1 - inscrições
A inscrição ao Prêmio Jovem Microbiologista 2011 é isenta de taxa e pode ser realizada até 01/07/2011. Poderão inscrever-se recém-doutores que tenham defendido a tese nos últimos três anos anteriores à data de início do 26º Congresso Brasileiro de Microbio-logia. O candidato deverá estar inscrito no 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia e deverá submeter apenas um trabalho. O comprovante de inscrição no 26º CBM deverá ser enviado para a Secretaria da SBM ao endereço Av. Prof. Lineu Prestes, 2415, Bu-tantã. CEP 05508-000, São Paulo, SP, juntamente com o trabalho, Currículo Lattes e documento da comissão de pós-graduação da instituição, declarando a data da defesa da tese e o título recebido. A documentação submetida não será devolvida. 2 - trABAlHo
O trabalho, de responsabilidade do recém-doutor, deverá ser encaminhado na forma de paper, tendo como modelo o periódico Brazilian Journal of Microbiology, em três vias, acompanhado do respectivo arquivo gravado em CD-Rom. O texto deverá ser redigido em inglês e ter, no máximo, 10 páginas (incluindo tabelas e figuras) for-matadas em fonte Arial, tamanho 12, espaçamento de 1,5 entrelinhas, formato A4, margens 2 cm (esquerda, direita, superior e inferior) em editor de texto Microsoft Word. As citações bibliográficas deverão ser apresentadas de acordo com as normas
da revista Brazilian Journal of Microbiology . Os trabalhos que não estiverem de acor-do com essas especificações serão automaticamente desconsideraacor-dos sem qualquer comunicado ao participante.
3 - ApresentAção e seleção
A Comissão Científi ca, designada pela Diretoria da SBM, selecionará cinco trabalhos. Os trabalhos selecionados deverão fi car expostos, na forma de painéis, durante o 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia, em local a ser designado pela Comissão Organi-zadora. Os autores serão convidados para apresentação pública desses trabalhos, em sessão do 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia. O tempo de apresentação oral será de 20 minutos, perante Comissão Julgadora, composta por três membros, indicada pela Diretoria da SBM. Não serão aceitos recursos quanto ao mérito das decisões das comissões de seleção e julgadora.
4 - prescrição Do Direito Ao prêMio
Caso o prêmio não seja solicitado no prazo de 1 ano contado a partir da data da pre-miação que acontecerá durante o 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia o mesmo perderá o direito de recebê-lo. A comissão avaliadora terá poderes para decidir as situ-ações em que nenhum trabalho merece receber o prêmio.
26º congresso BrAsileiro De MicroBiologiA
DAtA: 02/10/2011 à 06/10/2011.
locAl: rAfAin pAlAce Hotel e convention center foz Do iguAçu, pr – BrAsil.
1º Prêmio Jovem
Microbiologista 2011
pAtrocinADor oficiAl A Sociedade Brasileira de Microbiologia (SBM) e a OXOID e Remel convidam os
microbiologistas, com título de doutor obtido nos últimos três anos anteriores à data de início do 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia (02/10/2011), a participarem do Prê-mio Jovem Microbiologista 2011, uma oportunidade ímpar de se destacar e deixar sua marca no meio científi co. Visando a maior integração entre os países latino-americanos, a SBM abre as inscrições para jovens microbiologistas dos países membros da ALAM (Associação Latino Americana de Microbiologia). Ao primeiro colocado será concedido um prêmio em dinheiro em valor a ser defi nido. O prêmio será entregue durante a ses-são de encerramento do 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia. Os demais clas-sifi cados receberão um certifi cado de participação.
1. ApresentAção
O Presidente da Sociedade Brasileira de Microbiologia, Adalberto Pessoa Junior, e o Secretário Geral, Carla Taddei de Castro Neves, no uso de suas atribuições legais, farão realizar Concurso para Obtenção do Título de Especialista em Microbio-logia-TEMICRO, no dia 03 de outubro de 2011, regulamentado pelo presente Edital.
O Título de Especialista em Microbiologia terá validade por 5 (cinco) anos, devendo ser renovado de acordo com as normas estabelecidas pela Comissão Nacional de Titulação SBM.
2. DAs inscrições
2.1. A inscrição do candidato implicará o conhecimento e a tácita aceitação das normas e condições estabelecidas neste Edital, em relação às quais não poderá alegar desconhecimento.
2.2. As inscrições serão recebidas no período de 02 de feve-reiro a 29 de julho de 2011, por via eletrônica www.sbmicrobio-logia.org.br/26cbm.
2.3. O candidato deverá efetuar o pagamento da taxa de ins-crição no valor de R$ 390,00 além da insins-crição no 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia.
As especialidades
É importante esclarecer que as especialidades regulamen-tadas são profissionais, isto é, são especialidades no campo do exercício profissional do microbiologista. Foram regulamen-tadas algumas que se configuraram como mais definidas e consensuais. A Saber: Microbiologia Ambiental Microbiologia de Alimentos Microbiologia Industrial Microbiologia Clínica
Deve ser destacado que o título de especialista em microbio-logia é uma referência sobre a qualificação do profissional, não
26º congresso BrAsileiro De MicroBiologiA 2 A 6 De outuBro De 2011
rAfAin pAlAce Hotel e convention center foz Do iguAçu - pArAná
EDITAL DO CONCURSO PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO
DE ESPECIALISTA EM
MICROBIOLOGIA TEMICRO 2011.
se constituindo condição obrigatória para o exercício da profissão. Podem solicitar o título de Especialista os Biólogos, Biomé-dicos, Farmacêuticos, MéBiomé-dicos, Médicos Veterinários e outros profissionais que tenham atuação em uma das áreas da Micro-biologia, desde que preencham alguns dos pré-requisitos abaixo relacionados:
i – Das inscrições:
1. O candidato deverá ser associado da Sociedade Brasileira de Microbiologia (SBM) tendo quitado o ano vigente; 2. O candidato deverá ter nível superior e cinco anos de
expe-riência profissional comprovada na área após a graduação OU carga horária mínima de 1.200 horas de estágio em mi-crobiologia comprovadas depois de formado;
3. Estar inscrito no 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia 4. Pagar a taxa estabelecida pela SBM;
5. O candidato deverá ter uma carta de apresentação e três indicações de associados da SBM;
6. O certificado terá validade por cinco anos.
ii – Documentos necessários para inscrição:
1. Preencher a ficha de inscrição do 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia;
2. Durante o processo de inscrição no 26º CBM efetuar a ma-trícula no CONCURSO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
ESPECIALISTA EM MICROBIOLOGIA
Enviar para a SBM via correio curriculum vitae documenta-do, que deverá ser confeccionado de acordo com a “Plataforma Lattes” , histórico escolar e carteira ou comprovante de trabalho e uma fotografia recente 3x4;
Sociedade Brasileira de Microbiologia ICB III - SBM - Dep. de Microbiologia Av. Prof. Lineu Prestes, 2415 Cidade Universitária
05508-000 São Paulo, SP - Brasil Tel: (+5511) 3813-9647/3037-7095
iii – pontuação dos títulos e Atividades:
1. Para obtenção do título o candidato deverá atingir média final = 7,0;
Provas – 90% Títulos – 10%
iiia – provas
Prova escrita: será composta de questões de múltipla esco-lha e dissertativas sendo que 60% do conteúdo deverá versar sobre Microbiologia Geral e 40% sobre Microbiologia Específica da área de especialização escolhida.
