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O anúncio de que já
existem projetos para a
clonagem de seres
humanos vem provocando
grande polêmica.
Apesar dos sucessos
obtidos com outros
mamíferos (como ovelhas,
bois e porcos), é preciso
considerar que o processo
de clonagem é ainda muito
ineficiente e apresenta
grande número
de dificuldades,
o que torna prematura
qualquer tentativa de
aplicá-lo a humanos.
O desenvolvimento
da técnica pode trazer
muitos benefícios
(como na produção de
tecidos para transplantes),
mas será difícil justificar
a clonagem de um
indivíduo.
Franklin David Rumjanek
Departamento de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro 3 4 • C I Ê N C I A H O J E • v o l . 30 • n º 1 7 6
A TÉCNICA DE
CLONAGE
○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○pesquisava hidridação de plantas no Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. O significado do termo, definido pelo próprio Webber é uma colônia de organismos que, de modo assexuado (sem inter-venção de sexo), deriva de apenas um progenitor. A maçã Granny-Smith, variedade apreciada por gera-ções de degustadores de boas tortas, é um dos muitos exemplos de um clone desenvolvido por horticultores. Desde sua criação, o termo caiu no agrado dos cien-tistas e tem sido usado até os dias atuais, sem que a definição original tenha se desvirtuado.
Os clones não chamaram maior atenção durante muitos anos, pois a clonagem restringia-se princi-palmente a plantas e a protozoários os últimos multiplicam-se natural-mente de forma assexuada. Hoje, porém, o interesse pe-los clones renasceu aguda-mente, com a aplicação da técnica da clonagem a seres que normalmente se repro-duzem de forma sexuada. Em 1997, a clonagem histó-rica da ovelha Dolly um clone autêntico, por ter sido gerada a partir de uma célu-la somática (já diferenciada) de um doador adulto defla-grou um intenso debate, que prossegue até os dias de hoje. Esse tipo de clonagem provo-cou sensação devido à percepção
imediata de que o processo pode-
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O termo ‘clone’ foi cunhado em 1903 pelo botânico Herbert J. Webber, que
Quidquid agis, prudenter agas
et respice finem
Qualquer coisa que faças, age com prudência e considera o fim.
Provérbio medievalM DE MAMÍFEROS
○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ria em pouco tempo ser realizado com o ser huma-no, o que compreensivelmente inflamou a imagina-ção popular.
No entanto, guardadas as devidas proporções, a história da clonagem de animais não é novidade. Esse tipo de pesquisa já vinha ocorrendo desde os anos 70, com graus variados de sucesso. Na verda-de, no início dos anos 80 os cientistas estavam qua-se desistindo da clonagem de mamíferos. Em 1984, biólogo norte-americano James McGrath e o imu-nologista iugoslavo Davor Solter, por exemplo, che-garam a anunciar que os recursos técnicos da época estavam esgotados: A atividade diferencial dos genomas materno e paterno e os resultados apre-sentados aqui sugerem que a clonagem de mamífe-ros através de simples transferência nuclear é bio-logicamente impossível. A atividade diferencial dos genomas é o imprinting (ver adiante o que é). Essa perspectiva não desanimou outras gerações de pesquisadores e, como resultado, camundon-gos, carneiros, bezerros e porcos já foram clonados. No entanto, longe de constituir um arauto para a clonagem humana, esses aparentes sucessos trou-xeram em si uma mensagem cautelar que pode ser resumida no seguinte: (1) o prodedimento de clo-nagem é ainda muito ineficiente para todas essas espécies (em média, só 1% dos ovócitos manipu-lados desenvolve-se até a fase adulta), e as razões dessa ineficiência ainda são em grande parte des-conhecidas, e (2) o fator mais importante para o desenvolvimento correto do clone talvez seja a cha-mada reprogramação do genoma transferido para a célula recipiente, um fenômeno sobre o qual é mínima a informação disponível.
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COMO É REALIZADA A CLONAGEM.
