UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
EMMANUEL TELES SALES
PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E IMUNOEXPRESSÃO DE TLR-2, TLR-4, COX-2 e VEGF NA PELE DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR
Leishmania infantum
FORTALEZA – CEARÁ 2017
EMMANUEL TELES SALES
PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E IMUNOEXPRESSÃO DE TLR-2, TLR-4, COX-2 e VEGF NA PELE DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro.
FORTALEZA – CEARÁ 2017
RESUMO
A pele é a primeira barreira mecânica de proteção contra patógenos do ambiente. Na leishmaniose visceral canina (LVC), a infecção ocorre pelo rompimento da barreira da pele pelo flebotomíneo infectado que inocula o protozoário Leishmania infantum. Esses agentes infecciosos desencadeiam respostas imune e inflamatória severas no animal que podem ser avaliadas sistemicamente e no local da infecção. Na LVC, uma resposta inflamatória é desencadeada no sítio infeccioso por células sentinelas que liberam mediadores inflamatórios e citocinas e induzem ao recrutamento de células inflamatórias. Neste trabalho objetivou-se caracterizar o perfil hematológico e bioquímico e avaliar as expressões de VEGF+, COX-2+, TLR-2+ e TLR-4+ na pele de cães naturalmente infectados por L. infantum. Para tanto, cães soropositivos (n=33) foram divididos nos grupos assintomático (GA, n=10) e sintomático (GS, n=23), de acordo com a presença ou ausência de alterações dermatológicas, comparados com o grupo de animais soronegativos (GC, n=5). As principais manifestações clínicas observadas em GS foram alopecia, onicogrifose, ceratoconjuntivite e dermatites eritematosas, esfoliativas e ulcerativas. Amostras de sangue foram coletadas para avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos. Biópsias da pele foram coletadas da região escapular e da ponta de orelha, processados para histologia para avaliação do infiltrado inflamatório (ausente, leve, moderado e intenso) e imunoistoquímica com anticorpos monoclonais VEGF+, anti-COX-2, anti-TLR-4 e anti-TLR-2 (ausente, leve, moderado e intenso). Os animais sintomáticos para LVC apresentaram albuminemia, leucocitose e outras alterações hematológicas compatíveis com descrições da literatura. A contagem diferencial leucocitária apontou para uma neutrofilia e linfopenia significativas do GS quando comparadas aos demais grupos (p < 0,05), estando esse resultado confirmado pela razão neutrófilo:linfócito, também significativamente aumentada. Na histologia foi evidenciado infiltrado inflamatório intenso em GS em relação ao GA e GC. As expressões de VEGF+, COX-2+ e TLR-2 estavam aumentadas na pele de animais GS (intenso) quando comparadas a GA (moderado) e GC (leve), enquanto que a marcação de TLR-4, não foi alterada entre os grupos avaliados. Estes dados indicam o envolvimento de VEGF+ e COX-2, pela ativação do TLR-2, o que pode sugerir uma relação da via de transcrição do NF-kB pelo TLR-2 e não pelo TLR-4 em resposta a infecção por L. infantum.
ABSTRACT
The skin is a mechanical barrier in the protection against environmental pathogens. In Canine Leishmaniasis (CanL), the infection occurs through phlebotomine vectors that inoculate Leishmania infantum through the skin. These infectious agents elicit severe immune and inflammatory responses in the animal that can be assessed both systemically and at the site of infection. In response to the infection, sentinel cells triggered an inflammatory response trough the release of mediators and cytokines that induce recruitment of inflammatory cells to the local of infection. The objective of this study was to characterize the hematological biochemical profile and to evaluate the expression of VEGF+, COX-2+, TLR-2+ and TLR-4+ in the skin of dogs naturally infected by L. infantum. Therefore, seropositive dogs (n = 33) were divided into asymptomatic (AG, n = 10) and symptomatic (SG, n = 23) groups, according to the presence or absence of dermatological alterations, compared to the seronegative group (CG, n = 5). The main clinical manifestations observed in SG were alopecia/hypotrichosis, onychogryphosis, keratoconjunctivitis and erythematous, exfoliative and ulcerative dermatitis. Blood samples were collected for evaluation of hematological and biochemical parameters. Skin biopsies were collected from the scapular region and the ear tip, processed for histology to evaluate the inflammatory infiltrate (absent, mild, moderate and intense) and for immunohistochemistry to evaluate the expressions of VEGF+, COX-2, TLR-4 and TLR-2 (absent, mild, moderate and intense). The symptomatic animals for LVC presented albuminemia, leukocytosis and other hematological alterations compatible with descriptions in literature. The differential blood count shows a significant neutrophilia and lymphopenia in CG when compared to the other groups (p <0.05), and this result was confirmed by the neutrophil: lymphocyte ratio, also significantly increased. In the histological evaluation, both SG and AG presented inflammatory infiltrate. The expressions of VEGF +, COX-2 + and TLR-2 were increased at skin from dogs SG (intense) when compared to AG (moderate) and CG (mild), whereas TLR-4 was not detected between groups evaluated. These data indicate the involvement of TLR-2 in CanL and suggest the NF-kB transcription factor pathway to the VEGF + and COX-2 expressions in cutaneous immune system in response to L. infantum. TLR-4 not participate of this event in dogs naturally infected by L. infantum.
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1 Ciclo biológico da Leishmania spp... 12 Figura 2 Neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e monócitos em
suas diferentes respostas frente à infecção por Leishmania spp... ... 15 Figura 3 Vias de sinalização dos receptores do tipo Toll 2 e 4 em
resposta ao lipofosfoglicano (LPG) da Leishmania spp... 17 Figura 4 Resposta de fase agudada e regulação da expressão hepática
das APP desencadeada pelo estimulo oriundo de desafios diversos, tais como infecção e danos teciduais que podem levar a inflamação... ... 21 Figura 5 Cascata de migração neutrofílica do espaço vascular para o
sítio de infecção... ... 22
CAPÍTULO I
Figura 1 Contagem diferencial entre os leucócitos, neutrófilos, linfócitos e monócitos nos grupos controle (GC), assintomático (GA) e sintomático (GS). Letras (a) e (b) denotam diferença significativa entre os grupos avaliados (p < 0,05)... 40 Figura 2 Percentagem de neutrófilos imaturos nos grupos controle
(GC), assintomático (GA) e sintomático (GS) para Leishmaniose canina. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos avaliados (p < 0,05)... 40 Figura 3 Razão entre neutrófilos e linfócitos nos grupos controle
(GC), assintomático (GA) e sintomático (GS). Letras diferentes denotam diferença significativa entre os grupos
avaliados (p < 0,05)... 41 Figura 4. Razão entre albumina e globulina nos grupos controle (GC),
assintomático (GA) e sintomático (GS). Letras diferentes denotam diferença significativa entre os grupos avaliados (p < 0,05)... 41
CAPÍTULO II
Figura 1 Clinical and dermatologial findings of dogs naturally infected by L. infantum... 53 Figura 2 Histopathological and immunohistochemistry of skin dogs
naturally infected by L. infantum...……….. 54
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 1 Análise hematológica e proteica em cães naturalmente infectados por L. infantum... 39