Prova Prática: Versará sobre temas específicos da área de especialização escolhida
TÍTULOS Exigências Pontuação
Doutor na área escolhida,
Programa regular credenciado pela CAPES 5
Mestre na área escolhida
Programa regular credenciado pela CAPES 3
Especialização na área escolhida
Deverão ter carga horária mínima de 720 horas, considerando-se as horas-aulas e os trabalhos de campo, experimental, de estudo e monografia, bem como deverão atender às exigências do Conselho Federal de Educação e deverão ser reconhecidos pela SBM
1,5
Liderança técnica Liderança técnica em Laboratórios de Microbiologia nos últimos 10 anos 1 ponto a cada 2 anos de atividade (máximo 5 pontos) Atividade Docente Atividade Docente em Microbiologia nos últimos 10 anos 1 ponto a cada 2 anos de
atividade (máximo 5 pontos) Artigos científicos Artigo científico em Microbiologia na área escolhida, publicados em revistas
indexadas no ISI e/ou PubMed, como autor ou co-autor nos últimos 5 anos
1 ponto por artigo (máximo 5 pontos)
Apresentação em Congresso
Trabalhos científicos em Microbiologia, apresentados em Congressos reconhecidos pela SBM, como autor ou co-autor
0,2 por apresentado (máximo 1 pontos) Cursos de
aperfeiçoamento
Em microbiologia nos últimos 5 anos, carga horária mínima de 180 horas, reconhecido pela SBM
1 ponto Cursos de
atualização
Em microbiologia nos últimos 5 anos, , reconhecido pela SBM. Abaixo de 36 horas de atualização nos últimos cinco anos não será pontuado
36 - 72 h 0,5; 73 - 109 h 1.0; >110 h 1,5 (máximo 1,5 ponto) Estágio em
microbiologia
Período mínimo de 480 h consecutivas, nos últimos cinco anos Máximo de 1 ponto Eventos Participação em Congresso de Microbiologia e afins nos últimos 5 anos.
Somente eventos reconhecidos pela SBM serão pontuados (veja anexo). Eventos não reconhecidos serão julgados pela comissão
0,2 por evento (Máximo de 1 ponto) Eventos Participação ativa como palestrante em Congressos de Microbiologia nos
últimos 5 anos
0,2 por evento (Máximo de 1 ponto) Critérios a serem utilizados na avaliação do CV para
OBTEN-ÇÃO do Título de Especialista
OBS: Os documentos referentes às atividades pontuadas deverão ser enviados organizadamente, agrupados por ativida-de. Caberá à SBM, através da Comissão de Titulação, proceder a pontuação estabelecida nos itens acima discriminados, para cada candidato, ação essa que será executada antes da reali-zação da prova.
Outrossim, a comprovação de títulos e atividades constantes do currículo devem somar no mínimo 10 pontos nos últimos 5 anos para a aprovação da inscrição no concurso.
O título terá validade por cinco anos. Para revalidação, o solicitante deverá encaminhar CV circunstanciado à SBM. A ava-liação será feita pela Comissão de Titulação pela análise e pontuação do CV. Pontuação mínima exigida será de 10 pontos.
Índice
Editorial
Expediente
É com grande satisfação que publicamos a 15ª edição da Revista Microbiologia in Foco. Continuamos com os objetivos iniciais selecionando temas abrangentes e de interesse na divulgação da Microbiologia.
Voltamos a enfatizar que esperamos e contamos com a colaboração ativa dos leitores sugerindo temas e encaminhando artigos para publicação.
Esperamos que comunidade de microbiologistas continue a colaborar ativamente para que essa iniciativa possa alcançar o objetivo de divulgar a microbiologia nos mais diversos setores da comunidade brasileira.
Lembramos que a revista é de informação e divulgação e é composta de várias seções:
Seção 1: Ciência in foco: artigos de informação sobre temas relevantes Seção 2: Resenhas: comentários sobre livros
Seção 3: Resumos comentados de trabalhos científicos relevantes
Seção 4: Homenagem a profissionais com destaque na fundação da SBM e no desenvolvimento da Microbiologia
Seção 5: Ensino em Microbiologia
Seção 6: Departamento in Foco: Departamentos em destaque: Noticias de interes-se da Microbiologia
Seção 7: Leitor in Foco: espaço aberto ao leitor
Seção 8: Empresas in Foco - Informes publicitários: espaço destinado a empresas Agradecemos a todos que colaboraram com a edição número 15 da revista Micro-biologia in Foco e contamos com a colaboração dos colegas para futuros artigos.
Prezado
Microbiologista,
Ciência in Foco
Bcg recoMBinAnte: uMA vAcinA
MultivAlente . . . 8
proDução BiotecnológicA Do
BiopolíMero goMA xAntAnA . . 14
proDutos lácteos funcionAis:
conceitos, Benefícios e
tecnologiA . . . 23
recifes corAlíneos: DA
DiversiDADe MicroBiAnA à
explorAção BiotecnológicA . . 34
tuBerculose BovinA:
AntigAs e novAs ABorDAgens
DiAgnósticAs . . . 42
sBM in foco . . . 51
AgenDA in foco . . . 52
curso De especiAlizAção
e AperfeiçoAMento eM
MicroBiologiA . . . 53
fique sócio . . . 54
Adalberto pessoa JuniorPresidente Marina B. Martinez Editora carlos p. taborda Editor sBM in foco
revista da sociedade Brasileira de Microbiologia
Ano 4, nº 15
São Paulo: SBM, 2011 Periodicidade Trimestral
editores:
Carlos P. Taborda e Marina B. Martinez
tiragem:
2000 exemplares - Circulação Nacional Distribuição gratuita para sócios SBM
impressão:
Vox Editora Ltda. (11) 3871-7300
Diagramação:
Hermano Design Editorial [email protected]
responsabilidade autoral:
Todos os artigos assinados são de responsabilidade dos respectivos autores
responsabilidade editorial:
Ciência in Foco
BCG RECOMBINANTE:
UMA vACINA MULTIvALENTE
o BAcilo De cAlMette-guÈrin
Albert Calmette e Camille Guèrin (Fi-gura 1), trabalhando no Instituto Pasteur de Lille, França, atenuaram uma cepa virulenta de Mycobacterium bovis iso-lada por Nocardia em 1902 a partir de uma mastite bovina. Durante o período de 1908 a 1921 cultivaram essa cepa em meio contento bile bovina por 231 sucessivos subcultivos, o que resultou na atenuação desta cepa. Durante este período, vários testes demonstraram que a cepa havia perdido a virulência, mas ainda mantinha suas propriedades imu-nogênicas. Hoje, esta cepa é chamada de Bacilo de Calmette e Guèrin ou BCG, e é utilizada para prevenção das formas mais graves da tuberculose (Lugosi 1992).
