Mercodia Glucagon ELISA

Mercodia

Glucagon ELISA

Instruções de utilização

10-1271-01

REAGENTES PARA DETERMINAÇÃO 96S

Para fins de diagnóstico in vitro

Fabricado por

Mercodia AB

Sylveniusgatan 8A,

SE-754 50 Uppsala,

Sweden

∑ = 96

Reagentes para determinação 96

Prazo de validade

Armazenar entre 2–8 °C

N.º de lote

EXPLICAÇÃO DOS SÍMBOLOS UTILIZADOS NAS ETIQUETAS

© Mercodia 2013-2017

UTILIZAÇÃO PREVISTA

O Mercodia Glucagon ELISA é um ensaio destinado à medição da hormona pancreática gluca-gon no plasma e no soro. As medições de glucagluca-gon são utilizadas no diagnóstico e tratamento de doentes com vários distúrbios do metabolismo dos hidratos de carbono, incluindo diabetes mellitus, hipoglicemia e hiperglicemia.

RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE

Glucagon é um polipeptídeo de 29 aminoácidos processado a partir de proglucagon nas cé-lulas alfa pancreáticas. Nas cécé-lulas L intestinais o proglucagon é clivado em glicentina, cor-respondendo aos resíduos de proglucagon n.º 1-69. A glicentina pode ainda ser transformada em oxintomodulina, correspondendo aos resíduos de proglucagon n.º 33-69. Estes peptídeos são libertados em simultâneo em resposta à estimulação. Além disso, um fragmento do glu-cagon correspondente à sua parte terminal C (resíduos n.º 19-29), também designado por mini-glucagon, está presente no pâncreas em quantidades reduzidas comparado com o teor total de glucagon.

O glucagon é processado em diversas formas truncadas por várias endopeptidases (neprilisina, por exemplo) e exopeptidases (DPP-4). Se pretende medir o glucagon ativo (1-29), o ensaio não deve apresentar uma reação cruzada a qualquer um dos metabolitos (Campbell & Drucker, 2015), um dos quais, o glucagon 3-29, é o mais comum. As análises Biacore e ELISA mostraram que não existe qualquer reatividade cruzada nos ensaios Mercodia Glucagon em relação ao glu-cagon 3-29 a, ou acima, das concentrações fisiológicas. Isto é uma descoberta importante, uma vez que o glucagon 3-29 tem sido reportado como o metabolito mais importante em amostras clínicas devido, em grande parte, ao metabolismo de protease em plasma in vitro durante o armazenamento de amostras (Howard JW et al., 2015). A especificidade acrescentada é uma razão primordial pela qual as concentrações nos ensaios Mercodia glucagon são inferiores às concentrações geradas por outros ensaios glucagon.

Em geral, o glucagon tem o efeito oposto ao da insulina, ou seja, aumenta os níveis de glicose no sangue. Faz com que o fígado converta o glicogénio em glicose, a qual é posteriormente libertada para o fluxo sanguíneo. Com uma estimulação prolongada, a ação do glucagon no fígado resulta numa ativação de poupança de glicose da oxidação dos ácidos gordos livres e na produção de cetonas. Durante a hipoglicemia, a secreção de glucagon oferece um mecanismo de feedback protetor, defendendo o organismo contra os efeitos nefastos da deficiência de glicose no cérebro e nos nervos.

PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO

O Mercodia Glucagon ELISA é um imunoensaio enzimático de fase sólida em dois locais. Baseia-se na técnica de “sanduíche” direta, na qual dois anticorpos monoclonais são direcionados contra determinantes antigénicos separados da molécula de glucagon Durante a incubação, o glucagon na amostra reage com anticorpos anti-glucagon conjugados com peroxidase (clone E6A11K) e anticorpos anti-glucagon (clone M5F9S) ligados a poços da microplaca. Um simples passo de lavagem remove anticorpo etiquetado de enzima não ligado. O conjugado ligado é detetado por reação com 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB). A reação é parada adicionando ácido para dar um ponto final colorimétrico que é lido espetrofotometricamente.

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ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES

• O conteúdo deste kit e seus resíduos não devem entrar em contacto com animais rumi-nantes ou suínos.

