UNIVERSIDADE POSITIVO
MESTRADO PROFISSIONAL EM ODONTOLOGIA CLÍNICA
AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DA REABSORÇÃO ÓSSEA
INDUZIDA PELA Porphyromonas gingivalis COM E SEM
LIGADURAS APÓS TRATAMENTO COM ALENDRONATO E
RESVERATROL
DRIELE MARIA GONTARZ
CURITIBA 2019
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UNIVERSIDADE POSITIVO
MESTRADO PROFISSIONAL EM ODONTOLOGIA CLÍNICA
AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DA PERIODONTITE
EXPERIMENTAL INDUZIDA PELA Porphyromonas gingivalis
COM E SEM LIGADURAS APÓS TRATAMENTO COM
ALENDRONATO E RESVERATROL
DRIELE MARIA GONTARZ
Projeto de pesquisa apresentado à Universidade Positivo como requisito parcial para obtenção do título de mestre, pelo programa de Mestrado Profissional em Odontologia Clínica.
Orientadora: Prof. Carmen Lúcia Mueller Storrer
CURITIBA 2019
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Este trabalho de pesquisa foi realizado no Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento em Odontologia (LPDO) da Universidade Positivo e no Laboratório de Química da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR).
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha família, sem a qual, jamais chegaria aqui ou à qualquer outro lugar.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que me permitiu e me suportou durante esses dois anos de estudos e de estrada.
À professora Carmen L. Mueller Storrer, pelo seu tempo e dedicação.
À Universidade Positivo e a todos seus professores e funcionários, por almejarem juntos nossas conquistas. Agradeço especialmente à Fernanda Alves, Sirlei, Daiana, Philipe e Vinícius.
Ao colega Darlan Rigo Jr, parte essencial desse projeto.
Aos colegas de turma e companheiros de trabalho que se fizeram presentes durante o tempo de pós-graduação, dentro e fora da universidade.
À minha família, principalmente à minha mãe guerreira, paciente e que compartilhou comigo toda essa jornada. Ao meu pai, que se desdobrou para que eu pudesse estar aqui hoje. Ao meu marido, meu grande incentivador, que enxergou meu potencial e me motivou a estar aqui.
Aos meus amigos: aos que entenderam as ausências e aos que se fizeram família quando estava longe de casa, em especial à Marina e a Thais, que sempre estiveram lá.
Aos 140 ratos desse estudo e a todos os outros que são inestimáveis ao avanço da ciência.
A todos que de maneira direta ou indireta contribuíram para o enriquecimento desse trabalho.
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EPÍGRAFE
Se vi mais longe foi por estar de pé sobre ombros de gigantes. Sir Isaac Newton
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Gontarz DM. Avaliação radiográfica da reabsorção óssea induzida pela Porphyromonas gingivalis com e sem ligaduras após tratamento com alendronato e resveratrol. Curitiba: Universidade Positivo; 2019.
RESUMO
A periodontite é uma doença crônica inflamatória que se desenvolve com o tempo através do acúmulo do biofilme bacteriano, induzindo a produção exacerbada de mediadores imuno-inflamatórios. O objetivo desse estudo foi analisar radiograficamente a influência do alendronato e do resveratrol na periodontite induzida pela Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) com e sem ligadura. Cento e vinte ratos foram submetidos à periodontite experimental através de duas técnicas de indução da doença: com ligadura associada à P. gingivalis (LPg) e sem ligadura associada à P. gingivalis (SLPg). Após a doença instaurada, os ratos foram divididos em 4 grupos de acordo com o tratamento: o grupo alendronato (ALN) que recebeu a dose de 2 mg/kg/dia de alendronato; o grupo resveratrol (RESV) que recebeu a dose 10 mg/kg/dia de resveratrol dissolvido em 10 mg/ml de amido solúvel; grupo β- ciclodextrina (β- CD) /RESV que recebeu a dose 10 mg/kg/dia do complexo e grupo controle que recebeu a dose 10 mg/kg/dia de β- CD. As medicações foram administradas via oral por gavagem durante 30 dias. Os animais foram eutanasiados e as peças cirúrgicas da região das maxilas foram radiografadas e submetidas ao software ImageJ ® para a medição da reabsorção óssea das regiões proximais (junção esmalte cemento à crista óssea alveolar). Os dados foram submetidos à análise estatística através dos testes de Kruskal Wallis e Mann-Whitney com o nível de significância estabelecido de 0,05. Os ratos que receberam a administração dos medicamentos RESV, β- CD/RESV e placebo, apresentaram maior perda óssea, na presença de ligadura (p < 0,05). Já na presença do
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ALN, a ligadura não aumentou a perda óssea (p > 0,05). Em conclusão, constatamos que o ALN, quando em comparação a ele mesmo, em uma perda óssea mais aguda, parece não acentuar a perda óssea.
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Gontarz DM. Radiographic evaluation of bone resorption induced by Porphyromonas
gingivalis with and without ligatures after treatment with alendronate and resveratrol. Curitiba: Universidade Positivo; 2019.
ABSTRACT
Periodontitis is a chronic inflammatory disease that develops over time through the accumulation of bacterial biofilm, inducing the exacerbated production of immune-inflammatory mediators. The aim of this study was to radiographically analyze the influence of alendronate and resveratrol on periodontitis induced by Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) with and without ligation. One hundred and twenty rats were submitted to experimental periodontitis through two techniques of induction of the disease: with ligation associated with P. gingivalis (LPg) and without ligation associated with P. gingivalis (SLPg). After the disease was established, the rats were divided into 4 groups according to the treatment: the alendronate group (ALN), which received the dose of 2 mg/kg/day of alendronate; the resveratrol group (RESV) receiving the 10 mg/kg/day dose of resveratrol dissolved in 10 mg/ml soluble starch; β- cyclodextrin (β-CD) /RESV group receiving the 10 mg/kg/day dose of the complex and control group receiving the 10 mg/kg/day β- CD dose. The medications were administered orally by gavage for 30 days. The animals were euthanized and the jaw surgical specimens were x-rayed and submitted to ImageJ ® software for the measurement of bone resorption of proximal regions (cemented enamel junction to alveolar bone crest). Data were submitted to statistical analysis using the Kruskal Wallis and Mann-Whitney tests, with a significance level of 0.05. Rats receiving RESV, β- CD / RESV and placebo received higher bone loss in the presence of ligation (p < 0.05). In the presence of ALN, ligation did not increase bone loss (p > 0.05). In
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conclusion, we found that the ALN, when compared to itself, in a more acute bone loss, does not seem to accentuate the bone loss.