CAPÍTULO II
Tabela 1 Expressions of COX-2+, VEGF +, TLR-2, TLR-4 and L. infantum on skin of dogs naturally infected with L. infantum... 53
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac Anticorpo
AMP Peptídeos antimicrobianos
APCs Células apresentadoras de antígenos CanL Leishmaniose canina
CCZ Centro de Controle de Zoonoses CD4+ Células T auxiliares
CDs Células dendríticas
CEUA Comitê de Ética em Uso de Animais CanL
CLs
Leishmaniose Visceral Canina Células de Langerhans
DAB Diaminobenzidina
DAMPs Padrões moleculares associados ao dano celular EDTA Anticoagulante
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
GM-CSF Fator Estimulador de Colônia de Monócitos e Granulócitos
HGB Hemoglobina
HE Hematoxilina-Eosina
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
IgE Imunoglobulina E
IL Interleucina
LC Leishmaniose cutânea
LM Leishmaniose mucocutânea LV Leishmaniose Visceral
LVC Leishmaniose Visceral Canina
moCDs Células dendríticas derivadas de monócitos
mg Miligrama
mL Mililitro
NKT Linfócitos T Natural Killer
NO Óxido nítrico
PAMP Peptídeos moleculares associados aos patógenos PBS Phosphate Buffer Saline (Tampão salina fosfato)
PLT Plaquetas
RBC Red blood cell (Hemácias) EROs Espécies reativas de oxigênio TGF-β Fator de Crescimento Tumoral TLR Receptores do tipo Toll
TNF-ɑ Fator de Necrose Tumoral U/L Unidades por litro
WBC White blood cell (Leucócitos)
µg Microlitro
ºC Graus Celsius
SU M Á R I O
1 INTRODUÇÃO... 11
2 REVISÃO DE LITERATURA... 12
2.1 LEISHMANIOSE... 12
2.1.1 O ciclo da Leishmania spp... 13
2.2 RESPOSTA IMUNE CUTÂNEA À Leishmania spp... 13
2.2.1 A pele... 13
2.2.2 Os mecanismos gerais de defesa da pele contra Leishmania spp... 14
2.2.3 Os receptores do tipo Toll na leishmaniose... 16
2.2.4 O processo inflamatório da pele ... 20
2.3 INFILTRADO NEUTROFILICO... 2.4 FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) NA INFECÇÃO POR Leishmania spp... 2.5 CICLOXIGENASE-2 (COX-2) NA INFECÇÃO POR Leishmania spp... 22 23 24 3 JUSTIFICATIVA... 26 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA... 27 5 OBJETIVOS... 28 5.1 OBJETIVO GERAL... 28 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 28
6 CAPÍTULO I - Leucocitose e albuminemia em sangue periférico de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum... 29
7 CAPÍTULO II - Parâmetros inflamatórios e expressões de 2, TLR-4, COX-2 e VEGF na pele de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum... 42
8 CONCLUSÕES... 55
9 PERSPECTIVAS... 56
REFERÊNCIAS... 57
ANEXO... 66
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são zoonoses desencadeadas por protozoários do gênero Leishmania spp. e possuem grande importância para a saúde pública, tanto por sua elevada incidência na rotina veterinária como também por sua importância na clínica humana, estando o Brasil entre os países da América Latina que apresenta maior número de casos humanos (MONTEIRO et al., 2005). Nas zonas urbanas o cão é considerado o principal reservatório da leishmaniose (MAIA et al., 2013) e quando acometido pela forma visceral da leishmaniose (LVC) pode apresentar um amplo espectro de respostas, desde ausência de sintomatologia até uma sintomatologia bastante severa, como: perda de peso, caquexia, alopecia, dermatites, diarreia, conjuntivite, onicogrifose (FREITAS et al., 2012) podendo também levar a morte. É comum o surgimento de dermatites ou alterações cutâneas nos animais infectados, dentre as principais alterações observadas temos as dermatites crônicas, alopecia (principalmente na zona periocular, pregas de pele e articulações), anomalias de cornificação, seborréia seca, hiperqueratose, paroníquia, crostas, onicogrifose e úlceras, além de lesões no focinho e ponta da orelha (SANTOS, 2006; PINHÃO et al, 2009; FREITAS et al., 2012) .
A instalação de agentes infecciosos em animais e seu desenvolvimento, de um modo geral, acarretam diversas alterações inflamatórias no paciente, mediadas principalmente por citocinas e mediadores inflamatórios controlados pela via do fator nuclear kappa beta (NF-kβ) (VALLABHAPURAPU; KARIN, 2009). Essa via inflamatória também é estimulada no caso de infecção pelos agentes da Leishmania spp., desde o momento da inoculação do protozoário pelo flebotomíneo, quando células de defesa do animal entram em contato com os PAMPS do agente infectante. O reconhecimento desses PAMPS é realizado por receptores do tipo Toll (TLR) (MOGENSEN, 2001), que irão ativar a resposta inflamatória do NF-kβ. Essa via de identificação por intermédio de TLR tem sido considerado um importante mecanismo de defesa contra a leishmaniose canina (AMORIM et al, 2011). A via do NF-kβ tem sido estudada por sua importância na promoção da transcrição de genes associados a mediadores da resposta inflamatória, o que desencadeia a síntese de diversas citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 (VALLABHAPURAPU; KARIN, 2009). Outros mediadores liberados por esta ativação como a cicloxigenase-2 (COX-2) (TAK; FIRESTEIN, 2001) e o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) (XIE et al., 2010) são ainda pouco estudados em cães durante a infecção por Leishmania spp., mas podem ser potencialmente importantes para o desenvolvimento e visceralização da LVC (GREGORY et al, 2008).
2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 LEISHMANIOSE
A leishmaniose é uma zoonose grave que ocorre devido à transmissão da Leishmania spp. que são organismos pertencentes ao reino Protista, família Trypanosomatidae, gênero Leishmania e diversas espécies. O parasita é transmitido ao homem pelo vetor flebotomíneo, possuindo várias formas de apresentação, sendo elas: cutânea (LC), mucocutânea (LMC) e a forma visceral (LV) (BRASIL, 2014). A forma visceral é a mais severa, possuindo alta taxa de mortalidade quando não tratada, sendo considerada endêmica no Brasil (WHO, 2016). São conhecidos como agentes etiológicos da leishmaniose canina (CanL) do tipo visceral no brasil as espécies: L. chagasi e a L. infantum, sendo ambos considerados sinonímias (DANTAS-TORRES, 2006). O principal vetor biológico da LV são insetos, fêmeas, da ordem Diptera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae gênero Phlebotomus e Lutzomyia (SHARMA; SINGH, 2008). Os principais hospedeiros mamíferos são roedores, carnívoros e primatas, sendo o cão (Canis familiaris) considerado o principal reservatório e fonte de infecção doméstica da L. infantum (WHO, 2016).
Figura 1: Ciclo biológico da Leishmania spp.
2.1.1 O ciclo da Leishmania spp.
A Leishmania spp. possui ciclo biológico heteróxeno, com uma fase dentro do trato digestivo do flebotomíneo e outra fase no hospedeiro mamífero. A forma móvel e flagelada da Leishmania spp. é denominada de promastigota, ela se desenvolve no intestino do flebotomíneo em vários estágios morfológicos até se tornar a forma infectante, não replicativa e metacíclica (Fig. 1) (KAYE; SCOOT, 2011). Essa é a forma transmitida aos mamíferos durante o repasto sanguíneo das fêmeas, que se torna então a forma amastigota sem flagelo, parasita intra-celular de diversas células de defesa do hospedeiro. A forma amastigota se multiplica por divisão e infecta outras células mononucleares fagocíticas. O ciclo se completa quando flebotomíneos ingerem as células infectadas por amastigotas de mamíferos hospedeiros, que se transformam novamente em promastigotas no intestino e migram de volta para a proboscida (CDC, 2016).
