRAN et al., 2006). Contudo, apesar de ser um processo de extrema necessidade, poderá em determinadas circunstâncias se exacerbar, causando dano tissular e doença. Atualmente, um número elevado de doenças decorrentes de processos inflamatórios sejam agudos ou crônicos representam um problema global de saúde pública, acarretando gastos desnecessários e impactos na qualidade de vida dos indivíduos.
A terapia existente para tratar os distúrbios inflamatórios, envolve o uso de anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) e corticoides. No entanto o uso constante e prolongado desses medicamentos acarreta em prejuízos para saúde do individuo, uma vez que os efeitos colaterais são muitos e afetam, paralelamente, diversos sistemas do organismo humano (STEAGALL et al., 2009).
Em virtude da utilização empírica da espécie marinha H. reidi, utilizada como um agente natural na medicina popular para o tratamento de diversas doenças inflamatórias e que a literatura ainda carece de informações acerca de suas atividades biológicas, torna-se essencial pesquisas de bioprospecção da espécie supracitada almejando identificar um candidato ideal com potencial terapêutico e fonte para a descoberta e desenvolvimento de novos compostos de valor medicinal, passível de reações de síntese prevenindo assim o uso da espécie animal a partir de seu habitat. Neste trabalho, pretendemos realizar uma triagem imunofarmacológica in vitro realizada após a caracterização e descrição de perfil citotóxico do extrato hidroalcoólico de H. reidi, constituindo-se uma análiconstituindo-se inicial acerca do potencial imunofarmacológico desta espécie.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 BIODIVERSIDADE E BIOPROSPECÇÃO DE NOVOS FÁRMACOS
Um dos modos de se extrair valores econômicos da biodiversidade brasileira é através da bioprospecção, termo esse que, academicamente, pode ser compreendido como a busca ordenada por organismos, enzimas, genes, compostos e partes provenientes de seres vivos, que tenham potencial econômico e, eventualmente, levam ao desenvolvimento de um novo produto para uso geral (SACCARO JÚNIOR, 2011).
Segundo o inciso VII do artigo da Medida Provisória n.º 2.186-16/2001, bioprospecção é qualquer atividade que visa identificar
componente do Patrimônio Genético e informação sobre
Conhecimento Tradicional Associado, com potencial de uso comercial.
Neste sentido, o Brasil é detentor de uma rica biodiversidade e de conhecimentos populares tradicionais, no entanto, apesar do Brasil possuir essa grande diversidade, somente uma pequena parcela destas espécies têm sido pesquisadas cientificamente quanto ao seu potencial econômico que possam levar ao desenvolvimento de um produto.
É de suma importância estudos na área de bioprospecção, pois pesquisas nessa área é relevante para uma ampla gama de setores, incluindo biotecnologia, agricultura, indústria farmacêutica e de cosméticos, neste sentido, a bioprospecção torna-se um alvo coletivo que chamamos de recursos genéticos (SACCARO JÚNIOR, 2011).
É de conhecimento geral que, em nosso país, há tempos, observa-se o uso de produtos naturais na medicina popular e nas últimas décadas, o uso de fitoterápicos no Sistema Único de Saúde (SUS) tem sido uma alternativa na redução de gastos públicos com medicamentos, incorporando com seu baixo custo operacional, ainda convém lembrar a facilidade de acesso aos
organismos vivos no Brasil e a integração com a cultura e o saber popular (VELOSO & LARROSA, 2012).
Ao examinar alguns artigos, verifica-se que nos últimos anos, houve um aumento expressivo no mercado mundial de fitoterápicos, com uma atenção especial para os países industrializados, cujo mercado mundial atinge mais de US$ 20 bilhões anuais, sendo que os países europeus, asiáticos e os Estados Unidos, possuem os principais mercados consumidores desses fitoterápicos (CALIXTO, 2000; GRÜNWALD, 1995). Em 2001, o mercado de fitoterápicos no Brasil foi superior do que a comercialização dos medicamentos genéricos, atingido cerca de US$ 270 milhões o que corresponde a 5.9% do mercado brasileiro de medicamentos (CALIXTO, 2003).
Quando o assunto é biodiversidade, o Brasil sai na frente quando comparados com outras nações do mundo. Estima-se que 20% do número total de espécies existentes no planeta estão concentradas no Brasil. Devido a esse imenso patrimônio genético, já escasso nos demais países, o Brasil apresenta um enorme valor estratégico na economia nas mais diversas áreas como já mencionadas anteriormente. No entanto, é na área do desenvolvimento de novos fármacos onde reside sua maior potencialidade, a razão dessa afirmação é facilmente comprovada quando se analisa o número de medicamentos obtidos direta ou indiretamente a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2003).
A produção de novos fármacos a partir de produtos naturais é de extrema importância, devido tanto á sua relação com a saúde e o bem-estar do homem, quanto com a economia envolvida. O mercado farmacêutico movimentou em 2008 mais de US$ 700 bilhões e estima-se que em 2015 esse valor atinja US$ 1,1 trilhão. Neste sentido, o papel da bioprospecção nesse setor é fundamental, pois cerca de 50% dos fármacos atuais foram desenvolvidos a partir de fontes naturais (IMS, 2010). Quando analisamos as drogas desenvolvidas para tratamento de câncer e os antibióticos, essa proporção aumenta de forma significativa, chegando aos 70% (UNUIAS, 2005).
Além disso, é importante trazer para este contexto que a terapêutica existente atualmente, composta por medicamentos com ações específicas sobre receptores, enzimas e canais iônicos, que não teria sido possível sem a
contribuição dos produtos naturais, pois é graças às toxinas e substâncias extraídas de plantas, animais, bactérias, de fungos ou plantas que pesquisadores das mais diversas áreas puderam compreender os fenômenos complexos relacionados á biologia celular, molecular e á eletrofisiologia, permitindo assim que enzimas, receptores, canais iônicos e outras estruturas biológicas fossem identificados, isolados e sintetizados, possibilitando que industrias farmacêuticas formulassem drogas dotadas de maior seletividade e mais eficazes contra as mais diversas doenças (CALIXTO, 2003).