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 1
PROPOSIÇÃO ... 8
MANUSCRITO ... 9
Resumo ... 10 Introdução ... 11 Metodologia ... 11 Resultados ... 19 Discussão ... 21 Conclusão ... 23APÊNDICE 1 - METODOLOGIA ...28
1.1. Animais ... 28 1.2. Desenho do estudo ... 281.3. Repique e criopreservação da bactéria Porphyromonas gingivalis ... 29
1.4. Indução da periodontite ... 30
1.5. Preparo das medicações ... 31
1.6. Tratamento ... 32 1.7. Eutanásia... 33 1.8. Tomada radiográfica ... 34 1.9. Calibração do examinador ... 34 1.10. Análise radiográfica ... 34 1.11. Análise estatística ... 35
REFERÊNCIAS ...36
ANEXO ...40
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INTRODUÇÃO
A periodontite é uma doença crônica inflamatória que se desenvolve com o tempo através do acúmulo do biofilme bacteriano, induzindo a produção exacerbada de mediadores imuno-inflamatórios. A manifestação da periodontite se dá pela formação de bolsas periodontais e pela perda dos tecidos de sustentação dos dentes: gengiva, ligamento periodontal, cemento e osso alveolar, que pode levar à perda dentária (Papapanou et al., 2018). Alguns dos fatores de risco da doença são: idade, hereditariedade, higiene oral deficitária, tabaco, estresse, obesidade, diabetes e associação de medicação. A doença periodontal pode ser, também, uma manifestação de outras doenças sistêmicas, tais quais o HIV (Heitz-Mayfield, 2005).
O diagnóstico da periodontite é clínico e radiográfico. Clinicamente é feito através da medição de perda clínica de inserção, que deve ser maior de 4 mm em dois sítios ou mais, interproximais e não adjacentes. A avaliação radiográfica deve evidenciar perda óssea, resultante da periodontite e não por outros fatores, como cárie ou trauma dental (Caton et al., 2018).
A periodontite pode ser induzida para fins experimentais através da aplicação de bactérias nas regiões de interesse ou adjacentes, como a Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a Treponema Denticola e a Tannerella Forsythia (O'Brien-Simpson et al., 2016), e por meio de ligaduras posicionadas ao redor de elementos dentários (Corrêa et al., 2018; Olchanheskiet al., 2018; Bugueno et al., 2018). Os ratos têm a reação de perda óssea alveolar semelhante à dos humanos, sendo o roedor mais utilizado para o estudo experimental da periodontite (Vargas-Sanchez et al., 2017).
2 A Pg é uma bactéria anaeróbia Gram-negativa, intimamente ligada à indução da periodontite e, em 2009, Byrne et al. mostrou que, ao alcançar níveis de carga bacteriana maiores que 10 a 15 % na placa subgengival, a Pg pode vir a causar progressão da doença, como demonstraram Storrer et al. (2016) e Wu et al. (2018). A periodontite pode ser induzida com ligaduras através do acúmulo de biofilme no fio posicionado subgengivalmente, na junção esmalte cemento, como Corrêa et al., (2018) e Olchanheski et al. (2018) fizeram e/ou através de ligaduras infectadas com Pg e posicionadas ao longo das margens cervicais dos elementos dentários, demonstrado por Li et al. (2017) e Bugueno et al. (2018).
Alguns tratamentos podem reduzir ou estagnar o progresso da doença, como a remoção da placa bacteriana e a diminuição do quadro inflamatório, porém, a perda óssea é irreversível (Michaud et al., 2017), principalmente em dentes com múltiplas raízes e lesão, exposição e irregularidades na furca, que aumentam consideravelmente o risco de perda do elemento, pois propiciam o acúmulo de bactérias (Ipshita et al., 2018). Os tratamentos propostos para a periodontite são as raspagens cirúrgica e não cirúrgica, que podem ser associadas à uma intervenção medicamentosa (Slots e Ting, 2002). Em casos específicos, recorre-se aos antibióticos e, de acordo com a necessidade, são utilizados apenas um tipo de antibiótico ou uma combinação de medicamentos, a fim de atacar toda flora bacteriana dentro de suas especificidades: gram positivas, gram negativas, aeróbias ou anaeróbias. Os antibióticos mais habitualmente utilizados são as penicilinas e o metronidazol (Heta e Robo, 2018).
Diversas tentativas de regeneração óssea periodontal e recuperação do ligamento já foram propostas, como enxertos ósseos e sintéticos e laser terapia (Kao et al., 2015), porém, muitas delas apresentam problemas de previsibilidade, alto custo e necessidade de avançado domínio da técnica (Dutra et al., 2017).
3 Há algum tempo os bifosfonatos são utilizados na medicina para tratamento de doenças de reabsorção óssea como hipercalcemia, câncer associado à osteólise e osteoporose pós-menopausa, induzindo a apoptose osteoclástica, impedindo sua diferenciação (Fleisch, 1991). Em 2002, Rodan e Reszka propuseram que os bifosfonatos podem auxiliar na função dos osteoblastos, acelerando o processo de remodelação e mineralização óssea.
Pensando na modulação do quadro inflamatório da periodontite, poderia se ter o alendronato como coadjuvante ao tratamento, agregado às outras medicações sistêmicas visto que o mesmo se propõe a auxiliar na atividade óssea osteoblástica e interferir na função de reabsorção da matriz óssea dos osteoclastos (Ipshita et al., 2018; Jeon et al., 2019), agindo como um agente antiosteolítico (Sharma et al., 2012). Ele age através dos osteoclastos, induzindo a apoptose e diminuindo a remodelação óssea (Maeda e Lazaretti-Castro, 2014; Kates e Ackert-Bicknell, 2016). Recentemente alguns estudos têm mostrado a eficiência do ALN na reabsorção óssea alveolar induzida, como Storrer et al. (2016), Dutra et al. (2017) e Ipshita et al. (2018).
O Resveratrol (RESV), ou 3,5,40-trihydroxystilbene, é uma substância derivada de fungos, também presente em alimentos como uvas e castanhas (Corrêa et al., 2018) e tem poder antioxidante, anticancerígeno e anti-inflamatório, que auxilia no tratamento de algumas doenças degenerativas, doenças autoimunes, doenças metabólicas, doenças cardíacas, câncer, diabetes e degenerações neurais. Além disso, Bhattarai et al., (2016) e Corrêa et al. (2018), mostraram em seus estudos que o RESV pode contribuir para a formação óssea, interferindo na osteoblastogênese sendo, segundo Kugaji et al. (2019), uma forma barata de terapia sistêmica.
Para que a doença periodontal seja classificada como periodontite, é necessário que haja perda óssea envolvida, que pode ser confirmada através de tomadas radiográficas
4 periapicais e panorâmicas. Dentro do consultório, todos os dias os profissionais da odontologia se valem do uso das radiografias para realizar diagnósticos mais precisos, promover um plano de tratamento adequado e acompanhar a progressão ou estabilização da doença. Desde a descoberta dos raios-X em 1985, a teoria da formação de imagens e as análises das radiografias permaneceram basicamente as mesmas: no exame de raio-X a radiação passa diretamente pela estrutura a ser analisada, oferecendo uma imagem com diferentes contrastes, dependendo da densidade de cada órgão. Hoje em dia, já é de conhecimento que a radiação afeta negativamente nosso organismo, por isso a intensidade da mesma deve ser sempre ajustada ao mínimo necessário (Bagis et al., 2015; Rahmi-Fajrin et al., 2018; An et al., 2018).
