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INDICAÇÕES GERAIS ... 3
ASSIDUÍDADE MÍNIMA OBRIGATÓRIA: ... 6
CRONOGRAMA:... 6
AVALIAÇÃO DA COMPONENTE LABORATORIAL ... 7
ELABORAÇÃO DE RELATÓRIOS:... 8
1. Digestão de carbohidratos, proteínas e gorduras... 11
1.A - Digestão do amido pela amilase salivar... 12
1.B - Digestão da albumina do ovo pela pepsina... 17
1.C - Digestão de lípidos pela acção da pancreatina e da bilis... 20
2. Doseamento da glucose em plasma humano... 23
3. Quantificação do colesterol total e do colesterol HDL... 27
3. A - Determinação de colesterol total: ... 34
3. B - Determinação de colesterol HDL:... 35
4. Análise de hormonas esteróides por T.L.C. ... 36
5. ESTUDO HEMATOLÓGICO... 40
Obtenção de amostras de sangue e anticoagulantes: ... 42
Técnica de colheita de sangue capilar: ... 42
Anticoagulantes: ... 44
5. A – Contagem de eritrócitos e de leucócitos:... 47
Câmara de Neubauer modificada: ... 47
Pipetas diluidoras de Thoma: ... 50
Líquido diluidor:... 51
Tubo de borracha:... 51
5. B - Determinação da concentração em hemoglobina ... 55
5. C - Determinação do tempo de prótrombina... 59
5.D - Determinação do grupo sanguíneo ... 63
Bibliografia: ... 66
! ! " # ! ! $ " Maria Gil Ribeiro (Profª. Drª) – teóricas (regente da disciplina)
Gisela Oliveira (Engª) – práticas laboratoriais (turmas BUQ, CKL e CNJ) Pedro Silva (Prof. Dr.) – práticas laboratoriais (turmas BUP, BUR e CKK)
Para que os objectivos do trabalho sejam atingidos e a segurança no laboratório mantida, as instruções quanto à execução do protocolo experimental devem ser estudadas previamente e o aluno entender o que vai efectuar por forma a planear o tempo de um determinado trabalho e a saber actuar de imediato caso seja confrontado com alguma contrariedade. Deve-se trabalhar sem pressa, com método e cuidado para evitar acidentes e danificar o material do laboratório que é geralmente bastante caro.
Relembram-se, a seguir, alguns dos cuidados a ter no laboratório:
Proibido fumar no laboratório e na zona de acesso imediato. Proibido comer ou beber dentro do laboratório.
Proibido correr, gritar ou comportar-se de outros modos incorrectos.
Usar o máximo de cuidado se necessitar de ligar à corrente equipamentos eléctricos. Verifique que tem as mãos perfeitamente secas e que a tomada e a ficha também estão secos.
Vigiar placas de aquecimento e banhos térmicos que estejam ligados, para evitar o seu excessivo ou desnecessário aquecimento.
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Nunca testar se uma superfície ou um objecto estão quentes com as próprias mãos. Usar um termómetro ou um borrifo de água.
Nunca efectuar pipetagens com a boca mesmo que seja de água. Usar os pipetadores adequados.
Ter conhecimento prévio da toxicidade, poder corrosivo e inflamabilidade dos reagentes com que vai trabalhar (em caso de dúvida perguntar).
Não abrir recipientes de reagentes para cheirar ou espreitar. Alguns possuem vapores tóxicos e / corrosivos.
Não misturar reagentes ou soluções que não estejam indicadas no protocolo laboratorial ou que não tenha conhecimento prévio da sua compatibilidade. Algumas substâncias são incompatíveis com outras e reagem violentamente quando misturadas.
Limpar imediatamente reagentes que tenham sido derramados. Use toalhetes de papel para evitar alastrar o derrame.
Não abandone nem pouse directamente em cima da bancada, pedaços de algodão, lancetas, tubos ou outros objectos eventualmente contaminados com sangue ou outros fluídos fisiológicos.
Utilize os contentores de resíduos perigosos para descartar objectos cortantes, perfurantes, algodões, luvas, tubos e outros objectos descartáveis que possam estar contaminados. Nunca misturar com outro tipo de resíduos.
Após utilização, colocar imediatamente o material de vidro não descartável e contaminado com sangue em recipientes contendo detergente desinfectante. Não misturar com o restante material de vidro.
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Pergunte ao docente responsável pela aula qual deverá ser o procedimento correcto para a eliminação dos restos de soluções e reagentes após ter terminado o seu trabalho experimental.
Não verter restos de soluções nas pias, sem perguntar; quando tiver de deitar reagentes líquidos na canalização, ponha água a correr.
Não deitar pontas de pipetas ou outros objectos sólidos na canalização.
Despejar os resíduos sólidos e colocar o material de vidro (pipetas) e plástico (pontas, cuvettes), nos locais apropriados.
No final do trabalho, colocar o material de vidro utilizado na bancada de lavagem, deixar a bancada limpa, as torneiras fechadas e os equipamentos e aparelhos desligados, a não ser que tenha indicações expressas do contrário.
É obrigatório usar bata branca. A bata é um Equipamento de Protecção Pessoal (EPI) e deverá ter o tamanho adequado para proteger o indivíduo e as roupas em caso de salpicos ou derrames.
A utilização de óculos de protecção é aconselhada pois este é também um EPI fundamental em caso de salpicos que poderão ter consequências graves caso a substância seja corrosiva ou tóxica. Em todos os laboratórios existem sistemas lava-olhos mas que nalguns casos não são suficientes para impedir danos irreversíveis (queimaduras) nos olhos.
As regras de segurança aqui descritas deverão ser cumpridas rigorosamente de modo a garantir a segurança de todos os utilizadores do laboratório. Em caso de dúvida será sempre preferível perguntar do que arriscar.
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Conforme consta no regulamento pedagógico da Faculdade de Ciências da Saúde, desta universidade, os alunos são obrigados a frequentar 80% das aulas laboratoriais, ou seja, comparecer a 11 aulas completas. O aluno que não complete a frequência mínima obrigatória é considerado reprovado à disciplina, não podendo sequer realizar o exame de recurso no final do semestre.
Trabalho Turmas 5ª
feira
Turmas 6ª feira Apresentação, introdução aos trabalhos
experimentais 30 / 10 31 / 10 1A e 1B - Digestão de carbohidratos e proteínas 6 /11 7 /11 1 C – Digestão de lípidos 13 / 11 14 / 11 2 – Doseamento de glicose 20 / 11 21 / 11 3 – Quantificação de colesterol 27 / 11 28 / 11
4 – Análise de hormonas esteróides 4 / 12 5 / 12
Introdução ao estudo hematológico (TP) 11 / 12 12 / 12
5 A – Contagem de glóbulos sanguíneos 18 / 12 19 / 12
5 B- Doseamento da hemoglobina 8 / 01 9 / 01
5 C – Tempo de pró-trombina 15 / 01 16 / 01
5 D – Análise ao grupo sanguíneo 22 / 01 23 / 01
Aula suplementar de compensação / dúvidas 29 / 01 30 / 01
Teste de avaliação teórico - prático 5 / 02 6 / 02
! ! " # ! ! $ ' * A aula suplementar destina-se à repetição dos trabalhos já realizados, no caso em que tenha havido falha técnica ou humana e, ainda, permitir aos alunos compensar uma aula que tenham perdido por motivos de força maior.
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A avaliação da componente laboratorial é feita de modo contínuo durante as aulas e pelas notas obtidas nos relatórios e no teste de avaliação teórico-prático realizado no final do semestre.
O aluno só pode ser admitido a exame teórico se tiver nota da componente laboratorial igual ou superior a 10 valores. Conforme previsto no regulamento pedagógico da Faculdade de Ciências da Saúde, e um aluno exceder 20% de faltas nas aulas laboratoriais, reprova à parte laboratorial e consequentemente fica também reprovado à disciplina não podendo ser admitido a exame teórico em nenhuma época. Automaticamente terá que se inscrever à disciplina no ano seguinte.