Existem, todavia, problemas que dificultam pesquisas na área de bioprospecção para o desenvolvimento de novos medicamentos. O que inclui: 1) falta de leis específicas para o acesso a biodiversidade; 2) grande complexidade das moléculas isoladas a partir de produtos naturais, que às vezes dificulta sua síntese; 3) o tempo necessário para o descobrimento de moléculas líderes às vezes é longo; 4) a descoberta pode ser onerosa; 5) poucas bibliotecas de compostos naturais estão disponíveis; 6) existem poucas informações na literatura com relação à estrutura-atividade desses compostos; 7) frequentemente, moléculas já conhecidas com pouco interesse, são isoladas de produtos naturais; 8) os químicos sintéticos muitas vezes são relutantes em trabalhar com produtos naturais (CALIXTO, 2003; SHU, 1998).
Sabe-se que, atualmente, existem diversas estratégias e metodologias disponíveis para a síntese e descobrimento de novos fármacos, neste sentido, a química presente nos produtos biológicos torna-se uma importante ferramenta. Como por exemplo, podemos citar o veneno da jararaca, na qual os princípios ativos relacionados ao controle da pressão arterial foram isolados, a fim de se produzir um anti-hipertensivo. Pode-se mencionar também como exemplo clássico de fármacos produzidos a partir de produtos naturais, a penicilina, o primeiro antibiótico, descoberto por Alexandre Fleming proveniente de fungos. O anti-inflamatório de uso tópico Acheflan, indicado para quadros inflamatórios dolorosos associados a traumas de membros, entorses e contusões, produzido pelo Laboratório Aché em 2004, sendo uma inovação brasileira obtida do Cordia verbenacea, um arbusto nativo da Mata Atlântica (BARREIRO, 2009; SACCARO JÚNIOR, 2011). Considerando a grande quantidade de fármacos desenvolvidos a partir de moléculas biológicas, torna-se evidente o papel da bioprospecção no torna-setor farmacêutico.
2.2. BIODIVERSIDADE MARINHA
A biodiversidade é, enquanto riqueza (quantidade) de espécies, o resultado de um processo evolutivo de variabilidade genética dos organismos vivos de todas as origens, compreendendo, dentre outros, os ecossistemas terrestres, marinhos e outros ecossistemas aquáticos, de modo que a perda da biodiversidade constitui fenômeno irrecuperável, uma vez que a perda de genoma, que é único de cada espécie, significaria um detrimento do processo evolutivo das espécies (JOLY et al., 2011; LANA, JUL.-DEZ. 2003).
Com relação à biodiversidade marinha sabe-se que oceanos e rios representam mais de 2/3 da superfície terrestre e abrigam a maioria dos organismos vivos, incluindo representantes de 34 dentre os 36 filos descritos na literatura, desta forma, os ecossistemas marinhos podem ser considerados como detentores de produtos naturais com estruturas únicas responsáveis por diversas funções ecológicas (PROKSCH et al, 2002; COSTA-LOTUFO, L. V. et al 2009). Deste modo, toma-se o conhecimento que muitos dos compostos marinhos além de apresentarem importância para a manutenção das comunidades marinhas nos diferentes habitats, poderão servir como fonte de estruturas para a descoberta de novos protótipos candidatos a fármacos no tratamento de diversas doenças, como fármacos antitumorais, antivirais e antiinflamatórios (YASUHARA-BELL, et al., 2010; ABRANTES, et al., 2010; HARDEN, et al., 2009; BHATNAGAR, et al., 2010; LIN, et al., 2010; FOLMER, et al., 2010; DELLAI, et al., 2010).
Ao fazer uma análise do contexto histórico desse ecossistema, é possível notar que durante décadas seu estudo escapou do interesse dos pesquisadores de produtos naturais, em virtude do difícil acesso as profundidades. Só na década de 70 com o avanço de técnicas e com o advento de equipamentos seguros de mergulho, que as algas e invertebrados marinhos marcaram presença nas bancadas dos laboratórios de química e farmacologia. Entretanto, é válido destacar que os produtos naturais de origem marinha começaram a ser explorados no tocante a suas atividades biológicas de forma sistemática relativamente recente se comparados aos produtos naturais de origem terrestre pode-se mencionar, por exemplo, que quase a metade (45%) dos produtos
naturais oriundos de micro-organismos marinhos foi isolada após o ano 2000, de modo geral cerca de 10.000 produtos naturais marinhos foram descobertos, muitos com atividade farmacológica, incluindo acetogeninas, policetídeos, terpenos, alcalóides, peptídeos e metabólitos de origem biossintética mista (COSTA-LOTUFO, L. V. et al 2009; PINTO et al 2002).
Estudos na área de biotecnologia marinha vêm sendo estimulado cada vez mais no Brasil, e o Comitê Executivo para Levantamento e Avaliação do Potencial Biotecnológico da Biodiversidade Marinha (Biomar), no seu Plano Nacional de Trabalho (PNT-Biomar) estabelece como uma das áreas a serem priorizados o desenvolvimento de fármacos, medicamentos e kits diagnósticos a partir de produtos marinhos. Para isto, faz-se necessário um maior conhecimento da quimiotaxonomia dos organismos marinhos ao nosso alcance, o isolamento de moléculas derivadas desses produtos naturais e a avaliação de sua atividade biológica (HUNT & VINCENT, 2006).