Para realizar análises de grau e atividade da periodontite nos ratos, usualmente é utilizada a radiografia periapical de hemimaxila, onde o principal parâmetro avaliado é a perda óssea alveolar. Com o avanço das técnicas, a radiografia digital tem sido amplamente utilizada (Lewis., 2019), já que, se observa que a mesma, além de dispensar o uso de filmes e revelação, que pode prejudicar o resultado final da imagem, também entrega uma radiografia mais nítida, com a mesma precisão analógica e a possibilidade de ajustes ao final de cada tomada (An et al., 2018).
A periodontite é uma doença inflamatória causada por bactérias odontopatogênicas e mediada pela resposta do hospedeiro, que tem o papel principal na degradação do tecido conjuntivo e na reabsorção óssea através da migração de bactérias do tecido epitelial e pode ser agravada devido a fatores de risco. Os lipopolissacarídeos presentes na membrana externa da P. gingivalis induzem a produção de citocinas, que penetram os tecidos de suporte gengivais e provocam respostas inflamatórias locais. Uma das funções dessas citocinas pró-inflamatórias é recrutar leucócitos para as áreas afetadas. Os leucócitos por sua vez, modulam a formação dos osteoclastos, interferindo na sua
5 função34 35. A manifestação clínica da periodontite se dá pela perda de inserção e perda dos tecidos de sustentação dos dentes: tecido mole, cemento, ligamento periodontal e osso alveolar, que pode levar à perda dentária (Armitage, 1999).
O diagnóstico da doença é clínico com o auxílio de exames radiográficos. Clinicamente é feito através da medição de perda de inserção, que devem ser iguais ou maiores de 4 mm em dois sítios ou mais, interproximais e não adjacentes. A avaliação radiográfica deve evidenciar perda óssea, resultante da periodontite e não por outros fatores, como cárie ou trauma dental (Caton et al., 2018).
A doença periodontal pode ser induzida para fins experimentais através da aplicação de bactérias nas regiões de interesse ou adjacentes, como a Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a Treponema Denticola e a Tannerella Forsythia (O'Brien-Simpson et al., 2016), e por meio de ligaduras posicionadas ao redor de elementos dentários, através do acúmulo de biofilme no fio posicionado subgengivalmente, na junção esmalte cemento, como Corrêa et al., (2018) e Olchanheski et al. (2018) demonstraram e/ou através de ligaduras infectadas com alguma bactéria e posicionadas ao longo das margens cervicais dos elementos dentários, demonstrado por Li et al. (2017) e Bugueno et al. (2018).
A P. gingivalis é uma bactéria periodonto patógena, anaeróbia, Gram-negativa, intimamente ligada à indução da periodontite e, em 2009, Byrne et al. mostrou que, principalmente, ao alcançar níveis de carga bacteriana maiores que 10 a 15 % na placa subgengival, a P. gingivalis pode vir a causar progressão da doença, como demonstraram Storrer et al. (2016) e Wu et al. (2018).
Alguns tratamentos podem reduzir ou estagnar o progresso a doença, como a remoção da placa bacteriana e do cálculo dental supra e subgengivais diminuindo o quadro inflamatório (Michaud et al., 2017), especialmente em dentes com múltiplas raízes e
6 lesão, exposição e irregularidades na furca, que aumentam consideravelmente o risco de perda do elemento, pois propiciam o acúmulo de bactérias odontopatogênicas nesses sítios (Ipshita et al., 2018). Os tratamentos propostos para a periodontite são as raspagens cirúrgica e não cirúrgica, que podem ser associadas à uma intervenção medicamentosa (Feres et al., 2015; Graziani et al., 2018). Em casos específicos, recorre-se aos antibióticos e, de acordo com a necessidade, são utilizados apenas um tipo de antibiótico ou uma combinação de medicamentos, a fim de alterar a microbiota para bactérias compatíveis com a saúde. Os antibióticos mais habitualmente utilizados são as penicilinas e o metronidazol (Heta e Robo, 2018).
Há algum tempo os bifosfonatos são utilizados na medicina para tratamento de doenças que causam reabsorção óssea como hipercalcemia, câncer associado à osteólise e osteoporose pós-menopausa, induzindo a apoptose osteoclástica, impedindo sua diferenciação (Fleisch, 1991). Em 2002, Rodan e Reszka propuseram que os bifosfonatos podem aceler o processo de remodelação e mineralização óssea, através dos osteoblastos. Pensando na modulação do quadro inflamatório presente na periodontite, poderia se ter o alendronato (ALN) como coadjuvante ao tratamento, visto que o mesmo se propõe a auxiliar na atividade óssea osteoblástica e interferir na função de reabsorção da matriz óssea dos osteoclastos (Ipshita et al., 2018; Jeon et al., 2019), agindo como um agente antiosteolítico (Sharma et al., 2012). Ele age através dos osteoclastos, induzindo a apoptose e diminuindo a remodelação óssea (Maeda e Lazaretti-Castro, 2014; Kates e Ackert-Bicknell, 2016). Recentemente alguns estudos têm mostrado a eficiência do ALN na reabsorção óssea alveolar induzida, como Storrer et al. (2016), Dutra et al. (2017) e Ipshita et al. (2018).
O Resveratrol (RESV), ou 3,5,40-trihydroxystilbene, é uma substância derivada de fungos, também presente em alimentos como uvas e castanhas (Corrêa et al., 2018) e
7 tem poder antioxidante, anticancerígeno e anti-inflamatório, que auxilia no tratamento de algumas doenças degenerativas, doenças autoimunes, doenças metabólicas, doenças cardíacas, câncer, diabetes e degenerações neurais. Além disso, Bhattarai et al., (2016) e Corrêa et al. (2018), mostraram em seus estudos que o RESV pode contribuir para a formação óssea, interferindo na osteoblastogênese sendo, segundo Kugaji et al. (2019), uma forma barata de terapia sistêmica.
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PROPOSIÇÃO
Analisar por meio de radiografias qual o melhor tratamento para inibir a reabsorção óssea, resveratrol ou alendronato, após indução da periodontite pela injeção da Porphyromonas gingivalis associada ou não à inserção de ligadura em molar de ratos Wistar.
Hipotetiza-se que a injeção da P. gingivalis associada à ligadura promove maior reabsorção óssea e que o resveratrol e o alendronato são capazes de inibir a reabsorção óssea alveolar.