Desde 1921, várias cepas derivaram da vacina BCG original, estas foram denominadas então pelo país ou labo-ratório onde foram propagadas. Mais de 50 cepas de BCG são conhecidas, mas
Fabiana Kömmling Seixas
Bióloga, Doutora em Biotecnologia, Professora do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTec-Biotecnologia), Laboratório de Genômica Funcional, Universidade Federal de Pelotas, RS, Brasil - e-mail: [email protected]
Sibele Borsuk
Bióloga, Doutora em Biotecnologia, Professora do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTec-Biotecnologia), Laboratório de Parasitologia Molecular, Universidade Federal de Pelotas, RS, Brasil - e-mail: [email protected]
Odir Antônio Dellagostin
Médico Veterinário, Doutorado em Biologia Molecular pela University of Surrey - Inglaterra, Professor do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTec-Biotecnologia), Laboratório de Biologia Molecular, Universidade Federal de Pelotas, RS, Brasil - e-mail: [email protected]
somente seis estão atualmente em uso como vacina: BCG Connaught, BCG Glaxo, BCG Moreau, BCG Pasteur, BCG Tokyo e BCG Danish. Estas cepas apre-sentam diferenças e podem ser divididas em dois grandes grupos com base em 3 características: secreção do antígeno MPB70; composição da parede celular e polimorfi smo genético. O primeiro grupo, o qual inclui BCG Tokyo, secreta MPB70 em grandes quantidades, contém metoxi-micolato na parede celular, e possui duas cópias do elemento de inserção IS6110. As cepas que deram origem a este grupo são derivadas do Instituto Pasteur no pe-ríodo de 1925 a 1928.
O segundo grupo, o qual inclui as cepas BCG Glaxo e BCG Pasteur, não secreta o antígeno MPB70, não contém metoximicolato como componente de sua parede celular e possui uma única cópia do elemento de inserção IS6110. Essas cepas são derivadas de culturas produzi-das no Instituto Pasteur após 1938 (Behr et al. 1999). Subseqüentes estudos
mole-culares revelaram diferenças entre BCG e
M. bovis virulento (Mahairas et al. 1996),
bem como diferenças entre as várias ce-pas de BCG (Fomukong et al. 1992).
A primeira vacinação utilizando BCG foi realizada em 1921, em Paris. Em 1928 a vacina BCG foi recomendada pela Liga das Nações Unidas e passou a ser am-plamente utilizada. De 1929 a 1930 a se-gurança do BCG foi questionada quando 72 crianças de um total de 250 morreram após receberem a vacina em Lübeck, Ale-manha. Mas subseqüentes investigações mostraram que as mortes foram devidas a uma contaminação acidental com a cepa virulenta de M. tuberculosis e não por reversão da virulência do BCG. Em 1931 a Academia de Medicina de Paris reforçou as recomendações da Liga das Nações Unidas, confi rmando a segu-rança do BCG para uso em humanos e animais. Após a Segunda Guerra Mundial intensifi cou-se a utilização de BCG, com acompanhamento da UNICEF e OMS (Lugosi 1992). Atualmente BCG é uma
das vacinas mais utilizadas mundialmen-te, já tendo sido administrada a mais de três bilhões de pessoas (Bloom and Fine 1994) (Figura 2).
No entanto, BCG tem mostrado uma eficácia variável de 80% a 0%, dependen-do da região. Esta baixa eficácia pode ser devida à perda de muitas regiões do ge-noma da bactéria durante o processo de atenuação (Cole et al. 1998). Comparando com o genoma de M. bovis virulento, 15 a 16 regiões de M. bovis não estão presentes em BCG (Behr et al. 1999). Regiões regu-latórias podem ter sido perdidas em BCG. A ausência dessas proteínas regulatórias poderia ocasionar a perda ou expressão inadequada de antígenos imunogênicos e imunoprotetores importantes para gerar uma resposta imune adequada (Mahairas
et al. 1996). Por isso, grandes esforços têm sido feitos na tentativa de buscar um novo candidato à vacina contra tuberculose que tenha uma melhor eficácia. Vários estudos têm descrito o desenvolvimento de cepas atenuadas auxotróficas de BCG ou M.
tuberculosis como novos candidatos a
va-cina contra tuberculose. Outra tentativa de melhorar a eficácia de BCG é utilizar BCG expressando citocinas, como interleucina 2, IFN-γ, GM-CSF (fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos), ou expressando antígenos de Mycobacterium
tuberculosis (Parida and Kaufmann 2010).
Bcg recombinante
O BCG tem demonstrado ser um ex-celente candidato para utilização como
vetor para uma vacina recombinante multivalente, pois apresenta uma série de vantagens, tais como: é a vacina mais usada no mundo, pode ser ministrada em dose única logo após o nascimento, pois não é afetada pelos anticorpos maternos, uma simples inoculação sensibiliza o indi-víduo contra tuberculose por um período de 5 a 50 anos, é um potente adjuvante, pode ser administrada via oral, é a vacina viva mais estável ao calor, e seu custo de produção é baixo (Stover et al. 1991). Além disso, por ser uma vacina adminis-trada rotineiramente, é o veículo de apre-sentação de antígenos recombinantes de mais fácil e possível validação.
Os vetores de expressão em micobac-térias são chamados de “shuttle vectors”, pois permitem a manipulação em
Esche-richia coli e micobactérias pelo fato de
possuírem origem de replicação para am-bas as espécies (Jacobs, Jr. et al. 1987). As formas de apresentação de antígenos heterólogos em BCG podem ser: citoplas-mática, secretada ou ligada à membrana micobacteriana, dependendo do promotor e da sequência sinal utilizada para dirigir a expressão do gene heterólogo. Essas diferentes formas de apresentação po-dem influenciar na amplitude quanto na natureza da resposta imune a um antíge-no heterólogo (Bastos et al. 2009).
Nos últimos anos, sistemas para a manipulação e expressão de genes he-terólogos em micobactérias foram desen-volvidos, permitindo a avaliação do BCG recombinante (rBCG) como um veículo para antígenos heterólogo de uma varie-dade de antígenos, revisado por (Bastos et al. 2009). Nosso grupo tem demonstra-do a utilização de BCG para a expressão de antígenos virais, bacterianos e parasi-tários (Dellagostin et al. 1993; Dellagostin et al. 1995; da Cruz et al. 2001; Bastos et al. 2002; Medeiros et al. 2002; Bastos et al. 2004; Medeiros et al. 2005; Michelon et al. 2006; Borsuk et al. 2007; Seixas et al. 2007; da Silva Ramos et al. 2008; Bas-tos et al. 2009; Seixas et al. 2010).
Construção de um rBCG: uma abordagem experimental
A Figura 3 ilustra a abordagem experi-mental utilizada para a construção e ava-liação de vacinas baseadas em rBCG. O gene do antígeno heterólogo é amplifica-do por PCR, a partir amplifica-do gDNA amplifica-do
patóge-Figura 1. Albert Calmette e Camille Guèrin atenuaram uma cepa virulenta de M. bovis. (Fonte: http://www.nature.com/nri/journal/v6/n9/fig_tab/nri1920_F1.html)
Figura 2. Rótulo da vacina BCG (Bacilo de Calmette e Guèrin), utilizada no Brasil para prevenção da tuberculose em humanos.
no e clonado em vetores de expressão de micobactéria (figura 3). Células de BCG eletrocompetentes são transformados por eletroporação e plaqueadas em meio só-lido, contendo canamicina, para seleção dos transformantes (o plasmídeo contém o gene de resistência a este antibiótico). Colônias de BCG recombinantes são cultivadas em meio líquido, também con-tendo canamicina. Uma parte da cultura é utilizada para preparação de extratos protéicos por sonicação e extração com detergente SDS e outra parte é utilizada para as preparações vacinais. Os extratos protéicos são analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e por Western blot (reação com anticorpos específicos), para verificação da expres-são dos antígenos heterólogos. Prepa-rações vacinais de clones de rBCG que expressam os antígenos heterólogos são, então, administrados intraperitonealmen-te em camundongos BALB/c, com 106
unidades formadoras de colônia (CFU) em 0,5 mL de salina apirogência (Figura 3). A indução de resposta imune humoral é avaliada por ELISA, onde se verifica a presença de anticorpos homólogos espe-cíficos contra os antígenos nos soros dos camundongos imunizados. Após, ensaios de imunoproteção são realizados, em modelo experimental indicado para cada vacina a ser testada.
rBCG: vacina contra leptospirose humana e animal
A leptospirose é uma antropozoonose direta que ocorre de forma endêmica em todo o mundo. Ela é causada por espiro-quetas do gênero Leptospira e é conside-rada uma doença emergente que afeta humanos e diversas espécies de animais domésticos e silvestres (Adler and de la
Figura 3. Esquema das etapas da construção e avaliação de um rBCG.