2.2 RESPOSTA IMUNE CUTÂNEA À Leishmania spp. 2.2.1 A pele
A pele recobre a superfície do corpo dos animais formando uma barreira física, sendo esse um dos principais mecanismos de defesa inicial dos animais contra agentes exógenos. A pele é constituída pela epiderme e derme, sendo a epiderme, de origem ectodérmica, formada por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado, que pode ser subdividida em 5 camadas: basal, espinhosa, granulosa, lúcida e córnea. Entre os principais constituintes celulares da pele estão os queratinócitos, células dendríticas maturas e imaturas, monócitos/macrófagos, granulócitos, dentre outras (SIMPSON et al., 2011). Com relação aos constituintes humorais temos as β-defensinas, proteínas do complemento, imunoglobulinas, citocinas, quimiocinas, radicais livres e prostaglandinas (BOS et al., 2009). Estes componentes celulares e humorais formam o sistema imune da pele (GERNER et al., 2015). As células de Langerhans estão localizadas entre os queratinócitos, principalmente na camada espinhosa, e são originadas de células precursoras da medula óssea e transportadas pelo sangue (NESTLE et al., 2009), e juntamente com as células dendríticas na derme, são capazes de capturar antígenos, processá-los e apresenta-processá-los aos linfócitos T, sendo importante para a resposta imune cutânea (GERNER et al., 2015). Entre os principais constituintes celulares do sistema imune da pele estão os queratinócitos, células dendríticas maturas e imaturas, monócitos/macrófagos, granulócitos, dentre outras. Com relação aos constituintes humorais temos as β-defensinas, proteínas do complemento, imunoglobulinas, citocinas, quimiocinas, radicais livres e prostaglandinas (BOS et al., 2009).
2.2.2 Os mecanismos gerais de defesa da pele contra Leishmania spp.
Além da barreira física, a pele também conta tanto com mecanismos de imunidade inata quanto adaptativa. Os mecanismos de defesa inatos estão relacionados a fatores secretados por glândulas sebáceas e sudoríparas, células sentinelas e células fagocíticas (KUPPER; FUHLBRIGGE et al., 2004). As células sentinelas fazem uma correlação entre a resposta imune inata e adaptativa, sendo consideradas células apresentadoras de antígeno (APCs) e importantes tanto para a resposta a infecções como também para manutenção da tolerância imunológica (BRANDONISIO et al., 2004).
Após a picada do flebotomíneo infectado com Leishmania spp., as primeiras células a chegarem ao sítio, são os neutrófilos (PETERS, 2008), os quais podem contribuir direta ou indiretamente na eliminação do parasito. Na infecção por L. amazonensis (NOVAIS et al., 2009) e na L. braziliensis (GUIMARAES-COSTA et al., 2009), o neutrófilo pode tentar neutralizar o parasita tanto através das armadilhas extra-celulares neutrofílicas (NET), como fagocitose ou mesmo promovendo a destruição do parasita no interior de macrófagos infectados. No entanto, a eficácia dos neutrófilos pode ser comprometida por diversos fatores, como por exemplo, as proteínas da saliva do flebotomíneo que podem proteger a L. major no momento da inoculação (CHAGAS et al., 2014). Por outro lado, o processo de apoptose dos neutrófilos infectados por L. major pode inibir a ativação de macrófagos (SCOTT; NOVAIS, 2016) (Fig. 2). Da mesma forma que os neutrófilos influenciam a capacidade de resposta dos macrófagos, estudos com L. major apontam que os neutrófilos também afetam as células dentríticas tanto por promover seu recrutamento através de quimiocinas ligantes CC do tipo 3 (CCL3) como também por inativar as células dendríticas devido sua apoptose (CHARMOY et al., 2010).
Os monócitos são recrutados da corrente sanguínea para o local de infecção por diapedese estimulados pelas quimiocinas CCL2, produzidas pelas células no local da infecção após sua ativação pelo fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)(GONÇALVES et al., 2011). Os monócitos são importantes para o controle do parasita nos momentos mais iniciais da infecção devido a sua potente resposta com espécies reativas de oxigênio (EROs) sobre os agentes invasores (SCOTT; NOVAIS, 2016). Na infecção experimental por L. mexicana, foi encontrada correlação entre um maior número monócitos com maior recrutamento de células dendríticas monocitóides e uma maior resistência ao parasito. (HURREL et al., 2015). SCOTT e NOVAIS (2016) em seu artigo de revisão, como demonstrado na figura 2, descrevem que os monócitos também se diferenciam em células dendríticas que migram para os linfonodos e promovem a diferenciação de células Th0 em
células Th1 por IL-12. As células Th1, por sua vez, migram para o sítio primário de infecção onde auxiliarão na destruição do parasita, tanto via aumento da produção de óxido nítrico (ON) como no aumento de interferon gama (IFN-γ), prostaglandina E2 e do fator de necrose tumoral beta (TGF-β) (Fig. 2) (SCOTT; NOVAIS, 2016).
Figura 2: Neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e monócitos em suas diferentes respostas frente à infecção por Leishmania spp.
Fonte: Adaptado de SCOTT; NOVAIS, 2016
Na infecção por Leishmania spp., em camundongos e humanos, as células dendríticas tem a função de apresentar antígenos processados para células T CD4+ naive, o que desencadeia uma diferenciação dessas células em uma resposta que pode ser tanto do tipo Th1 como Th2 de acordo com estímulos de patógenos e de citocinas liberadas, sendo a resposta predominante de Th1, mediada principalmente por IL-12, a principal responsável pelo sucesso da resposta celular contra o parasita (BRANDIONISIO, 2004).
Com relação as células de Langerhans (CLs), são células dendríticas residentes na epiderme e correspondem as APCs mais abundantes da pele. No entanto, estudos têm apontado a capacidade da L. major em inibir a resposta imune associada às CDs e CLs, isso principalmente pelo retardo na maturação das CDs (BRANDONISIO et al., 2004) e pela
inibição na migração das CLs (PONTE-SUCRE, 2001). Essa sinalização foi atribuída ao principal glicoconjugado expresso na superfície da L. major. a Lipofosfoglicano (LPG), que é seu principal fator de virulência (PONTE-SUCRE, 2001), sendo considerado um PAMP. Essas estruturas moleculares são indentifcadas pelos receptores de reconhecimento padrão (PRRs) expressos nas superfícies das células sentinelas.
2.2.3 Os receptores do tipo TOLL na leishmaniose
Os PRRs são responsáveis não só pelo reconhecimento das moléculas PAMPS, associadas à microorganismos patógenos, mas também pelo reconhecimento de padrões moleculares associados a dano celular (DAMPS) e as moléculas relacionadas ao dano e morte celular ou alarminas, presentes no desenvolvimento das alterações inflamatórias de curso crônico de muitas doenças (PICCININI; MIDWOOD, 2010). Dentre os principais PRRs estão os receptores do tipo toll (TLR), esses receptores são proteínas trans-membranares que conferem especificidade para as células do sistema imune inato, sendo um dos principais receptores no reconhecimento da infecção inicial e capazes de induzir potente resposta inflamatória. (KAWAI; AKIRA, 2011). Essa família de receptores compreende do TLR1 ao TLR11, tendo como função tanto especificidade de reconhecimento de patógenos distinta como também produção de citocinas. Esses receptores encontram-se localizados tanto na membrana plasmática quanto na membrana interna de macrófagos, células dendríticas e células natural-killers (NKT), tendo expressão também em linfócitos T e B. Os receptores intracelulares são TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9, enquanto os receptores de membranas plasmática são TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 e TLR6 (KAWAI; AKIRA, 2011). Após o reconhecimento dos antígenos os TLR, por intermédio diversas moléculas adaptativas como a MyD88, ativam o fator nuclear kappa beta (NF-kβ) que levam informação até núcleo e promovem a síntese de citocinas pró-inflamatórias, quimiocínas além de regular positivamente moléculas co-estimulatórias presentes em macrófagos e células dendríticas que irão atuar sobre a ativação das células T e no desenvolvimento das respostas do tipo Th1 ou Th2 (ZEYTUN et al., 2010).