Se o aluno tiver aprovação na componente laboratorial e contudo reprovar na avaliação teórica, no ano seguinte só poderá repetir a componente teórica da disciplina. A nota obtida na componente prática não é susceptível de ser melhorada e mantém-se válida durante dois anos lectivos, após o aluno ter frequentado a disciplina.
Os alunos devem apresentar dois relatórios completos relativos aos trabalhos 3 – Quantificação de colesterol total e HDL e 5 A – Contagem de glóbulos sanguíneos. A
data limite para entrega do trabalho 3 é o dia 11 de Dezembro e para o trabalho 5A, o dia 15 de Janeiro.
! ! " # ! ! $ ( Os relatórios serão obrigatoriamente originais e todos os elementos do grupo que estiveram presentes na aula devem participar activamente na sua elaboração. Os relatórios contendo partes copiadas de relatórios de outros colegas serão fortemente penalizados e os relatórios integralmente copiados não serão corrigidos nem considerados para avaliação.
Para os restantes trabalhos, os alunos devem entregar os resultados experimentais e a respectiva ficha no final de cada aula. Esta ficha deve ser assinada por todos os elementos do grupo presentes nessa aula. De igual modo, é suficiente a entrega de uma ficha de resultados por grupo e por trabalho.
Cada relatório não entregue é contabilizada como zero no cálculo da nota laboratorial e os atrasos superiores a uma semana relativamente ás datas de entrega estipuladas são penalizados em 25% da classificação (o que é equivalente a restringir a escala de classificação de zero a quinze valores).
Em termos de resultado numérico, a classificação da componente laboratorial é calculada da seguinte forma:
35% (nota do relatório do trabalho 3) + 35% (nota do relatório do trabalho 5A) + 30% (nota obtida no teste de avaliação teórico-prático) = 100%.
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Os relatórios deverão ser sintéticos, bem estruturados e a linguagem utilizada deverá ser simples e directa. Um relatório deve traduzir o trabalho experimental efectuado, os resultados obtidos e a sua interpretação. Geralmente considera-se que as secções que compõem um relatório completo são as seguintes:
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O título do trabalho deve ser curto e informativo. Nesta página deve incluír-se o nome dos alunos que efectuaram o trabalho experimental assim como o relatório e as datas de execução do trabalho e de entrega do relatório.
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Na introdução deve ser mencionado o problema e a área de conhecimento em que ele se insere, a importância do trabalho e também o seu objectivo. O texto deve ser relativamente curto (uma página no máximo). A introdução deve ser informativa na sua globalidade e não resumir-se a parágrafos desconexos copiados dos livros consultados. Exprimir-se por palavras próprias é imperativo.
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Esta é uma das secções mais importantes num relatório científico pois a descrição do método experimental permite a outras pessoas reproduzir a experiência efectuada. Contudo, em relatórios de aulas, em que o destinatário final (e por vezes o único) é o docente que conhece perfeitamente o trabalho, a transcrição do protocolo experimental é um desperdício de tempo, por isso, devem mencionar-se apenas as alterações efectuadas ao procedimento experimental ou outra informação relevante que não conste no protocolo.
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Esta secção é bastante valorizada na avaliação do relatório e deve incluir todos os resultados obtidos com descrição das observações e medições efectuadas, tanto quanto possível sob a forma de figuras, gráficos, tabelas ou registos. As tabelas, gráficos ou figuras devem estar devidamente identificadas e os gráficos e figuras podem ter legendas. Uma legenda completa inclui um título destacado e uma descrição sumária dos pormenores da experiência cujos resultados nela são apresentados. A informação não deve ser repetida, ou seja, resultados apresentados na forma de tabela não deverão depois ser repetidos na forma gráfica.
Os resultados devem ser apresentados em alíneas separadas, a não ser que se tratem de resultados afins. Nos resultados numéricos deve ter-se em atenção os algarismos
! ! " # ! ! $ *! significativos e as dimensões das grandezas - deve optar-se sempre pelas unidades do Sistema Internacional.
Os cálculos extensos e pormenorizados devem ser remetidos para o final do relatório na forma de anexo, de modo a não tornar o corpo do relatório denso.
( + ) ( ( +
Tal como as restantes partes do relatório, esta secção deve ser escrita com a maior clareza e objectividade, de modo que o leitor possa distinguir entre as conclusões do trabalho e as apreciações críticas resultantes da comparação dos dados experimentais com os resultados teoricamente previsíveis. Esta é a secção mais importante do relatório. A discussão deverá também incluir as conclusões do trabalho experimental e descrever a ocorrência, se for o caso, de determinados erros ou desvios que possam ter afectado os resultados obtidos.
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Consiste na listagem, por ordem alfabética de autores ou pela ordem de citação no texto, de artigos, livros, revistas ou sites consultados para a realização do trabalho. Não existe apenas uma única forma válida de apresentar a bibliografia: algumas pessoas preferem indicar em primeiro lugar o nome dos autores (é a situação mais vulgar), mas por vezes surgem referências bibliográficas apresentadas por ano ou até pelo título do trabalho. Em várias situações poderá também ser útil listar as referências por ordem numérica conforme são citadas no texto. Contudo, deve-se ter o cuidado de ser coerente no modo de apresentação é essencial manter-se o estilo na escrita de um trabalho.
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A nutrição é definida como um conjunto de fenómenos físico-químicos e fisiológicos que ocorrem no interior do organismo e mediante os quais este recebe e utiliza os materiais fornecidos pelos alimentos, que lhe são necessários para a formação e manutenção da sua matéria viva e para a realização das actividades, próprias quer da vida vegetativa, quer da vida de relação e trabalho. No conceito anglo-saxónico, nutrição é o estudo dos nutrientes contidos nos alimentos, desde que são ingeridos até que os produtos finais do seu metabolismo são excretados. Assim, inclui os processos de digestão e absorção, as reacções catabólicas e anabólicas e o estudo das necessidades de nutrição para todos os segmentos do organismo da pessoa saudável.
Os alimentos ingeridos são normalmente biopolímeros: proteínas, carbohidratos e gorduras.
O conjunto de acções sofridas pelos alimentos no tubo digestivo, desde a boca, que levam à desagregação dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas em partículas suficientemente pequenas para passarem a parede intestinal e entrarem na circulação, este processo corresponde à digestão.
O tubo digestivo pode ser visualizado como uma “linha de desmontagem” que os alimentos percorrem devido aos movimentos peristálticos e contracções musculares, e onde são simultaneamente decompostos por acção de enzimas hidrolíticas e outras substâncias excretadas pelas células epiteliais e diversos órgãos glandulares.
Os sistemas complexos de que dispõem o aparelho digestivo do homem para separar os alimentos nos seus nutrientes (que serão, posteriormente, absorvidos), assentam num processo básico, que consiste na actualização de enzimas desagregadoras das grandes moléculas dos constituintes alimentares, sendo os hidratos de carbono convertidos em glicose e outros açucares simples (6 átomos de carbono), as gorduras em ácidos gordos e glicerol e as proteínas em aminoácidos. As enzimas estão contidas nos sucos digestivos da boca, estômago e intestino e são produzidas por glândulas específicas, controladas pelos sistemas nervoso e endócrino.
! ! " # ! ! $ * As bactérias da parte terminal do intestino podem desempenhar algum papel na digestão de certos alimentos, em especial dos constituintes do tipo da celulose, ou fibra, que, resistindo às enzimas digestivas, podem sofrer modificações por acção das celulases bacterianas.
Normalmente, mais de 90% dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas que formam os alimentos são completamente digeridos e absorvidos, mas os ácidos gordos e os aminoácidos essenciais são absorvidos em mais de 98%.