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MANUSCRITO
1AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DA PERIODONTITE EXPERIMENTAL INDUZIDA PELA Porphyromonas gingivalis COM E SEM LIGADURAS APÓS
TRATAMENTO COM ALENDRONATO E RESVERATROL
1 O manuscrito será submetido ao periódico: BMC Oral Health. Manuscrito formatado de acordo com as normas específicas do periódico (acessado em: 22/03/2019).
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Resumo
Introdução: A periodontite é uma doença crônica inflamatória que se desenvolve com
o tempo através do acúmulo do biofilme bacteriano, induzindo a produção exacerbada de mediadores imuno-inflamatórios. O objetivo desse estudo foi analisar radiograficamente a influência do alendronato e do resveratrol na periodontite induzida pela Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) com e sem ligadura.
Metodologia: Cento e vinte ratos foram submetidos à periodontite experimental
através de duas técnicas de indução da doença: com ligadura associada à P. gingivalis (LPg) e sem ligadura associada à P. gingivalis (SLPg). Após a doença instaurada, os ratos foram divididos em 4 grupos de acordo com o tratamento: o grupo alendronato (ALN) que recebeu a dose de 2 mg/kg/dia de alendronato; o grupo resveratrol (RESV) que recebeu a dose 10 mg/kg/dia de resveratrol dissolvido em 10 mg/ml de amido solúvel; grupo β- ciclodextrina (β- CD/RESV) que recebeu a dose 10 mg/kg/dia do complexo β- CD/RESV e grupo controle, que recebeu a dose de 10 mg/kg/dia. As medicações foram administradas via oral por gavagem durante 30 dias. Os animais foram eutanasiados e as peças cirúrgicas da região das maxilas foram radiografadas e submetidas ao software ImageJ ® para a medição da reabsorção óssea das regiões proximais (junção esmalte cemento à crista óssea alveolar). Os dados foram submetidos à análise estatística através dos testes de Kruskal Wallis e Mann-Whitney com o nível de significância de 0,05.
Resultados: Os ratos que receberam a administração dos medicamentos RESV,
β- CD / RESV e controle, apresentaram maior perda óssea, na presença de ligadura (p < 0,05). Já na presença do alendronato, a ligadura não aumentou a perda óssea (p > 0,05).
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Conclusão: Em conclusão, constatamos que o alendronato, quando em comparação a
ele mesmo, em uma perda óssea mais aguda, parece não acentuar a perda óssea.
Palavras-chave: periodontite, ligadura, Porphyromonas gingivalis, radiografia.
Introdução
A periodontite é uma doença crônica inflamatória multifatorial associada a um biofilme dental alterado que acarreta a destruição progressiva dos tecidos de suporte dos dentes (Papapanou et al., 2018)1. O diagnóstico clínico da periodontite é detectado pela perda de inserção maior ou igual a 2 mm em dois dentes não adjacentes e sangramento gengival; radiograficamente pode ser determinada pela perda óssea radiográfica, que pode se extender do terço coronário (<15%) até ápice da raiz. (Papapanou et al., 2018, Tonetti et al., 2018)1,2.
Modelos de indução de periodontite em animais são necessários para experimentações clínicas para novas terapias de tratamentos. A indução da periodontite experimental deve ser o mais semelhante possível com o que se procura estudar, assim existem diversas formas de indução da doença em ratos como o uso de ligaduras posicionada ao redor da junção esmalte cemento dos molares visando acumular biofilme e induzir reabsorção óssea (Corrêa et al., 2018, Olchanheski et al. 2018)3,4; outra forma utilizada é a inoculação de bactérias como a associação da Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), que é um periodontopatógno anaeróbio, Gram-negativo que pode induzir reabsorção óssea, e a Fusobacterium nucleatum que desempenha um papel importante na arquitetura do biofilme bacteriano pela sua característica de coagregação com outras bactérias
12 (Storrer et al, 2016)5 ou também a injeção da P. gingivalis na mucosa palatina, proporcionando inflamação e destruição dos tecidos periodontais (de Molon, 2014)6. O tratamento da periodontite visa a remoção do cálculo supra e subgengival e do biofilme bacteriano com raspagens não-cirúrgicas e cirúrgicas a fim de reduzir o processo inflamatórioe e sessar a progressão da doença. A utilização de alguns medicamentos poderia ser de grande valia na modulação da resposta do hospedeiro e redução da sequela da periodontite (Feres et al., 2015; Graziani et al., 2018)7,8. Na tentativa de interromper a progressão da doença periodontal, a utilização de medicamentos preparados a partir de compostos naturais como o resveratrol (RESV), e drogas anti-reabsortivas como os bisfosfonatos (BPs), vem se tornando uma prática frequente tanto no tratamento como na prevenção de doenças sistêmicas (Tenenbaum et al. 2007; Casati et al. 2013; Zhen et al. 2014; Correa et al. 2016; Cirano et al. 2016; Kugaji et al. 2019)3,9,10,11,12,13. O RESV ou 3,5,40-trihydroxystilbene é um polifenol naturalmente disponível em uvas, chocolate preto, chás, vinho tinto e amendoim com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, podendo promover efeitos imunomoduladores sobre a resposta do hospedeiro (Tamaki et al. 2014, Bhattarai et al. 2016)14,15. Outra alternativa eficaz de terapia adjuvante para periodontite são os BPs devido a sua capacidade de exercer um potente efeito inibitório na reabsorção óssea. Esses fármacos têm alta afinidade pelo tecido ósseo e se ligam fortemente aos cristais de apatita, especialmente na superfície de remodelação (Dutra et al. 2017)16. O alendronato de sódio (ALN) é um BP amplamente usado para tratar condições que levam à reabsorção óssea. Seu potente mecanismo de ação causa alterações no citoesqueleto dos osteoclastos, inibe sua interação com a matriz óssea e previne a reabsorção (Dutra et al 2017; Ipshita et al. 2018)16,17.
13 Estima-se que a periodontite acomete 11% da população mundial, com prevalência aumentando com o passar da idade, podendo levar à perda dos dentes (Kassebaum et al. 2014, Billings et al, 2017)18,19. Baseado nestes fatos, existe uma necessidade de se testar novos medicamentos para auxiliar no tratamento da periodontite. Assim, o presente estudo se propôs a investigar o efeito do resveratrol (RESV) e do alendronato de sódio (ALN) em ratos submetidos a periodontite experimental pela injeção da P. gingivalis associada ou não à inserção de ligaduras. A hipótese testada foi que o uso dos medicamentos reduziria a inflamção periodontal causada pela bactéria e ligadura, minimizando a reabsorção óssea.
Metodologia
Animais
Os experimentos foram realizados no Biotério da Universidade Positivo, após a aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais desta universidade (CEPUP 373).