Acredita-se que de forma análoga ao que aconteceu com os produtos naturais de origem terrestre que, direta ou indiretamente, através de modificação molecular ou semi-síntese representam uma parcela significativa de todo o arsenal terapêutico disponível, os produtos de origem marinha já representam uma promissora fonte de substâncias com finalidades terapêuticas, com alguns produtos já aprovados para uso humano com atividade analgésica e antitumoral, por exemplo, centenas de substâncias em fases variadas de ensaios clínicos (SCHWARTSMANN et al., 2003). Dentre estas, destacam-se: a) Ara-C (Citarabina) e Ara-A (Vidarabina) dois potentes antitumorais; b) a Ecteinascidina - extraída dos tunicados, está sendo testada em humanos para o tratamento do câncer de mama e de ovário e de outros tumores sólidos; c) Topsentina - anti-inflamatório extraído das esponjas
Topsentia genitrix, Hexadella sp. e Spongosorites sp; d) Lasonolide - agente
tumoral extraído da esponja Forcepia sp; e) Discodermolide - agente anti-tumoral extraído das esponjas abissais pertencentes ao gênero Discodermia; f) Briostatina - extraída do briozoário Bugula neritina, apresenta potencial terapêutico para a leucemia e o melanoma; g) Pseudopterosinas - agentes antiinflamatórios e analgésicos extraídos do octocoral (chicote-do-mar)
Pseudopterogorgia elisabethae que reduzem o inchaço e irritação da pele e
COSTA-LOTUFO et al 2009). Destaca-se ainda o peptídeo conotoxina MVIIA (Ziconotide®), isolado do caracol marinho Conus magus que foi o primeiro fármaco de origem marinha liberado pelo FDA, em 2004, para o tratamento da dor crônica severa (BARREIRO & BOLSANI, 2009).
2.3 CAVALO MARINHO – HIPPOCAMPUS REIDI
O cavalo-marinho, Hippocampus reidi (H. reidi), é um peixe ósseo de corpo estreito e focinho longo (figura 1), pertencente à família Syngnathidae, que habita nas águas litorâneas e estuarinas, de norte a sul do Brasil. O cavalo-marinho é um peixe de hábitos carnívoros, alimenta-se de presas vivas e a despeito de seu lento deslocamento, é um excelente caçador. O modo de alimentação é através de sucção; uma rápida expansão do opérculo cria uma pressão negativa que suga a presa para dentro do focinho (SILVEIRA, 2005; ROSA 2005).
Revisões recentes realizadas por diversos autores mostram que os cavalos marinhos são encontrados em águas costeiras, tropicais e temperadas (PERANTE et al., 2002; LOURIE et al., 2004).
No Brasil, vivem apenas duas espécies de cavalos marinhos, sendo elas
Hippocampus erectus Perry, 1810 e Hippocampus reidi Ginsburg, 1933, sendo
esta última a mais abundante no Brasil (ROSA et al., 2002). Entretanto, em 2004, ambas as espécies entraram para a lista das espécies de peixes e invertebrados aquáticos ameaçadas de extinção, sobreexplotadas ou ameaçadas de sobreexplotação, organizada pelo Ministério do Meio Ambiente (MMA). Considerando que a utilização empírica da zooterapia (uso de animais e seus produtos na cura de doenças) dos produtos naturais marinhos, como prática presente nas culturas humanas (MARQUES, 1994) torna-se essencial o estudo dessa espécie para a descrição de seu potencial efeito farmacológico e para também garantir a preservação e seu uso de forma sustentável.
Algumas peculiaridades biológicas dos cavalos-marinhos como a restrita capacidade de deslocamento, a baixa taxa reprodutiva e o cuidado parental
prolongado tornam os de cavalos-marinhos particularmente vulneráveis à sobreexploração (LOURIE et al., 1999, 2004).
De modo geral os cavalos marinhos formam casais monogâmicos. Neste caso, se um dos parceiros morre, o parceiro remanescente pode demorar algum tempo para encontrar um novo parceiro. O fato de serem os únicos animais de toda biodiversidade em que o macho carrega os filhotes na barriga até o nascimento, além do mais possuem um avançado cuidado parental no desenvolvimento dos embriões, de modo que a fêmea deposita os ovos em bolsas dos machos, permitindo assim a fertilização e o cuidado dos embriões até o seu total desenvolvimento quando são liberados (Woods, 2005b; CARLOS, 2010).
O ciclo reprodutivo dos cavalos marinhos se dá ao longo de todo ano, sendo registrados picos reprodutivos desta espécie nos meses de outubro a fevereiro (ROSA et al., 2007). Os ovos de H. reidi medem cerca de 1,5 mm a 2,0 mm, o período de incubação é de 14 dias, a uma temperatura de 25 ºC (SILVEIRA, 2001; NETO, 2011).
No que tange ao interesse pela espécie estudada neste trabalho, esta foi uma das espécies de invertebrados marinhos mais citados para o tratamento de asma em um inquérito etnofarmacológico realizado pelo nosso grupo na Baía
de Todos os Santos (Bernardino et al – submetido), a segunda maior baía costeira do Brasil (área máxima de 1223 km2 e profundidade média de 9,8 m) localizada nas proximidades da cidade de São Francisco do Conde, Bahia, População de 33,172 habitantes de acordo (Censo 2010) com o Instituto de Geografia e Estatísticas (IBGE) (CIRANO & LESSA, 2007; IBGE, 2010).