Em fisiologia, a absorção é a penetração de uma substância através das mucosas ou da pele
ou da membrana celular para o meio interno do organismo ou para o protoplasma celular. Em nutrição, a absorção corresponde à passagem através da mucosa do tubo digestivo dos nutrientes que fazem parte da constituição dos alimentos e atingem a corrente sanguínea. A absorção faz-se, principalmente, ao nível do intestino delgado e do cólon, de forma selectiva para cada um dos nutrientes. Os processos fisiológicos da absorção são para certos nutrientes mecanismos simples, como a osmose, mas na generalidade envolvem reacções complexas de passagem para o interior das células da mucosa e, posteriormente, do meio interno destas para os capilares sanguíneos ou linfáticos. Nestas reacções, muito delas ainda mal conhecidas, intervêm iões e moléculas ionizadas, enzimas e hormonas.
Com este trabalho experimental pretende-se evidenciar a função das enzimas amilase salivar, pepsina e lipase pancreática na digestão de alguns alimentos. A actividade ou capacidade digestiva destas enzimas pode ser verificada in vitro medindo o desaparecimento de substractos e o aparecimento dos produtos resultantes. Os resultados obtidos podem ser relacionados com patologias derivadas perturbações genéticas específicas, que condicionam anomalias metabólicas.
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/0 3333 &&&& ++++ 4444 4444 5 )5 )5 )5 )
A maior parte dos alimentos é ingerida sob formas que o organismo não pode utilizar directamente, por serem sólidos ou não serem absorvidos no tubo digestivo. Desta forma, os alimentos precisam de sofrer a mastigação para se produzir a ruptura de parte das suas
! ! " # ! ! $ *" estruturas e, posteriormente, serem decompostos em moléculas suficientemente pequenas para passarem a mucosa da parede intestinal e atingirem a corrente sanguínea.
A desintegração dos alimentos ingeridos em formas assimiláveis é facilitada pelas operações prévias de cozedura, e constitui o processo inicial de digestão.
Na boca, os alimentos vão libertando os seus hidratos de carbono simples e complexos, que começam a ser desintegrados pelos processos de trituração e da digestão enzimática, em resultado dos movimentos de mastigação e pela acção múltipla da saliva. Esta actua pela sua qualidade de líquido humidificante, lubrificante e como veículo da enzima amilase e de
elementos minerais.
A saliva é produzida por três pares de glândulas salivares e é formada por cerca de 99,5% de
água, pelo que favorece a dissolução de moléculas que a mastigação vai libertando dos alimentos sólidos, e inicia o ataque, pela amilase, dos polissacarídeos que são sensíveis à sua acção.
A amilase actua sobre o amido e o glicogénio, em presença de cloro, que é indispensável, desdobrando-os em dextrinas e maltose, de que é corrente apercebermos o sabor adocicado. Mas este efeito não tem significado relevante em digestão porque é de curta duração, e cessa quando o bolo entra em contacto com o suco gástrico estomacal. Este é praticamente inactivo no desdobramento dos polissacarídeos.
No intestino, o conteúdo do estômago (quimo) chegado intermitentemente, de consistência cremácea, vai sofrer desde o duodeno, e após se tornar alcalino, a acção de enzimas pancreáticas (amilase pancreática de efeito semelhante ao da amilase salivar) e intestinais segregadas pelas glândulas de Brunner do duodeno e de Lieberkuhn (dissacaridases: sacarase, lactase, maltase e isomaltase).
Sabe-se que existem várias dissacaridases, dentro das designações genéricas indicadas, sendo quatro particularmente importantes:
Maltase Ia: hidrolisa 50% da maltose e toda a isomaltose.
Maltase Ib (invertase ou sacarase): hidrolisa a totalidade da sacarose e 25% da maltose. Possui uma rápida actividade.
! ! " # ! ! $ *$ No intestino grosso há acção variável da flora intestinal, actuando pelas enzimas hidrolases sobre alguns polissacarídeos não decompostos na parte superior do intestino, como a hemicelulose e, em menor extensão, a celulose, que além de fermentações gasosas, podem produzir alguma glicose.
*+ ) ( ) *+ 6) ( &) *+ 4 7
O amido é a forma de reserva glucídica nos vegetais. Encontra-se em geral na forma de grãos de amido cuja morfologia só varia de acordo com a espécie vegetal. Na maior parte dos casos é formado por dois constituintes:
amilose, um poli-holósido de cadeias lineares, formada de unidades de D-glucose ligadas
entre si por ligações α-1,4-glicosídicas. Admite-se hoje, graças ao estudo dos espectros de raios-X, que a cadeia está disposta em hélice com 6 anéis glucopiranósicos, de configuração em cadeira, em cada volta. Esta estrutura explica a cor azul obtida com o iodo: as moléculas de halogéneo dispor-se-ão ao longo do eixo da hélice sob a forma de um complexo iodo-amilose devido a forças dipolares electrostáticas. Esta propriedade desaparece pela fragmentação da molécula de amilose, na hidrólise.
amilopectina, um polissacarídeo cuja massa molecular pode atingir muitos milhões e é
formado de cadeias principais idênticas às da amilose, mas sobre as quais vêm ligar-se, através de ligações α-1,6-glicosídicas, as cadeias laterais que apresentam estrutura idêntica à das cadeias principais e cujo comprimento varia de 20 a 25 resíduos de glucose.
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O processo de digestão inicia-se na boca, por acção da saliva, que contém amilase salivar, uma enzima que degrada o amido em açúcares redutores, principalmente a maltose.
A maltose, um di-holósido redutor (a função hemiacetálica de uma das oses está envolvida numa ligação osídica com um hidroxilo alcoólico da segunda ose), é um produto intermediário da hidrolise - ácida ou enzimática - de poli-holósidos, tais como o amido e o glicogénio. É formada pela união de duas moléculas de D-glucose através de uma ligação α-1,4-glicosídica.
A função aldeídica ou cetónica dos açúcares é susceptível de ser oxidada; as aldoses e cetoses vão, portanto, comportar-se como redutores e, em particular, vão poder reduzir os sais metálicos, em solução alcalina, até ao estado de metal ou até ao grau de oxidação inferior. Um dos reagentes mais utilizados para detectar a presença de açúcares redutores e para os dosear consiste num sal cúprico (Cu2+). O processo de oxidação das oses ocorre com a redução do hidróxido cúprico, em meio alcalino, de cor azul e solúvel, em hidróxido cuproso, amarelo e insolúvel. Pelo aquecimento à fervura, este desidrata-se e converte-se em óxido cuproso, dando origem a um precipitado vermelho-tijolo:
açúcar reduzido + 2 Cu(OH)2 açúcar oxidado + 2 CuOH (s) + H2O 2 CuOH Cu2O ↓ + H2O
Esta reacção ocorre com todas as moléculas de aldoses e cetoses que têm, senão um grupo aldeídico ou cetónico livre, pelo menos pseudoaldeídico ou pseudocetónico susceptível de fornecer um grupo livre à medida que o estado de equilíbrio da solução se desloca em função da própria reacção.
! ! " # ! ! $ *& Material:
Estufa a 37ºC para incubação de amostras Placa de aquecimento com banho-maria a 100ºC Tubos de ensaio em vidro, cap. 10 ml
Suporte para tubos de ensaio Molas para tubos de ensaio
Pipetas volumétricas de 3 ml, 4 ml, 5 ml Pipetas de pasteur
Vortex Pipetador Cronómetro
Soluções: (encontram-se já preparadas):
Solução de amido: dissolver 1g de amido em 100 ml de H2O destilada com aquecimento.
Lugol: dissolver 1g de iodo e 2g de iodeto de potássio em 300 ml de água.
Reagente de Benedict: Dissolver 5g de carbonato de calcio; 8,5g de citrato de sódio e 0,85g de sulfato de cobre em 500 ml de H2O.
Saliva ou solução de α-amilase (tipo VI-B) diluída de modo a ficar 300 unidades/ml (equivalente à saliva).
! ! " # ! ! $ *' Identificar 4 tubos de ensaio (A1; A2; A3 e A4).
Adicionar a 1 deles 3,0 ml de H2O destilada.
Colocar nos restantes 3,0 ml de saliva ou solução de α- amilase. Ferver em banho de água o tubo A4 durante 3 min e deixar arrefecer. Adicionar (na hotte) 3 gotas de HCl concentrado ao tubo A3 e agitar.