• Todas as amostras devem ser manuseadas como capazes de transmitir infeções. • Cada poço pode ser utilizado apenas uma vez.

• Stop Solution contém <5% de ácido sulfúrico. Stop Solution está marcado:

Perigo

H318 – Provoca lesões oculares graves. H315 – Provoca irritação cutânea.

P280 – Usar luvas de protecção/vestuário de protecção/protecção ocular/pro- tecção facial.

P264 – Lavar cuidadosamente após manuseamento.

P302 + P352 + P362 + P364 – SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE: lavar com sabonete e água abundantes. Retirar a roupa contaminada e lavá-la antes de a voltar a usar.

P332 + P313 – Em caso de irritação cutânea: Consulte um médico. P305 + P351 + P338 + P310 – SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar. Contacte imedia- tamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. • Enzyme Conjugate Buffer, Cal 0, 1, 2, 3, 4, 5 e Wash Buffer contém <0,06% de

5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona e 2-metil-2H-isotiazol-3-ona (3:1). Enzyme Conjugate Buffer, Calibrators e Wash Buffer estão rotulados:

Atenção

H317 – Pode provocar uma reacção alérgica cutânea. P280 – Usar luvas de protecção.

P261 – Evitar respirar as vapores.

P272 – A roupa de trabalho contaminada não pode sair do local de trabalho. P302 + P352 – SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE: Lavar com sabonete e água abundantes.

P333 + P313 – Em caso de irritação ou erupção cutânea: Consulte um médico. P501 – Eliminar o conteúdo/recipiente de acordo com a legislação local/regio- nal/nacional/internacional.

MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS

• Pipetas de volumes adequados (para a adição de solução de Enzyme Conjugate 1X, Substrate TMB e Stop Solution preferem-se pipetas de repetição)

• Tubos e provetas para preparar os reagentes • Água bidestilada

• Agitador magnético • Agitador vórtex

• Leitor de microplacas com filtro de 450 nm

• Agitador de microplacas (700–900 ciclos por minuto, movimento orbital) • Frigorífico (2-8 °C) com espaço para agitador de microplacas

• Dispositivo de lavagem de microplacas com função de sobrefluxo (recomendado mas não necessário)

REAGENTES PARA 1 X KIT 96

Cada kit Mercodia Glucagon ELISA (10-1271-01) contém um selador de placa e reagentes para 96 poços, suficiente para 42 amostras e uma curva de calibração em duplicado. Para uma série de ensaios maior, utilizar pools de reagentes de embalagens com números de lote idênticos. O prazo de validade do kit completo está impresso no rótulo exterior. A temperatura de armaze-namento recomendada é 2-8 °C.

Coated Plate 1 placa 96 poços Pronto a utilizar

Anticorpo monoclonal anti-glucagon de ratinho tiras de 8 poços

Para tiras de microplacas não utilizadas, voltar a fechar o saco com fita adesiva, conservar a 2-8 °C e utilizar no prazo de 2 meses.

Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 frascos 1000 µL Liofilizado

Glucagon sintético Adicionar 1000 µL

Código de cor: amarelo água bidestilada

Concentração indicada no rótulo do frasco. por frasco. Calibrators reconstituídos mantêm-se estáveis durante 1 mês a 2-8 °C.

Se for necessário utilizar os Calibrators reconstituídos para além de 1 mês, separar em alíquotas e armazenar a -20 °C. Os Calibrators aliquotados mantêm-se estáveis durante pelo menos 2 meses a -20 °C.

Evitar ciclos repetidos de congelação/descongelação.

Calibrator 0 1 frasco 5 mL Pronto a utilizar

Código de cor: amarelo

Enzyme Conjugate 11X 1 garrafa 2.2 mL Preparação,

Anticorpo monoclonal anti-glucagon de ratinho ver abaixo

Enzyme Conjugate Buffer 1 garrafa 22 mL Pronto a utilizar

Código de cor: azul.

Wash Buffer 21X 1 garrafa 50 mL Diluir com 1000 mL

Armazenamento após a diluição: de água bidestilada para 2-8 °C durante 2 meses. preparar a solução de wash buffer 1X

Substrate TMB 1 garrafa 22 mL Pronto a utilizar

Solução incolor Atenção! Sensível à luz!