O glicoconjugado superficial majoritário da Leishmania spp. é o lipofosfoglicano (LPG), este é um importante fator de virulência para a sobrevivência do parasito, ao mesmo tempo em que é o principal componente a ser reconhecido pelos receptores Toll na defesa do hospedeiro, principalmente pelos TLR2 e 4, que desencadearam uma resposta inflamatória ao seu contato (FARIA et al., 2012). Uma vez reconhecidos os LPGs pelos TLR2 e 4, inicia-se a
ativação sequencial de MyD88 e da proteína adaptadora indutora de interferon (TRIF). O MyD88 é um adaptador essencial para a resposta inflamatória que irá desencadear a fosforilação do receptor de TNF associada ao fator 6 (TRAF6) que desencadeará a ativação da via inibitória do kβ (IKK) do NF-kβ e da MAPK (proteína quinase mitogênica ativada), ambos levando a produção de citocinas inflamatórias (Fig. 3) (KRISHNAN et al., 2007). A sinalização pela via MyD88 pelos receptores Toll é uma das mais estudadas, ela desencadeia uma série de eventos que levam a degradação do IKK (IkB), que resulta na translocação do NF-kβ para dendtro do núcleo, resultando na produção de citocinas pró-inflamatórias (KAWAI; AKIRA, 2011).
Figura 3: Vias de sinalização dos receptores do tipo Toll 2 e 4 em resposta ao lipofosfoglicano (LPG) da Leishmania spp.
Fonte: Adaptado de KRISHNAN et al., 2007.
O NF-kβ são um grupo de proteínas que regulam a transcrição genética que codifica várias proteínas pró-inflamatórias bem como quimiocinas e moléculas de adesão (BONIZZI; KARIN, 2004). Essa resposta inflamatória NF-kβ desencadeado pelo reconhecimento dos TLR têm sido considerada um dos principais mecanismos de defesa contra o protozoário da CanL (AMORIM et al, 2011). Um dos primeiros testes in vivo para corroborar essa importância foi realizado em camundongos com ausência de MyD88 em que foi observado grande número de lesões cutâneas quando comparados a camundongos com presença de MyD88 (MURAILLE, 2003). A ausência dessas moléculas MyD88, importantes para a sinalização dos TLR, desencadearam uma forte resposta th2 com aumento dos níveis de IL-4
e diminuição nos níveis de IFN-Y e IL-12, sugerindo a provável importância desses receptores para o desenvolvimento da resposta do animal contra a leishmaniose. Estudos posteriores em camundongos infectados por L. major apontaram os TLR 2, 4 e 9 como os prováveis mais importantes receptores para os PAMPs do protozoário (TUON, 2008).
Na leishmaniose, os efeitos da expressão de TLR2 são controversos, estudos apontam que a ausência desse receptor em camundongos leva a uma resistência maior a L. braziliensis quando comparados a camundongos sob as mesmas condições que com ausência do MyD88 se tornavam mais suscetíveis à infecção (VARGAS-INCHAUSTEGUI et al., 2009). Além disso, camundongos infectados com L. major demonstraram uma interação do TLR-2 com o LPG do parasita capaz de modular uma redução na expressão do TLR-9 em macrófagos e uma consequente redução na resposta anti-leishmanial (SRIVASTA et al, 2013). Já quando avaliados infecção em camundongos por L. infantum, foi observado um aumento tanto na transcrição de TLR-2 como de TLR-4, bem como das suas citocinas associadas. Em todos os períodos de avaliação realizados, animais infectados apresentaram transcrição do mRNA para TLR-2 no fígado superior ao controle (CEZÁRIO et al., 2011).
Estudos em cães com o intuito de avaliar o comportamento desses TLR frente à infecção por LV, tanto natural como experimental, ainda são recentes. Em cães naturalmente infectados por L. infantum foi observado um aumento de TLR2 e TLR4 no baço possivelmente associado a uma evolução da doença (MELO et al., 2014). Alguns segmentos do trato gastro-intestinal apresentaram diferenças em suas respostas imunológicas. O jejuno mostrou uma carga parasitária menor com aumento na expressão de TLR9, por outro lado, o cólon teve uma carga parasitária mais elevada com aumento da expressão de TLR2 e de IL-4, sendo observado, dessa forma, uma correlação entre aumento da expressão do TLR-2 pela infecção de L. intantum (FIGUEIREDO et al., 2013). A importância do TLR2 também é discutida quando estudado sistema nervoso central de cães naturalmente infectados por L. chagasi, onde foi observado aumento na expressão desse receptor, corroborando sua provável importância na resposta contra a leishmaniose (MELO et al., 2013).
Em cães experimentalmente infectados por L. infantum, quando avaliado a transcrição de TLR diversos órgãos após período de tempo de 6 e de 15 meses do início da infecção, foi observado após 6 meses uma correlação positiva da expressão de TLR4 e IL-17 no fígado com o aumento da carga parasitária. Com relação a cargas parasitárias na pele foi observada uma correlação positiva moderada a forte na transcrição de TLR3. Após 15 meses foram observadas correlações positivas na pele apenas para IL-17, enquanto que a transcrição de TLR2 e TLR9 estava regulada negativamente. Nos linfonodos, após esse mesmo período, foi
observada uma correlação positiva com TLR-4. (HOSEIN et al., 2015). Estudo recente com biopsia de pele de cães naturalmente infectados por L. infantum e apresentanto alterações dermatológicas mais leves como dermatite papular (CanL estágio I) quando comparada com manifestações cutâneas mais severas de CanL (estágio I e II) apresentou uma frequência significativamente maior de formação de granuloma, uma tendência a menor carga parasitária e uma expressão significativamente menor de TLR2. Esse resultado indica uma possível associação da leishmaniose cutânea com TLR2 (ESTEVE et al., 2015).
Em um estudo com camundongos, foi observado que os parasitas da leishmaniose podem ser capazes de modular negativamente a ativação da resposta inflamatória, esse mecanismo ocorre via infecção das células dendríticas pela promastigota da L. infantum promovendo clivagem de subunidades do NF-kβ, levando a uma desaceleração na maturação ou ativação das células infectadas pelo protozoário (NEVES et al., 2010). Esse efeito negativo sobre o NF-kβ afetando as células dendríticas e macrófagos infectados desencadeia diminuição na produção de citocínas e de enzimas relacionadas a produção de mediadores inflamatórios secundários, tornando a resposta imune à leishmaniose, em especial a Th1, menos eficiente (REINHARD et al., 2011). O NF-kβ tem participação importante também em processos de controle anti-inflamatório, atuando diretamente na inibição da expressão de genes pró-inflamatórios e também na modulação da expressão e ativação de citocinas diversas como a IL-10 (TOMCZAK et al., 2006). Por outro, o NF-kβ como fator de transcrição também tem função crucial para o processo inflamatório na síntese de citocinas dentre as quais TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 (VALLABHAPURAPU; KARIN, 2009). Além desses mediadores inflamatórios, o NF-kβ também tem importância na expressão da cicloxigenase-2 (COX-2) (TAK; FIRESTEIN, 2001) e também importância em processos de angiogênese e possivelmente participação na expressão do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) (XIE et al., 2010), fator de angiogênico importante no processo inflamatório. Através da estimulação das citocinas TNF-a e da IL-1 pelas vias de ativação do NF-kβ (TNF-α), temos a estimulação de células endoteliais e consequente aumento da expressão de moléculas de adesão, favorecendo à migração neutrofílica (BEHM et al., 2012).