Foram utilizados 120 ratos Wistar machos com 4 meses de vida pesando aproximadamente 350g. Os animais foram mantidos no biotério em condições controladas de temperatura (23 ± 10 C) e umidade relativa (55 ± 5 %), com iluminação artificial por lâmpada fluorescente com foto períodos de 12 horas claro e 12 horas escuro, com ração e água (0,7 ppm F) ad libitum.
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Desenho do estudo
Esse estudo em animais teve como desenho o desenvolvimento da doença periodontal no mesmo animal de duas formas, pela injeção da Porphyromonas gingivalis (ATCC®33277™) na mucosa palatina adjacente ao primeiro molar superior com ligaduras e sem ligaduras e posterior tratamento sistêmico, via oral, com alendronato e resveratrol por 30 dias (Figura 1).
Figura 1 – cronologia do desenho experimental do estudo
Repique e Criopreservação da bactéria Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)
A P. gingivalis (ATCC ® 33277™) foi concedida pelo laboratório de microbiologia da Universidade Guarulhos (UNG). Para verificar a viabilidade da bactéria, que foi recebida em uma placa Petri, foi realizada a técnica de semeadura por esgotamento do repique, de onde recolhemos uma pequena porção de bactérias e transferimos para o ágar sangue, que foi incubado por 24 horas à uma temperatura de 36˚ C. Após retiradas da estufa, verificamos a viabilidade das bactérias.
Depois do repique, realizamos a criopreservação dessas bactérias, coletando-as novamente do meio sólido (placa de ágar sangue) e transferindo-as para um meio líquido (caldo BHI – brain heart infusion). Em seguida, pipetamos em um criotubo
15 1 ml de sangue de carneiro desfibrinado ao caldo já existente, que foi incubado a 36˚ C, durante 4 horas. Após esse período, os criotubos foram transferidos para um freezer e mantidos, verticalmente, durante 7 dias a – 20˚ C. Posteriormente, foram descongelados e as bactérias transportadas para um meio de crescimento adequado, através do repique do meio líquido (caldo BHI) para o meio sólido (ágar sangue em placa de Petri). Foi verificada e atestada a viabilidade bactéria. Essa viabilidade foi verificada novamente após 7, 30, 60, 90 dias e 1 ano. Para chegarmos a dosa ideal que seria utilizada, realizamos uma diluição seriada.
Na a indução da doença periodontal, 0,1 ml de 1 x 105 UFC/ml (unidades formadoras de colônias/ml) foi aplicada na mucosa palatina dos ratos. O caldo contendo essas bactérias foi aquecido ante o uso a 60˚ C, por 5 minutos.
Indução da periodontite
Os animais foram anestesiados com cloridrato de quetamina (90 mg/kg) (Dopalen ®, Agribrands Brasil Ltda., Paulínia, Brasil) e cloridrato de xilazina (12 mg/kg) (Rompun ®, Bayer SA, São Paulo, Brasil) e em seguida induzidos, também, à anestesia inalatória com oxigênio e isoflurano (Cristália, Itapira, SP, Brasil). A anestesia foi mantida pela vaporização de isoflurano por máscara facial quando necessário. A indução da periodontite foi realizada de duas formas: pela injeção de 0,1 ml de 1 x 105 UFC/ml da bactéria com o auxílio de uma seringa de insulina (BD Ultra-Fine 100UI - 6mm) na mucosa palatina adjacente ao primeiro molar superior esquerdo e posicionamento de ligadura (4-0 sutura de algodão- Ethicon, Johnson & Johnson ®, São Paulo, SP, Brasil) ao redor do dente (LPg) e do lado oposto foi injetada a mesma quantidade de bactéria na mucosa palatina adjacente ao molar sem ligadura
16 (SLPg). A injeção da bactéria foi a cada 3 dias durante 15 dias e as amarrias foram mantidas até o final do estudo.
Os animais foram avaliados a cada três dias ao longo do experimento para verificar possíveis sintomas clínicos, reaplicação da P. gingivalis e, caso fosse necessário, reposicionamento das ligaduras.
Tratamento
Os animais foram medicados diariamente via oral por gavagem durante 30 dias de acordo com o grupo de tratamento: o grupo alendronato (ALN) que recebeu a dose de 2 mg/kg de alendronato; o grupo resveratrol (RESV) que recebeu a dose 10 mg/kg de resveratrol dissolvido em 10 mg/ml de amido solúvel; grupo β- ciclodextrina/ resveratrol (RESV/β- CD) (Storrer et al., 2016) que recebeu a dose 10 mg/kg em uma proporção de 1: 1 Mol e o grupo controle que recebeu a dose de 10 mg/kg de β- CD.
A forma de administração dos medicamentos foi via oral através de uma cânula de gavagem (agulha de aço inox curvo 22 GA- Ciencor, com diâmetro de 1,0 mm, esfera de 1,7 mm e comprimento de 31mm) 1 vez ao dia durante 30 dias.
Após 30 dias, os ratos foram eutanasiados pela inalação de dose excessiva de isoflurano. Sequencialmente as maxilas foram separadas em direita e esquerda e armazenadas em solução de formaldeído a 10 % em tampão fosfato de sódio (Sigma-Aldrich ®, Saint Louis, MO, EUA).
17
Tomada radiográfica
Para quantificar a perda óssea ocasionada pela periodontite após o tratamento com alendronato e resveratrol, as hemimaxilas foram radiografadas utilizando um raio-x digital (X DENT Equipamentos Odontológicos LTDA) com um sensor intraoral digital 3x4 (NewIda), expostas aos seguintes parâmetros: 70 Kvp, 7 mA, distância foco-filme de 30 cm e tempo de exposição de 0,17 s, com o feixe do raio-x posicionado perpendicularmente às peças em posicionador.
Análise radiográfica
Para assegurar a reprodutibilidade das medidas radiográficas, um único examinador (DMG) foi calibrado realizando cada análise de medida com repetição de três vezes dentro de um período de 7 dias com coeficiente de correlação intraclasse de 0,99 - CCI 95 %.
A análise das imagens foi realizada sempre nas mesmas condições, com o auxílio do software ImageJ ® (https://ImageJ.nih.gov/ij/). Antes de realizar as medidas no programa, foi executado o escalonamento utilizando como parâmetro uma régua micrométrica de 1 mm.
As medidas, no software, foram realizadas entre as proximais dos primeiros e segundos molares superiores. Para padronizar essas medidas, foi traçada uma linha entre a junção esmalte cemento (JEC) do primeiro ao segundo molar superior. A partir desta linha, foram demarcadas outras três até o ponto mais alto da crista óssea alveolar (COA) da região interproximal dos molares. Os valores das três medidas foram
18 tomados em milímetros, somados e então foi obtida uma média. A média das medidas das imagens radiográficas foram encaminhas para análise estatística.