Issoper-mite perceber que as dificuldades de ordem técni-ca e biológitécni-ca ainda existentes certamente exigirão um trabalho científico bem mais minucioso antes que a clonagem de vertebrados superiores possa ser considerada uma prática rotineira. Para destacar essas dificuldades, as etapas da clonagem são des-critas a seguir, chamando-se a atenção em especial para o fato de que a falta de conhecimento é preci-samente o que torna a idéia de clonar seres humanos um tanto prematura.
No esquema geral da clonagem (ver figura), os principais protagonistas são a célula receptora (a célula que receberá o núcleo transplantado) e a célu-la doadora do núcleo. Em geral, a célucélu-la usada para receber o material genético da célula doadora é um zigoto, ou seja, um ovo fertilizado por um esperma-tozóide (que, portanto, contém dois pronúcleos, com material genético materno e paterno) ou um ovócito, ou seja, um ovo não fertilizado (que só contém ma-terial genético materno).
Os ovócitos, obtidos pela estimulação da ovulação com hormônios esteróides, são colhidos e transfe-ridos a um meio de cultura, onde podem ou não ser fertilizados com espermatozóides. Antes da trans-ferência do núcleo da célula doadora para o ovócito (ou o zigoto), é preciso retirar o núcleo do ovócito (ou do zigoto). Essa etapa, chamada de enucleação, é realizada cuidadosamente com uma micropipeta li-gada a um micromanipulador, que literalmente suga o material nuclear. Durante a enucleação, deve-se ter um cuidado especial para que a micropipeta não pe-netre na membrana plasmática do ovócito, porque
Anos 1880 Os alemães Wilhelm Roux (1850-1924) e August Weismann (1834-1914) dizem que o ovo e o es-perma contribuem igualmente com cromossomos para o zigoto (ovo ferti-lizado). Também propõem – errada-mente, como se descobriria depois – que só as células germinais do em-brião carregam todos os potenciais he-reditários e que, ao se diferenciarem, perderiam parte desses potenciais.
1894 O alemão Hans Driesch (1867-1941) separa células de embriões de ouri-ço do mar (com duas e quatro célu-las) e observa o desenvolvimento de larvas pequenas mas completas. Esse e outros experimentos des-mentem a teoria de Weismann-Roux.
1901 Outro alemão, Hans Spemann (1869-1941), divide um embrião de sala-mandra (com duas células) e produz com sucesso duas larvas.
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1914Spemann enlaça um ovo recém-ferti-lizado com um fio de cabelo e aperta o laço, forçando o núcleo para um lado e deixando apenas citoplasma para o outro. O lado com núcleo divi-de-se até ter 16 células. Nesse está-gio, um dos núcleos invade o outro lado e o nó é mais apertado, para evitar outra transferência. Agora, os dois lados formam larvas, uma pouco mais velha que a outra, pro-vando que um núcleo celular (de embrião com 16 células) pode gerar uma larva completa.Anos 1940-1950 Mamíferos de várias espécies são clonados por divisão de embriões, mas só quando estão nos estágios iniciais, antes da fase em que se fixariam no útero.
1952 Primeiro transplante de núcleo. Os norte-americanos Robert Briggs (1911-1983) e Thomas J. King
trans-plantam o núcleo de uma célula de embrião de sapo para um oócito não-fertilizado, do qual foi retirado o núcleo. Os ovos trans-plantados produzem girinos e mui-tos tornam-se sapos juvenis.
1961-1962 O inglês John B. Gurdon e o norte-americano Robert McKinnell usam o método de transplante de núcleo em diferentes espécies de sapos e obtêm animais adul-tos que geram prole normal. Isso prova a totipotencialidade de nú-cleos de células embrionárias.
1962-1965 McKinnell, King e Marie Di Bernardino obtêm girinos ao transferir núcleos de células can-cerosas do rim de sapos para ovos enucleados. Isso mostra que cer-tas células cancerosas podem vol-tar ao normal pelo processo de diferenciação.
eventualmente essa membrana receberá o novo mate-rial nuclear e nessa ocasião não poderá vazar.