Adicionar a cada um dos 4 tubos 5.0 ml de solução de amido e agitar no vórtex. Incubar na estufa a 37 °C durante uma hora.
Identificar mais 4 tubos de ensaio como B1; B2; B3 e B4;
Transferir metade do volume existente no tubo A1 (ou seja 4 ml), para o tubo B1. Repetir o procedimento para os outros tubos.
Ao conjunto dos tubos A adicionar 3 gotas de solução de Lugol e observar o resultado.
À serie de tubos B adicionar 5.0 ml de reagente de Benedict e colocar em banho de água a ferver durante 2 min. Retirar os tubos do banho e observar.
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/0 3333 &&&& ++++ -(4-(4-(4-(4 5555
As proteínas dos alimentos, quer de origem animal, quer de origem vegetal, só começam a ser digeridas no estômago, e a sua decomposição (até que sejam libertados os aminoácidos
que as constituem), prossegue no intestino, onde se passam as fases principais.
No estômago, as substâncias quimicamente activas são o ácido clorídrico, o pepsinogénio e a quimosina (ou renina). As acções do ácido clorídrico consistem principalmente na acidificação do meio gástrico e no seu efeito hidrolítico. O HCl activa, igualmente, o
! ! " # ! ! $ *( pepsinogénio, transformando-o em pepsina, destrói os micróbios que possam estar presentes
nos alimentos e, ao atingir o duodeno, desencadeia diversos mecanismos essenciais para a digestão das proteínas, nomeadamente as secreções pancreática e intestinal.
A desnaturação das proteínas pelo HCl, em resultado da destruição das ligações de hidrogénio condicionadoras da estrutura terciária, que desaparece, facilita as acções das enzimas proteolíticas.
A digestão das proteínas é iniciada no estômago pela pepsina, que tem origem nas células principais sob a forma de fermento inactivo - o pepsinogénio. A activação da pepsina é desencadeada, no pH adequado, por moléculas de outro pepsinogénio que desdobram o pepsinogénio inactivo, seguindo-se a acção da pepsina activa que, por autocatálise, activa novas moléculas de pepsinogénio.
A pepsina transforma as proteínas desnaturadas pelo ácido clorídrico em proteoses e estas em peptonas, que são ainda polipeptídeos de elevado peso molecular, mas solúveis em solução
aquosa. Hidrolisa as ligações peptídicas, dentro da estrutura dos polipetídeos, pelo que se trata de uma endopeptidase, actuando, preferencialmente nas ligações formadas pelos aminoácidos dicarboxílicos e aromáticos.
No intestino, as proteínas e petídeos oriundos do estômago são atacados pelas enzimas do
suco pancreático, designadamente, a tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase.
As proteases pancreáticas libertam pequenos peptídeos com 2, 3 ou 4 aminoácidos e alguns
aminoácidos, sobretudo tirosina e triptofano.
O suco intestinal segrega várias enzimas, com acção sobre os derivados das proteínas
libertados anteriormente, incluindo a enteroquinase, activadora da tripsina.
Na parte final do intestino, no cólon esquerdo, alguns compostos azotados podem ser substracto de acções bacterianas de putrefacção, com libertação de aminas de cheiro característico, que são bases provenientes da descarboxilação de aminoácidos, como a alanina, a tirosina e histidina.
! ! " # ! ! $ *) Material:
Bisturi
Tubos de ensaio de vidro de 15 ml Congelador
Banho ou estufa a 37°C Suporte para tubos de ensaio Microespátula
Cronómetro Vórtex Pipetador
Pipetas volumétricas de 5 ml Reagentes (encontram-se já preparadas):
Ovo cozido
Esguicho com H2O destilada HCl concentrado (2M) NaOH 10 M
Solução de pepsina (5g em 100 ml) Procedimento:
Colocar 1 microespátula de clara de ovo cozido previamente triturada em cada tubo de ensaio
Identificar os tubos com P1, P2, P3, P4 e P5 Adicionar 1 gota de H2O ao tubo P1
Adicionar 1 gota de HCl 2M aos tubos P2, P3, P4 Adicionar 1 gota de NaOH 10 M ao tubo P5
Adicionar 5,0 ml de solução de pepsina a cada um dos tubos e agitar. Colocar o tubo P3 no congelador durante 1 hora.
! ! " # ! ! $ ! Colocar os restantes tubos na estufa a 37°C durante 1 hora.
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/0 3333 &&&& ++++ '''' *+*+*+*+ )))) ---
-Na boca, as acções mecânicas e de ensalivação dos alimentos são predominantes, não havendo para as gorduras modificações de ordem digestiva. Julga-se que na criança seja segregada pequena quantidade de lípase, activada pelo leite materno.
No estômago, tem sido verificada a existência de uma lípase gástrica muito fracamente activa, que na criança também seria activada pelo leite. Os lípidos são, desta forma, pouco modificados no estômago, apenas se iniciando a sua emulsão pelos movimentos de agitação do conteúdo gástrico que vai sendo evacuado para o intestino, com demora proporcional à natureza dos constituintes dos alimentos em digestão.
Os lípidos desencadeiam a secreção das hormonas enterogastronas pela parede duodenal, as quais inibem a motilidade e a evacuação gástricas.
O pâncreas produz um conjunto de enzimas vulgarmente designado por suco pancreático. Este contém a lipase pancreática, uma enzima que degrada os lípidos emulsionados com os sais da bílis em ácidos gordos e glicerol. O suco pancreático e a bílis são ambos descarregados no duodeno.
No duodeno, a chegada do quimo ácido desencadeia as secreções pancreática, biliar e intestinal, pelo contacto directo com a mucosa, que têm a função de neutralizar o quimo. O desencadeamento da secreção pancreática é essencialmente hormonal, e devido, em primeiro lugar, à secretina, que provoca a secreção de um volume abundante de suco pancreático rico em iões bicarbonato que neutraliza a acidez do quimo, e em segundo lugar, à colecistoquinina (CCK), a qual actua na seceção das enzimas pancreáticas.
! ! " # ! ! $ * A secreção externa do pâncreas contem enzimas activas para todos os alimentos, aumentando a quantidade de cada um deles, proporcionalmente ao uso no regime alimentar de hidratos de carbono, gorduras e proteínas.
A lípase pancreática hidrolisa as gorduras neutras (triglicerídeos) em ácidos gordos e glicerol, mas esta acção não leva sempre à separação completa, encontrando-se mono- e diglicerídeos.
A bílis é enviada para a vesícula onde é concentrada e armazenada. O desencadeamento da excreção biliar, para a secreção da bílis da vesícula, é efectuado intermitentemente pelas gorduras chegadas ao duodeno, sendo a contracção da vesícula biliar estimulada pela hormona CCK.
A bílis é segregada de forma contínua pelo fígado, em volume de 500-1000 ml por dia, sendo estimulada a sua secreção pelos coleréticos fisiológicos e medicamentos. É constituída fundamentalmente por três componentes: bilirrubina, colesterol e sais biliares.
Os sais biliares (glicolato e taurocolato de sódio, conjugados, respectivamente, com glicina e taurina) têm grande capacidade de emulsão, dividindo as moléculas de gordura de forma a constituírem pequenas gotículas, o que faz aumentar enormemente a sua superfície de contacto com os fluídos biológicos, nos quais se encontram as enzimas hidrolíticas.
Os sais biliares desempenham o papel de activadores, ao prepararem as gorduras pela emulsão e reforçarem a actividade das lípases pencreática e intestinal, indispensáveis para a digestão das gorduras.
Material:
Estufa a 37°C
Tubos de ensaio em vidro de 15 ml Microespátula
Caixa de Petri em vidro Fita indicadora de pH
Pipetas de Pasteur em vidro ou em plástico Pipetador
! ! " # ! ! $ Cronómetro
Vórtex
Suporte para tubos Reagentes:
Azeite Sais de bílis
Solução de pancreatina (já preparada). Procedimento:
Identificar 3 tubos de ensaio com L1, L2, L3. Pipetar 3.0 ml de azeite para cada um dos tubos.