Figura 4. Estante ventilada (A) e rack ventilado (B) utilizados para o alojamen-to de hamsters e camundongos utilizados na avaliação de imunogenicidade e
potencial imunoprotetor de vacinas baseadas em rBCG. Pena 2010). As vacinas baseadas em
células inteiras inativadas (bacterinas) estimulam imunidade restrita (6 a 12 me-ses), necessitando repetir a vacinação para manutenção da imunidade. Nestes casos, a resposta imune desencadeada é contra o LPS e, portanto, restrita a soro-vares antigenicamente relacionados (Mc-Bride et al. 2005; Slack 2010). Existe um grande número de sorovares patogênicos (>260), o que impõe uma maior limitação para a produção de uma vacina com com-ponentes multi-sorovar (Cerqueira and Picardeau 2009).
Frente a esta situação, é desejável o desenvolvimento de uma vacina de amplo espectro contra a leptospirose. Proteínas imunogênicas conservadas, principalmente de membrana externa de
Leptospira, são alvos promissores para
o desenvolvimento de uma vacina com esta característica. A LipL32 é a proteína de membrana externa mais abundante e conservada entre as leptospiras patogêni-cas (Cullen et al. 2005). Nosso grupo ava-liou o potencial imunoprotetor do antígeno LipL32, utilizando M. bovis BCG como
ve-tor vacinal e hamsters como modelo ani-mal para experimentos de desafios com cepa virulenta de L. interrogans. Os resul-tados mostraram que BCG expressando LipL32 é capaz de induzir uma resposta imune protetora em hamsters (Seixas et al. 2007). Além disso, foi comparada a es-tabilidade in vivo do sistema de seleção e expressão por complementação auxotró-fica em M. bovis BCG DleuD e do sistema de expressão convencional em M. bovis BCG Pasteur, utilizando os antígenos va-cinais de leptospiras patogênicas, LipL32 e a fração não idêntica de LigA. O sistema de clonagem em M. bovis BCG que utiliza complementação auxotrófica como mar-cador de seleção permite a manutenção estável do vetor plasmidial após a inocu-lação em hamster, enquanto o sistema convencional é instável sem pressão de seleção (Seixas et al. 2010).
rBCG: vacina contra a síndrome reprodutiva e respiratória de suínos
A síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) é
causa-da pelo vírus causa-da PRRS, o qual ocasiona problemas reprodutivos em fêmeas ges-tantes e respiratórios em suínos de todas as faixas etárias. A vacinação de animais parece proteger contra o desafio com a mesma cepa do vírus, mas não contra ou-tro isolado e oferece proteção parcial tra problemas reprodutivos, mas não con-tra problemas respiratório. Nosso grupo descreveu a construção e avaliação imu-nológica do BCG expressando antígenos do PRRSV. Os resultados mostraram que leitões inoculados com rBCG desenvolve-ram resposta imune específica contra as proteínas virais e induziram uma proteção parcial contra o vírus (Bastos et al. 2002; Bastos et al. 2004).
rBCG: vacina contra raiva bovina
A raiva, causada pelo vírus Rabdoví-rus, é um grande problema econômico e de saúde pública na América do Sul. Nosso grupo desenvolveu um rBCG ex-pressando epitopos da nucleoproteína rábica para células T e B, contra raiva. Esta vacina desenvolveu anticorpos em camundongos, sendo que os títulos de imunoglobulinas estimulados pela vaci-na foram significativamente superiores quando comparados à vacina comercial e foram continuamente crescentes 60 dias pós-inoculação (da Cruz et al. 2001).
rBCG: vacina contra pneumonia micoplásmica suína (PMS)
A pneumonia enzoótica ou pneumo-nia micoplásmica suína, causada pela bactéria Mycoplasma hyopneumoniae, é a doença respiratória de maior impacto na suinocultura. As vacinas mais utiliza-das no controle da PMS contém células totais mortas (bacterinas). No entanto, o
M. hyopneumoniae, ainda que cultivável
“in vitro”, exige meio enriquecido, o que somado ao seu crescimento pobre e lento, encarece excessivamente a pro-dução deste tipo de vacina. Nosso grupo, desenvolveu uma vacina recombinante composta por rBCG/LTBR1 ou rBCG/ R1 a qual, induziu nos camundongos a produção de anticorpos séricos anti-R1, os quais reconheceram a P97 da cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. rBCG pUS2000/LTBR1 induziu as maio-res soroconversões, sugerindo um efeito coadjuvante da LTB - fragmento B da toxi-na termolábil de E. coli. Estes resultados
encorajam a realização de novos expe-rimentos com rBCG/R1 e rBCG/LTBR1, visando a avaliação da resposta imune local e celular, avaliação de vias de ad-ministração (oral e nasal) e avaliação da imunogenicidade e eficácia de proteção em suínos (da Silva Ramos et al. 2008).
rBCG: vacina contra anaplasmose bovina
A anaplasmose bovina é uma do-ença hemolítica dos bovinos causada pela riquétsia Anaplasma marginale (Rickettsiales:Anaplasmataceae) que se replica em eritrócitos bovinos e células de carrapato. A doença causa importan-tes perdas econômicas, principalmente devido à alta morbidade e mortalidade em bovinos suscetíveis. Nosso grupo clonou e expressou o antígeno Msp1A de A. marginale em BCG (BCG/msp1a). O gene msp1a foi amplificado por PCR a partir de DNA de A. marginale extraído de eritrócitos bovinos, e clonado nos vetores pUS2000 e pMIP12, que, posteriormente foram utilizados para transformar BCG. Camundongos foram imunizados com rBCG aos 0 e 21 dias de experimento, ficando os grupos distribuídos da seguin-te maneira: salina (T1); BCG (T2); rBCG/ pUS2000/msp1a (T3) e rBCG/pMIP12/ msp1a (T4). Quarenta e dois dias após a 1ª inoculação (dpi) os camundongos dos tratamentos 3 e 4 desenvolveram resposta imune humoral contra o antí-geno de Msp1a. Os resultados obtidos no ELISA demonstraram uma resposta de anticorpos máxima aos 63 dpi, sendo que o grupo 4 apresentou uma resposta maior que os demais grupos testados (P<0,001). Da mesma forma, produção de interferon gama específica contra Ms-p1a foi detectada em células de baço de camundongos imunizados com rBCG aos 49 dpi, sendo que o grupo 3 apresentou maiores níveis dessa citocina. Anticorpos dos grupos T3 e T4 foram capazes de reconhecer Msp1a, na sua forma nativa, obtida de extrato de A. marginale, oriundo de eritrócitos de bovinos infectados com a riquétsia. Da mesma forma, o anticorpo monoclonal ANA22B1, específico para um epitopo de Msp1a, foi capaz de reco-nhecer rMsp1a, produzida por E. coli e M.