Figura 1-Desenho esquemático representando a metodologia de medida da reabsorção óssea realizada da JEC-COA. Linha (tracejada) entre as JEC do primeiro e segundo molar superior. Linha do ponto mais alto da COA até JEC em três posições distintas
Análise estatística
A normalidade de distribuição das variáveis foi avaliada através do teste Kolmogorov-Smirnov. As médias de todas as medidas radiográficas foram submetidas ao programa IMB SPSS Statistics (SPSS 22.0, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA), onde foram feitos os testes de Kruskal Wallis e Mann-Whitney para comparação entre os grupos. O nível de significância estabelecido foi de 0,05.
19
Resultados
Para as análises das medidas radiográficas duas diferentes comparações foram realizadas: a primeira análise compara a efetividade dos medicamentos, relacionando-os uns arelacionando-os outrrelacionando-os. Essas análises foram feitas em ambrelacionando-os relacionando-os gruprelacionando-os de indução de periodontite (LPG e SLPG) (tabelas 1 e 2).
A segunda análise compara como o mesmo medicamento agiu em dois tipos diferentes de indução da periodontite (LPG e SLPG) (tabela 3).
A tabela 1 compara a perda óssea de acordo com as medicações utilizadas no lado submetido à ligadura associada à P. gingivalis. De acordo com as análises estatísticas, não houve diferença entre eles (p = 0,549).
Tabela 1 – comparação das medidas radiográficas (mm) realizadas da JEC-COA entre os diferentes grupos de tratamento onde foi inserida a ligadura e injetado a P. gingivalis.
LPg
Grupo Mediana (Min-Max) p valor
ALN 0,151 (0,590 - 0,031)
0,549
RESV 0,201 (0,509 - 0,070)
β- CD/RESV 0,217 (0,451 - 0,045)
CONTROLE 0,247 (0,611 - 0,061)
Teste de Kruskal Wallis. Nível de significância estabelecido de 0,05 %. ALN: alendronato. RESV: resveratrol. Β- CD/RESV: β- ciclodextrina associada ao resveratrol. – β- CD: β- ciclodextrina. JEC-COA: junção esmalte cemento até a crista óssea alveolar. LPg: com ligadura + P. gingivalis
A tabela 2 compara a perda óssea de acordo com as medicações utilizadas no lado submetido somente à indução da periodontite pela bactéria P. gingivalis. De acordo com as análises estatísticas, também não houve diferença entre eles (p = 0,966).
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Tabela 2 - comparação das medidas radiográficas (mm) realizadas da JEC-COA entre os diferentes grupos de tratamento onde foi injetado a P. gingivalis.
SLP. gingivalis
Grupo Mediana (Min-Max) p valor
ALN 0,133 (0,282 - 0,061)
0,966
RESV 0,140 (0,255 - 0,061)
β- CD/RESV 0,130 (0,292 - 0,049)
CONTROLE 0,014 (0,227 - 0,042)
Teste de Kruskal Wallis. Nível de significância estabelecido de 0,05 %. ALN: alendronato. RESV: resveratrol. Β- CD/RESV: β- ciclodextrina associada ao resveratrol. β- CD: β- ciclodextrina. JEC-COA: junção esmalte cemento até a crista óssea alveolar. SLP. gingivalis: sem ligadura +
P. gingivalis.
A tabela 3 mostra que quando analisada a maneira de desenvolvimento da doença periodontal, verificou-se que onde foi injetada a P. gingivalis com a presença de ligadura, a perda óssea alveolar interproximal foi significativamente maior, independente do tratamento, RESV (p = 0,007), β- CD/RESV (p = 0,027) e placebo (p = 0,026), exceto no grupo que foi administrado o ALN (p = 0,737), em que a análise estatística não demonstrou diferença nos valores de perda óssea.
Tabela 3 - comparação individual dos grupos de tratamento em relação às medidas interproximais (JEC-COA), quanto à presença ou não da ligadura.
Grupos LP. gingivalis SLP. gingivalis
Mediana (Min-Max) Mediana (Min-Max) p valor
ALN 0,151 (0,03-0,59) 0,158 (0,08-0,28) 0,737
RESV 0,247 (0,06-0,61) 0,143 (0,04-0,23) 0,007
β- CD/RESV 0,201 (0,07-0,51) 0,140 (0,06-0,26) 0,027
CONTROLE 0,217 (0,05-0,45) 0,130 (0,05-0,29) 0,026
Teste de Kruskal Wallis. Nível de significância estabelecido de 0,05 %. ALN: alendronato. RESV: resveratrol. Β- CD/RESV: β- ciclodextrina associada ao resveratrol. Β- CD: β- ciclodextrina
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Discussão
Nesse estudo verificamos que os medicamentos alendronato e resveratrol reduziram a reabsorção óssea alveolar observada no exame radiográfico, frente a dois tipos diferentes de indução de periodontite (injeção de P. gingivalis associada ou não à inserção de ligadura), confirmando a nossa hipótese. Por objetivo tivemos a análise da ação dos medicamentos alendronato e resveratrol em duas situações distintas, porém em um mesmo hospedeiro e, por consequência, constatamos que na indução da periodontite com ligaduras associadas à injeção de P. gingivalis a perda óssea é muito maior do que apenas injetando a P. gingivalis na mucosa palatina. O ALN foi administrado numa dose de 2 mg/kg e o resveratrol em dose de 10 mg/kg, ambos via oral, uma vez ao dia, durante 30 dias. Estatisticamente percebemos que o ALN diminuiu a perda óssea quando administrado em uma periodontite mais avançada. Já no RESV não foi percebida diferença significante em nenhum grau de doença periodontal induzida.
Estudos anteriores apresentaram a indução da periodontite através da injeção de Porphyromonas gingivalis na mucosa14 31, ligaduras posicionadas ao redor dos molares dos ratos28 32 e ligaduras associadas à P. gingivalis11 33. Para termos dois parâmetros de comparação, duas formas distintas de provocar a doença foram utilizadas: no lado direito da maxila através da aplicação exclusiva da P. gingivalis na mucosa adjacente ao dente que seria avaliado e no lado esquerdo pelo posicionamento de uma ligadura ao redor do primeiro molar superior do mesmo rato associada à aplicação da P. gingivalis na mucosa adjacente. Ao induzirmos a periodontite de duas maneiras, também comprovamos a eficácia de cada uma, onde pudemos perceber claramente que,
22 apesar da injeção da P. gingivalis ser extremamente eficiente, na indução da doença pela P. gingivalis associada à ligadura a perda óssea é muito maior.
Desta maneira, para o tratamento da periodontite vimos buscando alternativas ou métodos complementares aos já existentes, sendo que reduzir a carga bacteriana e diminuir os níveis inflamatórios são os principais objetivos36. Os tratamentos tradicionais mais empregados hoje são as raspagens, que promovem a remoção mecânica dos agentes etiológicos da doença periodontal. Nem sempre essa remoção mecânica é totalmente eficaz, nessas situações são utilizadas medicações sistêmicas, principalmente antibióticos, que buscam diminuir a ação bacteriana e melhorar aspectos inflamatórios da doença18.