Adicionar 1 microespátula de sais de bílis aos tubos L1 e L3 e agitar no vórtex. Pipetar 5.0 ml de solução de pancreatina para os tubos L2 e L3 e agitar no vórtex. Adicionar 5.0 ml de H2O destilada ao tubo L1 e agitar.
Incubar os tubos a 37°C durante 1 hora. Retirar 2 gotas da solução do tubo L1 e aplicar sobre a fita indicadora de pH. Repitar o processo de 20 em 20 min e para cada um dos tubos de modo a obter 4 medidas de pH por tubo.
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Numa pessoa saudável, as concentrações plasmáticas dos diferentes monómeros e biopolímeros (resultantes da digestão ) são mantidas constantes e variam apenas dentro de limites apertados. Quando a concentração de uma destas moléculas no sangue se desvia dos valores normais são activados mecanismos reguladores específicos de modo a compensar estes desvios e a promover que a concentração volte ao normal (mecanismo de feed-back negativo). Assim a homeostasia é mantida.
O diagnóstico de doenças associadas a disfunções no metabolismo dos açúcares depende da determinação da concentração de glucose no sangue. A determinação da glicemia faz parte das análises laboratoriais mais importantes e mais frequentes. Os métodos enzimáticos para o doseamento da glucose têm sobre os outros métodos (processos de redução) a inestimável vantagem de serem simples e rigorosamente específicos da glucose.
Entre estas doenças destaca-se a Diabetes mellitus que se caracteriza pela ocorrência de
valores elevados de glucose no plasma (estes valores elevados pode dever-se também à hiperactividade das glândulas endócrinas, como a tiróide, ou das glândulas adrenais). Por outro lado, a hipoglicémia caracteriza-se por níveis baixos de glucose que podem resultar de doenças do fígado, dos rins, artrite, overdose de insulina, hipopituitarismo, etc. A análise de glucose no sangue é por isso fundamental para o diagnóstico e controlo de várias doenças e perturbações metabólicas. Os resultados das campanhas de despistagem precoce mostram que, em cada dois diabéticos, um não está ainda reconhecido. Mas quanto mais cedo se estabelece o diagnóstico, tanto melhor é o prognóstico. Afecções tardias, principalmente macro- e microangiopatias, podem ser evitadas ou, pelo menos, detidas pelo tratamento dietético e medicamentoso.
A pesquisa de diabetes é especialmente importante em doentes com antecedentes familiares de diabetes, obesidade, lipémia, perturbações circulatórias coronária, periférica e cerebral,
! ! " # ! ! $ $ hipertensão, pielonefrite, durante a gravidez, em afecções crónicas cutâneas, prurido, furunculose, micose e neuropatias.
As determinações da glicemia são indispensáveis tanto para o reconhecimento, como para o controle da terapêutica e da evolução de diabetes mellitus. Cerca de um terço dos diabéticos não apresentam temporariamente glicosúria, apesar de terem hiperglicemia significante. Ainda mais importante que a análise da glicemia em jejum, que na diabetes ligeira pode estar dentro dos limites normais, é a determinação da glicemia duas horas depois duma refeição rica em hidratos de carbono. Reconhece-se mais exactamente uma perturbação metabólica diabética com o “teste de sobrecarga de glucose” que permite verificar a presença não só da diabetes manifesta, como também da latente.
Como método simples de pesquisa de diabetes, depois da realização do teste de sobrecarga de glucose pode determinar-se somente o importante valor da glicemia após 2 horas.
Teste oral de tolerância à glucose.
Sobrecarga de glucose com 50 g ou 1 g de glicose por Kg de peso. Em jejum Após 1 hora Após 2horas
< 100 mg/dl < 160 mg/dl < 120 mg/dl valores normais
100-130 mg/dl 160-220 mg/dl 120-150 mg/dl suspeito
> 130 mg/dl > 220 mg/dl > 150 mg/dl diabético
No ser humano, as concentrações normais de glicemia oscilam nos seguintes valores: 70 - 110 mg/dl pela manhã e em jejum.
O estado metabólico diabético latente é um factor de risco importante para as doenças vasculares ateroscleróticas. Nesta patologia já se encontram frequentemente perturbações circulatórias coronárias e periféricas, hipercolestrolémia e hiperlipidémia.
Especialmente depois de doses elevadas de insulina, encontram-se valores reduzidos de glicemia. No caso de insulinoma e na doença de Addison, pode igualmente manifestar-se hipoglicemia.
! ! " # ! ! $ % Neste trabalho prático será feita a determinação da concentração de glucose em duas amostras de plasma provenientes do mesmo indivíduo e que representam a amostra recolhida em jejum e a amostra retirada 60 min após a ingestão de 100 g de glucose.
O método utilizado é um método indirecto e enzimático em que a glucose é inicialmente oxidada a ácido glucónico e peróxido de hidrogénio numa reacção catalisada pela glucose oxidase:
glucose + 2 H2O + O2 glucose oxidase ácido glucónico +H2O2
O peróxido de hidrogénio de hidrogénio formado, na presença da peroxidase, reage com a 4-aminoantipirina e o p-hidroxibenzenossulfonato para formar a quinoneimina, que atinge um máximo de absorção para o comprimento de onda de 505 nm. A intensidade da cor produzida pela reacção é directamente proporcional à concentração de glucose na amostra: 2H2O2 + p-hidroxibenzenossulfonato + 4-aminoantipirina peroxidase quinoneimina + 4H2O
Material:
Espectrofotómetro programado para 505 nm
Células de espectrofotómetro em acrílico de volume reduzido Pipetador
Pipeta volumétrica de 1 ml Micropipeta automática de 20 µl Pontas amarelas para tubos de ensaio Suporte para tubos eppendorf
Tubos eppendorf Cronómetro Reagentes:
! ! " # ! ! $ & 2 Amostras de plasma humano liofilizado e reconstituído, identificadas como:
J (amostra colhida em jejum);
1H (amostra colhida ao fim de 1 hora após ingestão de 100 g de glucose);
Solução padrão de glucose com a concentração de 300 mg/dl; Reagente “Trinder” com a composição (a pH 7.0):
- 4-aminoantipirina 5x10-4 mol/l - p-hidroxibenzenossulfonato 2x10-2 mol/l - glucose oxidase 15 000 U/l
- peroxidase 10 000 U/l
Procedimento:
Ligar o espectrofotómetro e ajustar o comprimento de onda para 505 nm; Usar água destilada para estabelecer o zero de absorvância;
Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações: Branco; Padrão; J e 1H;
Pipetar 1 ml da solução “reagente Trinder” para cada um dos tubos;
Pipetar 5 µl de água desionisada para o tubo com a designação Branco e inverter para agitar;
Aguardar 30 seg e pipetar 5 µl de solução padrão de glucose para o tubo com a designação Padrão, agitar por inversão;
Respeitando um intervalo de 30 seg, pipetar também 5 µl de cada uma amostras de plasma para os respectivos tubos. Misturar por inversão suave dos tubos;
Incubar à temperatura ambiente durante exactamente 18 min;
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Os lípidos constituem uma família de moléculas muito diversa que partilham uma característica comum que é não serem solúveis em água e por isso também não o são no plasma. Contudo, no plasma podem encontrar-se vários tipos de lípidos:
-ácidos gordos livres (também designados por ácidos gordos não esterificados);
-triglicerídeos (lípidos neutros: óleos e gorduras);
-fosfolípidos;
-esteróides.