bovis BCG Pasteur. Apesar de não terem
sido realizados testes em bovinos com essa vacina recombinante, rBCG,
expres-sando Msp1a de A. marginale constitui-se em uma potencial estratégia de imuniza-ção contra anaplasmose bovina, motivan-do a continuidade motivan-dos estumotivan-dos (Michelon et al. 2006).
rBCG na imunoterapia do câncer de bexiga
Tumores de bexiga são classificados em dois tipos, superficiais e músculo in-vasivo, dependendo do tecido no qual se inserem. O tratamento padrão para carcinoma superficial de bexiga consiste em uma ressecção transuretral (TUR) para sua remoção, porém, na maioria dos casos ocorre recorrência da doença. Vi-sando a diminuição da recorrência deste tipo de tumor, pacientes que apresentam câncer superficial de bexiga são tratados com injeções de BCG intravesical, as-sociados à TUR (Amirkhah et al. 2009). Diversos estudos relatam que a adminis-tração de BCG após a ressecção transu-retral promove uma redução significativa da taxa de recorrência do tumor e pode auxiliar na prevenção da progressão da doença, sendo a imunoterapia com BCG considerada o tratamento com maior efi-cácia para câncer superficial de bexiga (Gontero et al. 2010).
Os mecanismos de atuação da BCG frente a tumores não estão completa-mente elucidados. Acredita-se que isso ocorra devido a uma estimulação local e inespecífica do sistema imune, o que leva à ativação de células T, células NK e macrófagos (Liu et al. 2009), bem como a um aumento na secreção de citocinas Th1 (IL-2, IL-12, INOS e TNF-α) e INF-γ (Andrade et al. 2010). Embora apresente vantagens claras, o tratamento de câncer de bexiga utilizando BCG possui algu-mas limitações que comprometem seu uso. Atualmente cerca de 30 a 40% dos pacientes submetidos a esse tratamento não apresentam resultados satisfatórios (Andrade et al. 2010), principalmente de-vido à resistência à terapia ocasionada por mutações no gene p53 (Al- Sukhun and Hussain, 2003). A reintrodução da proteína p53 selvagem em linhagens ce-lulares tumorais, através de vetores, pode acarretar em desestruturação do fenóti-po tumorigênico, sendo essa estratégia uma nova alternativa para terapia gênica. Assim, nosso grupo de pesquisa está trabalhando na construção de um rBCG
secretando a P53, visando avaliar sua utilização para imunoterapia de câncer superficial de bexiga.
Bcg Auxotrófico
Vários estudos já demonstraram a via-bilidade de BCG em expressar antígenos heterólogos de bactérias, vírus, parasitas entre outros (Bastos et al. 2009). No en-tanto, os vetores que dirigem a expressão de antígenos heterólogos contêm genes de resistência a antibióticos como marca-dores seletivos e não conferem uma boa estabilidade da vacina quando utilizada in
vivo, o que acaba prejudicando a
respos-ta imune contra o antígeno expresso por rBCG. Em virtude disso, novos sistemas de expressão e seleção que permitem uma maior estabilidade são necessários. Recentemente nosso grupo desenvolveu um sistema baseado no uso de comple-mentação auxotrófica como marcador de seleção, uma cepa de BCG auxotrófica para o aminoácido leucina foi construída por knockout do gene leuD por recombi-nação homóloga. A expressão do gene
leuD em um plasmídio atuou como
mar-cador de seleção nas cepas auxotróficas de M. bovis BCG ΔleuD e M. smegmatis mc2144. A seleção por complementação de BCG auxotrófica se mostrou equi-valente à seleção por resistência a an-tibiótico, com a vantagem adicional de proporcionar maior estabilidade do vetor plasmidial, já que a pressão seletiva é mantida mesmo durante a multiplicação da bactéria in vivo (Borsuk et al. 2007). Além disso, nosso grupo comparou a es-tabilidade in vivo do sistema de seleção e expressão por complementação auxotró-fica em M. bovis BCG DleuD e do sistema de expressão convencional em M. bovis BCG Pasteur, utilizando os antígenos va-cinais de leptospiras patogênicas, LipL32 e a fração não idêntica de LigA (Seixas et al. 2010).
conclusão e perspectivAs
Há mais de 80 anos o BCG tem sido utilizado como vacina contra a tuberculo-se, e ainda hoje desempenha importante papel na imunização contra essa doença. Nas ultimas décadas, vários avanços fo-ram feitos para o desenvolvimento rBCG
não apenas como uma vacina contra a tuberculose, mas também contra outras doenças, tornando-se uma vacina multi-valente.
Nosso grupo tem explorado as poten-cialidades do rBCG como vetor vacinal expressando antígenos de diferentes pa-tógenos, demonstrando que rBCG é ca-paz de induzir resposta imune adequada e proteção contra diversas enfermidades. Além disso, estamos buscando melhorar a eficácia do rBCG através da utilização de cepas auxotróficas, as quais possuem uma maior estabilidade in vivo e dispen-sam o uso de genes de resistência à an-tibióticos como marcadores de seleção na construção da vacina recombinante. Associado a tudo isso, estamos também buscando desenvolver uma técnica de diagnóstico que possibilite diferenciar in-divíduos infectados de vacinados, o que possibilitará a utilização de rBCG também em animais.
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Ciência in Foco
PRODUÇÃO BIOTECNOLóGICA
DO BIOPOLÍMERO GOMA
XANTANA
1. introDução
As gomas são polímeros com pro-priedades gelifi cantes, estabilizadoras de emulsão, agentes que dão corpo a alimentos, dentre outras funções e po-dem ser obtidos pelas vias:
1. Natural - extraída de plantas - pec-tina, goma arábica, amidos, algas – ex.: Agar-agar, carragenana biossíntese mi-crobiana - Xantana, dextrana e levana.
2. Semi-sintéticas - ex. derivadas de celulose - Carboximetilcelulose (CMC)
3. Sintéticas - síntese química – polí-meros acrílicos ou vinílicos.
1.1. características gerais dos Biopolímeros
Os polissacarídeos de origem micro-biana, também chamados de biopolíme-ros, são capazes de formar soluções vis-cosas e géis em meio aquoso, mesmo em baixas concentrações. Devido a essa propriedade singular, os biopolímeros têm sido objetivo de intensa pesquisa, tendo em vista o seu alto potencial de
Pedro de Oliva Neto
Dept. Ciências Biológicas - FCLA - UNESP - Av. Dom Antônio 2100 - Assis SP Cep 19806-900
Valéria Marta Gomes de Lima
Dept. Ciências Biológicas - FCLA - UNESP - Av. Dom Antônio 2100 - Assis SP Cep 19806-900
Cíntia Regina Rodrigues Carignatto
Dept. Ciências Biológicas - FCLA - UNESP - Av. Dom Antônio 2100 - Assis SP Cep 19806-900
Ana Flávia Azevedo Carvalho
Dept. Ciências de Alimentos - FEA - UNICAMP - Cidade Universitária Zefferino Vaz - Campinas -SP
aplicação em vários segmentos indus-triais, como o de alimentos, onde en-contram um vasto campo de aplicação como agentes espessantes, estabilizan-tes, gelifi cantes e emulsifi canestabilizan-tes, e vêm substituindo progressivamente os polis-sacarídeos obtidos de fontes convencio-nais como plantas e animais, dadas as incertezas no suprimento do mercado mundial de polissacarídeos extraídos de fontes naturais, os quais são vulneráveis aos fenômenos que ocorrem na nature-za e à instabilidade política das regiões produtoras , provocando escassez e alta de preços.