O cavalo marinho como descrito anteriormente, foi citado pelos entrevistados para o tratamento da asma. Na medicina popular utiliza-se um chá do pó do cavalo marinho, preparado a partir do seu corpo torrado e moído. No Brasil, os cavalos-marinhos são comercializados em vários pontos da costa e até em localidades interioranas (ROSA et al. 2005). Seu comércio envolve desde a coleta de animais vivos para fins de aquarismo até a venda de animais secos, que são comercializados para diversas finalidades (ROSA et al. 2002, ROSA et al. 2005). Embora não exista nenhum registro médico de que esses peixes possuam propriedades curativas, acredita-se que possuam um papel curativo sobre doenças como a asma, artrite, bócio, impotência, distúrbios renais e várias enfermidades da pele (VINCENT, 1996). No Brasil, seu uso terapêutico foi introduzido pelos africanos em alguns locais da Bahia a partir da confecção de chá com o pó torrado do animal para tratar gastrite, gripe e asma (ALVES & ROSA, 2006). Ryu et al. (2010) apresentam em seus estudos os efeitos benéficos de peptídeos isolados do cavalo marinho, Hippocampus kuda em osteoblastos e condrócitos humanos, no qual foi possível constatar a inibição da produção de mediadores inflamatórios como óxido nítrico-sintase induzida (iNOS) e ciclo-oxigenase-2 (COX2) através das vias de bloqueio como o fator nuclear kappa B (NFK-B) e pela via da proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK), propondo assim que peptídeos isolados do cavalo marinho possam ser agentes terapeuticamente eficazes na modulação e diferenciação na resposta inflamatória em modelo de artrite.
Corroborando com os resultados supracitados Ryu et al. (2012) propuseram que o peptídeo isolado do cavalo marinho nomeado SHP-1 foi capaz de inibir a liberação de colágeno, sugerindo assim que SHP-1 apresenta um potencial terapêutico nas doenças inflamatórias das articulações. Van Toan & Hanh (2013) demonstraram que extrato de cavalo marinho da espécie Hippocampus
kudda apresenta atividade antioxidante e antiasmática. Como já relatado
inquérito etnofarmacológico realizado na cidade de São Francisco do Conde (Bernardino et al, submetido), como tratamento alternativo no controle da asma e outras desordens inflamatórias. Em virtude do que foi mencionado, nota-se que a literatura ainda carece de informações acerca de estudos de bioprospecção de H. reidi. No presente estudo apresentaremos dados que demonstram o potencial farmacológico do H. reidi em modelos in vitro. Tendo em vista o uso popular da espécie marinha H. reidi, utilizada como um agente natural na medicina popular para o tratamento de diversas desordens inflamatórias, torna-se essencial o estudo de bioprospecção desse produto para descrição de seu potencial efeito farmacológico e para também garantir a preservação e seu uso de forma sustentável.
2.4 INFLAMAÇÃO
O termo inflamação ou flogose, do grego phlogosis do latim flamma, que significa fogo, área em chamas, consiste em uma resposta fisiológica do organismo humano diante de uma infecção, exposição a toxinas ou lesão tecidual, envolvendo uma resposta coordenada entre o tecido afetado e o sistema imunológico. De modo geral, esse processo pode ser encarado como um mecanismo protetor, objetivando realizar os processos de reparação do tecido lesado. No entanto, apesar de ser um processo extremamente necessário, poderá em determinadas ocasiões se exacerbar, causando dano tecidual e doença. Deste modo, o termo inflamação é utilizado para designar as mudanças que podem ocorrer nos tecidos vascularizados, como respostas a danos teciduais, infecções ou reações imunológicas (COTRAN et al., 2006; GILMAN et al., 2006; SPINOSA et al., 2006; ABBAS, 2008).
As características clinicas envolvidas em toda resposta inflamatória foram encontradas em papiros egípcios a aproximadamente 3000 a.C. no entanto foi Celsius um escritor romano do século I d.C. que primeiro descreveu os quatro sinais cardinais da inflamação (tumor, calor, rubor e dor), caracterizando o aumento no fluxo sanguíneo e a dilatação dos vasos como rubor, a permeabilidade aumentada como tumor, que consequentemente acarretaria no aumento da temperatura local chamado calor e a passagem de células
circulantes e substancias algésicas de dor (SILVA; LEME, 2006). Posteriormente Rudolf Virchow, considerado o pai da patologia moderna, adicionou o quinto sinal cardinal da inflamação, a perda da função.
De modo geral, a resposta inflamatória pode ser dividida em dois tipos, aguda e crônica, tal divisão baseia-se na duração da resposta e nas características patológicas envolvidas na resposta. A fase aguda caracteriza-se pela curta duração (horas a dias) e pelos eventos vasculares, observando-se a vasodilatação local e o aumento da permeabilidade vascular iniciando uma cascata de citocinas e quimiocinas que atraem células imunes e não-imunes, principalmente neutrófilos para o sítio da lesão (LEES et al., 2004; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Quando a inflamação aguda é bem-sucedida na eliminação dos agentes agressores, a reação reduz-se, porém se a resposta aguda não for suficiente para eliminar os agentes invasores, ela irá progredir para a fase crônica, esta, porém, perdura por um período indeterminado, envolvendo o recrutamento de macrófagos, linfócitos e plasmócitos em adição aos neutrófilos e existe degeneração tecidual e reparação do tecido com formação de fibrose, simultaneamente (PHILIP et al., 2004).
A resposta inflamatória é findada quando o agente agressor é eliminado do organismo, de modo que a reação se resolve de forma rápida, porque os mediadores são esgotados e dissipados e os leucócitos possuem meia vida curta nos tecidos. No mais, os mecanismos são ativados e servem para controlar a reposta e preveni-la de causar dano excessivo ao hospedeiro (COTRAN et al., 2006).
O número de doenças consideradas inflamatórias na sua origem abrangem diversas doenças conforme apresentada na Tabela 1, representando assim um problema global de saúde pública, de modo que doenças inflamatórias, frequentemente, provocam impactos sobre a qualidade de vida e sobre a demanda no Sistema Único de Saúde (SUS).
Tabela 1. Exemplos de desordens inflamatórias Doenças Essencialmente Inflamatórias
Doença de Alzheimer Anafilaxia
Asma
Aterosclerose Dermatite atópica
Doença pulmonar obstrutiva crônica Doença de crohn
Esclerose múltipla Osteoartrite Psoríase
Artrite reumatoide
Lúpus eritematoso sistêmico Diabete mellitus tipo I
Colite ulcerativa Vasculite Gastrite Espondilite anquilosante Gota Tiroidite de Hashimoto Pênfigo
Doenças de origem infecciosa em que a inflamação pode contribuir tanto para patologia assim como para toxicidade microbiana
Doença de Chagas Filariose
Hepatie C
Gastrite por Hilicobacter pylori
Pneumonia Tuberculose
Meningite pneumocócica Hanseníase
Fonte: Adaptada de Nathan. C (2002).