Os bifosfonatos já vêm sendo amplamente utilizados na medicina para o tratamento de doenças ósseas metabólicas, como a osteoporose, por exemplo. Na periodontia entram como auxiliares dos tratamentos sistêmicos, pois pesquisas sugerem que esses compostos trabalham na diminuição das funções osteoclásticas, resultando na diminuição da perda óssea e podendo auxiliar num aumento de volume e resistência do osso20 21 22. O alendronato é um bifosfonato que já se provou eficaz quando administrado via oral quando Storrer et al. (2016)14 ministrou uma dose de 2 mg/kg e quando aplicado sobre o sítio inflamado por Sharma et al. (2017)24 na forma de gel 1% ALN, porém em altas doses se evidencia citotóxico, como mostrou Martins et al. (2015)37, sendo fundamental o controle de dosagem.
Alguns autores sugerem que o resveratrol age como um potente inflamatório, anti-bacteriano, antioxidante e antifúngico que estimula mecanismos de defesa frente à periodontite, inclusive com Battharai et al. (2016)27 e Corrêa et al. (2016)9 mostrando que o RESV preveniu a perda óssea em periodontite induzida e Chin et al. (2017)35, mostrando a inibição da expressão de citocinas pró-inflamatórias, impedindo o
23 desenvolvimento da doença periodontal. Nesse estudo não observamos melhora significativa da periodontite associada ao uso do RESV, seja em uma periodontite de menor ou maior grau.
Conclusão
Os ratos que fizeram uso do RESV e do Β -CD/RESV, e os que receberam a medicação placebo (β- CD), apresentaram maior perda óssea, na presença de ligadura. Já na presença do Alendronato, a ligadura não aumentou a perda óssea.
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Abreviações
P. gingivalis – Porphyromonas gingivalis
SLP. GINGIVALIS
–
lado sem ligaduras, apenas injeção de Porphyromonas gingivalis LP. GINGIVALIS – lado com ligaduras e associação de Porphyromonas gingivalis ALN – alendronatoRESV - resveratrol
β- CD/RESV – associação de β-ciclodextrina ao resveratrol β- CD – β-ciclodextrina
CNT – controle
Declarações
Agradecimentos
Agradecemos à Universidade Guarulhos por nos ceder as bactérias inoculadas de Porphyromonas gingivalis e ao professor José Domingos Fontana e a UTFPR pelo preparo dos medicamentos utilizados neste estudo.
Financiamentos
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Disponibilidade de dados e materiais
Os conjuntos de dados gerados ou analisados durante o estudo atual, disponibilizados pelo autor correspondente mediante solicitação razoável.
Contribuição dos autores
Todos os autores realizaram as induções da periodonte e o tratamento. DMG e MAB realizaram as tomadas radiograficas. DMG fez as análises radiograficas e escreveu o manuscrito.
Interesses competitivos
Os autores declaram não ter interesses conflitantes.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Aprovação ética
O protocolo experimental (CEUA 373) foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa no Uso de Animais da Universidade Positivo (CEUA - UP).
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Referências
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APÊNDICE 1 - METODOLOGIA
1.1. Animais
Os experimentos foram realizados no Biotério da Universidade Positivo, após a aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais desta universidade (CEPUP 373).
Foram utilizados 120 ratos Wistar machos com 4 meses de vida pesando aproximadamente 350 g. Os animais foram mantidos no biotério em condições controladas de temperatura (23 ±10 C) e umidade relativa (55±5%), com iluminação artificial por lâmpada fluorescente com foto períodos de 12 horas claro e 12 horas escuro, com ração e água (0,7 ppm F) ad libitum.
1.2. Desenho do estudo
Esse estudo em animais teve como desenho o desenvolvimento da doença periodontal no mesmo animal de duas formas, pela injeção da Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) (ATCC®33277™) na mucosa palatina adjacente ao primeiro molar superior com ligaduras e sem ligaduras e posterior tratamento sistêmico, via oral, com alendronato e resveratrol por 30 dias (Figura 1).
29
1.3. Repique e criopreservação da bactéria Porphyromonas gingivalis
A Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) (ATCC®33277™) foi concedida pelo laboratório de microbiologia da Universidade Guarulhos (UNG). Para verificar a viabilidade da bactéria, que foi recebida em uma placa Petri, foi realizada a técnica de semeadura por esgotamento do repique, de onde recolhemos uma pequena porção de bactérias e transferimos para o ágar sangue, que foi incubado por 24 horas à uma temperatura de 36˚ C. Após retiradas da estufa, verificamos a viabilidade das bactérias. Depois do repique, realizamos a criopreservação dessas bactérias, coletando-as novamente do meio sólido (placa de ágar sangue) e transferindo-as para um meio líquido (caldo BHI – brain heart infusion). Em seguida, pipetamos em um criotubo 1 ml de sangue de carneiro desfibrinado ao caldo já existente, que foi incubado a 36˚ C, durante 4 horas. Após esse período, os criotubos foram transferidos para um freezer e mantidos, verticalmente, durante 7 dias a – 20˚ C. Posteriormente, foram descongelados e as bactérias transportadas para um meio de crescimento adequado, através do repique do meio líquido (caldo BHI) para o meio sólido (ágar sangue em placa de Petri). Foi verificada e atestada a viabilidade bactéria. Essa viabilidade foi verificada novamente após 7, 30, 60, 90 dias e 1 ano. Para chegarmos a dosa ideal que seria utilizada, realizamos uma diluição seriada.
Na a indução da doença periodontal, 1ml de 1 x 105 UFC/ml (unidades formadoras de colônias/ml) foi aplicada na mucosa palatina dos ratos. O caldo contendo essas bactérias foi aquecido ante o uso a 60˚ C, por 5 minutos.
30
1.4. Indução da periodontite
Os ratos passaram por um período de adaptação de cinco dias após terem sido transferidos para gaiolas individuais com 3 ratos em cada. Para a realização da periodontite experimental, os animais foram anestesiados com cloridrato de quetamina (90 mg/kg) (Dopalen ®, Agribrands Brasil Ltda., Paulínia, Brasil) e cloridrato de xilazina (12 mg/kg) (Rompun ®, Bayer SA, São Paulo, Brasil) e em seguida posicionados dentro da campânula individualmente e induzidos, também, à anestesia inalatória com oxigênio e isoflurano (Cristália, Itapira, SP, Brasil). A anestesia foi mantida pela vaporização de isoflurano por máscara facial quando necessário. A indução da periodontite foi realizada de duas formas: pela injeção de 1 ml de 1 x 105 UFC/ml da bactéria com o auxílio de uma seringa de insulina (BD Ultra-Fine 100 UI - 6mm) na mucosa palatina adjacente ao primeiro molar superior esquerdo que estava com a ligadura ao redor do dente e do lado oposto foi injetada a mesma quantidade de bactéria na mucosa palatina adjacente ao molar sem ligadura. A injeção da bactéria foi a cada 3 dias durante 15 dias.