A preferência por biopolímeros: características funcionais, somadas às vantagens da sua produção ser in-dependente de condições climáticas, permitindo que sejam obtidos em con-dições controladas e em lotes homo-gêneos com qualidade assegurada. A especificidade da biossíntese dos mi-crorganismos, os quais permitem ainda modificações genéticas, visando obter polissacarídeos com propriedades es-pecíficas.
Além da possibilidade dos biopolíme-ros substituírem e imitarem a textura dos polissacarídeos clássicos, agindo em baixas concentrações, se observa atual-mente um grande avanço nas pesquisas sobre sinergismo, onde polissacarídeos convencionais são associados à biopo-límeros visando a intensifi car as proprie-dades funcionais.
O mercado anual para as gomas uti-lizadas em alimentos foi estimado em 405 milhões de dólares e, o da goma xantana, em 60 milhões de dólares. De acordo com a CACEX, a importação de goma xantana no Brasil evoluiu de 29,9 toneladas para 132,6 toneladas somente no período de 1984 a 1986 (ABIA, 1989-1993).
1.2. Aplicação dos Biopolímeros.
As áreas em que os biopolímeros podem atuar são amplas envolvendo alimentos, indústrias de petróleo, de mi-neração, têxtil e termoquímica, de tintas de impressão, de papel, cosmética,
far-macêutica, e de produtos agropecuários, onde além de serem utilizados como for-madores de gel, espessantes e agentes de suspensão, são utilizados também por suas propriedades floculantes, ade-sivas, formadoras de filmes, lubrificantes e redutoras de fricção.
Entretanto, a obtenção de biopolíme-ros para consumo humano é uma tarefa mais complexa do que para a utilização em outros produtos, uma vez que estes devem ser considerados seguros do ponto de vista alimentar e, portanto, sa-tisfazer os severos códigos e legislações
alimentares, atualmente em vigor. Uma amostra disso é que, apesar de a pesqui-sa em biopolímeros ter sido iniciada há mais de três décadas, e há vários tipos já descobertos (Tabela 1) até agora apenas dois biopolímeros foram aprovados para uso alimentar nos EUA: xantana e gelana.
1.3. seleção de variedades de microrganismos produtores de biopolímeros
A seleção de microrganismos que produzam polissacarídeos em
quanti-dade e com propriequanti-dades economica-mente interessantes é um desafio que vem sendo enfrentado por vários gru-pos de pesquisa. Dos microrganismos que crescem em meio sólido produzin-do colônias gomosas, poucos produ-zem polissacarídeos extracelulares em cultura líquida, e destas, são poucas as que convertem o substrato de culti-vo em quantidades de polissacarídeos economicamente viáveis. Ademais, é preciso levar em consideração se o biopolímero é hidrossolúvel e apresen-ta propriedades funcionais de interesse comercial, e não serem tóxicos. A equi-pe do professor Dr. Pedro de Oliva Neto isolou 8 linhagens de Xanthomonas
campestris. A Figura 1 mostra detalhes
de uma das linhagens crescida em pla-ca de Petri (OLIVA-NETO et al. 2000).
2. goMA xAntAnA
2.1. Histórico da goma xantana
A xantana é um biopolímero produzi-do pela bactéria Xanthomonas. Consiste num heteropolissacarídeo extracelular, hidrossolúvel, descoberto em 1960, pelo Northern Utilization Research Deve-lopment dos EUA, anunciado como o polissacarídeo B-1459 como sendo um produto de fermentação da bactéria fito-patogênica Xanthomonas campestris, com alto peso molecular e propriedades únicas que o diferenciava das demais gomas, estabilidade térmica e à acidez especialmente, e altíssima capacidade de formar géis
No Brasil, o uso de goma xantana como estabilizante e espessante em ali-mentos foi permitido pelo Decreto Lei nú-mero 55.871 do ano de 1965. O mercado brasileiro é um tradicional importador de polissacarídeos para uso industrial, com exceção dos amiláceos e segue a ten-dência mundial, na qual o total de impor-tações de biopolímeros vem crescendo (CRUZ,1983 e ABIA,1989/1993).
2.2. estrutura química da goma xantana
A estrutura da xantana (Figura 2) é formada por uma cadeia principal idênti-ca à da celulose, composta de unidades de D-glicose unidas por ligações b(1 ®
tABelA 1. Alguns MicrorgAnisMos que proDuzeM BiopolíMeros.
Biopolímero Microrganismos Monômeros do polissacarídeo
Xantana Xanthomonas campestris, X. juglandis Glicose, ac. Glicurônico, manose, acetato e piruvato Dextrana Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mutans,
Streptococcus viridans
Glicose
Pululana Pullularia pullulans, (sin. Aureobasidium pullulans) Glicose
Alginato Azotobacter vinelandii Ácido β-D manurônico, α-L-ácido Gulurônico, acetato.
Curdlana Alcaligenes faecalis Glicose
Figura 1. Detalhe das características morfológicas de Xanthomonas campes-tris no. 3 com aspecto gomoso (xantana) e amarelado em placa de Petri.
4) e cadeias laterais com resíduos alter-nados de D-manose e ácido D-glicurôni-co na proporção de 2:1 . A manose termi-nal está ligada por ligações glicosídicas na posição 4 ao ácido b-D-glicurônico , e este liga-se na posição 2 da a-D-manose. Em aproximadamente metade das unidades de D-manose terminal, um resíduo de ácido pirúvico está ligado nas posições 4 e 6. A unidade de D-manose não terminal carrega um grupo acetil na posição 6 (ORENTAS et al., 1963).
2.3 Biossíntese da goma xan-tana.
A biossíntese da goma xantana inicia-se com a montagem de unida-des repetidas de pentassacarídeos, os quais são polimerizados para produzir a macromolécula. Esta tem sua cadeia construída através da adição dos mo-nossacarídeos ativados, denominados açúcares nucleotídeos, GDP-manose, UDP-glicose e UDP-ácido glicurônico. Os açúcares nucleotídeos (açúcar difos-fato nucleotídio) fornecem as formas ati-vadas de monossacarídeos. Estes açú-cares nucleotídeos doam, seqüencial-mente, seus resíduos de açúcares para o aceptor lipídico isoprenilfosfato C-55 para formar uma unidade de pentassa-carídeo-P-P-lipídeo, que é polimerizado, formando a goma xantana. No último estágio da síntese são introduzidos os grupos acetil e pirúvico. A etapa final da biossíntese ocorre quando a goma é excretada para o meio extracelular (RO-SEIRO et al. ,1993).
O processo necessita de energia, e é provavelmente realizado através de um sistema de transporte específico, o qual assegura a liberação do polímero do carregador lipídico e o transporta pela membrana externa. Estima-se que para a síntese da goma xantana sejam utiliza-dos 11ATP para cada subunidade de 5 hexoses polimerizadas. A energia exce-dente do metabolismo de Xanthomonas
campestris é direcionada para a
biossín-tese da goma xantana, aumentando sua produção (ROSEIRO et al., 1993). Os parâmetros que mais influenciam o pro-cesso de biossíntese deste exopolissa-carídeo são: o microrganismo produtor, a composição do meio de cultivo, o pH e a temperatura de incubação. Na natureza
este microrganismo usa a goma com um fator de virulência já que se trata de uma bactéria fitopatogênica.