2.2.4 O processo inflamatório da pele e as proteínas de fase aguda
Uma vez que haja a inoculação do protozoário através do rompimento das barreiras físicas da pele, com consequente ativação das diversas vias de liberação de citocinas inflamatórias como já visto, ocorre então o processo inflamatório. Esse processo inflamatório lesivo da pele em cães afetados pela leishmaniose pode se agravar à medida que temos o
alojamento e aumento da carga parasitária na pele desses animais e principalmente quando a evolução da infecção desencadeia danos epiteliais característicos das infecções secundárias, tais como observadas na dermatite papular (LOMBARDO et al., 2014, ORDEIX et al., 2006).
De uma forma geral, a inflamação é um mecanismo de defesa inato dos tecidos vascularizados para eliminação de agentes estranhos ou exógenos (GRIVENNIKOV et al., 2010). O processo inflamatório pode ser classificado como agudo ou crônico, onde, no primeiro caso, os mecanismos de defesa celulares e vasculares atuam em um espaço curto de duração, em que é observado um aumento da permeabilidade vascular, com migração de leucócitos em geral, mas principalmente neutrófilos (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013). Por outro lado, a inflamação crônica caracteriza-se por sua duração mais longa, permanecendo instalada e influenciando a persistência crônica de macrófagos, angiogênese e dano tecidual (FREIRE; VAN-DYKE, 2013).
O processo inflamatório desencadeia cinco sinais clínicos clássicos, sendo eles edema, calor, rubor, dor e perda da função. O edema, causado pela fase exsudativa, é resultante do aumento da pressão hidrostática devida a saída de moléculas de água e proteínas para o meio extra-capilar. O calor e o rubor são oriundos da fase vascular, onde há hiperemia arterial (aumento do volume sanguíneo local), essas alterações vasculares são oriundas da vasoconstricção arterial e vasodilatação e permeabilidade venular induzidas por histaminas e prostaglandinas. Por fim, a perda de função é decorrente do edema (principalmente em articulações, impedindo a movimentação) e da dor (devido a compressão das fibras nervosas locais devido ao edema, agressão direta às fibras nervosas), que dificultam as atividades locais. A fase vascular e exsudativa resultam em grande quantidade de mediadores oriundos do estimulo dos agentes patógenos invasores que, uma vez drenados aos linfonodos regionais, iniciam uma resposta imune no animal (MEDZHITOV et al., 2008; ROCK et al., 2010; FREIRE; VAN-DYKE, 2013).
No momento em que as células de defesa como monócitos e macrófagos são ativadas em resposta ao estímulo inflamatório devido a danos teciduais ou infecções, temos uma consequente ativação da resposta de fase aguda, onde diversas citocinas são liberadas pelas células inflamatórias, tais como IL-6, IL-8, IL-1 e TNF-a (JAIN et al., 2011). Essa resposta de fase aguda é um tipo mecanismo de defesa rápida e não específica contra distúrbios que alterem a homeostasia, tanto de forma localizada como generalizada, alterações essas que podem ser desencadeadas por inflamação, infecções, dano tecidual, neoplasia entre outros (Fig. 4) (PETERSEN et al., 2004). O resultado dessa resposta inclui mudanças na concentração de algumas proteínas plasmáticas denominadas de proteínas de fase aguda
(APP), produzidas pelo fígado. Entre as principais proteínas de fase aguda que sofrem essa alteração temos o haptoglobina (Hp) e a proteína C-reativa (PCR) que sofrem aumento em sua concentração sorológica e a albumina que sofre diminuição (BODE et al., 2011). Durante esse processo inflamatório, a IL-6 induz a produção da PCR que é um importante marcador da atividade inflamatória, estando presente em altas concentrações em até 48 horas após o início do processo inflamatório (CRAY et al., 2009). Em cães naturalmente infectados por L. infantum, é possível observar um aumento significativo da concentração do PCR circulante, principalmente em cães sintomáticos (MARTINEZ-SUBIELA et al., 2002).
Figura 4: Resposta de fase agudada e regulação da expressão hepática das APP desencadeada pelo estimulo oriundo de desafios diversos, tais como infecção e danos teciduais que podem levar a inflamação.
Fonte: Adaptado de BODE et al., 2011.
2.3 INFILTRADO NEUTROFÍLICO
O processo inflamatório na fase celular desencadeia acúmulo de leucócitos em tecidos infeccionados por via do recrutamento celular pelas citocinas e quimiocinas. Ambas favorecem a ligação desses leucócitos ao endotélio com concomitante migração através do endotélio em direção ao local da infecção. Entre os leucócitos, temos tanto neutrófilos como monócitos migrando ao local da infecção fagocitando e destruindo agentes patógenos, no
entanto, também essas células podem causar dano tecidual pela liberação de enzimas e EROs (SCHMIDT et al., 2013; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
Esse recrutamento leucocitário, mais especificamente o neutrofílico, envolve uma cascata que compreende as seguintes etapas: ancoragem, rolamento, adesão e transmigração para além da barreira do endotélio em direção aos tecidos afetados (Fig. 5) Essa cascata é desencadeada graças a mudanças na superfície do endotélio resultante de estimulação por mediadores pró-inflamatórios (TNF-α and IL-1) oriundos das células sentinelas presentes nos tecidos quando entram em contato com agentes patógenos (PHILLIPSON; KUBES, 2011). Para atravessar a membrana basal e o endotélio, processo que leva de 10 a 20 minutos, é necessário o auxilio das integrinas, de moléculas de adesão pertencentes à super-familia das imunoglobulinas, como as moléculas de adesão intercelular 1 e 2 (ICAM1 e ICAM2) (SPRINGER, 1994), de molécula de adesão celular-vascular 1 (VCAM1) (OSBORN et al., 1992), além de diferentes tipos de proteínas de junção como CD31, CD99, molécula de adesão juncional (JAMs) e moléculas de adesão celular endotelial (ECAM) (MULLER, 2011).
Figura 5: Cascata de migração neutrofílica do espaço vascular para o sítio de infecção.
Fonte: Adaptado de PHILLIPSON; KUBES, 2011.
Após esse processo de diapedese, os neutrófilos permanecem predominantes como células de defesa no local de lesão em um momento inicial que se estende por até 48 horas do início do processo inflamatório. O papel desse infiltrado neutrofílico é central para a resolução do processo inflamatório, mas também pode desencadear danos teciduais. Estudos
apontam que o agravamento e cronicidade de condições inflamatórias em diversas alterações, tais como diabetes, artrite reumatoide ou em alguns quadros infecciosos, pode desencadear um aumento considerável do infiltrado inflamatório neutrofilico e a um severo dano tecidual com agravamento da condição clínica do animal acometido (BIAN et al., 2016). Dessa forma, é importante estudar o infiltrado inflamatório em animais com doenças que podem desencadear sintomatologia de lesões crônicas em diversos órgão e tecidos, tal como observado na leishmaniose.
2.4 O FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) NA INFECÇÃO POR Leishmania spp.
O dano tecidual da pele, em animais sintomáticos, desencadeado nos processos inflamatórios crônicos pelos diversos fatores já citados (liberação de enzimas e mediadores por neutrófilos e macrófagos), além da ação das espécies reativas de oxigênio sobre os agentes patógenos da pele, é contra balanceado pelo processo de resposta cicatricial que visa reestabelecer a homeostase desses tecidos (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
É na etapa proliferativa que observamos o predomínio da angiogênese, além de deposição da matriz extra-celular e recuperação do tecido epitelial perdido e da deposição do tecido de granulação. Esse processo de angiogênese é resultante da liberação de mediadores químicos pelos macrófagos, como o VEGF que irá atrair fibroblastos para o local da lesão epitelial, para compor o tecido de granulação (BARRIENTOS et al., 2008; TELLER; WHITE, 2011). Por fim, ocorre no local de lesão tecidual o processo de fibroblastia, que compreende: a ativação dos fibroblastos, produção de colágeno e substituição por tecido conjuntivo. Esse processo é essencial para a recuperação tecidual e é completamente dependente da formação concomitante de vasos sanguíneos pela angiogênese estimulada principalmente pelo VEGF (BAO et al., 2009; GREAVES et al., 2013).
O fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) é uma sub-familia de fatores de crescimento, são proteína de sinalização e são subdivididas em: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D, sendo que apenas o VEGF-A está diretamente ligado ao papel de formação dos vasos sanguíneos. Várias moléculas são apontadas como tento algum tipo de participação no processo de angiogênese, tais como: TGF-α, TGF-β, HGF e IL-8 (YANCOPOULOS et al., 2000). No entanto, apesar de ser um processo bastante complexo e com a participação de diversas moléculas, estudos vêm apontando a importância crucial do VEGF para a angiogênese, tanto natural como desencadeada por processos patológicos, tais como crescimento tumoral e metástase (YANG et al., 2015), diabetes (GUPTA et al., 2013) ou
mesmo em infecções que possam desencadear sinais clínicos de desordem epitelial, como a leishmaniose (FRAGA et al., 2012). Essa angiogênese observada em processos patológicos é iniciada em resposta à hipóxia, a situações de isquemia ou ao próprio processo inflamatório (ZAREMBER; MALECH, 2005).
Na infecção por leishmaniose estudos tem apontado que as lesões epiteliais encontradas nos quadros clínicos podem estar associadas à hipóxia em camundongos (ARRAIS-SILVA et al., 2005) e em humanos acometidos por leishmaniose cutânea (FRAGA et al., 2012). Estudo recente in vitro, formas pro-mastigotas de diversas cepas de Leishmania spp., entre elas a L. infantum e a L. donovani, demonstraram interação com fatores pró-angiogênicos como o VEGF (ARDORE et al., 2014). Não apenas os sinais clínicos de lesão da pele na leishmaniose estão relacionados com quadros de hipóxia, o controle in vitro dessa mesma hipóxia no decorrer da infecção por leishmaniose foi apontado como possivelmente associado à diminuição das porcentagens de células infectadas (COLHONE et al., 2004).
Por outro lado, a promoção da angiogênese pode também proporcionar um ambiente favorável para o desenvolvimento da leishmaniose, tendo com base o fato de que algumas moléculas leishmanicidas têm potenciais anti-angiogênico (GALAL et al., 2009). Existem evidencias que também algumas formas de Leishmania spp., como a L. donovani, pode ser capaz de ativar o fator indutor de hipóxia 1 (HIF-1) que regula a ação do VEGF no intuito de auxiliar sua adesão e sobrevivência em macrófagos (SINGH et al., 2012).
2.5 A CICLOXIGENASE-2 (COX-2) NA INFECÇÃO POR Leishmania spp.
A COX é uma enzima que pode ser encontrada em três isoformas distintas, a COX-1, COX-2 e a COX-3. A COX-1 encontra-se expressa na maior parte dos tecidos com função de sintetizar baixos níveis de prostaglandinas e manter as funções fisiológicas normais do organismo (SMITH et al., 1996). A COX-2 é induzida como uma resposta a estímulos pró-inflamatórios e a citocinas, tendo como principal função a liberação de prostaglandinas. Expressam-se em células de diversos órgãos entre os quais neurônios, células epiteliais da região cortical do rim, células endoteliais (HARRIS, 2006) e células da epiderme submetidas a processo inflamatório em diversas espécies, tais como camundongos (FUTAGAMI et al., 2002) e cães (Fig. 6) (HAMAMOTO et al., 2009). Por fim, a COX-3 é apenas uma variação da COX-1 com expressão e função de relevância ainda questionável (SCHWAB et al., 2003).
A expressão de COX-2 é regulada pelo NF-κB em resposta a diferentes estímulos pró-inflamatórios, como lipopolissacarídeo, TNF-α e IL-1, em diferentes tipos celulares (TAK; FIRESTEIN, 2001). O mecanismo de ação da COX ocorre pela conversão do ácido
aracdônico (presente na membrana plasmática) em prostaglandina G2 e posteriormente em prostaglandina H2 que servirá então de substrato para tromboxano A2 (TxA2) e para prostacilcinas (PGI2, PGD2, PGE2 e PGF2α). Ambas as COX do tipo 1 e 2 possuem uma estrutura morfológica relativamente semelhante, que permite essa interação com o ácido aracdônico, no entanto, a COX-2 possui capacidade de reconhecimento de substrato bastante superior a COX-1, tendo ainda a capacidade de metabolizar o ácido eicosapentaenoico (EPA) irá auxiliar na produção de mediadores anti-inflamatórios e de pró-resolução (RAJAKARIAR et al., 2006). Apesar de estudos apontarem que tanto a COX-1 como a COX-2 tem importância no processo inflamatório, são as prostaglandinas oriundas da COX-2 que possuem papel importante nas fases de resolução do processo inflamatório. Nos quadros de infecção por leishmaniose sem resolução satisfatória, ou seja, com inibição da resposta do tipo 1, temos a produção de IL-10 que desencadeia a inibição da IL-12. Além do IL-10, a PGE-2 induzida pela COX-2 em infecções também pode estar associada à inibição da produção do IL-12 (BHATTACHARJEE et al., 2012). Dessa forma, aponta-se que a produção de PGE-2, mediada por COX-2, pode levar a uma imunossupressão na fase aguda da leishmaniose. Essa expressão do COX-2 em macrófagos pode ter um importante papel em desencadear o processo de visceralização da L. donovani em camundongos (GREGORY et al, 2008).
3 JUSTIFICATIVA
A LVC é uma zoonose endêmica de alta incidência anual no Brasil, sendo o cão um dos principais reservatórios. É uma infecção que naturalmente desencadeia um desequilíbrio na resposta imunológica provocando danos teciduais secundários na pele, principalmente devido à resposta inflamatória desencadeada pelo reconhecimento desses patógenos por receptores Toll.
Apesar disso, ainda não existem relatos que comprovem o comportamento dos TLR-2 e TLR-4 na pele dos cães naturalmente infectados e sua correlação com os sinais clínicos desses animais. A resposta dos tecidos a Leishmania spp. caracteriza-se também por uma reação inflamatória sendo importante avaliar a participação de mediadores inflamatórios como o VEGF ou o COX-2.
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
A infecção por L. infantum desencadeia um processo inflamatório sistêmico que altera a maturação dos neutrófilos do sangue periférico e induz um processo inflamatório no sítio infeccioso pela participação dos receptores de reconhecimento padrão dos tipos TLR-2 e TLR-4 com a participação da cicloxigenase-2 (COX-2) e do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) no sistema imune cutâneo.
5 OBJETIVOS
Objetivo Geral
Caracterizar os parâmetros hematológicos e bioquímicos e avaliar as expressões de VEGF, COX-2, TLR-2 e TLR-4 na pele de cães naturalmente infectados por L. infantum.
Objetivos específicos
1 - Avaliar o perfil leucocitário e proteico da resposta inflamatória sistêmica de cães naturalmente infectados por L. infantum.
2 - Estudar a expressão de TLR2, TLR4, COX-2 e VEGF na pele de cães naturalmente infectados por L. infantum.