Os animais foram avaliados a cada três dias ao longo do experimento para verificar possíveis sintomas clínicos, reaplicação da P. gingivalis e, caso fosse necessário, reposicionamento das ligaduras.
31
1.5. Preparo das medicações
1.5.1. Preparo do Alendronato de Sódio (ALN)
O ALN (Alendronato Sódico, Ultrafarma, Curitiba, Paraná – Brasil) foi manipulado na concentração de 1 mg/ml em suspensão de 2% de carboximetil celulose (CMC) (Storrer, 2016).
1.5.2. Preparo do RESV
O RESV (Mega Resveratrol, Danbury, CT- EUA) foi preparado no laboratório de química da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) na concentração de 10 mg/ml em amido solúvel (MeOH: 50 mg/ml; in water – 3 mg/100ml).
Figura 3- posicionamento da ligadura no primeiro molar superior esquerdo
Figura 2 - injeção da bactéria Porphyromonas
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1.5.3. Preparo do complexo (β-CD / RESV)
Foi utilizada a β- ciclodextrina (β- CD) para encapsular o fenol Resveratrol (RESV; fonte da raiz de Polygonum cuspidatum, Mega Resveratrol, Danbury, CT-USA), tornando-a uma mistura em pó solta. O complexo de inclusão β- CD/RESV foi preparado em uma proporção de 1: 1 Mol. Ambas as drogas secas foram cuidadosamente misturadas em um graal de porcelana com a ajuda de um pistilo. Em seguida, adicionou-se uma quantidade mínima de metanol seco e repetiu-se a agitação vigorosa num capuz ventilado até à completa evaporação do solvente. O complexo β- CD/RESV seco foi dividido em alíquotas de 175 mg em tubos de microcentrífuga roscados até ser utilizado quando cada alíquota foi coletada em 5 ml de água bidestilada para dar uma solução turva de 35 mg/ml do complexo, contendo 10 mg/ml de RESV.
1.6. Tratamento
Após o período de 15 dias da indução da periodontite, os animais foram medicados diariamente via oral por gavagem durante 30 dias de acordo com o grupo de tratamento: o grupo alendronato (ALN) que recebeu a dose de 2 mg/kg de alendronato; o grupo resveratrol (RESV) que recebeu a dose 10 mg/kg de resveratrol dissolvido em 10 mg/ml de amido solúvel; grupo β- ciclodextrina/ resveratrol (β- CD/RESV) que recebeu a dose 10 mg/kg em uma proporção de 1: 1 Mol de β- ciclodextrina e o grupo controle que recebeu a dose de 10 mg/kg de β- CD.
33 A forma de administração dos medicamentos foi via oral através de uma cânula de gavagem (agulha de aço inox curvo 22 GA- Ciencor, com diâmetro de 1,0 mm, esfera de 1,7 mm e comprimento de 31 mm) 1 vez ao dia durante 30 dias.
Ao término do período de tratamento os animais foram eutanasiados.
1.7. Eutanásia
Após 30 dias de tratamento, os ratos foram eutanasiados pela inalação de dose excessiva de isoflurano. Sequencialmente as maxilas foram separadas em direita e esquerda e armazenadas em solução de formaldeído a 10% em tampão fosfato de sódio (Sigma-Aldrich ®, Saint Louis, MO, EUA).
Figura 4 - demonstração da aplicação da gavagem intragástrica
Figura 5 - demonstração da aplicação da gavagem intragástrica
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1.8. Tomada radiográfica
Para quantificar a perda óssea ocasionada pela periodontite após o tratamento com alendronato e resveratrol, as hemimaxilas foram radiografadas utilizando um raio-x digital (X DENT Equipamentos Odontológicos LTDA) com um sensor intraoral digital 3x4 (NewIda), expostas aos seguintes parâmetros: 70 Kvp, 7 mA, distância foco-filme de 30 cm e tempo de exposição de 0,17s, com o feixe do raio-x posicionado perpendicularmente às peças em posicionador.
1.9. Calibração do examinador
Para assegurar a reprodutibilidade das medidas radiográficas, um único examinador foi calibrado realizando cada análise de medida com repetição de três vezes dentro de um período de 7 dias com coeficiente de correlação intraclasse de 0,99 - CCI 95 %.
1.10. Análise radiográfica
A análise das imagens foi realizada sob uma mesma luz artificial em um computador Samsung Expert X23 com monitor de 15,6 polegadas, com o auxílio do software ImageJ ® (https://ImageJ.nih.gov/ij/). Antes de realizar as medidas no programa, foi executado o escalonamento utilizando como parâmetro uma régua micrométrica de 1 mm.
Cada imagem foi ampliada duas vezes no programa. As análises foram realizadas entre as proximais dos primeiros e segundos molares superiores. Para padronizar as medidas, foi traçada uma linha entre a junção esmalte cemento do primeiro ao segundo molar superior. A partir desta linha foram demarcadas outras três linhas,
35 perpendiculares à primeira, até a crista óssea alveolar da região interproximal dos molares. Os valores das três linhas foram tomados em milímetros e transformados em uma única média.
Figura 6 - Desenho esquemático representando a metodologia de medida da reabsorção óssea realizada da JEC-COA. Linha (tracejada) entre as JEC do primeiro e segundo molar superior. Linha do ponto mais alto da COA até JEC em três posições distintas
1.11. Análise estatística
A normalidade de distribuição das variáveis foi avaliada atrás do teste Kolmogorov-Smirnov. As médias de todas as medidas radiográficas foram submetidas ao programa IMB SPSS Statistics (SPSS 22.0, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA), onde foi feito o teste de Kruskal Wallis e Mann-Whitney para comparação entre os grupos. O nível de significância estabelecido foi de 0,05.
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40
ANEXOS
41 2. BMC Oral Health – Submisson Guidelines
Database article
Criteria
Database articles should describe a novel biomedical database likely to be of broad utility. The database must be readily accessible and data within the database should be attributed to a source.
An article describing a database but also including research that merits publication in its own right should either be submitted as a Research article or should be split into a Research article and a separate Database article.
The database described in the manuscript must be available for testing by reviewers in a way that preserves their anonymity. If published, the described databases must be accessible by any researcher wishing to use them for non-commercial purposes, without restrictions such as the need for a material transfer agreement. We may require an archive copy of the database to be held by BioMed Central as a safeguard. Authors who need help depositing and curating data may wish to consider uploading their data to Springer Nature’s Research Data Support or contacting our Research Data Support Helpdesk. Springer Nature’s Research Data Support provides data deposition