Durante a síntese deste e de ou-tros exopolissacarídeos, a presença de polissacarases específicas podem degradar o biopolímero se elas forem liberadas via lise celular durante o culti-vo. A bactéria Xanthomonas campestris produz uma celulase (SUTHERLAND; KENNEDY, 1996).
Caminho das Pentoses - para enten-der a biossíntese da goma xantana tem que entender a produção de KDPG via caminho das pentoses. Esta via também chamada via fosfogluconato ou quebra da hexose monofosfato (HMP shunt) é um processo que gera NADPH e uma síntese não oxidativa das pentoses (Ribulose, Xilulose). Este caminho é al-ternativo à glicólise, e tem função prefe-rencialmente de biossíntese (ex. ácidos nucleicos). Na maioria dos organismos ocorre no citoplasma e nas plantas nos plastos (Figuras 3-5).
2.4. propriedades e Aplica-ções da goma xantana
Como possui estrutura de fibra ali-mentar, a xantana pode ser usada na indústria de alimentos como: agente
es-tabilizante e gelificante para alimentos, como cremes, sucos artificiais, sobre-mesas enlatadas ou em pó, molhos para saladas, carne, frango ou peixe, assim como para xaropes e coberturas para sorvetes e sobremesas. A compatibilida-de compatibilida-deste polissacarícompatibilida-deo com a maioria dos colóides usados em alimentos, in-cluindo o amido, torna a goma xantana ideal para a preparação de pães e ou-tros produtos para panificação. Queijos e seus derivados, molhos de tomates, produtos cárneos e seus derivados, pro-dutos de panificação, sobremesas for-muladas com amido, bebidas dietéticas, sorvete com baixa caloria.
A goma ainda pode ser aplicada como agente estabilizante em diversos produtos cosméticos e farmacêuticos, é compatível com sais minerais. A boa estabilidade em soluções de ácido e de base fortes permite que a goma xantana seja usada como espessante em produ-tos de limpeza industrial, em banhos de metais e aplicações similares, processos de fundição, emulsões de látex, lubrifi-cantes, tintas, formulação de pastas de impressão e de soluções para aplica-ções têxteis (PETTITT,1982).
Na agropecuária, é utilizada como agente de suspensão de vitaminas e minerais para suplementos e
tante para a fase seguinte e a produção de goma xantana. Estes pesquisadores produziram um meio mais eficaz que o YM para a propagação celular e estuda-ram o efeito de diferentes nutrientes no crescimento celular, produção e qualida-de da goma xantana.
2.5.2. Cultivo de Xanthomonas campestris pv campestris FCLA 26
A Fase de crescimento é normalmen-te realizada em no máximo 24 horas, podendo ser usado o já citado meio YM ou outros meios (Carignatto et al., 2011). Como a cultura é aeróbia, o crescimen-to pode ser feicrescimen-to em incubadora orbital a 160 – 180 rpm, ou em fermentador aerado (0,5-0,8 vvm) onde o importan-te não é o ar alimentado, mas quanto de oxigênio permanece residual (ideal-mente não permitir ser inferior a 30% do oxigênio dissolvido no início da cultura. O meio nesta fase deve ser corrigido ini-cialmente para pH 6 e a temperatura não deve ser superior a 27ºC. A Fase de pro-dução da goma xantana é normalmente realizada em até 72h. O meio pode con-ter diferentes tipos de substratos, pois a bactéria consome glicose, sacarose ou amido. O meio descrito por SOUW e DEMAIN (1979) pode ser usado também em condição aeróbia, tanto em incuba-dora orbital, 160-180 rpm, ou fermen-tador, nas condições já citadas, porém com pH ajustado incialmente para 7,0 e temperatura de até 30 ºC.
A produção industrial da xantana é feita convencionalmente em modo de batelada, utilizando-se elevadas ae-ração e agitação. O meio de cultivo é elaborado com uma fonte de carbono (sacarose ou glicose) utilizado como substrato para produção da goma, uma fonte de nitrogênio (extrato de levedura, peptona, nitrato de amônia ou uréia) e sais para o crescimento do microrganis-mo (MAUGERI, 2001; PAPAGIANNI et
al., 2001).
Como a produção da goma xan-tana é feita em dois estágios onde no primeiro é feita a produção da biomas-sa, exige-se mais alta concentração de nitrogênio e baixa concentração de açúcar. No segundo, o inóculo é prepa-rado com base na fase anterior, e mis-turado ao meio de produção da goma, que nesse caso inverte-se a exigência,
Figura 3. Biossíntese da goma xantana por Xanthomonas campestris.
camente para suspender proteínas nos substituintes de leite para bezerros. As propriedades reológicas das soluções de xantana aumentam a capacidade de dispersão das suspensões de fungici-das, herbicidas e inseticifungici-das, e também a capacidade de aderência à vegetação (COTTRELL,1979).
2.5. Método de produção da goma xantana
A goma xantana é produzida nor-malmente em duas etapas. Primeiro é realizada a produção do inóculo na fase de crescimento, o qual será introduzido na segunda etapa, para a produção da goma. As duas fases apresentam condi-ções e parâmetros de processos distintos.
2.5.1 Meios de cultura e produ-ção do biopolímero
O meio normalmente utilizado para isolamento, manutenção e propagação das bactérias é meio YM (Yeast Malt), com a seguinte composição em g/L: Ex-trato de malte 3,0; ExEx-trato de levedura 3,0; Peptona 5,0; Glicose 10,0 e Ágar 20,0. Para a produção do biopolímero são descritos diversos meios (Tabela 1), destaca-se o meio descrito por SOUW & DEMAIN (1979). O pH ajustado a 7,0 com solução de hidróxido de sódio 1M antes da esterilização a 121°C/15 min. em autoclave.
Trabalhos mais recentes desenvolvi-dos por CARIGNATTO et al (2009, 2010) demonstraram que o meio de cultivo para produção do inóculo é muito
impor-Figura 4. Via das pentoses para chegar ao KDPG.
Figura 5. Fase Oxidativa do caminho das Pentoses . glucose-6-phosphate (1), 6-phosphoglucono-δ-lactone (2), 6-phosphogluconate (3), ribulose 5-phosphate (4). mais alta concentração de açúcar e
me-nor de nitrogênio. Isso vale para outros processos fermentativos também, tais como etanol.
Devido à alta viscosidade desen-volvida no fluido da cultura, somente 3 a 5% de glicose poderia ser usada no meio de fermentação para alcançar maior rendimento e eficiência. Na maio-ria das fermentações, o crescimento mi-crobiano para quando a viscosidade do meio alcança cerca de 2000 cP (Brook-field LVT, 28ºC, 30rpm). Com concen-trações baixas de açúcar (até 2%), há uma diminuição na produtividade da goma se o nível de nitrogênio for acima de 0,06%.
A grande versatilidade nutricional de Xanthomonas campestris é um dos fatores que torna a produção da goma xantana de grande interesse industrial. Entretanto, a variação do peso molecular da goma sintetizada utilizando diferentes substratos interfere na qualidade desta
(SUTHERLAND, 1993).
Alguns estudos que foram relatados sobre os requerimentos nutricionais de
Xanthomonas campestris podem ser
ob-servados na Tabela 2.