6 CAPÍTULO I – LEUCOCITOSE E ALBUMINEMIA EM SANGUE PERIFÉRICO DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum
Leukocytosis and albuminemia in peripheral blood of dogs naturally infected by Leishmania infantum
LEUCOCITOSE E ALBUMINEMIA EM SANGUE PERIFÉRICO DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum
(Leukocytosis and albuminemia in peripheral blood of dogs naturally infected by Leishmania infantum)
Emmanuel Teles Sales, Gian Karlo Gama de Almeida, Ana Raquel Fontenele de Oliveira, Amanda de Lacerda Moura, Tarssila Mara Vieira Ferreira, José Claudio Carneiro Freitas e
Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro*
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias. Laboratório de Imunologia e Bioquímica Animal. Faculdade de Veterinária. Universidade Estadual do Ceará. Av.Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE. CEP:60.714-903.
Resumo
O objetivo desse estudo foi caracterizar o perfil leucocitário e protéico de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum. Para tanto, foram realizados exame parasitológico de punção de medula e PCR em amostras de pele para identificação de Leishmania spp. e avaliação de sinais clínicos e dermatológicos para categorizar e distribuir cães em três grupos: grupo controle (GC); grupo positivo assintomático (GA) e grupo positivo sintomático (GS). Amostras de sangue foram coletadas para avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos. As principais manifestações clínicas observadas no GS foram alopecia, onicogrifose, ceratoconjuntivite e dermatites eritematosas, esfoliativas e ulcerativas. Os animais com LVC apresentaram alterações hematológicas significativas compatíveis com descrições da literatura, com leucocitose significativa (p<0,05) do GS e do GA quando comparados ao GC, além de anemia no GS e GA em relação ao GC. Também foi observado hiperproteinemia, hipergamablobulinemia e hipoalbuminemia significativa em GS quando comparado aos demais grupos (p<0,05), estando esse resultado confirmado pela razão albumina:globunlina reduzida (p<0,05). A contagem diferencial leucocitária apontou para uma neutrofilia e linfopenia significativas do GS quando comparadas aos demais grupos (p<0,05), estando esse resultado confirmado pela razão neutrófilo:linfócito aumentada (p<0,05). Ressalta-se um aumento de neutrófilos segmentados maduros, mas sem alterações nos neutrófilos imaturos. Animais naturalmente infectados por L. infantum apresentaram neutrofilia e albuminemia características de alterações sistêmicas associadas a um processo inflamatório. Contudo, faz-se necessária uma investigação mais aprofundada com um maior número de animais e com acompanhamento da LVC para avaliar a participação dos neutrófilos imaturos neste processo.
Palavras-chave: Leishmania infantum, leishmaniose canina, leucócitos, albumina, inflamação.
Abstract
The objective of this study was to evaluate the leukocyte and protein profile of dogs naturally infected by Leishmania infantum. For that, a bone marrow parasitological test and PCR were performed to identify Leishmania spp. Evaluation of clinical and dermatological signs was used to categorize and distribute dogs in three groups: control group (CG); asymptomatic group (AG) and symptomatic group (SG). Blood samples were collected for evaluation of hematological and biochemical parameters. The main clinical manifestations observed in SG were alopecia, onychogryphosis, keratoconjunctivitis and dermatitis. Leukocytosis and
anemia were observed in SG and AG (p <0.05) when compared to CG. In SG were detected hyperproteinemia with hyperglobulinemia and hypoalbuminemia when compared to the other groups (p <0.05). The differential leukocytes count indicated neutrophilia and lymphopenia in SG when compared to AG and CG (p<0.05), and this result was confirmed by a neutrophil:lymphocyte ratio which was increased (p<0.05). We highlight an increase of mature segmented neutrophils in GS, but there is no change in immature neutrophils. Thus, animals naturally infected by L. infantum presented leukocytosis with neutrophilia and hypoalbuminemia characteristic of systemic changes associated to inflammatory process. However, a more in-depth investigation with a larger number of animals and earlier follow-up of CanL animals is necessary to evaluate the participation of immature neutrophils in this process.
Keywords: Leishmania infantum, Canine leishmaniasis, leukocytes, albumin, inflammation.
1. INTRODUÇÃO
As leishmanioses são zoonoses desencadeadas por protozoários do gênero Leishmania spp. sendo de grande importância para a saúde pública, principalmente. Nas zonas urbanas o cão é considerado o principal reservatório da leishmaniose (MAIA et al., 2013) e quando acometido pela forma visceral (LVC) pode apresentar um amplo espectro de respostas (FERREIRA et al., 2016), porém os fatores que levam ao exacerbamento ou controle dessa sintomatologia ainda não são bem conhecidos.
Durante a infecção, as células do sistema monocítico fagocitário atuam como apresentadoras de antígenos que podem estimular uma resposta do linfócito TCD4+ (BANETH et al., 2008) com ativação de macrófagos produtores de óxido nítrico responsável pela destruição intracelular da Leishmania spp. (IKEDA et al., 2003). Além dos macrófagos, os neutrófilos são células de grande importância para o processo de infecção, tanto diretamente sendo recrutadas ao sítio de infecção, podendo eliminar o parasita por fagocitose, por liberação de espécies reativas de oxigênio e pelas armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs) (KRUGER et al., 2015), como indiretamente nas funções de ativação e regulação das células do sistema imune inato e adaptativo (MANTOVANI et al., 2009). Nas infecções por leishmanioses em geral são especialmente importantes por serem as primeiras células a serem recrutadas ainda nas primeiras horas após a infecção como no caso de infecção por L. infantum (THALHOFER et al., 2011).
Estudos recentes do perfil neutrofílico em humanos diagnosticados com leishmaniose visceral (LV) demonstraram alterações tanto na sua função como estágio de maturação, sendo
então potencialmente determinantes na severidade da infecção (YIZENGAW et al., 2016). Também foi reportado em casos humanos de leishmaniose cutânea (LC) que os neutrófilos teriam uma participação mais importante em influenciar o estado inflamatório sistêmico dos pacientes, através da produção de mediadores inflamatórios, do que de destruição direta do parasita (CONCEIÇÃO et al., 2016) e na infecção experimental de camundongos com L. amazonense também foi investigado o papel e o perfil dos neutrófilos durante a infecção (SOUSA et al., 2014). Neste sentido, estudos sobre o perfil leucocitário/neutrofílico e bioquímico na inflamação sistêmica provocada em cães na leishmaniose visceral ainda não foram relatadas. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi caracterizar o perfil leucocitário e protéico em cães naturalmente infectados por L. infantum.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O protocolo experimental foi submetido ao Comitê de Ética em Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará sob protocolo nº6508268/2016.
2.1. População do estudo
Amostras de sangue de 33 cães adultos provenientes do Centro de Controle de Zoonoses em Fortaleza (Ceará, Brasil), foram incluídas nesse estudo. O diagnóstico de Leishmniose Visceral Canina (LVC) foi baseado no teste rápido DPP LVC Bio-Manguinhos® associado ao teste sorológico ELISA e PCR para L.infantum em amostras de pele obtidas por biópsia. Punção aspirativa de medula óssea foi realizada para pesquisa parasitológica. Os cães (n = 33) naturalmente infectados por L. infantum foram divididos com base na presença ou ausência de alterações clinico-dermatológicas em: um grupo assintomático (GA, n = 10), e grupo sintomático (GS, n = 23), sendo consideradas alterações clínicas relevantes para a inclusão dos amimais às características da infecção, tal como: caquexia, onicogrifose, alopecia, dermatites, ceratoconjuntivites entre outras. Cães sem manifestações clínico-dermatológicas e que apresentaram resultados negativos nesses testes foram considerados como sendo não infectados e incluídos como o grupo controle (GC, n = 5).