2.5 EVENTOS VASCULARES E CELULARES ENVOLVIDOS NA RESPOSTA INFLAMATÓRIA
Em situações de homeostase do organismo, normalmente as proteínas plasmáticas e as células circulantes estão contidas no interior dos vasos. Porém, diante de uma reação inflamatória os vasos sanguíneos sofrem uma série de mudanças que são destinadas a maximizar o movimento das proteínas plasmáticas e células para fora da circulação e para o local da lesão. A fim de restabelecer a homeostase uma resposta vasomotora local é efetuada, esse processo é iniciado pela liberação de catecolaminas e por prostaglandinas secretadas pelas células lesadas. Após esse processo de vasoconstricção há uma transcrição de constrição para dilatação dos vasos, envolvendo primeiramente as arteríolas e posteriormente a abertura de novos leitos capilares na área. A vasodilatação é induzida pela ação de vários mediadores, notavelmente a histamina e o óxido nítrico (NO), no músculo liso vascular (ALLER et al., 2007; COTRAN et al., 2006).
O processo de vasodilatação é rapidamente seguido pela permeabilidade vascular aumentada levando ao escape de exsudato para o interior do tecido extravascular, causando edema. Esse aumento da permeabilidade ocorre por
vários mecanismos. Em parte, ocorre devido à contração das células endoteliais, o que resulta no aumento do espaço intercelular entre estas. Outro mecanismo é resultante de uma injúria endotelial direta dependente de leucócitos ocorrendo em seguida o processo de neoangiogênese. Um papel fundamental da mudança na permeabilidade vascular é facilitar a chegada de células e fatores solúveis, como anticorpos e proteínas de fase aguda, ao sítio da lesão tecidual ((ALLER et al., 2007; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; COTRAN et al., 2006).
Não raro, toma-se o conhecimento que uma função crítica da inflamação é recrutar leucócitos para o sítio da lesão e ativar os leucócitos a fim de eliminar os agentes agressores. A passagem dos leucócitos do interior do vaso para o tecido extravascular é mediada por interações adesivas entre os leucócitos e as células endoteliais (PEREIRA, 2011). A sequência de eventos envolvida neste processo inclui rolamento do leucócito no interior do vaso, ativação, adesão estável e a migração através do endotélio. Inicialmente, acontece a fase de rolamento dos leucócitos através da exposição de seus receptores, L-selectinas, e a interação destes com os receptores P-selectinas das células endoteliais ativadas, promovendo uma fase de adesão fraca com ás células do endotélio, permitindo assim o processo de rolagem. Posteriormente acontece a adesão firme por meio do contato das integrinas presentes nos leucócitos com as imunoglobulinas endoteliais (SILVEIRA & YOSHIDA, 2004; MITCHELL, RN et al., 2006).
Como iniciadoras deste processo, destacam-se as selectinas, dentre elas a P-selectina na qual é uma glicoproteína intracelular presente nas plaquetas e no endotélio, que quando expressa, apresenta ligação principalmente aos neutrófilos, sendo essa ligação normalmente induzida pela IL-1 e Fator de necrose tumoral (TNF). A E-selectina (ELAM-1) que participa tanto no processo de rolagem quanto na adesão dos leucócitos, é responsável pela adesão da maioria dos leucócitos e por último a L-selectina que está presente na maioria dos linfócitos, neutrófilos e monócitos, participando no inicio do processo de adesão dos leucócitos ao endotélio (FRANCISCHETT et al., 2010; MITCHELL, RN et al., 2006).
Em seguida, as integrinas presentes nos leucócitos junto com as imunoglobulinas nas células endoteliais promovem uma adesão forte. As integrinas são proteínas da superfície celular e se ligam as imunoglobulinas e à matriz extracelular, de forma que cada integrina possuem uma cadeia α e β. Por outro lado, as imunoglobulinas estão expressas nas células do endotélio como receptores para as integrinas leucocitárias. Entre os principais receptores para as integrinas β2 destacam-se a molécula de adesão vascular celular -1 (VCAM-1) e a molécula de adesão intracelular-1 (ICAM-1) (BEVILACQUA & NELSON, 1993; MITCHELL, RN et al., 2006; FRANCISCHETT et al., 2010). Após esse processo de adesão forte, os leucócitos migram por diapedese e se dirigem ao local da inflamação guiada pelos fatores quimiotáticos (Figura 2).
Figura 2 – Processo com múltiplas etapas da migração dos leucócitos dos vasos sanguíneos. Primeiro os leucócitos rolam, tornando-se ativados e aderem ao endotélio, então transmigram pelo endotélio, penetrando na membrana basal e posteriormente migrando em direção aos quimioatraentes liberados no local da injúria.
Fonte: Modificado de Robbins & Contran. “Bases Patológicas das Doenças”. Elsevier, 2010.
2.6 MEDIADORES QUÍMICOS ENVOLVIDOS NA INFLAMAÇÃO
A resposta inflamatória é guiada pela presença de mediadores químicos, de forma que cada mediador liberado desempenha uma função específica em
determinada fase da reação inflamatória. Tais mediadores são classificados de acordo com sua origem plasmática advindo das cascatas das cininas, coagulação, fibrinólise e complemento ou de origem tecidual que incluem as aminas vasoativas, eicosanoides, enzimas lisossomais, radicais livres derivados do oxigênio, fator ativador de plaquetas (PAF) e citocinas (SIQUEIRA; DANTAS, 2000).