Outro elemento comum a todas as moléculas de lípidos é o facto de todas possuírem átomos de carbono, hidrogénio e oxigénio na sua estrutura. Os ácidos gordos apresentam-se em cadeias longas lineares de 16 a 24 átomos de carbono. As moléculas que só possuem ligações simples designam-se de ácidos gordos saturados enquanto que as moléculas que possuem ligações duplas são chamadas de ácidos gordos insaturados. Os triglicerídeos e os fosfolípidos têm estruturas ramificadas derivadas da molécula de glicerol. Numa molécula de triglicerídeo encontram-se ligadas três cadeias de moléculas de ácido gordo. Os triglicerídeos com grau de insaturação reduzido (poucas ligações duplas) apresentam-se como sólidos à temperatura ambiente e são vulgarmente chamados de gorduras, enquanto que as moléculas com maior grau de saturação são líquidos e designam-se normalmente por óleos. Os fosfolípidos têm duas cadeias de ácidos gordos substituídas na molécula de glicerol e um grupo fosfato na 3ª posição. Os esteróides possuem uma estrutura mais complexa com 3 anéis hexagonais, um 4º anel pentagonal e uma cadeia lateral. O colesterol constitui um dos esteróides mais importantes no organismo e é o maior componente das lipoproteínas de baixa densidade (designada por fracção LDL) e um componente menor das lipoproteínas de muito baixa densidade (fracção VLDL) e da fracção HDL (lipoproteínas de alta densidade). A designação de colesterol total inclui todas as formas de colesterol encontradas nas lipoproteínas.
! ! " # ! ! $ ( Como componente de células e tecidos o substracto para a síntese de numerosos
compostos, o colesterol desempenha um papel importante no nosso metabolismo. Para realizar essas tarefas, o organismo humano dispõe de colesterol quer exógeno (absorvido com os alimentos), quer endógeno (sintetizado pelo próprio organismo). Hábitos alimentares diferentes fazem variar muito a quantidade de colesterol fornecido pelos alimentos. Uma alimentação exclusivamente vegetariana não fornece colesterol, enquanto que os produtos alimentares de origem animal fornecem cerca de 1 g de colesterol por dia.
A síntese endógena do colesterol tem lugar principal no fígado, a partir de acetil-CoA que se forma no organismo por degradação dos hidratos de carbono, proteínas e, principalmente, gorduras. Além disso, são local de síntese a mucosa do intestino delgado e outros tecidos e orgãos (com excepção do cérebro do adulto).
É possível que entre a absorção fisiológica normal através dos alimentos e a biossíntese endógena hepática exista um mecanismo de regulação específico que procure estabelecer o equilíbrio do nível de concentração de colesterol no soro. Um vegetariano pode ter uma concentração sérica de colesterol que não se distingue da concentração apresentada por outro indivíduo saudável que faça uma alimentação mista. Naquele caso, a síntese endógena é reforçada para se atingir o valor normal.
Num indivíduo que absorve grande quantidade de gorduras, principalmente animais, a síntese endógena fica inibida, mas só para além dos valores normais da concentração do colesterol no soro. A diminuição da absorção de colesterol diminui a colesterolémia; o
! ! " # ! ! $ ) tratamento medicamentoso reforça esta medida. Parte do colesterol endógeno é lançado na corrente sanguínea através da linfa, parte é transformado em ácidos biliares e hormonas esteróides e, parte é integrada na membrana celular e no tecido nervoso. O colesterol exógeno é emulsionado por sais biliares no intestino, ficando igualmente ao dispor das vias de síntese atrás referidas.
O colesterol absorvido por biossíntese e o colesterol absorvido com os alimentos constituem o pool de colesterol que, no adulto, é aproximadamente 130 a 150 g. Esta quantidade de colesterol distribui-se do seguinte modo:
cérebro: 30 g; músculos esqueléticos: 30 g; pele: 15 g; sangue: 10g; fígado: 5 g; glândulas supra-renais: 0,5 g; restantes tecidos: 40 a 60 g.
A parte de colesterol que o organismo utiliza como produto de síntese é excretada por três vias, de acordo com o metabolismo:
pelas fezes, sob a forma de sais biliares e de esteróides pela urina, como catabolito de hormonas
pela pele, evidentemente em quantidade insignificante
São as lipoproteínas que fazem o transporte do colesterol no sangue. Existem várias lipoproteínas (Lps) que podem ser representadas pela estrutura geral demonstrada na Figura 4 (página seguinte).
Todas as Lps são formadas por uma fracção protéica (apoproteina ou apolipoproteina) e uma fracção lipídica (colesterol livre e esterificado, triglicerídeos e fosfolípidos), em proporções diferentes, segundo o tipo de Lp:
α-lipoproteínas ou HDl pré-β-lipoproteínas ou VLDL β-lipoproteínas or LDL quilomicras
! ! " # ! ! $ "! Do colesterol que aparece no sangue, 70% encontra-se sob a forma esterificada.
Depois da decomposição enzimática do éster, o colesterol esterificado e o colesterol livre no soro são doseados sob a forma de colesterol total. A sua concentração depende da idade, sexo e hábitos de vida do indivíduo.
Há evidências científicas de que valores elevados de colesterol no sangue, nomeadamente da fracção LDL, associados a outros factores de risco como sejam a hipertensão e a condição de fumador, contribuem para o aparecimento da aterosclerose. Por outro lado, a concentração da fracção HDL no sangue está inversamente relacionada com o risco de doenças cardiovasculares.
A determinação do nível de colesterol no sangue pode servir como um indicador da função hepática, função biliar, da absorção intestinal, das funções da tiróide e das glândulas adrenais. A análise do colesterol total e da fracção HDL são de grande importância no diagnóstico e avaliação de doenças cardiovasculares, aterosclerose e outras doenças. Diversos factores como o stress, a idade, a tendência natural (hereditariedade), o equilíbrio hormonal e a gravidez são susceptíveis de afectar os níveis normais de colesterol num indivíduo.
colesterol proteína
fosfolípido
! ! " # ! ! $ "* Verificou-se que pelo menos 10% da população apresenta hiperlipoproteinémia que, na maioria dos casos, não provoca perturbações, mas pode produzir graves alterações patológicas das paredes dos vasos, especialmente, das coronárias, cujas consequências são insuficiência circulatória e lesão de orgãos de importância vital. Estudos epidemiológicos revelaram, igualmente, que a hipercolesterolémia, favorecida por hipertensão e tabagismo, também é responsável pelas coronariopatias.
Angina do peito, insuficiência coronária, enfarte do miocárdio, morte súbita manifestam-se tanto mais frequentemente num período de 10 anos, quanto mais elevada for a concentração sérica de colesterol.
Em caso de hipercolesterolémia, a dieta deve ser rica em ácidos gordos insaturados, como o ácido linoléico, e pobre em colesterol. Quando a terapêutica não baixa suficientemente a concentração, administram-se medicamentos hipolipemizantes.
A hipocolesterolémia pode verificar-se no hipertiroidismo.
É problemática a fixação de valores normais de colesterol. As chamadas determinações do valor normal, que se baseiam em análise duma amostra populacional clinicamente saudável, não excluem que nesta amostra figurem indivíduos cujas doenças ateroscleróticas não sejam ainda detectáveis e cujo nível lipídico é, portanto, erradamente considerado normal. Os valores normais indicados não devem ser interpretados como limites decisivos de opção terapêutica, sendo sempre necessário considerar o quadro global dos factores de risco. Deve considerar-se valor limite de risco elevado de enfarte do miocárdio uma concentração de 220 mg de colesterol/100 ml de soro. Este valor foi obtido do estudo de Framingham, cujo dispendioso método de doseamento fornece valores concordantes com os do teste colorimétrico enzimático.
O “Adult Treatment Panel of National Cholesterol Education Program U.S.A.” considera:
valores desejáveis da concentração de Colesterol Total: < 200 mg/dl
limites aceitáveis entre 200 - 239 mg/dl valores elevados: ≥ 240 mg/dl
valores desejáveis da concentração de LDLc: < 130 mg/dl
! ! " # ! ! $ " valores de risco elevado: ≥ 160 mg/dl
valores desejáveis da concentração de HDLc: H: > 45 mg/dl ; M: > 65 mg/dl
valores de risco moderado: H: 35 - 45; M: 45 - 65 mg/dl valores de risco elevado: H: < 35 mg/dl ; M: < 45 mg/dl
Existem diversos métodos para análise de colesterol em sangue e, da mesma forma que para a determinação de glucose, utilizar-se-á um kit de diagnóstico que se baseia num método enzimático indirecto. A medição do colesterol em cada uma das fracções é determinada após hidrólise enzimática e oxidação.