Em seguida, também usando uma micropipeta, acrescenta-se o carioplasto da célula doadora. O ca-rioplasto é o núcleo retirado da célula doadora, ain-da rodeado por uma camaain-da delgaain-da de citoplasma e de membrana plasmática. Alternativamente, po-de-se transplantar também a célula inteira contendo o núcleo que dará origem ao clone. Em ambos os casos, o material transplantado (o carioplasto ou a célula inteira) é fundido ao ovócito por meio de eletrofusão (choques elétricos de baixa intensida-de), ou através da adição do vírus Sendai inativado, que promove a fusão das membranas. A partir daí, o clone poderá se desenvolver.
OS CUIDADOS COM AS CÉLULAS.
O processoaparenta ser simples, mas na verdade é necessário considerar uma série de cuidados técnicos com as células receptora e doadora.
A célula receptora pode ser o ovócito ou o zigoto. O uso do primeiro apresenta algumas vantagens em relação ao uso do outro: o ovócito enucleado dá ao núcleo transplantado mais tempo para adaptar-se do que o zigoto. Nesse último caso, o prazo para trans-ferência do núcleo é mais curto, porque a célula re-ceptora já está fertilizada e, portanto, o programa de desenvolvimento do embrião já está em curso logo após a fertilização começa a ativação, processo que consiste em uma série de alterações dentro da célu-la, seguidas pelas divisões celulares rápidas, típicas do embrião.
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preservar células indefini-damente, congeladas, desde que a água intracelular seja substituída por solventes que não formem cristais no conge-lamento). A idéia de clonar mortos ilustres ficou bem pre-sente no imaginário popular quando Dolly foi clonada. Agora sabe-se que não será possível clonar pessoas como Isaac Newton, Albert Einstein, Adolf Hitler e outros (por va-riadas motivações) candidatos à imortalidade.
As células doadoras de nú-cleos devem ainda estar em um
estado de dormência (chamado de quiescência) e portanto na fase G0 do ciclo celular as outras fases desse ciclo são G0/G1 e G2. Essa dormência é induzida in vitro retirando-se os nutrientes do meio de cultura, e esse procedimento é importante por-que o núcleo da célula doadora tem por-que interromper o seu próprio programa para depois ser reprogramado no interior do citoplasto receptor.
IMPRINTING, ATIVAÇÃO E TELÔMEROS.
Onú-cleo doado também precisa conter toda a carga ge-nética materna e paterna, por causa do fenômeno chamado de imprinting, revelado em experiências realizadas com camundongos e coelhos. O imprinting que ocorre durante a produção dos gametas, como
1964 Na Universidade de Cornell (Estados Unidos), F. C. Stewart consegue que uma planta completa de cenoura se desenvolva a partir de células de raízes. Esse e outros experimentos anteriores com anfíbios levam al-guns cientistas a acreditar que seria possível clonar células diferencia-das (somáticas). Em 1966, isso é conseguido por John Gurdon e V. Uehlinger, usando núcleos de célu-las intestinais de girinos.
Anos 1970 Outros cientistas obtêm gi-rinos e sapos com o mesmo méto-do, usando outros tipos de células diferenciadas.
1983 O norte-americano James McGrath e o iugoslavo Davor Solter desenvol-vem o método de transferência nu-clear para embriões de mamíferos. Camundongos férteis são gerados de ovos fertilizados enucleados que
recebem núcleos de outros ovos fer-tilizados acompanhados de uma pe-quena quantidade de citoplasma.
1986 O dinamarquês Steen Willadsen clona carneiros, na Inglaterra, fun-dindo o núcleo de uma célula de embrião (no estágio de oito células) em um ovo enucleado. Outros pes-quisadores, em seguida, conse-guem o mesmo com bois, ovelhas, porcos, bodes e ratos, usando téc-nicas semelhantes.
1993 Neal First e M. Sims relatam pela primeira vez a clonagem de bezer-ros pelo transplante do núcleo de células embrionárias cultivadas em laboratório.