2.2. Coleta de amostras de sangue e Análises hematológica e bioquímica
Amostras de sangue (10 mL) foram coletados dos diferentes grupos através de venopunção da jugular com seringa estéril. Desse total, 5 ml de sangue foram colocados em tubo de coleta contendo anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) para serem destinados a avaliação hematológica e outros 5 mL em tubo de coleta sem anticoagulante, para a avaliação bioquímica. As amostras foram então centrifugadas para obtenção do soro que foram aliquotados e armazenados a -20 ° C até a análise bioquímica. Os resultados dos
exames hematológico e bioquímico foram comparados aos valores de referência para a espécie canina.
As amostras de sangue coletadas em frascos com EDTA foram conduzidos ao laboratório de Patologia Clínica da FAVET-UECE para avaliação dos parâmetros hematológicos em aparelho de automação: contagem total de hemácias, hematócrito (HCT, %), contagem Leucócitos totais (LT, mm³) e diferencial de leucócitos, e contagem de plaquetas (PLT, mm³). Foram realizados esfregaços de sangue das amostras para contagem diferencial dos leucócitos e avaliar o perfil neutrofílico desses animais.
Das amostras de soro de cães coletados em tubos sem EDTA, foram avaliados os níveis de proteína total sérica (TPS, g/dL), albumina (Alb, g/dL) e globulina (Glob, em g/dL); A dosagem sérica foi realizada por sistema automatizado (Konelab 60i) utilizando kits comerciais específicos (Wiener Lab®), de acordo com a metodologia do fabricante.
2.3. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa estatístico computacional GraphPadPrism 7.0. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Os dados foram submetidos ao teste de Grubbs e Kolmogorov para determinar a homocedasticidade dos dados. As alterações clínicas observadas foram expressas em percentagem. Para as análises hematológicas e bioquímicas foram utilizados o teste de Kruskal-Wallis seguido de teste de Dunn. Em todos os casos, significância foi definida em p <0,05.
3. RESULTADOS e DISCUSSÃO
Entre as principais alterações sintomatológicas observadas nos cães temos: onicogrifose em 91,3% dos animais (n=21), conjuntivite em 34,7% (n=8) além de alguma forma de lesão dermatológica, variando de leve à severa, em 60,8% (n=14). Dentre essas alterações dermatológicas, pudemos observar alopecia/hipotricose em 56,5% dos animais (n=13), lesões ulcerativas em 17,3% (n=4) e dermatites em 43,4% (n=10). Também foram observadas lesões em ponta de orelha em 21,7% dos animais (n=5). Essas alterações clínicas e dermatológicas estão de acordo com a literatura que aponta a evolução sintomatológica à medida que temos o aprofundamento e cronicidade da infecção (SILVA et al., 2015).
As alterações hematológicas encontram-se na Tab. 1. Os leucócitos totais (LT) sofreram aumento significativo (p<0,05) em GA quando comparado ao controle, apontando um quadro de leucocitose. Por outro lado, GS manteve-se semelhante ao GC, esse achado de leucocitose em animais acometidos por LVC está respaldado em literatura prévia (JAFARI et
al., 2006), embora nem sempre esta alteração seja observada (FREITAS et al., 2012). Verificou-se uma redução significativa (p<0,05) no hematócrito (HCT) nos grupos com leishmaniose em relação ao controle. Uma alteração comumente relatada na LV é a anemia, podendo estar inclusive relacionada com o estágio da infecção (DIAS et al., 2009). Nossos dados apontaram também que animais com trombocitopenia significativamente (p<0,05) mais acentuada foram encontrados no grupo GA quando comparado ao mas não ao GS. Neste trabalho, as plaquetas em todos os grupos avaliados mantiveram-se dentro dos níveis de normalidade da espécie. É relatado que nos quadros mais avançados da infecção por LV há uma tendência a diminuição da contagem plaquetária (contagens inferiores a 150.000/mm³) (DUARTE et al., 2009).
Com relação aos parâmetros proteicos, a proteína total sérica (TPS) do GS (8,34±0,72) apresentou aumento significativo quando comparado aos demais grupos (p<0,05), bem como a globulina estava significativamente superior no GS (6,15±1,06) (p<0,05). A albumina sérica nos animais do GS (2,09±0,60) encontrava-se inferior (p<0,05) ao GC (3,19±0,28). Dessa forma, o presente estudo observou um aumento dos níveis de proteína total e globulina associado a uma diminuição nos níveis de albumina sérica. Esse aumento das proteínas totais do plasma e presença de hiperglobulinemia é considerado uma das alterações mais comuns na LVC, estando possivelmente associada ao aumento dos níveis de anticorpos anti-Leishmania, principalmente em estágios mais crônicos da infecção (CIARAMELLA e CORONA, 2003). Contudo, a hipoalbuminemia observada nos animais se deve provavelmente a migração da albumina para o meio extravascular com formação de edema, alteração clínica bastante comum na LVC (KUMAR et al., 2016). Nossos dados reforçam o comprometimento protéico com a redução (p<0,05) da relação albumina:globulina nos animais do grupo sintomático (GS) e consequentemente indicam um quadro inflamatório.
A contagem diferencial dos leucócitos do sangue periférico está representada na Fig. 1. Nossos dados demonstraram um aumento significativo na contagem de neutrófilos superior em animais do GS em relação aos GA e GC (p<0,05). Estudos prévios sugerem que a contagem diferencial leucocitária não varia significativamente com o estágio clínico da infecção (AMUSATEGUI et al., 2003). Vale ressaltar que a neutrofilia era acompanhada de linfopenia no GS quando comparado aos demais grupos. Esses achados estão de acordo com estudos prévios em quadros característicos de leishmaniose (BOGDAN et al. 2001; JAFARI et al., 2006). Por fim, a análise neutrofílica, realizada em todos os grupos testados, não resultou em alterações significativas quanto ao estágio de maturação dos neutrófilos, estando todos os grupos semelhantes quanto a contagem de neutrófilos maduros. Os neutrófilos
imaturos eram raros e encontravam-se dentro da normalidade para a espécie e sem diferenças entre os grupos (Fig. 2). Foi observada, no entanto, uma tendência a um aumento na contagem de neutrófilos segmentados e hipersegmentados em animais do GS, mas sem diferença significativa. Para se verificar a influência da neutrofilia sobre a linfopenia foi analisada a relação neutrófilos:linfócitos (Fig. 3) a qual estava elevada (p<0,05) no GS em relação a GC e GA. Estes dados reforçam um quadro inflamatório na leishmaniose.
De um modo geral, a literatura sempre apontou a existência de uma alteração do perfil leucocitário em pacientes com leishmaniose visceral (MUSUMECI et al., 1978). Além de ter seus números totais comprometidos, é argumentado que os neutrófilos podem ter sua função na infecção por leishmaniose diminuída devido a um bloqueio no CD10, presente na superfície dos neutrófilos e que regulam seus processos inflamatórios e quimiotáticos (ELGHETANY, 2002). Estudos recentes em humanos apontam a LV associada com quadro de aumento na ativação neutrofílica, além de um aumento na frequência de neutrófilos imaturos e uma diminuição na efetividade de suas funções, o que pode caracterizar a importância neutrofílica na severidade da infecção (YIZENGAW et al., 2016). Em resumo, foram observados neutrofilia e linfopenia significativa do GS quando comparado ao GA em cães naturalmente infectados por L. Infantum. No entanto, não foram encontradas diferenças significativas no tocante ao estágio de maturação entre os grupos. Vale ressaltar que no presente estudo os animais não tinham histórico prévio de exames, o que dificulta o acompanhamento por estadiamento dessas alterações leucocitárias.
4. CONCLUSÃO
Animais naturalmente infectados por L. infantum apresentaram alterações sistêmicas características de inflamação associada a LVC. Contudo, faz-se necessária uma investigação mais aprofundada com um maior número de animais e com acompanhamento da LVC para avaliar a participação dos neutrófilos imaturos neste processo.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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