Os ésteres de colesterol são inicialmente hidrolisados a colesterol e a ácidos gordos livres por acção da colesterol esterase. O colesterol produzido nesta reacção é seguidamente oxidado a 4-colesteno-3-ona e peróxido de hidrogénio numa reacção catalisada pela colesterol oxidase:
ésteres de colesterol + H2O colesterol esterase colesterol + ácidos gordos colesterol + O2 colesterol oxidase 4-colesteno-3-ona + H2O2
O peróxido de hidrogénio de hidrogénio formado, na presença da peroxidase, reage com a 4-aminoantipirina e o ácido hidroxibenzóico para formar a quinoneimina, um corante que atinge um máximo de absorção para o comprimento de onda de 505 nm. A intensidade da cor produzida pela reacção é directamente proporcional à concentração de colesterol na amostra:
2H2O2 + ácido hidroxibenzóico + 4-aminoantipirina peroxidase quinoneimina + 4H2O
Material:
Espectrofotómetro programado para efectuar o varrimento entre 500 e 550 nm Células de espectrofotómetro em acrílico de volume reduzido
! ! " # ! ! $ "" Estufa ou incubadora com temperatura constante a 37ºC
Vórtex Pipetador
Pipeta volumétrica de 1 ml Micropipeta automática de 20 µl Suporte para tubos eppendorf Tubos eppendorf
Cronómetro Reagentes:
1 Amostra de plasma humano liofilizado e reconstituído
Solução padrão de colesterol total com a concentração de 200 mg/dl; Solução padrão de colesterol HDL com a concentração de 50 mg/dl;
Solução de ácido fosfotúngstico (30.3x10-3 mol/l) e de cloreto de magnésio (0.1 mol/l).
Reagente “Infinity” com a composição (a pH 6.6):
- 4-aminoantipirina 2.5x10-4 mol/l -ácido hidroxibenzóico 1.0x10-2 mol/l - colesterol oxidase 100 U/l - colesterol esterase 1 250 U/l
! ! " # ! ! $ "$ 90 90 90 90 3333 )4)4)4)4 *+*+*+*+ )))) Procedimento:
Ligar o espectrofotómetro e ajustar o modo de funcionamento para varrimento entre os comprimentos de onda de 500 a 550 nm;
Usar água destilada para estabelecer o zero de absorvância;
Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações: Branco; Padrão total; Amostra total;
Pipetar 1 ml da solução “reagente Infinity” para cada um dos tubos;
Pipetar 10 µl de água desionisada para o tubo com a designação Branco e inverter para agitar;
Aguardar 30 seg e pipetar 10 µl de solução padrão de colesterol total para o tubo com a designação Padrão total, agitar por inversão;
Respeitando um intervalo de 30 seg, pipetar também 10 µl da amostra de plasma para o respectivo tubo. Misturar por inversão suave dos tubos;
Incubar à temperatura de 37ºC durante exactamente 5 min;
Ler as absorvâncias respeitando também um intervalo de 30 seg entre amostras. Anotar o comprimento de onda para o qual a absorvânica é máxima.
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A determinação da fracção HDL necessita a prévia separação das fracções VLDL e LDL. Esta separação pode ser efectuada por ultracentrifugação ou por precipitação selectiva, sendo o sobrenadante posteriormente analisado em fracção HDL. No presente método utiliza-se uma solução de ácido fosfotúngstico e de cloreto de magnésio que provoca a precipitação das fracções VLDL e LDL, deixando a fracção HDL em suspensão. O doseamento do colesterol HDL é efectuado a partir deste sobrenadante usando o mesmo método que para o colesterol total.
Procedimento:
Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações: Padrão HDL; Amostra HDL; Análise HDL
Pipetar 500 µl de amostra de plasma para um tubo eppendorf
Adicionar 100 µl de solução de solução de ácido fosfotúngstico / cloreto de magnésio
Agitar no vórtex e deixar repousar durante 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 min;
Transferir todo o sobrenadante para o tubo com a designação Amostra HDL;
Proceder ao doseamento do colesterol HDL da mesma forma que efectuou a determinação do colesterol total.
Obs.: para algumas amostras pode ocorrer a precipitação incompleta das
lipoproteínas VLDL e LDL, e neste caso deve utilizar-se uma amostra de plasma diluída com soro fisiológico na proporção de 1:1.
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O sistema endócrino, com a sua grande quantidade de hormonas, afecta todos os tecidos do
corpo humano. Em resposta a um sinal apropriado, um mensageiro químico é libertado e transferido para um tecido alvo, cuja actividade é subsequentemente modificada. Em associação com o sistema nervoso autónomo, algumas hormonas mantêm a homeostasia;
outras, por exemplo, permitem a gestão do stress. As características sexuais, o tamanho e as formas do corpo humano são determinas pelas hormonas esteróides.
Estruturalmente, as hormonas esteróides são derivados esteróides dos triterpenos, caracterizam-se por terem uma estrutura de 4 anéis e possuem um núcleo ciclopentanoperidrofenantreno, como está representado na Figura 5.. Este grupo é de natureza alicíclica constituído por três anéis hexagonais com composição fenantrénica, designados por A, B e C, e por um pentagonal, o anel D.
Pequenas modificações na estrutura podem resultar em grandes diferenças na actividade biológica dos esteróides. Com base na estrutura e na actividade biológica, as hormonas esteróides podem ser agrupadas em 4 categorias funcionais: androgénios, estrogénios, progestogénios e corticosteróides.
Os androgénios são responsáveis pelo desenvolvimento dos caractéres sexuais secundários
masculinos, sendo o androgénio mais importante a testosterona, que é segregada principalmente pelos testículos e, secundariamente, pelo córtex das supra-adrenais.
Os estrogénios promovem o aparecimento dos caractéres sexuais secundários femininos,
sendo a principal hormona o β–estradiol. Os estrogénios são segregados, pelos ovários, ciclicamente, em que níveis elevados destas hormonas alternam com níveis mais reduzidos. O nível máximo de estrogénios atinge-se na ovulação. A progesterona é também uma
A B
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! ! " # ! ! $ "' hormona cuja segregação é cíclica, surgindo na fase final da ovulação. Durante a gravidez, a placenta produz progesterona em níveis que acompanham o desenvolvimento do feto.
Os corticosteróides são hormonas do córtex supra-adrenal e podem subdividir-se em duas
classes funcionais: os glucocorticóides e os mineralocorticóides, sendo segregados por duas regiões distintas do córtex.
Os mineralocorticóides (como por exemplo a aldosterona e a desoxicorticosterona) são produzidos pela zona glomerulosa e estão envolvidos na regulação dos iões sódio e, consequentemente, potássio. Níveis elevados destes corticosteróides estão associados à hipertensão, alterações de níveis de sódio e potássio, cirrose ou problemas de coração ou de rins.
Os glucocorticóides são segregados pelas zonas fasciculada e reticulada do córtex supra-adrenal e intervêm no metabolismo dos hidratos de carbono, proteínas e gorduras. Os glucocorticóides mais potentes são a corticosterona, a cortisona e a hidrocortisona (ou cortisol). Valores elevados de glucocorticóides no sangue estão associados com a gravidez, hiperplasia adrenal e stress devido a doença, intervenção cirúrgica ou queimadura.
Este trabalho tem como objectivo a separação, pela cromatografia em camada fina (TLC -Thin Liquid Chromatography), de hormonas derivadas do colesterol, designadamente, da testosterona (androgénio), β–estradiol (estrogénio) e do hidrocortisona (glucocorticóide) presentes nas amostras fornecidas aos alunos. Pretende-se, igualmente, proceder à identificação dos compostos analisados, calcular os respectivos valores de Rf e, finalmente, determinar a solubilidade relativa das hormonas ensaiadas.