Stop Solution 1 frasco 7 mL Pronto a utilizar

Preparação de solução de enzyme conjugate 1X

Preparar o volume necessário de solução de enzyme conjugate 1X por diluição do Enzyme Con-jugate 11X (1+10) em Enzyme ConCon-jugate Buffer de acordo com a tabela abaixo. Ao preparar a solução de enzyme conjugate 1X para toda a placa, verter totalmente o conteúdo de Enzyme Conjugate Buffer na garrafa de Enzyme Conjugate 11X. Misturar suavemente.

Utilizar no prazo de 1 semana. Número de tiras Enzyme

Conjugate 11X Enzyme Conjugate Buffer 12 tiras 8 tiras 4 tiras 1 garaffa 1300 µL 700 µL 1 garaffa 13 mL 7 mL

COLHEITA E MANUSEAMENTO DE AMOSTRAS

Pode utilizar-se soro ou plasma. No entanto, o glucagon em amostras de soro ou plasma EDTA é sensível às condições de armazenamento e aos ciclos de congelação/descongelação. Recomen-da-se conservar as amostras em gelo durante sua a descongelação e a preparação do ensaio. Voltar a colocar no congelador o mais rapidamente possível. A adição de aprotinina a amostras de plasma EDTA não melhora a estabilidade.

Soro

Efetuar a colheita de sangue por venopunção, deixar coagular e separar o soro por centrifu-gação. Armazenar as amostras a -80 °C e evitar os ciclos de congelação/descongelação. Evitar armazenar as amostras à temperatura ambiente ou a 2-8 °C.

Plasma

Plasma EDTA

Efetuar a colheita de sangue por venopunção em tubos que contenham EDTA como anticoagu-lante e separar a fração de plasma por centrifugação. Armazenar as amostras a -80 °C e evitar os ciclos de congelação/descongelação. Evitar armazenar as amostras à temperatura ambiente ou a 2-8 °C.

Plasma EDTA em tubos BD

_P800

Para estudos nos quais seja necessário detetar níveis baixos de glucagon, poderá ser vantajoso utilizar tubos BD™ (Becton Dickinson) P800 para a colheita de amostras (art. n.º 366420) para prevenir a degradação do glucagon. Armazenar as amostras a -80 °C e evitar os ciclos de congelação/descongelação. Evitar armazenar as amostras à temperatura ambiente ou a 2-8 °C.

Meio de cultura para células

Note-se que diferentes produtos químicos utilizados nos meios de cultura para células podem interferir com o ensaio (como azida de sódio (NaN₃) e beta-mercaptoetanol).

Preparação das amostras

Normalmente, a diluição não é necessária. No entanto, as amostras acima do valor obtido de Calibrator 5 devem ser diluídas com Calibrator 0. Atenção! Os buffers que contêm azida de sódio (NaN3) não podem ser utilizados para diluição de amostras.

PROCEDIMENTO DE TESTE

Preparar uma curva de calibração para cada ensaio

1. Preparar solução de enzyme conjugate 1X e solução de wash buffer 1X.

2. Preparar poços de microplaca suficientes para os Calibrators, Controls e amostras em duplicado.

3. Pipetar 25 µl de cada Calibrator, Control e amostra nos poços correspondentes. 4. Adicionar 200 µl de solução de enzyme conjugate 1X a cada poço e colocar o selador

de placa.

5. Incubar num agitador de placas (700-900 rpm) durante a noite (18-22 horas) a 2-8 °C. 6. Lavar 6 vezes com 700 µl de solução de wash buffer 1X por poço, utilizando um lava-dor de placas automático com função de sobrefluxo de lavagem. Após a lavagem final, inverter a placa e bater firmemente contra papel absorvente. Não incluir o passo de imersão durante o processo de lavagem.

Ou manualmente,

Descartar o volume de reação invertendo a microplaca sobre uma pia. Adicionar 350 µl de solução de lavagem a cada poço. Descartar a solução de wash buffer 1X e bater várias vezes e com firmeza a microplaca contra papel absorvente para remover o excesso de líquido. Repetir 5 vezes. Evitar a imersão prolongada durante o processo de lavagem.