1997 Nasce a ovelha Dolly, primeiro mamí-fero clonado de célula somática, ob-tida pela equipe do escocês Ian Wilmut, do Instituto Roslin. O núcleo
transplantado foi obtido de uma cé-lula de glândula mamária de uma ovelha adulta. No mesmo ano, Don Wolf e equipe, do Centro de Pesqui-sa de Primatas do Oregon, clona dois macacos Rhesus por transplante de núcleo de células de embrião (no estágio de oito células).
1998 Na Universidade do Havaí, Teruhiko Wakayama e equipe geram grande número de camundongos transplan-tando núcleos de células adultas de ovário para ovos enucleados. Pela primeira vez, eles clonam células de um animal clonado.
1999 a 2001 Cientistas relatam o nasci-mento de outros animais clonados, em diversos países, e avanços nas técnicas utilizadas. Este ano, es-pecialistas em fertilização assisti-da anunciam projetos de clonagem humana.
No entanto, como veremos adiante, o zigoto tam-bém oferece algumas vantagens sobre o ovócito, no que diz respeito à ativação. Sabe-se que resultados melhores foram obtidos quando, antes do transplante nuclear, o ovócito havia sido coletado em um está-gio específico (a metáfase) da segunda divisão que ocorre durante a meiose (processo de divisão que gera células com a metade do número de cromosso-mos da célula-mãe). Isso indica que o próprio am-biente do citoplasto (o ovócito sem o núcleo) é impor-tante para a reprogramação do núcleo transferido.
Por razões ainda desconhecidas, os ovócitos de algumas espécies são melhores que outros para o processo de clonagem. É mais fácil, por exemplo, obter a clonagem com ovócitos de carneiro do que com as mesmas células de camundongos.
Em relação às células doadoras dos núcleos, vá-rios fatores também têm que ser levados em conta. A primeira pergunta é: qual a melhor célula doado-ra? A resposta é difícil, pois sabe-se apenas que algu-mas células funcionam como doadoras e outras não. Além disso, para que a doação do núcleo seja fun-cional, não é necessário que as células venham dire-tamente de um embrião, como ficou bem claro no caso de Dolly, no qual as células doadoras eram da glândula mamária de uma ovelha adulta.
Outra condição indispensável para as células do-adoras é que estas têm que estar vivas. É comum incubá-las por dois ou três dias em meio de cultura, antes do transplante nuclear. Essa exigência já basta para eliminar a possibilidade de realizar a clonagem a partir de tecidos de pessoas mortas, se não houve preservação das células (hoje, no entanto, é possível
Esquema básico da clonagem, seja com um zigoto ou com um ovo não-fertilizado
Zigoto Ovo não-fertilizado
Micropipeta Pronúcleos DNA Pronúcleos são sugados Núcleo é sugado Transferência do núcleo para o zigoto ou para o ovo não-fertilizado Carioplasto
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o óvulo e o espermatozóide é um programa de regulação ainda desconhecido que estabelece quais genes estarão ativos e quais ficarão inativos.
Descobriu-se que, em função desse fenômeno, as contribuições genéticas materna e paterna para o desenvolvimento do embrião não são idênticas. Um ovócito enucleado que, por exemplo, só receba ma-terial genético masculino (como o de um esperma-tozóide) desenvolverá estruturas extrafetais, como a placenta, mas não as estruturas do feto propria-mente ditas, que ficam sob a responsabilidade da porção materna do genoma embrionário. Portanto, se o conjunto genômico completo não estiver pre-sente durante a transferência do núcleo da célula doadora, o embrião não se desenvolverá.
A seguir, é preciso considerar o fenômeno da ati-vação, como mencionado acima. Com a ativação do ovócito fertilizado, inicia-se uma cascata de eventos relacionados ao preparo dessa célula para o even-tual desenvolvimento embrionário. O fenômeno in-clui, após a fertilização, alterações na membrana, para impedir a entrada de outros espermatozóides. Muitos desses eventos não são bem compreendidos, mas algumas das manifestações já estão bem defi-nidas em ovócitos de camundongos, como os au-mentos repetitivos, pulsáteis, da concentração de cálcio dentro da célula. Outros fatores envolvidos no fenômeno da ativação a participação do gás NO (óxido nítrico), por exemplo estão sendo estuda-dos no momento.