Notavelmente, as aminas vasoativas, a exemplo da histamina e a serotonina, encontram-se em grânulos celulares, de forma que são liberadas imediatamente após a ação do estímulo agressor. Sua ação está intimamente ligada aos vasos sanguíneos e sobre os neurônios sensoriais, de modo que
Alguns neurônios sensoriais expressam receptores H1 e a ativação destes receptores aumenta a permeabilidade ao cálcio, culminado com a liberação de neuropeptídios sensoriais, promovendo uma sensação de dor na resposta inflamatória (DRAY, 1995).
A histamina, uma amina primária hidrossolúvel, é o primeiro mediador implicado nas alterações fisiopatológicas nas desordens inflamatórias. Assumindo grande importância no inicio da resposta inflamatória, uma vez que medeia o aumento da permeabilidade vascular ao se ligar em receptores H1,
localizado nas células endoteliais, esta ligação faz com que células se contraiam, produzido espaços intercelulares permitindo assim a passagem de substancias. Sua síntese acontece a partir da L-histidina e posteriormente armazenada nos grânulos dos mastócitos e basófilos. A liberação dos mastócitos é desencadeada por diferentes fatores como nas respostas imunológicas envolvendo IgE, fragmentos do sistema complemento C3a e C5a e citocinas ( IL-1 e IL-18). A histamina também pode agir mediando à contração do músculo liso nas vias aéreas e induzindo a produção de muco nasal (OHTSU, 2008; ROOME, 2007; TROWBRIDGE & EMLING, 1997).
Tal como a histamina, a serotonina ou 5-hidroxitriptamina (5-HT) é uma amina vasoativa, formada pela descarboxilação do triptofano e é armazenada nos grânulos secretores das plaquetas, de forma que são liberadas das plaquetas através do PAF. Seu mecanismo de ação é semelhante ás da histamina, inicialmente vasoconstricção, vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular (FAVACHO, 2009; ROOME, 2007). Dentre os receptores
responsáveis por controlar suas funções biológicas destacam-se (5-HT1, 5-HT2,
5-HT3 e 5-HT4).
Os metabólitos do ácido araquidônico (AA) também são importantes mediadores químicos envolvidos na resposta inflamatória. Os eicosanoides derivados do AA são hormônios locais liberados pelas células de modo a ativarem-se a si mesmas (efeito autócrino) ou ativando células circunvizinhas (efeito parácrino). Masresha et al., (2012) afirma que os eicosanoides são mediadores importantes na regulação da resposta imunológicas que vão desde respostas inflamatórias a remodelação de tecidos, cancro, asma, artrite reumatoide e doenças auto-imunes (PHUNG, 2008; HARIZI ET AL., 2008). As duas principais classes de enzimas que são responsáveis pela síntese dos metabólitos do AA: as lipoxigenases, que produzem os leucotrienos e as lipoxinas e a classe das ciclooxigenases, que sintetizam as prostaglandinas e os tromboxanos (DRAY, 1995).
Atualmente são encontradas três isoformas de enzima cicloxigenase (COX): a COX-1, COX-2 e COX-3, de forma que cada uma apresenta propriedades catalíticas, reguladoras e de distribuição nos tecidos específicas de sua isoforma (PHUNG, 2008).
A COX-1 é expressa constitutivamente na maioria das células e é fonte dominante da produção de prostaglandinas (PGs), principalmente, as relacionadas com ações fisiológicas como proteção gástrica, homeostase vascular, agregação plaquetária e na manutenção do fluxo sanguíneo renal. Dentre as PGs mais abundantemente produzidas no organismo é a prostaglandina E2, sabe-se que durante o processo inflamatório o rubor e a
formação de edema resultam de um aumento do fluxo sanguíneo no tecido lesionado através de um aumento da dilatação arterial e permeabilidade vascular mediados pela prostaglandina E2. Essa isoforma se relaciona com as
plaquetas objetivando sintetizar o tromboxano A2, um mediador que favorece a
adesão e agregação plaquetária, como sendo uma isoforma integrante do trato gastrointestinal, sendo associada á produção de muco protetor e inibição da secreção ácida gástrica, de modo que fármacos que atuam inibindo a COX-1 causam diversos distúrbios no trato digestivo podendo estar associadas ao
risco de sangramento cutâneo e gastrointestinal como efeito adverso (KUMMER; COELHO, 2002; LEES et al., 2004; BRICKS; SILVA, 2005; FRANCO et al., 2006; HAZEWINKEL et al., 2008; STEAGALL et al., 2009).
Os produtos originados pela clivagem do AA através da COX-2 levam a formação de PGs que participam dos eventos inflamatórios, algésicos e térmicos. Esta isoforma também é chamada de indutiva, pois sua expressão ocorre após o estímulo inflamatório nas células migratórias e tecidos lesados, tal estimulo está relacionado á presença de citocinas, fatores de crescimento e estimulantes tumorais, o que sugere sua relevância no câncer e em processos inflamatórios (KUMMER; COELHO, 2002; FRANCO et al., 2006; HAZEWINKEL et al., 2008; STEAGALL et al., 2009). É induzida pelas citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-2, TNF e outros mediadores nos sítios da inflamação, como fatores de crescimento e endotoxinas. As citocinas inflamatórias como IL-13 e IL-4, assim como os glicocorticoides inibem a expressão de COX – 2. Recentemente foi descoberta uma nova isoforma para esta enzima a COX-3 que parece ser uma variante do gene da COX-1, esta isoforma parece atuar no sistema nervoso central e os anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) como paracetamol e dipirona parece exercer na inibição desta enzima (HILÁRIO et al., 2006; MARNETT, 2009).