7. Adicionar 200 µl de Substrate TMB.

8. Incubar na bancada durante 15 minutos à temperatura ambiente (18-25 °C). 9. Adicionar 50 µl de Stop Solution a cada poço. Colocar a placa no agitador durante

aproximadamente 5 segundos para assegurar a mistura.

10. Ler a densidade ótica a 450 nm e calcular os resultados. Ler no prazo de 30 minutos.

Atenção! Tenha muito cuidado para evitar a contaminação do Substrate TMB com a solução de enzyme con-jugate.

CONTROLO DE QUALIDADE INTERNO

Os controlos comerciais e/ou pools de soro internos com concentrações baixas, médias e altas de glucagon devem ser testados regularmente como amostras e os resultados anotados diari-amente. Constitui boa prática de laboratório registar os dados seguintes relativamente a cada ensaio: número de lote do kit, datas de diluição e/ou de reconstituição dos componentes do kit, valores de DO do branco, dos Calibrators e dos Controls. Os laboratórios devem respeitar os regulamentosgovernamentais ou os requisitos de acreditação relativos à frequência do controlo de qualidade.

CÁLCULO DOS RESULTADOS

Cálculo computorizado

Para obter a concentração de glucagon, reduzir os dados computorizados da absorvância para os Calibrators, com exceção de Calibrator 0, versus a concentração utilizando uma logística de quatro parâmetros.

Cálculo manual

1. Registar os valores de absorvância obtidos para os Calibrators, com exceção de Calibrator 0, versus a concentração utilizando uma logística de quatro parâmetros.

2. Ler a concentração das amostras desconhecidas a partir da curva de calibração.

Exemplo de resultados

Poços Identidade A₄₅₀ Conc. médiapmol/L 1A–B 1C–D 1E–F 1G–H 2A–B 2C–D 2E–F 2G–H 3A–B Calibrator 0 Calibrator 1* Calibrator 2* Calibrator 3* Calibrator 4* Calibrator 5* Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 0.067/0.069 0.106/0.104 0.152/0.157 0.331/0.316 0.902/0.923 2.949/2.945 0.154/0.155 0.191/0.193 0.569/0.562 3.14 4.43 18.1 * Concentração indicada no rótulo do frasco

Curva de calibração

É aqui mostrada uma curva de calibração típica. Esta curva não deve ser utilizada para determi-nar resultados de um ensaio.

0,1   1,0   10,0   1   10   100   O.D.  4 50  n m   Glucagon  (pmol/L)   0.1 1.0 10 1 10 100 O.D . 450 nm Glucagon (pmol/L) 8

Fator de conversão

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO

As amostras altamente lipémicas ou ictéricas não interferem no ensaio. Níveis altos de hemoglo-bina (>500 mg/dl) podem interferir no ensaio. Tal como com todos os testes de diagnóstico, um diagnóstico clínico definitivo não deverá basear-se nos resultados de um único teste, mas deverá ser emitido por um médico após a avaliação de todas as conclusões clínicas.

Ao medir amostras onde os níveis de oxintomodulina, glicentina ou proglucagon 1-61 estão acima do intervalo fisiológico normal, ou se um destes peptídeos tiverem sido injetados nos su-jeitos antes da amostragem, pode ser usado um protocolo alternativo (veja abaixo) para reduzir a reatividade cruzada destes peptídeos. São habitualmente encontrados níveis aumentados de glicentina e de oxintomodulina em pacientes de cirurgias pôs-bariátrica. São habitualmente encontrados níveis aumentados de proglucagon 1-61 em pacientes com insuficiência renal. O protocolo alternativo é exclusivamente para utilização em pesquisa e encontra-se descrito em TechNote TN34-0158. O protocolo requer uma frasco extra de buffer conjugado (n.º d/ref.ª 20-7055). Para mais informações, entre em contato com info_europe@mercodia.com ou com o representante comercial local.

VALORES ESPERADOS

As boas práticas ditam que cada laboratório estabelece sua própria faixa prevista de valores. Os seguintes resultados poderão servir de guia até o laboratório ter recolhido suficientes dados próprios. Níveis de jejum de 121 indivíduos testados, aparentemente saudáveis, gerou uma mediana de 6,5 pmol/L e 95% da faixa de referência central de ≤1,5-18 pmol/L analisado no plasma.