Fica claro, porém, que se o ovócito não fertilizado for escolhido como o receptor do núcleo, torna-se necessário mimetizar o fenômeno da ativação, para que o embrião vingue. Como a reprodução fiel desses eventos ainda não está controlada, é preferível então escolher o zigoto como célula receptora (mesmo que a janela temporal para o transplante do núcleo seja mais estreita do que com o ovócito), já que a ativação é deflagrada naturalmente pelo espermatozóide.
Em relação ao núcleo transplantado, uma ques-tão ainda em aberto é a do tamanho dos telômeros, as estruturas dos cromossomos que controlam a lon-gevidade das células (ver Dolly já nasceu velha?, em CH nº 152). Também está em estudos o
fenôme-no da heteroplasmia mitocondrial, fenôme-no qual a pre-sença de mais de um tipo de DNA mitocondrial na mesma célula pode contribuir para o insucesso da clonagem.
PARA QUE CLONAR HUMANOS?
Com todasessas dificuldades, não surpreende que ocorram tantos insucessos na clonagem. Se a eficiência do processo gira em torno de 1%, o êxito está quase no limite do aleatório, apesar da sofisticação téc-nica crescente nessa área. No entanto, o que mais preocupa os pesquisadores é o fato de não se poder atribuir as falhas da clonagem a causas específicas uma mensagem clara para que os cientistas vol-tem à prancheta, antes de qualquer tentativa mais ousada.
Por outro lado, o conhecimento obtido com as clonagens de carneiros, vacas, camundongos e por-cos deixa bem claro que a clonagem de humanos não representa uma situação particularmente difícil do ponto de vista técnico. Em outras palavras, a clonagem do homem não deve reservar surpresas no contexto laboratorial. Assim que os problemas com as outras espécies forem superados e isso é só uma questão de tempo , a clonagem do homem necessi-tará apenas de alguns pequenos ajustes.
Resta saber: para que clonar seres humanos? No caso de bovinos, caprinos e suínos, as vantagens são óbvias. E quanto a homens e mulheres? As pessoas, muitas vezes, esquecem que um clone não seria uma entidade instantânea. Ele teria que pas-sar por uma gestação de nove meses e cresceria tal e qual seus semelhantes não clonados. Os clones teriam que ser educados e estariam sujeitos a in-fluências talvez bem diversas daquelas que molda-ram o indivíduo que doou o seu núcleo. Além dis-so, devido à norma de reação, os clones gerados podem até assumir aparências distintas daquela do clone fundador. Segundo essa norma, mesmo que uma característica seja ditada pela constituição genética, o ambiente precisa permitir a manifesta-ção plena do gene uma criança filha de pais altos (com predisposição genética para ser alta) não cres-cerá como devia se não se alimentar corretamente em certa fase da vida.
Assim, nada impediria que o clone de Isaac New-ton, se isso fosse possível e se ele vivesse em uma região costeira, viesse a ser por exemplo um musculo-so surfista, ou que o clone de Albert Einstein virasse um pagodeiro e o de Adolf Hitler se tornasse um as-sistente social em uma favela carioca. A técnica da clonagem pode vir a revelar como cultivar órgãos para transplantes, uma meta verdadeiramente de-sejável, mas será difícil encontrar argumentos que justifiquem a clonagem de um indivíduo. n
Sugestões para leitura ALDOUS, P., ‘Can they rebuild us?’ in Nature 410, pp. 622, 2001. DEGUCHI, R. et al., ‘Spatiotemporal analysis of Ca2+ waves in relation to the sperm entry site and animal-vegetal axis during Ca2+ oscillations in fertilized mouse eggs’ in Developmental Biology, 218, pp. 299, 2000. SOLTER, D., ‘Mammalian cloning: advanced and limitations’ in Nature Reviews Genetics, 1, pp. 199, dezembro/ 2000. WAKAYAMA, T. et al., ‘Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatica cells by nuclear transfer’ in Science, 292 (5517), pp.740, 2001.