Todas estas moléculas citadas anteriormente como participantes do processo inflamatório são reguladas por diversos fatores de transcrição e certamente um dos mais importantes é o Fator Nuclear Kapa B (NF-KB), respondendo a
estímulos pró-inflamatórios como IL-1β ou TNF, o NF-KB controla a transcrição
de vários genes celulares que regulam a resposta inflamatória (KARIN & GRETEN, 2005). O NF-KB é um heterodímero constituído de duas
subunidades, a p65 (também conhecida como Re1A) e a p50. Quando não estimulado o NF-Kb encontra-se em repouso no citoplasma ligado a uma
proteína inibitória chamada IkB uma proteína que pertence á família das subunidades Re1, de modo que esse complexo impede a translocação do
NF-Kb para o núcleo. Assim, a fosforilação e a degradação do IkB pela ação dos
complexos IkB quinase (IKK) são extremamente necessárias para que ocorra a translocação e posteriormente culminado com a liberação de mediadores, tais como: citocinas pró-inflamatórias, moléculas de adesão, quimiocinas, fatores de crescimento e enzimas indutivas, tais como COX-2 e sintase de óxido nítrico
(iNOS) (KARIN & GRETEN, 2005; KARIN & BEM, 2000; HOBBS & MONCADA, 1999).
Nos últimos anos o NF-KB tem atraído o interesse de pesquisadores como um
novo alvo terapêutico para o tratamento de doenças inflamatórias, de modo que a inibição desta via acarreta em uma drástica diminuição da produção de mediadores inflamatórios em diferentes tipos celulares, como os linfócitos, macrófagos e células endoteliais. Lawrence e colaboradores (2001) sugeriram em dos trabalhos que a ativação do o NF-KB em leucócitos recrutados durante
o processo inflamatório está associada com a expressão de genes pró-inflamatórios em modelo de pleurite em ratos, enquanto a ativação tardia, durante a resolução da inflamação está associada com a expressão de genes anti-inflamatórios e indução de apoptose.
As citocinas possuem papel crucial na formação dos sinais locais ou sistêmicos durante a resposta inflamatória. Segundo Cotran et al., (2006) as citocinas são polipeptídeos produzidos por diferentes tipos celulares, principalmente linfócitos e macrófagos ativados, bem como células do endotélio, epitélio e tecido conjuntivo, em resposta a uma variedade de estímulos desencadeados por bactérias, parasitas, vírus, doenças auto-imunes e de doenças inflamatórias. As principais citocinas na inflamação aguda são o Fator de Necrose Tumoral (TNF) e as interleucinas IL-1, IL-6 e IL-8, que são importantes mediadores nas reações inflamatórias agudas e crônicas, assim como dos processos de reparo e de resolução. São principalmente produzidas por macrófagos ativados e podem estimular, secundariamente, a liberação de mais citocinas (MITCHELL et al., 2006; RANG et al., 2007).
Em relação ao Interferon- (IFN-sabe-se que sua atuação está concentrada na ativação de macrófagos para liberação das demais citocinas inflamatórias, em especial TNF e IL-6 e óxido nítrico. Além disso, IFN-induz a adesão celular, apoptose celular e deposição de matriz extracelular responsáveis pela disfunção nas células endoteliais, contribuindo para o processo inflamatório (SIKORSKI, 2012).
Ainda convém lembrar-se dos processos inflamatórios de perfil Th2, ocorrendo na reação ás infecções helmínticas e nas doenças alérgicas, como a asma.
Neste tipo de resposta os antígenos de helmintos ou alérgenos estimulam os linfócitos T a produzirem citocinas Th2, como a interleucina 4 (IL-4). A IL-4 atua estimulando os plasmócitos a produzir imunoglobulina E (IgE). E a interleucina 5 (IL-5) atrai e ativa os eosinófilos (LAMBRECHT & HAMMAD, 2015). A eosinofilia e o aumento do nível sérico de IgE são, portanto, características da resposta imune Th2. Uma parte da IgE produzida durante a resposta imune Th2 é antígeno-específica. O aumento da expressão de receptores para IgE em mastócitos e basófilos, também mediados pela IL-4 permite o sistema imune o desenvolvimento de um sistema de alerta nas reações alérgicas a qualquer exposição ao antígeno. A resposta imune Th2 é reforçada sempre que o antígeno se liga à IgE específica na superfície dos mastócitos, que degranulam, liberando mediadores que intensificam a resposta inflamatória como a histamina, prostaglandinas, leucotrienos e também citocinas pró-inflamatórias (PONTE ET AL., 2007; BUSSE, 2001; KAY, 2001)
Outro mediador importante que assume relevância na resposta inflamatória é óxido nítrico (NO). O óxido nítrico é um gás solúvel produzido pelas células endoteliais, macrófagos e alguns neurônios cerebrais e é produzido a partir da L-arginina pela ação da NO sintase (NOS) (Bogdan, 2001; Yen et al., 2001; Redington, 2006).
O óxido nítrico apresenta uma ação parácrina, ou seja, age em células próximas ao local da sua produção, desempenhando um papel crucial nas respostas vasculares e celulares da reação inflamatória. Muitas linhas de evidência, indicam que o aumento na produção de NO, devido a indução da expressão de iNOS (NOS induzível) por citocinas inflamatórias, é instrumento da fisiopatologia da inflamação (PACHER; BECKMAN; LIAUDET, 2007). Por sua ação no músculo liso vascular, é um potente vasodilatador e reduz a agregação e adesão plaquetária. Em condições normais, sua produção diminui o recrutamento leucocitário, enquanto a diminuição de seus níveis promove o rolamento e a adesão leucocitária (GUZIK; KORBUT; ADAMEK-GUZIK, 2003). Por outro lado, leucócitos ativados produzem a NOS induzida (iNOS) após a exposição a produtos microbianos ou citocinas pró-inflamatórias (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
2.7 TERAPIA ANTI-INFLAMATÓRIA
Como visto até aqui, é indiscutível que uma resposta inflamatória é um mecanismo de defesa do organismo, no entanto na resolução deste processo são liberados diversos mediadores que conduzem aos sinais clínicos da resposta. Tais mediadores acarretam prejuízos e desconforto para os pacientes portadores das mais diversas doenças inflamatórias, como exemplo, a dor a qual decorre da sensibilização dos nociceptores e, para isto, são aplicadas intervenções terapêuticas nas quais a, inibição da produção e da liberação dos mediadores responsáveis em desencadear os sinais clínicos da inflamação são as principais estratégias.