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO

Limite de deteção

O limite de deteção define-se como a capacidade de deteção de acordo com ISO11843-Parte 1. A capacidade de deteção deve ser considerada como parte da validação de um método e não a concentração mais baixa mensurável. O limite de deteção é 1 pmol/L, conforme determinado pela metodologia descrita em ISO11843-Parte 4.Não será necessário calcular a concentração das amostras com uma absorvância inferior à de Calibrator 1. Em vez disso, será expressa como sendo inferior ou igual (≤) à concentração indicada no frasco de Calibrator 1.

Recuperação

Recuperação à adição 96-101% (valor médio - 98%) Recuperação à diluição 81-96% (valor médio - 86%)

Efeito de hook

As amostras com uma concentração até pelo menos 8 µmol/L podem ser medidas sem dar resultados falsamente baixos.

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Precisão

Cada amostra foi analisada em 4 réplicas em 39 ocasiões diferentes. Valor médio

pmol/L

Coeficiente de variação Amostra Repetibilidade %* No laboratório %** 1 2 3 3.0 5.2 21.9 5.1 3.6 3.3 8.5 9.5 7.5 *Dentro da variação do ensaio

**Variação total do ensaio

Especificidade

Foram encontradas as seguintes reações cruzadas:

Concentrações mais ele-Crossreaction (%) vadas testadas (pmol/L)

Glicentin 0.8 300 Oxyntomodulin 4.4 135 Mini-glucagon <0.1 1600 GLP-1 <0.3 500 GLP-2 <0.3 500 GRPP <0.0005 300 000

GlucaGen (glucagon recombinante para injeção)

100 100

CALIBRAÇÃO

O Mercodia Glucagon ELISA é calibrado contra a primeira preparação internacional de referên-cia da OMS 69/194.

GARANTIA

Os dados de desempenho apresentados no presente documento foram obtidos usando o pro-cedimento indicado. Qualquer alteração ou modificação do propro-cedimento, não recomendada pela Mercodia AB, poderá afetar os resultados, caso em que a Mercodia AB rejeita qualquer garantia expressa, implícita ou estatutária, incluindo a garantia implícita de comerciabilidade e adequação para utilização.

Em tal caso, a Mercodia AB e seus distribuidores autorizados não serão responsáveis por quaisquer danos indiretos ou subsequentes.

BIBLIOGRAFIA

Campbell, J. E., & Drucker, D. J. (2015). Islet α cells and glucagon—critical regulators of energy homeostasis. Nature Reviews Endocrinology, 11(6), 329–338.

Howard JW et al. (2015) Identification of Plasma Protease Derived Metabolites of Glucagon and Their Formation Under Typical Laboratory Sample Handling Conditions. Rapid Commun Mass Spectrom 29:171-181.

Bagger JI et al (2011) Glucagon antagonism as a potential therapeutic target in type 2 diabetes. Diabetes, Obes and Metab 13:965-971.

Holst J et al (2004) Role of incretin hormones in the regulation of insulin secretion in diabetic and nondiabetic humans. Am J Physiol Endocrinol Metab 287:E199-206.

Holst J (2010) Glucagon and Glucagon-Like Peptides 1 and 2. Results Probl Cell Differ 50:121-135.

Young A (2005) Inhibition of Glucagon Secretion. Adv in Pharmacol 52:151-171.

FOLHA DE RESUMO DO PROTOCOLO

Mercodia Glucagon ELISA

amostras 25 µL

Adicionar solução de enzyme conjugate

1X e colocar o selador de placa 200 µL

Incubar Durante a noite (18-22 horas) a 2-8 °C _{num agitador de placas, 700-900 rpm} Lavar a placa com solução de wash

buffer 1X 700 µL, 6 vezes

Adicionar Substrate TMB 200 µL

Incubar 15 minutos a 18-25°C

Adicionar Stop Solution

50 µL

Agitar durante 5 segundos para as-segurar a mistura

Medir A450 Avaliar resultados

* Não incluído Para informações completas, ver a página 7.

31-3185 Version 8.0 2017-11-20 Para suporte técnico, contactar: support@mercodia.com