Material:
Placas para TLC em silica gel com indicador de fluorescência F –254 Câmara de cromatografia
Lâmpada de luz UV (λ = 254 nm)
Tubos capilares para aplicação de amostras Óculos de protecção com filtro UV
! ! " # ! ! $ "( Provetas de vidro
Régua Reagentes:
Soluções padrão de hormonas esteróides, com concentração 1.0 mg/ml, nomeadamente: testosterona, hidrocortisona, β-estradiol;
Amostras para análise contendo hormonas esteróides;
Eluente para desenvolvimento da TLC: 160 ml da mistura de solventes contendo tolueno, acetato de etilo e acetona, na proporção de 6:1:1.
Procedimento:
Preparar a solução eluente, na hotte, misturando num frasco com rolha de vidro: 120 ml de tolueno, 20 ml de acetato de etilo e 20 ml de acetona, medidos em proveta. Agitar vigorosamente para misturar e verter na câmara de TLC.
Untar os bordos esmerilados da câmara e da tampa com silicone para esmerilados de modo a manter a câmara bem vedada. Deixar a câmara em repouso durante cerca de 20 min para equilibrar o eluente.
Usando um lápis grosso, marcar suavemente uma linha recta à distância de 2 cm de uma das extremidades da placa de TLC. Todos os pontos de aplicação de amostras e soluções padrão terão origem nesta linha.
Marcar com o lápis os locais onde serão aplicadas as amostras e os padrões, com um espaçamento de 1.5 cm.
! ! " # ! ! $ ") Aspirar a solução padrão com o capilar e com muito cuidado aplicar a amostra na placa sem ferir o adsorvente: encostar a extremidade do capilar à placa mantendo-o quase na vertical e deixar saír uma gota.
Depois desta gota secar aplicar mais solução padrão exactamente no mesmo local, deixando a amostra evaporar entre aplicações. Anotar numa folha de papel a localização da amostra aplicada.
Repetir este procedimento para as restantes soluções padrão e também para as amostras, respeitando os locais previamente marcados.
Depois de aplicar todas as amostras e padrões, colocar a placa de TLC com extremo cuidado e segurando-a pelas extremidades, garantindo que o nível de solvente está abaixo da linha de aplicação das amostras. Deixar em repouso durante cerca de 1 hora para que se desenvolva a cromatografia.
Remover a placa da câmara, mantendo-a na vertical e segurando-a pelo bordo superior. Com o lápis marcar a linha da frente do solvente em ambas as extremidades laterais da placa de TLC.
Escorrer o eluente e colocar a placa sobre uma folha de papel absorvente, na hotte, para secar.
Colocar a placa já seca sob a lâmpada de luz UV para observar os pontos de aplicação. ATENÇÃO: Nunca olhar directamente para a luz ultravioleta! Colocar os óculos de protecção!
Delimitar com um lápis as manchas observadas e traçar a linha de frente do solvente. Analisar o cromatograma e com uma régua medir as distâncias de cada mancha à origem.
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O sangue é um constituinte importantíssimo do organismo e os seus diversos componentes desempenham funções também diversas. O sangue é responsável pelo transporte e distribuição de substâncias a todos os órgãos e tecidos do organismo, como a água, o
oxigénio (vindo dos pulmões) e os nutrientes (absorvidas pelo intestino delgado), e remove os materiais residuais resultantes do metabolismo encaminhando-os para os órgãos responsáveis pela sua eliminação como sejam o fígado, os rins, ou os pulmões. Ele transporta os produtos celulares que são exportados para outros tecidos, assim como os mensageiros químicos de natureza sanguínea que servem de comunicação entre os diferentes órgãos, como sejam as hormonas segregadas pelas glândulas endócrinas e os anti-corpos produzidos por alguns glóbulos brancos.. Além das funções de transporte e comunicação do sangue, os
seus vários componentes desempenham as suas próprias funções independentes.
O sangue proporciona os meios que tornam possível a regulação de muitos aspectos do
ambiente interno ou fluído extracelular. O grande volume e o efeito agitador contínuo da circulação sanguínea permite que a composição do fluído que banha as células se mantenha relativamente constante. No entanto, uma vez que a taxa de trocas entre o sangue e o fluído tecidular pode variar pela alteração do gradiente de pressões, podem ser efectuadas rápidas alterações sempre que necessário.
A regulação do ambiente interno requer normalmente a cooperação dos vários sistemas do organismo, onde o sangue actua como mecanismo de ligação e de encadeamento. A
regulação da temperatura corporal pela distribuição do calor é um exemplo disso. Durante o exercício físico, o músculo esquelético produz uma grande quantidade de calor que deve ser libertado para que o corpo não aumente demasiado a sua temperatura. Para que isso se torne possível, o calor é transportado pelo sangue até à pele, onde pode ser libertado para a atmosfera. Quando o organismo está em repouso, o calor produzido pelo fígado nos
! ! " # ! ! $ $* processos metabólicos é transportado para os tecidos que se encontram mais frios, mantendo-se assim a temperatura corporal.
O sangue é constituído por plasma e por células. A porção fluída do sangue é o plasma, do
qual nove décimos é formado por água, sendo esta utilizada para hidratar todas as células e tecidos.
O plasma é um líquido de cor amarelada que constitui cerca de 55% de todo o sangue. Tem muitas funções importantes:
Distribuição do calor produzido pelo organismo.
Actua como sistema de transporte para uma grande variedade de substâncias, designadamente, gases, hormonas, nutrientes, electrólitos (Na+, Cl-, K+, Ca2+) e produtos residuais, tais como, ureia e creatinina.
Contém as proteínas plasmáticas, as quais constituem cerca de 7% do peso do plasma, desempenhando um papel importante na manutenção da pressão osmótica sanguínea. Sem o seu efeito osmótico seria impossível manter o volume sanguíneo dentro do sistema vascular. Funcionam, igualmente, como tampões químicos, regulando o equilíbrio ácido/base. As diferentes proteínas plasmáticas desempenham papéis particulares. A albumina, por exemplo, devido à sua elevada concentração e pequeno tamanho molecular, contribui significativamente, para a pressão osmótica funcionando também como transportador de substâncias, nomeadamente de ácidos gordos e de determinados fármacos. O plasma contém as proteínas necessárias para a formação e posterior degradação de coágulos sanguíneos. Para além disso, contam várias classes de proteínas, por exemplo, as gamaglobulinas, que são imunoglobulinas essenciais ao mecanismo de defesa do organismo.
As células sanguíneas são por vezes referidas como “elementos figurados”, porque um dos tipos de células, a plaqueta, não é uma célula completa e é desprovida de muitas estruturas
! ! " # ! ! $ $ celulares típicas. A expressão é mais vezes utilizada em fisiologia clássica, do que em situações clínicas, onde a expressão “células sanguíneas” é perfeitamente aceitável.
Outros dois constituintes importantes do sangue são os glóbulos brancos (ou leucócitos) e os
glóbulos vermelhos (ou eritrócitos). Os glóbulos vermelhos contribuem para a função
respiratória do sangue pois são os responsáveis pelo transporte de oxigénio e em menor extensão de dióxido de carbono. Os leucócitos e os seus produtos desempenham um papel importantíssimo no sistema imunitário actuando em caso de infecção reconhecendo e atacando moléculas e células estranhas ao indivíduo. O sangue também inclui as plaquetas que em conjunto com as proteínas do plama ajudam amanter a integridade dos vasos sanguíneos formando os coágulos.
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Antes de se iniciar um estudo hematológico é imprescindível ter conhecimento da técnica correcta para colheita de amostras e também dos anticoagulantes disponíveis e como devem ser utilizados. A maioria da técnicas hematológicas utiliza como amostra sangue completo incoagulável ou plasma. Poderá colher-se por punção capilar, venoso, arterial ou do cordão umbilical mas, estes dois últimos tipos só poderão ser efectuados por médicos. Nas análises que serão efectuadas nesta disciplina todas as colheitas de sangue serão do tipo capilar e efectuadas pelos próprios alunos por razões óbvias.
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