Dentre os agentes farmacológicos mais utilizados no controle das reações inflamatórias, destacam-se os antiinflamatórios não esteroidais (AINEs). Os AINEs encontram-se entre as drogas mais prescritas no mundo todo (NA et al., 2006; YADAV et al., 2006). O arsenal de AINEs disponíveis no mercado apresentou um grande aumento nas últimas décadas, e atualmente calcula-se que um em cada sete indivíduos com sintomatologia dolorosa associada a alterações inflamatórias crônicas estão fazendo uso contínuo dos AINEs e que um em cada cinco indivíduos com queixa de dor aguda utilizará um AINE (NAKAO, 2008). Os AINEs são formados por um grupo heterogêneo de compostos, que apesar de compartilharem do mesmo mecanismo de ação, apresenta fórmula estrutural e propriedades químicas distintas. Agem inibindo o sítio ativo da COX, consequentemente levando a não formação dos prostanóides, combatendo assim os sinais clínicos da inflamação, como a dor e a febre (GAITAN et al., 2004; LEES, et al., 2004; BASBAUM & JULIUS, 2006; MIRANDA et al., 2006; SHIN et al., 2006; HAZEWINKEL et al., 2008).
As maiores classes de AINEs apresentam como característica comum à inibição das isoformas COX-1 e COX-2 em suas dosagens terapêuticas, passando assim a serem caracterizados de acordo com sua capacidade de inibição da COX-1 e da COX-2. Em resposta a este mecanismo de inibição, os AINEs apresentam diversos efeitos adversos principalmente no trato gastrointestinal, na função renal e na agregação plaquetária, o que limita o uso
continuo dessas drogas (CHAN et al., 1999; BRZOZOWSKI et al 2005; YADAV et al., 2006; STEAGALL et al., 2009).
Após a descoberta de que a COX-1 constituía-se fisiologicamente como uma isoforma citoprotetora gástrica e mantenedora da homeostase renal e plaquetária e, a COX-2 ou também chamada de indutiva, a qual surgia apenas em situações de trauma tecidual ou inflamação, surgiu a ideia de que os inibidores específicos da COX-2 impediriam os danos causados pelo processo inflamatório sem gerar os efeitos colaterais indesejáveis (KUMMER & COELHO, 2002; YADAV et al., 2006; HANSON et al., 2006). Com base nas pesquisas entre as diferenças da COX-1 e COX-2, os laboratórios desenvolveram uma classe de drogas, chamadas inibidores específicos da COX-2 como o rofecoxibe (Viooxx®); o valdecoxibe (Bextra®); o entoricoxibe (Arcoxia®), e o lumiracoxibe (Prexige®) (DAVIES & JAMALI, 2004), embora promissora, apresentam consideráveis efeitos colaterais também.
Por outro lado, os corticoides (AIEs) são descritos como agentes esteroides possuindo ação anti-inflamatória e imunossupressora, tornando os corticoides uma das classes terapêuticas mais importantes da atualidade, com múltiplas indicações em doenças inflamatórias e autoimunes, tornando-se inclusive o principal tratamento para inflamação alérgica, incluindo a asma. O mecanismo de ação desses hormônios inclui a estabilização de membranas lisossômicas, inibição da formação de cininas que causam vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e posteriormente a dor. Outro mecanismo de ação desempenhado pelos corticoides se da através da inibição do NFk-B, uma vez que ao penetrar na célula, as moléculas de corticosteroides unem-se a receptores plasmáticos específicos para corticoides, sendo então transportados ao núcleo, permitindo assim uma ligação á sequência de DNA, resultando na ativação do fator de IKB, especificamente a IKBB, molécula responsável em manter o NFk-B inativo no citoplasma. De modo que inibição do fator de transcrição NFk-B caracteriza-se como uma importante via na resolução do processo inflamatório, impedindo a expressão de diversos genes envolvidos na produção de citocinas, moléculas de adesão e receptores relevantes no processo inflamatório (MONTEIRO et al., 2003; FAUCI, A et al., 2008). É valido lembrar que os corticoides também previnem o início da cascata de
reação que leva á produção de certas prostaglandinas e leucotrienos, através da diminuição de oferta do ácido araquidônico, liberado pelos fosfolipídios da membrana pela fosfolipase A2. Esse mecanismo de ação explica grande parte
da ação anti-inflamatória dos corticoides, uma vez que o ácido araquidônico desempenha um importante papel na inflamação através da produção dos mediadores humorais da inflamação (SILVA, 2010).
Os efeitos adversos do uso de corticoides são bastante frequentes e variam desde sintomas leves e reversíveis com a parada do medicamento, até manifestações irreversíveis e por vezes inclusive, letais. Apesar de alguns sintomas como irritabilidade e insônia poderem ocorrer com administrações curtas, em geral, os efeitos adversos são diretamente proporcionai à duração do tratamento e frequência de administração.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral do presente trabalho foi descrever o perfil químico, citotóxico e o potencial efeito imunofarmacológico do extrato hidroalcoólico do
Hippocampus reidi.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
o Produzir extrato hidroalcoólico do organismo marinho Hippocampus reidi e padronizá-lo através de HPLC;
o Avaliar a citotoxicidade in vitro do extrato hidroalcoólico do organismo marinho Hippocampus reidi;
o Avaliar o efeito anti-inflamatório in vitro através da investigação de mediadores inflamatórios, citocinas e do fator transcripcional NFK-B;
o Descrever os possíveis mecanismos pelos quais o Hippocampus reidi possui atividade anti-inflamatória.