2.5.3. Uso de fontes alternativas para a produção de goma xantana
Vários trabalhos foram desenvolvidos para aumentar o rendimento de goma xantana juntamente com o emprego de
técnicas mais econômicas de produção, recuperação e purificação do polímero, abaixando o custo total do processo. Em nível experimental utilizam-se substratos purificados na produção de xantana, mas na indústria são empregados substratos de baixo custo tais como: sacarose, ami-do, amido hidrolisaami-do, xarope de milho e melaços residuais da indústria açucarei-ra. Para a produção industrial da goma xantana já foram testados, entre outros, soro de leite, água de maceração de mi-lho, açúcar mascavo, xaropes de glicose e bagaço de frutas.
tABelA 2. Diferentes Meios utilizADos pArA proDução De xAntAnA por Xanthomonas campestris. Nutrientes Autores Starr (1946) Rogovin (1961) Cadmus (1976) Davidson (1978) Souw e Demain (1979) De Vuyst (1987) Garcia- Ochoa (1992) Nitschke (2001) Glicose 0,5% 2,0% 2,6% 5,5% monohidratada Sacarose 4,0% 4,0% 2,0% KH2PO4 0,2% 0,5% 0,5% 0,02% 0,286% K2HPO4 0,2% 0,5% MgSO4 7H2O 0,02% 0,02% 0,02% MgSO4 0,01% 0,01% MgCl2 0,0163% hexahidratada 0,0507% (NH4)2SO4 0,2% NH4 Cl 0,1% 0,2% NH4 NO3 0,114% (NH4 ) 2HPO4 0,1% CSL 1,0% Citrato 0,23% monohidratada 0,2% 0,15% 0,21% H3BO3 0,0006% 0,0006% 0,0006% 0,0006 ZnO 0,0006% 0,0006% ZnCl2 0,00067% ZnSO4 0,002% FeCl3 0,00014% FeCl3 6H2O 0,00024% 0,00024 0,0002% CaCO3 0,002% 0,002% 0,002% CaCl2 2H2O 0,0012% K2SO4 KI Na2CO3 0,05% Na2SO4 0,0114% 0,0089% Nitrogênio 0,02% Soro do leite em pó 4,0% 2.5.4. Manutenção e propagação do microrganismo
O subcultivo das linhagens produto-ras de goma é feito em tubos de ensaio contendo meio YM ágar inclinado ou outros meios, e é armazenado posterior-mente em refrigerador. Método de manu-tenção de curto prazo.
Para a manutenção permanente, após propagação, as culturas puras são semeadas em tubos inclinados, conten-do Meio YM padrão líquiconten-do e estes são incubados a 30°C, durante 24-40 horas,
sob agitação de 120 rpm. Após incuba-ção, o volume dos tubos é transferido, de forma asséptica, para um Erlenmeyer contendo 50 mL do mesmo meio e incu-ba-se de forma idêntica à etapa anterior. Após a incubação, 6 mL do cultivo são transferidos assepticamente para tubos estéreis e estes, centrifugados de ma-neira asséptica a 3000 rpm por 20 mi-nutos, dispensando-se o sobrenadante. A massa celular é ressuspendida em 3 mL de meio YM estéril contendo 10% de glicerol, podendo-se usar também trea-lose como crioprotetor, e congelada em freezer especial a -81°C ou nitrogênio líquido ou liofilização.
2.5.5. Efeito dos nutrientes no crescimento celular de Xanthomo-nas e produção da goma xantana.
O efeito dos nutrientes é muito gran-de tanto no crescimento como na pro-dução da goma xantana. Em trabalhos anteriores, as cepas de X. campestris, em estoque foram repicadas para pla-cas contendo ágar YM, e incubadas a 28°C por 24 horas, visando avaliar o efeito da sacarose na produção do inóculo para a fase seguinte - produção do biopolímero. Para o crescimento da bactéria foram utilizados o meio YM e outros cinco meios formulados com di-ferentes concentrações de sacarose. A fase posterior ocorreu no meio proposto por Souw e Demain (1979). Foram ava-liados os seguintes parâmetros: bio-massa, goma xantana produzida, visco-sidade do caldo e do biopolímero como indicadores de qualidade. Goma mais viscosa foi obtida quando o microrga-nismo cresceu no meio com maior con-centração de sacarose (2,5%). Cons-tatou-se que a forma como o inóculo é produzido é de grande importância para a produção do biopolímero.
O acetato ambém foi estudado como componente do meio de cultivo de
Xan-thomonas campestris pv. campestris,
visto que a composição da xantana apre-senta radicais acetil e não há trabalhos que tenha sido estudado esse ácido or-gânico como nutriente da fase de cresci-mento dessa bactéria. Foram avaliados os efeitos do acetato, em diferentes con-centrações, sobre a produção e viscosi-dade do biopolímero e sobre a produção de biomassa. O uso de até 0,05% de
acetato no meio de cultivo proporcionou um aumento na biomassa produzida du-rante a fase de crescimento, porém não contribuiu para o aumento na produção e viscosidade da goma xantana. A partir de 0,1% de acetato, houve inibição total do crescimento celular e de produção do biopolímero.
2.6. processo de produção in-dustrial da goma xantana.
Basicamente, trata-se de um proces-so biotecnológico semelhante a outros bioprocessos. A cultura é iniciada em laboratório com linhagens puras, em repicagens sucessivas aumentando a escala de propagação numa razão de cerca de 10 vezes (Figura 6). Ou seja, a cultura da fase anterior serve de inóculo para a posterior sendo que este último representa cerca de 8-10% do volume total da cultura. Esta fase de propagação da cultura deve ser feita com esteriliza-ção do meio por trocadores de calor a placa ou tubulares, e inoculação assép-tica via tubulações previamente esteri-lizadas. Qualquer contaminação nesta etapa pode comprometer todo o restante do processo.
O meio de cultura para produção da goma xantana estéril é misturado as-septicamente com o inóculo, dentro do fermentador, iniciando-se a fermentação que irá durar cerca de 60-72 horas. Após o término desta etapa, o caldo fermen-tado (Figura 7) será então esterilizado em trocado tubular por meio de vapor e, então, segue para outro tanque onde é feita a mistura etanol e caldo fermentado esterilizado, respectivamente, proporção volume: volume de 2,0 a 4,0 : 1.
A goma então se insolubiliza imedia-tamente (Figura 8) e, então é separada por centrifugação em centrífuga do tipo Decanter. A fase leve desta etapa é a so-lução hidro-alcoólica que será destilada para recuperar o etanol. A fase pesada trata-se da goma que sai ainda úmida e que deverá perder a umidade num seca-dor tubular. Finalmente, a goma seca (Figura 9) é então moída em moinho in-dustrial e separada em duas granulome-trias comerciais (80 e 200 mesh).
O rendimento do processo é de cerca de 50% de goma produzida em relação ao total de açúcar consumido. Os
inves-Figura 6. Propagação inicial de Xanthomonas campestris para produção da goma xantana.
Figura 7. Amostra de caldo fermentado contendo a goma xantana.
Figura 8. Precipitação da goma xantana com etanol.
Figura 9. Goma xantana na forma de fibra precipitada com etanol e seca em estufa.
Figura 10. Fluxograma da produção industrial da xantana via fermentação de Xanthomonas campestris, concentração e precipitação via solvente.
timentos para montagem de uma fábrica são expressivos, pois demandam equi-pamentos em aço inox, fermentadores bem projetados, boa condição de lim-peza CIP e uma unidade de destilação para recuperação do etanol usado para separação da goma. Os preços de mer-cado da goma variam de cerca de US$ 5.0 a 12.0/kg dependendo da aplicação e qualidade do produto. O fluxograma completo está descrito na Figura 10.
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